Summary
Beschreven is een methode om te kwantificeren van de expressie van genen die 96 en 18 oppervlakte eiwitten door afzonderlijke cellen ex vivo, waardoor voor de identificatie van differentially uitgedrukte genen en proteïnen in virus-geïnfecteerde cellen ten opzichte van niet-geïnfecteerde cellen. Passen we de aanpak van de studie SIV-geïnfecteerde CD4+ T cellen geïsoleerd van rhesus makaken.
Abstract
Eencellige analyse is een belangrijk instrument voor het ontleden van heterogene populaties van cellen. De identificatie en de isolatie van zeldzame cellen kunnen moeilijk zijn. Om te overwinnen deze uitdaging, een methodologie combineren geïndexeerd stroom cytometry en high-throughput multiplexed kwantitatieve polymerase-kettingreactie (qPCR) werd ontwikkeld. Het doel was om te identificeren en te karakteriseren simian immunodeficiëntie virus (SIV)-geïnfecteerde cellen aanwezig binnen rhesus makaken. Via de kwantificatie van oppervlakte-proteïne door fluorescentie-activated cell sorting (FACS) en mRNA door qPCR, worden virus-geïnfecteerde cellen geïdentificeerd door virale genexpressie, die wordt gecombineerd met host gen- en eiwit metingen een multidimensionale profiel maken . We noemen de aanpak, gerichte eencellige Proteo-transcriptionele evaluatie of tSCEPTRE. Voor het uitvoeren van de methode, zijn levensvatbare cellen gekleurd met fluorescerende antilichamen specifiek voor oppervlakte markeringen gebruikt voor FACS isolatie van een deelverzameling van de cel en/of downstream fenotypische analyse. Afzonderlijke cellen worden gevolgd door onmiddellijke lysis, multiplex omgekeerde transcriptie (RT), pre PCR versterking en hoge doorvoer qPCR van maximaal 96 afschriften gesorteerd. FACS metingen worden geregistreerd op het moment van het sorteren en vervolgens gekoppeld aan het gen expressie gegevens door goed positie om een gecombineerde eiwit en transcriptionele profiel te maken. Om te studeren SIV-geïnfecteerde cellen rechtstreeks ex vivo, cellen werden geïdentificeerd door qPCR detectie van meerdere virale RNA-soorten. De combinatie van virale afschriften en de hoeveelheid van elk bieden een kader voor de indeling van cellen in verschillende fasen van de virale levenscyclus (b.v., productieve versus niet-productieve). Bovendien waren de tSCEPTRE van SIV+ cellen ten opzichte van niet-geïnfecteerde cellen geïsoleerd van het zelfde model host differentially uitgedrukte genen en eiwitten te beoordelen. Uit het onderzoek bleek eerder ongewaardeerd virale RNA expressie heterogeniteit onder geïnfecteerde cellen, alsmede in vivo SIV-gemedieerde post-transcriptional genregulatie met eencellige resolutie. De tSCEPTRE methode is relevant voor de analyse van iedere cel bevolking vatbaar voor identificatie door expressie van oppervlakte-proteïne marker(s), host of pathogen gene(s) of combinaties daarvan.
Introduction
Vele intracellulaire pathogenen rekenen op gastheer cel machines te repliceren, vaak veranderen van de biologie van de cel van de host of gericht op zeer specifieke subpopulaties van cellen van de gastheer te maximaliseren van hun kansen op vermeerdering. Cel biologische processen zijn daardoor vaak verstoord, met schadelijke gevolgen voor de algehele gezondheid van de gastheer. Begrijpen van de interacties tussen virussen en de cellen van de gastheer waarin ze repliceren zal toelichten ziekte mechanismen die bij de ontwikkeling van verbeterde therapieën en strategieën helpen kunnen om infectie te voorkomen. Directe analytische hulpmiddelen waarmee de studie van gastheer-pathogeen interacties zijn essentieel aan dit einde. Eencellige analyse biedt het enige middel ondubbelzinnig een cellulaire fenotype toeschrijven aan een bepaald genotype of infectie status1. Bijvoorbeeld, veroorzaken pathogene infecties vaak zowel directe als indirecte veranderingen in de cellen van de gastheer. Daarom onderscheid te maken geïnfecteerde cellen van hun niet-geïnfecteerde tegenhangers is noodzakelijk om te host cel kenmerkwijzigingen directe infectie of secundaire effecten, zoals veralgemeende ontsteking. Bovendien, voor veel ziekteverwekkers, zoals SIV en human immunodeficiency virus (HIV), host cel infectie verloopt via meerdere fasen, zoals vroeg, laat of latent, elk waarvan kan worden gekenmerkt door verschillende gen- en eiwit expressie profielen2 , 3 , 4 , 5. bulk analyses van cel mengsels te vangen deze heterogeniteit6zal mislukken. Daarentegen zeer multiplexed eencellige analyses kunnen kwantificeren van de expressie van zowel virale en host genen bieden een middel om op te lossen infectie-specifieke cellulaire verstoringen, met inbegrip van variaties in stadia van de infectie. Verder, gastheer-pathogeen interacties in fysiologisch analyseren relevante instellingen is van cruciaal belang voor de identificatie van gebeurtenissen die zich in besmette organismen voordoen. Dus, methoden die kunnen worden toegepast direct ex vivo zijn waarschijnlijk beste vastleggen in vivo verwerkt.
SIV en HIV gericht CD4+ T cellen, waarin ze tegen gastheer antivirale "beperking" factoren en downregulate antigeen presentatie van moleculen te stellen productieve infectie voorkomen immuun toezicht7,8, 9,10,11. Zonder behandeling, de infectie resulteert in massale verlies van CD4+ T-cellen, uiteindelijk culminerend in verworven immunodeficiency syndrome (AIDS)12. In de omgeving van antiretrovirale therapie aanhouden latent geïnfecteerde cel reservoirs voor decennia, een geduchte barrière voor curatieve strategieën poseren. Inzicht in de eigenschappen van in vivo HIV/SIV-geïnfecteerde cellen heeft het potentieel om het onthullen van de ontvangende cel functies instrumentale in de pathogenese en volharding. Echter, dit heeft zijn zeer uitdagend, voornamelijk te wijten aan de low frequency van geïnfecteerde cellen en gebrek aan reagentia kunnen gemakkelijk om ze te identificeren. Cellen die viraal RNA, transcriberen naar schatting aanwezig zijn op 0,01 – 1% van CD4+ T cellen in bloed en lymfoïde weefsel13,14,15. Onder onderdrukkende therapie zijn latent geïnfecteerde cellen zelfs minder frequent op 10-3–10-7 16,17,18. Virale eiwit kleuring testen zijn werk goed voor het bestuderen van in vitro infecties, zoals intracellulaire Gag, suboptimaal is toe te schrijven aan de achtergrondkleuring van 0.01-0,1%, gelijk aan of groter is dan de frequentie van de geïnfecteerde cellen13, 14. Oppervlakte kleuring voor Env eiwit met goed gekarakteriseerd SIV/HIV Env-specifieke monoklonale antilichamen ook bewezen moeilijk te zijn, waarschijnlijk om dezelfde redenen. Onlangs, roman tools willen verbeteren van de opsporing van cellen uiten Gag door hetzij integratie testen specifiek voor gag RNA of met behulp van alternatieve imaging technologieën14,15,19. Een dergelijke aanpak blijven echter beperkt in het aantal kwantitatieve metingen uitgevoerd op elke cel.
Hier beschrijven we een methodologie waarmee (1) enige virus-geïnfecteerde cellen rechtstreeks ex vivo door gevoelige en specifieke virale gen kwantitatieve qPCR en (2) kwantificeert de expressie van maximaal 18 oppervlakte-eiwitten en 96 genen voor elk besmet (en niet-geïnfecteerde) cel. Deze methodologie combineert eencellige oppervlakte-proteïne meting door FACS gevolgd door onmiddellijke cellysis en gebruik van gen expressie analyse multiplexed gerichte qPCR op het Biomark-systeem. De geïntegreerde fluidic circuit (IFC)-technologie kunnen multiplexed kwantificatie van 96 genen van 96 monsters tegelijk, bereikt door een matrix van 9,216 kamers waarin de individuele qPCR reacties worden uitgevoerd. Hoge-inhoud eiwit overvloed metingen de levende cel FACS sortering registreert terwijl het behoud van de volledige transcriptoom p.a. onmiddellijk uitgevoerd stroomafwaarts. Ter identificatie van virus-geïnfecteerde cellen, tests specifiek voor alternatief afgesplitste en unspliced virale RNAs (vRNA) zijn opgenomen in de analyse van de qPCR, samen met een panel van gebruiker gedefinieerde tests tot 96 genen, het maximum aantal testen momenteel ondergebracht in totaal de IFC. De expressie van genen en eiwitten informatie verzameld voor elke cel zijn verbonden door goed standpunt. Eerder berichtten we resultaten van deze analyse elders20. Wij bieden hier, nadere methodologische richtsnoeren, alsmede verdere beschrijvende fenotypering van SIV-geïnfecteerde CD4+ T cellen.
Deze aanpak, die we tSCEPTRE noemen, kan worden toegepast op de schorsingen van een levensvatbare cellen bevolking reactieve fluorescently gelabelde antilichamen en uiten van een transcriptome compatibel met beschikbaar qPCR testen. Bijvoorbeeld kan het worden gebruikt voor het karakteriseren van differentiële gen- en eiwit expressie in zeldzame cellen of cellen niet gemakkelijk kunnen onderscheiden door oppervlakte-proteïne markeringen. De bereiding van de monsters is gebaseerd op een standaard protocol met verkrijgbare antilichamen kleuring. Cytometers met eencellige Sorterende vermogen ook commercieel beschikbaar zijn, maar extra bioveiligheid voorzorgsmaatregelen zijn vereist voor de verwerking van besmettelijke levende cellen. Opnemen van de single - cel eiwit expressie profiel voor elke cel door goed standpunt, aangeduid is als geïndexeerd sorteren, een gemeenschappelijk kenmerk van verkrijgbare FACS sorteren software. Computationele analyse van host differentially uitgedrukte genen onder mobiele bevolkingsgroepen van belang hier niet wordt beschreven, maar verwijzingen naar eerder gepubliceerde methoden worden geleverd.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Opmerking: Een schematische voorstelling van de protocol-werkstroom wordt weergegeven in Figuur 1. Het bestaat uit drie belangrijkste stappen: FACS, RT en cDNA pre versterking en qPCR voor maximaal 96 genen tegelijk. Twee versies van het protocol, sorteren van cellen in de verdunningen te beperken en sorteren van de afzonderlijke cellen, zijn meer gedetailleerd beschreven in stap 5 en 6, respectievelijk. Deze strategieën richten verschillende onderzoeksvragen maar soortgelijke procedures volgen.
1. vereiste of voorafgaande Analyses
- Alle gen expressie testen moet worden gebruikt als eerder beschreven6valideren.
Opmerking: Deze stap is gedaan ruim voor de datum van het experiment. Alle testen te valideren, is commerciële en aangepaste, vereist om ervoor te zorgen efficiënte en lineaire versterking van relevante RNA tot op het niveau van één cel. Veel commercieel beschikbaar en aangepaste testen niet voldoen aan deze specificaties. Verwerking en geautomatiseerde curve-fitting voor gelijktijdige kwalificatie van meningsuiting tests van maximaal 96 genen worden verstrekt in Aanvullende codering bestanden 1 – 5, maar individuele tests kunnen worden gekwalificeerd via R2 en helling van de lineaire pasvorm. Representatieve assay voor geslaagde en mislukte kwalificatie percelen zijn afgebeeld in Figuur 2. -
Ontwikkelen van een stroom cytometrische panel van antilichamen tegen vlekken cel oppervlakte markers van belang.
- Titreer antilichamen door kleuring van een relevante steekproef, bijvoorbeeld rhesus perifere bloed mononucleaire cellen (PBMCs), met elke antilichaam. Beginnen met 20 µL van antilichaam per test in 100 µL kleuring reactie en acht twee-voudige seriële verdunningen maken. De optimale concentratie dat de maximale intensiteit kleuring vertoont met behoud van een duidelijke scheiding tussen de negatieve en positieve populaties te identificeren.
- Evalueren de gecombineerde kleuring op elk exemplaar van extra cel met behulp van het mengsel van alle antilichamen op de optimale concentratie bepaald in stap 1.2.1. Zorg ervoor dat de kleuring vergelijkbaar met die voor individuele antilichaam vlekken in acht genomen is. De kleuring is minder dan wat is waargenomen toen een antilichaam in isolatie werd gebruikt, overweeg alternatieve fluorescerende conjugaten ter vervanging van dergelijke antistoffen.
2. gen expressie Assay voorbereiding
- Combineer 96 genexpressie testen in een RNase/DNase-gratis tube 1 – 15 mL (grootte kan variëren met het aantal soort platen). Het paneel van tests gebruikt in deze studie wordt gespecificeerd in tabel 1 en tabel 2. Het daaruit resulterende materiaal wordt aangeduid als de "Assay Mix". Elke bepaling toevoegen om een eindconcentratie van 180 nM voor voorwaartse en omgekeerde inleidingen. DNA schorsing Buffer om de aangewezen verdunning van de Assay Mix toevoegen.
Opmerking: Voor praktische doeleinden, aangepaste (door de gebruiker gegenereerde) assay voorraden kunnen worden voorbereid op 18 µM overeenstemming te zijn met de concentratie van verkrijgbare "20 x" gen expressie qPCR tests (Tabel van materialen). 18 µM mengelingen van aangepaste voorwaartse en omgekeerde primer voor elk gen zijn gemaakt van stamoplossingen in de Buffer van de schorsing DNA. Verkrijgbare assays (Tabel of Materials) ook sondes, maar sondes zijn niet vereist voor RT of cDNA pre versterking en kan dus worden weggelaten voor aangepaste testen. Het wordt aanbevolen om één of meer genen van de huishouding voor gebruik in kwaliteitscontrole voor de beoordeling van de doeltreffendheid van sorteren, cel herstel en cDNA synthese. Gebruik van willekeurige inleidingen voor het genereren van cDNA is niet vastgesteld, maar naar verwachting worden minder efficiënt dan gen-specifieke primers. - De 2 x assay plaat gereedmaakt voor gebruik in stap 7.1 (multiplex qPCR). Pipetteer 6 µL van elke bepaling in elk aangewezen goed van een 96-Wells PCR plaat voor elke 96 x 96 chip array verwacht. Bijvoorbeeld, voor 5-chips, zal 30 µL van elke bepaling bezetten een enkele goed in de 96-wells-plaat. Als 96 testen, zal elk putje van de 96-wells-plaat een bepaling bevatten. Het zegel van de plaat met zelfklevende zegel.
Opmerking: in het ideale geval stap 2.1 en 2.2 worden gelijktijdig uitgevoerd, om te voorkomen dat meerdere bevriezen-ontdooien cycli voor gen expressie testen. Alle genen binnen de assay plaat moeten ook aanwezig zijn geweest in de Assay Mix (stap 2.1). Zowel de test-mix en de assay plaat kunnen worden opgeslagen bij-20 ° C of 4 ° C voor lange - of korte termijn gebruik, respectievelijk.
3. oppervlakte vlek levensvatbare cellen
Opmerking: Intracellulair kleuring, permeabilization en fixatie zijn niet compatibel met deze methode als ze compromis RNA.
- Bereiden de compensatie monsters door elke antilichaam vermeld in de Tabel van materialen aan 40 µL van compensatie parels op 2.5-fold hogere concentratie dan die is gebruikt voor de kleuring van de cel toe te voegen. Incubeer gedurende 20 minuten bij 25 ° C beschermd tegen licht. Voeg 3 mL PBS toe aan de kralen en centrifugeer bij 500 x g gedurende 3 min bij 25 ° C. De PBS gecombineerd en resuspendeer de kralen in ~ 300 µL van PBS.
- De stroom cytometrische cel sorter voorbereiden monster verwerking: verwerven van compensatie buizen, compensatie matrix maken en toepassen van matrix naar de overname-bestanden voor de experimentele specimens.
- De master mix van fluorescerende antilichamen cocktail voor te bereiden door het combineren van de juiste hoeveelheid elke antilichaam zoals aangegeven in de Tabel van de materialen, in een tube 1,5 mL oranje voor alle monsters worden gekleurd. Vortex en centrifuge wordt de cocktail bij 21.000 x g gedurende 2 min bij 25 ° C tot het antilichaam pellet aggregaten.
Opmerking: Antilichamen gebruikt hier staan in de Tabel van materialen. - Ontdooi de cryopreserved cellen in een waterbad 37 ° C voor 2 min. toevoegen 0,5 – 2 mL van de celsuspensie aan 12 mL PBS in een tube van 15 mL, centrifuge op 500 x g gedurende 3 minuten bij 25 ° C, en de PBS gecombineerd. Resuspendeer in 3 mL PBS en overdracht aan een polystyreen tube van 5 mL. Centrifugeer als hierboven en de PBS, verlaten ~ 20 µL residuele PBS gecombineerd.
Opmerking: De kleuring temperatuur kan worden aangepast aan warmere of koudere temperaturen zo nodig voor specifieke toepassingen door aanpassing van de titratie van antilichamen kleuring voorwaarden dienovereenkomstig (zie stap 1.2). - Resuspendeer tot 2 x 107 cellen in 80 µL van antilichaam cocktail gewassen en incubeer gedurende 20 min bij 25 ° C beschermd tegen licht. Voor monsters die meer dan 2 x 107 cellen, meereninkwalitatiefopzichthoog kleuring reactie dienovereenkomstig te handhaven < 2 x 107 cellen/100 µL.
- Wassen van de cellen door toevoeging van 3 mL PBS, centrifugeren bij 500 x g gedurende 3 min, en aspirating het supernatant.
- Resuspendeer de cellen in 300-500 µL van PBS en filter grondig door pipetteren via een 35 µm nylon cel zeef GLB. Houden van de cellen op ijs en beschermd tegen licht tot de soort.
4. bereid cel collectie platen, uitvoeren FACS sorteren en genereren cDNA
- Combineer de RT-voorversterker reactie Mix onderdelen (tabel 3) door pipetteren in een enkele RNAse/DNAse-gratis steriele buis.
Opmerking: Deze stap kan worden uitgevoerd vóór of tijdens de kleuring in stap 3. De RT-enzym kan hier achterwege om te bepalen van de bijdrage van de DNA sjabloon qPCR signaal. - Gebruik een meerkanaalspipet af te zien van 10 µL van RT-voorversterker reactie Mix in het gewenste aantal 96-wells-platen in de collectie PCR sorteren. Zegel van de platen met zelfklevende folie, en plaats de platen op vooraf gekoeld 96-Wells-aluminium blokken.
- Stellen de cel sorteren van gating regeling op de cytometer van de stroom door de overname van gegevens uit ongeveer 20.000 cellen van het gebrandschilderde monster. Zorg ervoor dat de compensatie-matrix wordt toegepast op de verzamelde gegevens. Tekenen van poorten en het gating boom waarmee de cel populaties van belang om te worden geïsoleerd gen expressie p.a. definiëren.
Opmerking: De gating boom gebruikt voor het verzamelen van potentiële SIV vRNA+ cellen is afgebeeld in Figuur 3. - Voer de passende instrumentele instellingen om op te geven van het aantal en de subset van cellen worden gesorteerd in elk putje. Als u meer gedetailleerde instructies voor het sorteren van hetzij een beperkende verdunningsreeks van de cel of de afzonderlijke cellen vindt u in stap 5 en 6, respectievelijk.
- FACS sorteren de cellen in bereid 96-Wells-PCR collectie platen. De Zelfklevende zegel vóór sortering verwijderen en vervangen door een verse zegel na het sorteren.
Opmerking: Houd de platen op vooraf gekoeld aluminium blokken te allen tijde, met inbegrip van tijdens de sorteerbewerking. - Onmiddellijk na het sorteren, de draaikolk en de centrifuge de collectie plaat bij 2.000 x g gedurende 1 minuut bij 4 ° C.
- Thermocycle de plaat in een PCR-machine met een voorverwarmde deksel met behulp van de volgende voorwaarden: 50 ° C gedurende 15 minuten (RT), 95 ° C gedurende 2 min, gevolgd door 18 cycli van 95 ° C voor 15 s en 60 ° C gedurende 4 minuten (pre amplificatie).
- Verdun de cDNA 1:5 door 5 μL van cDNA overgeplaatst naar 20 µL van DNA schorsing buffer in een nieuwe 96-Wells PCR plaat. Verdunde cDNA kan worden opgeslagen bij 4 ° C of -20 ° C voor onbepaalde tijd op dit punt. CDNA is nu klaar om te worden gebruikt als een sjabloon voor qPCR (stappen 5.2, 7.4).
Opmerking: Deze verdunning zorgt ervoor dat de inleidingen aanwezig in de RT-voorversterker reactie niet tot overschrijding stroomafwaarts qPCR bijdragen.
5. variatie A: FACS soort cellen in een verdunningsreeks beperken om te bepalen van de frequentie van vRNA+ cellen of de experimentele kwaliteitscontrole uitvoeren
Opmerking: Voordat u een soort eencellige, het wellicht van nut zijn voor het bepalen van de frequentie van cellen van belang, de cellen in seriële verdunningen in repliceren wordt gesorteerd. Deze stap biedt ook waardevolle kwaliteitscontrole voor sorteren efficiëntie, lysis van de cel, RNA herstel en cDNA synthese, zoals beschreven in stap 5.3. Voorafgaande bepaling van vRNA+ cel frequentie zorgt voor meerder stipt waardering van het aantal afzonderlijke cellen om voldoende grootte van de steekproef voor adequaat aangedreven vRNA+ cel gen expressie analyse moeten worden gesorteerd.
- FACS sorteren van de cellen in de 96-wells-platen bereid zoals in stappen 4.1-4.2, en het verzamelen van 1-1000 cellen per putje in meerdere wordt gerepliceerd.
Opmerking: Het aantal repliceren putten bij elke cel verdunning is meestal omgekeerd gekoppeld aan de cel concentratie per putje. Wanneer de frequentie van de geïnfecteerde cel is goed minder dan 1%, moeten cel verdunningen richten op 100-1000 cellen per putje. Een voorbeeld soort plaat kaart wordt gegeven in Figuur 1, links boven. Meer dan 1000 cellen per putje dient te worden vermeden als gevolg van resulterende stijgingen in de omvang van de reactie en interferentie met stroomafwaartse cDNA synthese en kwantificering. - Combineer de qPCR reagentia in een oplossing van de master mix in tabel 4. Voor een volume van 25 µL-reactie, wordt 22.5 µL van master mix gecombineerd met 2,5 µL van verdunde cDNA sjabloon vanaf stap 3.9. Uitvoeren van de qPCR met behulp van fietsen standaardomstandigheden (bijvoorbeeld94 ° C gedurende 5 minuten, gevolgd door 40 cycli van 94 ° C voor 15 s en 60 ° C gedurende 1 min).
Opmerking: Singleplex qPCR reacties met behulp van een conventionele real-time qPCR instrument worden aanbevolen als een economische voorlopige analyse van één of enkele tests om aan te tonen van efficiënte cel sorteren, RNA herstel en cDNA synthese. Het kan ook worden gebruikt voor het berekenen van de frequentie van cellen van de vRNA+ . Multiplex qPCR reacties met behulp van de Biomark zijn meestal beter geschikt voor grootschalige eencellige analyses. - Voor kwaliteitscontrole, plot Et waarden (Et = Ctmax − Ct) versus aantallen cellen gesorteerd per putje op een log10 schaal en toepassen van een lineaire regressie-analyse.
Opmerking: Consistent wordt gerepliceerd, helling van de lineaire regressie voor 3.3 (± 0,3) en R2 > 0.9 zijn indicatief voor een efficiënte experiment. Voorbeelden van optimale en suboptimaal soort, RT-voorversterker experimenten zijn weergegeven in Figuur 4. - Om te bepalen van de frequentie van vRNA+ cellen, plot cel nummers gesorteerd per putje op de x-as (10 logschaal) en de Fractie van wells positief voor vRNA bij elke verdunning van de cel op de y-as. Zie bijvoorbeeld Figuur 1 (lagere links, Poisson-verdeling). Een lineaire regressiemodel toepassen op de gegevens om te bepalen van het aantal cellen die haven één positieve cel gemiddeld overeenkomt met 63,2% van putten positief (0.632 op de y-as)21. Deze verdunning celaantal (snijpunt van de x-as) converteren naar frequentie uitgedrukt als een percentage. Bijvoorbeeld is één cel van vRNA+ per 48 cellen gelijk aan een frequentie van 2,1%.
6. variatie B: FACS soort cellen voor eencellige analyse
- Stappen 4.1 – 4.8, en geef één cel gesorteerd per goed gebruik van de cytometer van de stroom soort indexfunctie voor het maken van afzonderlijke FCS bestanden voor elke cel gesorteerd, toegewezen door goed standpunt.
Opmerking: Als het aantal sorteren collectie platen groter is dan het aantal beschikbare thermocyclers, fietsen kan worden gestopt na de reverse-transcriptase inactivatie stap (95 ° C gedurende 2 min) en cDNA kan worden achtergelaten bij 4 ° C, totdat thermocyclers beschikbaar zijn. In dit geval beginnen vóór versterking op de eerste cyclus van 95 ° C voor 15 s. - Optioneel: Maak cDNA "pools" bestaande uit cDNA van gebruiker gedefinieerde batches van afzonderlijke cellen aan het scherm voor zeldzame cellen van belang met behulp van residuele onverdund cDNA. Pipetteer 2 µL van onverdunde eencellige vooraf versterkte cDNA door meerkanaalspipet in een nieuwe 96-wells-plaat. Herhaal door pipetting 2 µL van cDNA van alles extra afzonderlijke cellen van een aangewezen zwembad in hetzelfde goed. Het scherm van cDNA zwembaden voor gene(s) van belang (bijvoorbeeld, vRNA) om te bepalen die met positieve cellen met behulp van conventionele qPCR. Aangezien de pooling vereist slechts een kleine hoeveelheid cDNA van elke cel, is de resterende ~ 8 µL van cDNA nog steeds beschikbaar voor eencellige analyses.
Opmerking: Bundeling van strategieën worden aanbevolen voordat u eencellige gen expressie analyses uitvoert in een poging om het verminderen van het aantal afzonderlijke cellen ondervraagd door resource-intensieve multiplex qPCR. Het is geschikt voor situaties waarin de cellen van belang (b.v., SIV mRNA +) kunnen worden geïdentificeerd door een voorlopige single-plex qPCR assay. Eenvoudige omvatten high-throughput maken cDNA zwembaden strategieën combineren 2 µL van onverdunde cDNA uit een collectie soort plaat (dat wil zeggen, alle 12 in rij cellen) rijen of kolommen (dat wil zeggen, alle 8 in kolom 1 cellen), in een enkele goed in een nieuwe plaat. Om te bepalen van de beste strategie bundelen, kunt u overwegen de verwachte frequentie van de cellen van belang vanaf stap 5.4. Bijvoorbeeld als 10% van de cellen zijn naar verwachting zal positieve, zwembaden bestaat uit zes eencellige cDNA monsters zullen vaak negatief en de cellen in die groep vertegenwoordigd kunnen dus worden uitgesloten van downstream eencellige analyses.
7. multiplex qPCR op het Biomark Platform
Opmerking: Deze sectie kan ofwel versie A of B hierboven beschreven volgen. In de studie die hierin worden beschreven, het is uitsluitend van toepassing op eencellige analyse.
- Bereid de qPCR assay plaat door pipetting 4 µL van elke bepaling van de 2 x assay plaat (bereid in stap 2.2) in een nieuwe 96-Wells PCR plaat met 4 µL van assay laden reagens in elk putje. Handhaven van de assay plaat bij 4 ° C.
Opmerking: De assay plaat is stabiel bij 4 ° C gedurende maximaal één week en bij-20 ° C gedurende één maand. Dus, het dienstig is om voldoende materiaal voor meerdere chips voor te bereiden en op te slaan op de juiste manier. - Afzien van het besturingselement lijn vloeistoffen uit de priming spuiten in de kleppen van de twee inname van de chip. Verwijder het beschermende plastic onder de plaat. Plaats de chip op een IFC-controller met de ingekeepte kant op de positie van de A1. Vanuit het hoofdmenu, selecteer het script dat "Prime". Het script uitvoeren.
- Bereid de Real-Time reactie Mix door het mengen van 50 µL van monster reagens met 500 µL van het PCR Master Mix (Tabel of Materials) voor elke microfluidic chip te laden. Pipetteer 4.4 µL in ieder putje van een nieuwe 96-Wells PCR plaat, voortaan aangewezen als de "monster plaat".
- Pipetteer 3.6 µL van verdunde cDNA uit stap 4.8 in de steekproef plaat met de Real-Time reactie Mix 1:5.
Opmerking: Als een PCR down-selectie werd uitgevoerd om te screenen op zeldzame (bijvoorbeeld, vRNA+) cellen voor downstream analyse zoals besproken in stap 6.2, bevatten alleen de cellen in de positieve zwembaden vertegenwoordigd. - Na de voltooiing van de chip priming, door de inhammen van de chip door verstrekking 5 µL van de plaat van de bepaling in de corresponderende goed op de ingekeepte (assay) kant van de chip en 5 µL van de monster-plaat in de corresponderende goed aan de andere kant van de (voorbeeld) van de chip te laden. Invoegen van een chip in de IFC-controller en voer het script van "Load mix".
- De chip aan het Biomark platform voor het uitvoeren van de multiplexed qPCR overdragen. Doorgaan met de installatie van het instrument en qPCR programing volgens stapsgewijze instructie verstrekt door de Real-Time PCR analyse software en het gebruik van het protocol van gen expressie (GE) 96.96 standaard V.1 met 40 cycli van PCR. Sla het bestand ChipRun in een aangewezen map.
Opmerking: Meerdere chips kunnen worden uitgevoerd per dag en meerdere dagen. - De qPCR-gegevens analyseren.
- Open de Software van de analyse van PCR in real time. Open het bestand "ChipRun.bml" uit het "File | Open"menu.
- Zoek "Chip Explorer" en "Chip uitvoeren samenvatting" in de linker bovenhoek van het venster software. Identificeren van de drie componenten van de Chip uitvoeren Samenvatting: analyseweergaven, monster Setup en Detector Setup.
- Klik op "Detector Setup". Onder "Taak" Klik "Nieuw" en Selecteer type "SBS plaat" van de container, en container-formaat "SBS96". Naast "Mapping", klik op de... en selecteer "M96-Assay-SBS96.dsp".
- Optioneel: Toewijzen elke Detector (assay) een nummer of naam in de sectie van de "naam" van elk putje door te dubbelklikken op de 1st goed. Verplaatsen naar de volgende goed door op "F2" te drukken.
- Klik op "Voorbeeld Setup". Klik onder "Taak" naast "Mapping", op de... en selecteer "M96-monster-SBS96.dsp".
- Klik op "Analyseweergaven". Selecteer onder "Taak" in het tabblad "qPCR", "Correctie van de basislijn voor lineaire (afgeleide)", en "Ct drempel methode voor gebruiker (detectoren)". Controleer de "initialiseren met Auto doos" in het tabblad "Ct drempels". Klik op de knop "Analyseren" hierboven.
- In de hogere juiste kwadrant van "Analyseweergaven", klik op de tweede tab "Uitslagen stand". Uit de drop-down menu, selecteer "Warmte kaart View". De warmte-kaart met gegevens wordt weergegeven.
- Optioneel: Om uniforme ROX fluorescentie over de spaander, selecteer "Image View" in plaats van "Warmte kaartweergave" in hetzelfde menu. Selecteer in de tweede van het juiste venster boven de warmte kaart, "ROX". In de eerste van het juiste venster, selecteert u een van de 1-40 cycli. Klik op de vierde van het juiste venster om te schakelen naar zwart-wit weergave van ROX fluorescentie. Een afbeelding wordt weergegeven die informeert splatters, deeltjes, of defecten op de chip. Als de ROX uniformiteit is schromelijk verduisterd, opnieuw uitvoeren de chip.
- Onder de hitte-kaart, klikt u op "Drempel" en "Log Graph". De Ct-drempels handmatig voor elke detector aanpassen door op testen (kolommen van de warmte-kaart) te klikken en te slepen de drempel als nodig zijn om te snijden de versterking bochten in de exponentiële fase. Wanneer u klaar bent, klikt u op "Analyseer".
- De qPCR-gegevens exporteren als een CSV-bestand. Importeer de gegevens in een werkblad of een statistische analysesoftware (bijvoorbeeldJMP) en de resultaten per monster en assay posities op de chip kaart. De cellen indelen in groepen op basis van de expressie van virale genen, door een nieuwe kolom te maken en met behulp van een voorwaardelijke formule. Onder "Analyze", selecteer "Y door X Fit" en genexpressie versus groep uitzetten. Statistische analyse van de toepassing.
Opmerking: Vertegenwoordiger eencellige kwantitatieve expressie van vier soorten van SIV RNA wordt afgebeeld op de bivariate percelen in figuur 5A. Kwantitatieve host genexpressie in cellen van SIV RNA+ is afgebeeld in figuur 5B. - Kwantitatieve eiwit expressie waarden extraheren op basis van één cel FACS gegevens.
- Open de .fcs bestanden uit de FACS sorteren (stap 6.1) overeenkomt met 96-wells-plaat met behulp van FlowJo versie 9. Met de naam van het bestand gemarkeerd, selecteert u "Platform | Gebeurtenis nummer Gate | Geïndexeerde sorteervolgorden maken poorten". Afzonderlijke cellen worden weergegeven door rij weergegeven.
- Markeer alle 96 cellen (niet rijen) en selecteer "werkruimte | Exporteren | Selecteer alle gecompenseerd fluors". Onder 'Gegevenstype', selecteer "FCS file" en klik op "Export" Selecteer een aangewezen map.
- Nieuwe .fcs bestanden voor afzonderlijke cellen naar een nieuwe FlowJo-werkruimte slepen. Alle cellen markeren, klikt u op "Add statistieken" (de "Σ"-knop in de linkerbovenhoek wordt getoond) "| Bedoel | Alle fluor parameters".
- Open "tabel Editor" door te klikken op de vierde knop van links in de linkerbovenhoek wordt getoond. Markeer alle fluores van de eerste cel en sleept u deze in de tabel editorvenster. In de tabel editorvenster, klikt u op dezelfde knop bovenaan "Create en weergave Table". Hierdoor ontstaat een tabel met 96 cellen en een numerieke parameter voor elk fluor.
- Kopieer de output naar een database-software (bijvoorbeeldMS Excel, JMP), door beide kopiëren/plakken of door te klikken op "Opslaan en toepassing starten" (vierde van de linker knop boven de tabel).
Opmerking: Deze procedure is specifiek voor de FlowJo versie 9. FlowJo versie 10 maakt gebruik van een andere procedure om geïndexeerde gegevens te importeren. Geïndexeerde stroom gegevens kunnen ook worden gekopieerd/geplakt in JMP rechtstreeks van CSV-bestanden gemaakt door de cel sorteerder.
- Samenvoegen van één cel FACS gegevens en qPCR door de nummerplaat en goed plaats. Grafische en statistische analyses uitvoeren op het gecombineerde eencellige gen (qPCR) en eiwit expressie (FACS) gegevens.
Opmerking: Voorbeelden van eencellige gecombineerd qPCR en FACS gegevens worden weergegeven in Figuur 6 (host oppervlakte-proteïne expressieprofielen voor SIV-geïnfecteerde, afgesplitste vRNA+ rhesus makaak cellen), Figuur 7 (CD4 genexpressie versus oppervlak CD4 eiwituitdrukking in verbonden vRNA+ rhesus makaak cellen), en eerder gepubliceerd20. Ter identificatie van differentially uitgedrukte genen in de cel populaties van belang, eencellige analyse methoden eerder beschreven zijn aanbevolen20,22,23,24, die goed zijn voor het aantal cellen positief voor een gen, alsmede de voortdurende gen expressie waarde.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
De werkstroom voor het gehele protocol wordt afgebeeld in Figuur 1. Het bestaat uit twee varianten die zijn gedefinieerd door het aantal cellen gesorteerd op: ofwel beperkende verdunning of als single van cellen, zoals beschreven in de tekst. Voorbeelden van primer-sonde kwalificatie analyses op 2-fold seriële verdunningen van het RNA zijn afgebeeld in Figuur 2. De gating strategie potentiële SIV+ cellen opsporen is afgebeeld in Figuur 3. Een succesvolle en mislukte suboptimaal kwaliteitscontrole-qPCR voor het huishouden gen GAPDH op cellen in het beperken van verdunning FACS-gesorteerd worden weergegeven in Figuur 4. Eencellige kwantitatieve expressie van vier SIV RNA soorten en rhesus makaak genen die differentieel werden uitgedrukt in de geïnfecteerde cellen zijn afgebeeld in Figuur 5. Vertegenwoordiger bivariate, histogram en scatterplots verbeelden het oppervlakte-proteïne expressie profiel van SIV RNA+ CD4+ T cellen gemeten door stroom cytometry in Figuur 6. De trivariate bubble plot (Figuur 7) toont de relatie tussen oppervlakte CD3 of CD4-proteïne, CD3 of CD4 mRNA en kwantitatieve virale gen (tat/rev) expressie in afzonderlijke cellen.
Figuur 1 : Schematische voorstelling van experimentele werkstroom illustreert drie hoofdonderdelen: flow cytometrische sorteren, omgekeerde transcriptie plus PCR-gebaseerde pre versterking van cDNA (RT, pre amp), en qPCR. De soort kan worden uitgevoerd als een beperkende verdunning (A, groene achtergrond) of als afzonderlijke cellen (B, oranje achtergrond). Direct na de sorteerbewerking FACS, cellen zijn lysed en RNA wordt reverse getranscribeerde in cDNA en vooraf versterkte (RT, pre-amp PCR) ter voorbereiding qPCR sjabloon. Beperkende verdunning soorten bepalen de frequentie van cellen positief voor virale RNA met behulp van statistieken van de Poisson-verdeling, alsmede experimentele efficiëntie en proef van herstel. Het hoofd van de groene pijl geeft aan het geschatte aantal cellen gesorteerd per goed met één cel positief voor een virale gen (overeenkomt met een goedkeuringskans van de 63,2% van dergelijke putten wordt gene positieve), die wordt omgezet in de frequentie van een cel. Frequentie ramingen mogen worden gebruikt om het aantal afzonderlijke cellen verzameld in een latere soort (B). Geïndexeerde eencellige FACS sorteren deposito's één cel per putje en genereert gegevensbestanden voor elke cel geannoteerd door goed positie binnen de 96-wells-plaat. Eencellige qPCR wordt uitgevoerd in multiplex voor 96 genen tegelijk. Het combineren van de oppervlakte-proteïne (FACS) en mRNA uitdrukking zorgt voor profilering van afzonderlijke cellen (rechter kolom). Een optionele qPCR voor een virale gen kan worden uitgevoerd tussen de pre amplificatie PCR en multiplexed qPCR (B, midden) aan scherm afzonderlijke cellen of zwembaden van eencellige cDNA naar down-select virale RNA+ cellen of zwembaden voor multiplex qPCR analyse. De warmte kaart illustreert (Ct-waarde) van de expressie van genen voor 96 assays (kolommen) en 96 afzonderlijke cellen (rijen). Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 2: Vertegenwoordiger qPCR gegevens uit primer kwalificatie experimenten staan voor succesvolle (linker- en middelste) en mislukte (rechts) verkrijgbare assays ( CD6, SIV tat/rev, en TLR3, respectievelijk). Voor CD6 en TLR3, RNA werd gewonnen uit 106 FACS-gesorteerd resusaap PBMC CD4+ T-cellen met behulp van een commerciële kit. Acht een replica van een twaalf-punt RNA tweevoudige verdunningsreeks (0.023-48 ng RNA, overeenkomt met 1.2 – 2.400 cel equivalenten uitgaande van 20 pg RNA per CD4+ T-cel) werden onderworpen aan RT-voorversterker en qPCR. Voor SIV tat/rev, werd RNA gewonnen uit resusaap PBMCs besmet in vitro met SIVmac239. RNA verdunningen bereid waren spanning RNA equivalenten van 6 – 12.000 cellen. Et (40-Ct)-waarden, die met genexpressie te verhogen, wordt uitgezet tegen de geschatte cel nummers. Verdunningsreeks exposeren R2 > 0.97 en helling van 3,32 ±0.3 geven aan succesvolle primer kwalificatie. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 3: Bivariate FACS Staanplaatsen met gating regeling voor isolatie van rhesus makaak cellen potentieel besmet door SIV. Sequentiële poorten voor het selecteren van geheugen (CD95 +) CD4+ T cellen staan van linksboven tot lagere recht met elke naam van de populatie aangegeven. Procent van bovenliggende plot die binnen elke poort valt wordt aangegeven. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 4 : Representatief experimentele validatie van qPCR uitgevoerd op FACS-gesorteerd op cellen in het beperken van de verdunning met behulp van GAPDH gen van de huishouding voor drie onafhankelijke experimenten: succesvolle (links), suboptimaal (midden), en (rechts) mislukt. Duplo's van 10-100 cellen per well-element moeten omvatten niet meer dan 2 Ets en 300-1000 cel wells binnen 1 Et. De helling van de lineaire regressie moet 3,32 ± 0,3, R2 > 0.95. Gebrek aan het bereiken van deze specificaties geeft aan technische moeilijkheden bij het stappen 1, 2, 3, of een combinatie daarvan. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 5 : Eencellige kwantitatieve virale en gastheer genexpressie in FACS-gesorteerd resusaap CD4+ T-cellen van de mesenterische lymfeklieren 10 dagen post-SIVmac251 infectie. (A) virale genexpressie bivariate percelen van vermenigvuldigen-verbinding aan de randen (tat/rev) en afzonderlijk-verbinding aan de randen (env) SIV mRNA door single cellen (links). Tat/rev+env- cellen (licht groene cellen langs de x-as) express minder kopieën van tat/rev RNA dan de cellen van de env+ (donkergroen), consistent met een vroege stadium van infectie en voorafgaand aan Rev eiwit-gemedieerde stabilisatie en nucleaire export van gedeeltelijk afgesplitste vRNAs zoals env. Cellen die niet afgesplitste viraal RNA uitdrukken doen worden afgebeeld in grijs (geen virale RNA), bruin (gag+ en LTR+), of tan ( gag+ of LTR+). Unspliced (gag+) en totaal (LTR+) SIV mRNA expressie weergegeven voor dezelfde cellen (rechts). Hoge overvloed van unspliced gag RNA in tat/rev+env+ cellen strookt met het late stadium productieve infectie gedurende welke overvloedige genomic RNA wordt uitgedrukt voor verpakkingen in de ontluikende virionen. (B) viool percelen van rhesus makaak genen differentieel uitgedrukt in ten minste één subset van SIV-geïnfecteerde cellen ten opzichte van niet-geïnfecteerde cellen (grijs). Statistische analyse werd uitgevoerd zoals eerder beschreven20,22,23,24. Sterretje geeft aan valse ontdekking tarief < 10% in de gecombineerde waarschijnlijkheid verhouding test vergelijkingen ten opzichte van niet-geïnfecteerde cellen. Lijn verbindt gemiddelde waarden in cel groepen voor elk gen. Dit cijfer is gewijzigd van Bolton et al. 20 Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 6: Vertegenwoordiger host oppervlakte-proteïne expressieprofielen FACS-gesorteerd op cellen van rhesus makaak mesenterische lymfeklieren 10 dagen post-SIVmac251 infectie. (A) Scatterplot weergave van CD3 en CD4 ICOS oppervlakte-proteïne expressie in niet-geïnfecteerde (grijs), gag+tat/rev- (bruin) en gag+tat/rev+ cellen (groen). Intensiteit van de fluorescentie wordt uitgezet voor elke cel (dot). Uitschieter vak percelen verbeelden de interkwartielafstand (IQR) en de mediaan (doos), de verste punten binnen 1,5 x IQR uit de doos (snorharen), en potentieel uitschieters (verbroken punten). Horizontale balken boven geven significante verschillen (p < 0,05, niet-parametrische Wilcoxon rangschikking test). (B) Bivariate en histogram weergave van oppervlakte CD3 en CD4 eiwit expressie voor de cellen weergegeven in (A). Stip perceel (links) geeft aan dat de percentages van de bevolking van elke cel binnen een Kwadrant. CD3 en CD4 histogrammen (midden, rechts) verbeelden oppervlakte-proteïne Downregulatie onder gag+tat/rev+ cellen ten opzichte van niet-geïnfecteerde en gag+tat/rev- cellen. (C) twaalf representatieve tat/rev+ enkele cellen uit (A – B) worden weergegeven in drie bivariate percelen voor oppervlakte expressie van CD3/CD4 (links), CD69/CD38 (midden), en ICOS/HLA-DR (rechts). Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 7 : Trivariate perceel weergave van eencellige virale gen (tat/rev), host gen (CD3 of CD4) en gastheer (CD3 of CD4) oppervlakte-proteïne expressie in SIV-geïnfecteerde geheugen CD4+ T cellen uit de mesenterische lymfeklieren 10 dagen infectie van de post-SIVmac251. CD4 eiwit expressie (fluorescentie) wordt uitgezet tegen CD4 mRNA (qPCR), terwijl de hoeveelheid tat/rev uitgedrukt door elke cel wordt weerspiegeld door de puntgrootte. In tat/rev+ cellen (groen), daalde oppervlakte CD4 en CD3 eiwit expressie met aanhoudende CD4 en CD3 afschriften, respectievelijk, geef aan dat de oppervlakte-proteïne expressie stroomafwaarts gemoduleerd van de genexpressie. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Tabel 1: Primers en sondes gebruikt voor de detectie van SIV nucleïnezuren. Toen twee reeksen zijn geïndiceerd voor een primer of de sonde, werden mengsel bedragen van beide reeksen gebruikt. Klik hier om dit bestand te downloaden.
Tabel 2: een 96-gen panel gebruikt voor kwantificatie van waarbij op Biomark instrument. Vier SIV testen worden aangegeven met blauwe achtergrond. Klik hier om dit bestand te downloaden.
Tabel 3: Reactie mix gebruikt voor omgekeerde transcriptie en pre amplificatie. Klik hier om dit bestand te downloaden.
Tabel 4: qPCR reactie mix gebruikt voor PCR in real time uitgevoerd op een instrument Quant Studio 6. Klik hier om dit bestand te downloaden.
Aanvullende codering bestand 1. Instructies voor de kwalificatie van gen expressie testen. Klik hier om dit bestand te downloaden.
Aanvullende codering File 2: monster kaart sjabloon in JMP. Klik hier om dit bestand te downloaden.
Aanvullende codering bestand 3: sonde kaart sjabloon in JMP. Klik hier om dit bestand te downloaden.
Aanvullende codering bestand 4: Primer analyse script voor JMP. Klik hier om dit bestand te downloaden.
Aanvullende codering bestand 5. Stuksgewijs analyse script voor JMP. Klik hier om dit bestand te downloaden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Het protocol hier beschreven, genoemd tSCEPTRE, eencellige oppervlakte-proteïne kwantificatie integreert door multiparameter stroom cytometry met kwantitatieve eencellige mRNA uitdrukking door zeer multiplexed RT-qPCR. De vereniging van deze twee technologieën kunt momentopnamen van hoge-inhoud van de gecombineerde transcriptionele en eiwit Profiel van afzonderlijke cellen in de indeling van een hoge gegevensdoorvoer. Wij gebruiken de methode voorheen ongrijpbare cellen geïnfecteerd met SIV in vivoopsporen, en beschrijven van host differentially uitgedrukte genen en proteïnen. Het protocol kan worden aangepast voor de studie van iedere cel bevolking van belang te onderscheiden door de uitdrukking van oppervlakte expressie gebrachte eiwitten, mRNA, of een combinatie daarvan. De beschreven methoden gebaseerd op nauwkeurige eencellige sorteren en gegevensregistratie door stroom cytometry gekoppeld aan verkrijgbare qPCR reagentia en multiplexed real-time PCR instrumentatie. De output is gevoelig, kwantitatieve beoordeling van eencellige gecombineerde eiwitten en gen expressie gegevens.
Andere benaderingen koppelen van eiwitten en gen-expressie in afzonderlijke cellen zijn beschreven van1,25,26,27. Geïndexeerde FACS sorteren gevolgd door RNAseq, met succes toegepast op de karakterisatie van hematopoietische stamcellen, vertegenwoordigt een bijzonder veelbelovend aanpak28. Echter, terwijl RNAseq diverse voordelen ten opzichte van gerichte gen expressie analyses, namelijk onpartijdige volledige transcriptoom analyse heeft, is onderworpen aan een hogere meerdere vergelijkingen statistische kosten en minder gevoelig voor de kwantificering van de laag kopie kan worden afschriften. Bovendien, het is momenteel niet economisch haalbaar is voor het uitvoeren van RNAseq op duizenden cellen op zoek naar zeldzame geïnfecteerde cellen aanwezig bij frequenties < 1% (bijvoorbeeld, HIV, SIV). Andere opkomende eencellige technologieën willen genereren een enkele uitlezing, dat wil zeggen, door FACS of PCR, voor de detectie van zowel proteïnen en nucleic zuren in dezelfde cel. Het gaat hierbij om de detectie van eiwitten door fluorescerende antilichamen en mRNA door fluorescerende oligonucleotide sondes gevolgd door FACS analyse (mRNA-Flow-vis)14,15,29,30. U kunt ook kunnen eiwitten worden gedetecteerd door paren van antilichaam-oligonucleotide geconjugeerde die zijn gedetecteerd door qPCR parallel met omgekeerd getranscribeerde mRNA31,32,33,34 . Deze "hybride" benaderingen bieden gelijktijdige nucleic zuur en eiwit metingen met eencellige resolutie vergelijkbaar met tSCEPTRE, maar ze zijn beperkt waar zij beide niet kwantitatieve (mRNA-Flow-vis) of wellicht aangepast antilichaam of mRNA sondes. Onze benadering van tSCEPTRE is kwantitatieve voor zowel eiwitten als mRNA metingen en alle reagentia commercieel beschikbaar zijn, met de mogelijke uitzondering van pathogeen-specifieke tests.
Bijzondere aandacht moet worden toegepast op de verschillende stappen in het protocol vóór de analyse van experimentele monsters. Eerste, hoge-parameter stroom cytometry vereist zorgvuldige optimalisatie van een panel van fluorescerende antilichamen om gevoelige detectie en resolutie35. Elke antilichaam moet individueel getitreerd worden ter identificatie van de concentratie die behaalt optimale scheiding en minimale achtergrondkleuring, gevolgd door de beoordeling van de vlekken wanneer alle antilichaam geconjugeerde in combinatie worden gebruikt. Tweede, experimentele bepaling van de juiste qPCR gen expressie assay voor het meten van elk gen van belang is essentieel. Meerdere verkrijgbare tests zijn normaal gesproken beschikbaar zijn voor elk gen, maar in onze ervaring, zijn veel niet kwantitatieve op de eencellige niveau6. Het is dus belangrijk om alle voorgestelde tests op serieel verdunde RNA vóór gebruik voor kwantitatieve genexpressie in aanmerking komen. Optimalisatie van deze reagentia is tijdrovend, maar de waarde van betrouwbare panelen van geconjugeerde antilichaam en gen expressie testen voor gevoelige detectie van alle moleculen van belang waarmee rechtvaardigt de tijdsinvestering. Daarnaast moet prioriteit worden gegeven aan verkrijgbare testen met sondes die zich uitstrekken over exon-exon kruispunten (aangeduid met achtervoegsel "m1") ter verbetering van de specificiteit van mRNA, hoewel alternatieve testen voor het opsporen van genomic DNA (achtervoegsel "s1" of "g1" van ) worden beschouwd als onwaarschijnlijk om gen expressie resultaten als gevolg van gelijkwaardige chromosomale exemplaren in elke cel te beïnvloeden. Behoud van RNA stroomopwaarts van RT is kritisch en door het bijhouden van monsters gekoeld, zoals opgemerkt in het gehele protocol wordt bereikt. Ook de duur van FACS sorteren en het interval tussen sorteren en RT-voorversterker moet tot een minimum worden beperkt. Voor zowel beperkende verdunning en eencellige sorteren, kan cDNA worden eerst geanalyseerd door conventionele qPCR om te beoordelen van RNA herstel van sterk uitgedrukt huishouden genen. Als de waargenomen expressie niet uniform onder replicatieonderzoeken van zoals cel nummers, of de helling van de lineaire fit voor het beperken van verdunningen mislukt validatie, moet probleemoplossing worden uitgevoerd met cel Sorteren en "downstream"-procedures.
Mogelijke beperkingen van de hier beschreven aanpak omvatten (1) opsporing van DNA naast RNA, met name voor tests niet specifiek zijn voor mRNA splice kruispunten, en (2) beperkt aantal oppervlakte eiwitten en genen gemeten. DNA detectie is echter onwaarschijnlijk dat wezenlijke bijdrage leveren aan de differentiële ontvangst gen expressie analyse om de reden die hierboven vermeld. Bovendien, we rechtstreeks gemeten naar de mate waarin DNA tot het signaal van de qPCR in dit protocol door twee benaderingen bijdraagt: a) met uitzondering van reverse-transcriptase, en b) het protocol van de lysis van de cel om kernmembraan lysis te wijzigen. Bij het ontbreken van reverse-transcriptase, beide verbinding aan de randen en unspliced virale genen nog geconstateerd, maar bij aanzienlijk lagere frequentie dan in aanwezigheid van reverse-transcriptase (~ vermindering van de 6-fold en 2-fold, respectievelijk)20. Vandaar, de virale gen expressie testen kunnen het overschatten van de hoeveelheid virale RNA in een cel als gevolg van de aanwezigheid van cel-geassocieerde virale DNA aanwezig. Wij hechten deze bevinding cytoplasmatische RT producten gegenereerd tijdens de ontvangende cel infectie, optreden voor zowel de unspliced als de afgesplitste SIV/HIV RNA die afkomstig zijn van binnenkomende virionen36. Dus, is het wellicht raadzaam te wijden een deel van de experimenten aan voorwaarden ontbreekt reverse-transcriptase om te kwantificeren van DNA-afgeleide sjabloon voor sommige toepassingen. Ook opgemerkt moet worden dat unspliced SIV/HIV RNA afgeleid van inkomende virus niet kunnen worden onderscheiden van DOVO gesynthetiseerd virale RNA. Ten tweede, we een nucleaire lysis stap opgenomen in het protocol van de RT-voorversterker en waargenomen een exponentiële toename van de geïntegreerde SIV DNA (Alu-LTR) kopieën (Figuur S3 van Bolton et al.) 20. genomic DNA is daarom onwaarschijnlijk dat aanzienlijke bijdrage te leveren aan de sjabloon van de nucleic zuur geëxtraheerd uit de cellysis methode die hier wordt gebruikt. Van de nota wellicht de toevoeging van een nucleaire lysis stap nuttig in de toekomst eencellige studies willen onderzoeken SIV of andere virus-DNA-positieve cellen, met inbegrip van latent geïnfecteerde cellen.
Het aantal oppervlakte eiwitten geanalyseerd wordt gedicteerd door het vermogen van de stroom cytometrische cel sorteerder. Huidige verkrijgbare instrumenten overschrijden 30 parameters niet. Toekomstige studies met meer geavanceerde stroom cytometry zal verder verbreden het eiwit profilering vermogen van deze aanpak. Het aantal afschriften kan ook worden uitgebreid buiten 96, verstrekt ondersteunende reagentia (bijvoorbeeld, inleidingen van hogere concentratie), apparatuur en instrumentatie. Uiteindelijk, nieuwe eencellige technologieën die analyse van Proteoom (massaspectrometrie) combineren, transcriptome (RNAseq) en genoom (DNAseq) vervangt de gerichte benaderingen voor discovery onderzoek31,37, 38 , 39. gerichte qPCR zal waarschijnlijk blijven echter een waardevol instrument voor de validatie van een dergelijke "omics"-aanpak als een gouden standaard voor kwantitatieve expressie analyses.
Gecombineerde eiwit en transcriptie analyse per tSCEPTRE is een krachtig hulpmiddel voor het onderzoeken van zeldzame of moeilijk te identificeren cellen zoals die ziektekiemen herbergen, bevattende oncogenen of anders exposeren een afwijkende fenotype. Nieuwe tellers voor transcriptionally actieve SIV/HIV-geïnfecteerde cellen worden geïdentificeerd in deze manier, evenals de ontdekking van nieuwe mechanismen die betrokken zijn bij de pathogenese van deze virale infecties. Identificatie van latent geïnfecteerde cellen vergt verdere ontwikkeling van een protocol bij ezels viraal DNA geïntegreerd in het genoom van de gastheer. Van de nota is de frequentie van de HIV/SIV geïnfecteerde cellen aanzienlijk lager in chronische viremic of behandelde infectie, die een praktische uitdaging in studeren geïnfecteerde cellen afgeleid van deze instellingen zal presenteren. Onze benadering legt de basis voor de beoordeling van een eerder hardnekkige mechanisme: dat van post-transcriptional verordening op het niveau van eencellige, en heeft brede toepasbaarheid gastheer-pathogeen interacties evenals meer algemene cellulaire processen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Dit werk werd gesteund door een samenwerkingsovereenkomst (W81XWH-07-2-0067) tussen de Henry M. Jackson Foundation for the Advancement van militaire geneeskunde, Inc. en het Amerikaanse departement van defensie (DOD). De standpunten zijn die van de auteurs en mag niet worden uitgelegd te vertegenwoordigen de standpunten van het Amerikaanse leger of het ministerie van defensie. Onderzoek werd uitgevoerd onder een protocol van de goedgekeurde dierlijke gebruik in een AAALACi geaccrediteerde faciliteit met inachtneming van de Animal Welfare Act, federale statuten en andere voorschriften met betrekking tot dieren en experimenten waarbij dieren en houdt zich aan de beginselen vermeld in de gids voor de verzorging en het gebruik van proefdieren, NRC publicatie 2011 editie.
Acknowledgments
De auteurs bedank de NIAID VRC Stroom Cytometry kern en de MHRP Stroom Cytometry Core voorzieningen voor onderhoud en werking van FACS instrumenten en sorteermachines; Maria Montero, Vishakha Sharma, Kaimei Song voor deskundige technische bijstand; Michael Piatak, Jr. (overleden) voor hulp bij SIV ontwerp voor de bepaling van de qPCR; en Brandon Keele en Matthew Scarlotta voor SIV isoleren sequenties. De standpunten zijn die van de auteurs en mag niet worden uitgelegd te vertegenwoordigen de standpunten van het Amerikaanse leger of het ministerie van defensie. Onderzoek werd uitgevoerd onder een protocol van de goedgekeurde dierlijke gebruik in een AAALAC geaccrediteerde faciliteit met inachtneming van de Animal Welfare Act, federale statuten en andere voorschriften met betrekking tot dieren en experimenten waarbij dieren en houdt zich aan de beginselen vermeld in de gids voor de verzorging en het gebruik van proefdieren, NRC publicatie 2011 editie.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| RNA extraction and PCR reagents and consumables |
|||
| Genemate 96-Well Semi-Skirted PCR Plate |
BioExpress/VWR |
T-3060-1 |
|
| Adhesive PCR Plate Seals |
ThermoFisher |
AB0558 |
|
| Armadillo 384-well PCR Plate |
ThermoFisher |
AB2384 |
|
| MicroAmp Optical Adhesive Film |
Applied Biosystems/ThermoFisher |
4311971 |
|
| DEPC Water |
Quality Biological |
351-068-101 |
|
| Glass Distilled Water |
Teknova |
W3345 |
|
| Superscript III Platinum One-Step qRT-PCR Kit |
Invitrogen/ThermoFisher |
11732088 |
|
| SUPERase-In Rnase Inhibitor |
Invitrogen/ThermoFisher |
AM2696 |
|
| Platinum Taq |
Invitrogen/ThermoFisher |
10966034 |
|
| dNTP Mix |
Invitrogen/ThermoFisher |
18427088 |
|
| ROX Reference Dye (if separate from kit) |
Invitrogen/ThermoFisher |
12223012 |
|
| DNA Suspension Buffer |
Teknova |
T0223 |
|
| RNAqueous kit |
Invitrogen/ThermoFisher |
AM1931 |
|
| TaqMan gene expression assays not listed in Table 2 |
|||
| CD6 |
Applied Biosystems/ThermoFisher |
Hs00198752_m1 |
|
| TLR3 |
Applied Biosystems/ThermoFisher |
Hs1551078_m1 |
|
| Biomark reagents |
|||
| Control Line Fluid Kit |
Fluidigm |
89000021 |
|
| TaqMan Universal PCR Mix |
Applied Biosystems/ThermoFisher |
4304437 |
|
| Assay Loading Reagent |
Fluidigm |
85000736 |
|
| Sample Loading Reagent |
Fluidigm |
85000735 |
|
| Dynamic Array 96.96 (chip) |
Fluidigm |
BMK-M-96.96 |
|
| FACS reagents |
|||
| SPHERO COMPtrol Goat anti-mouse (lambda) |
Spherotech Inc. |
CMIgP-30-5H |
|
| CompBeads Anti-Mouse Ig,k |
BD Biosciences |
51-90-9001229 |
|
| 5 ml Polystyrene tube with strainer cap |
FALCON |
352235 |
|
| Aqua Live/Dead stain |
Invitrogen/ThermoFisher |
L34976 |
dilute 1:800 |
| Mouse Anti-Human CD3 BV650 clone SP34-2 |
BD Biosciences |
563916 |
dilute 1:40 |
| Mouse Anti-Human CD4 BV786 clone L200 |
BD Biosciences |
563914 |
dilute 1:20 |
| Mouse Anti-Human CD8 BUV496 clone RPA-T8 |
BD Biosciences |
564804 |
dilute 1:10 |
| Mouse Anti-Human CD28 BV711 clone CD28.2 |
Biolegend |
302948 |
dilute 1:20 |
| Mouse Anti-Human CD95 BUV737 clone DX2 |
BD Biosciences |
564710 |
dilute 1:10 |
| Mouse Anti-Human CD14 BV510 clone M5E2 |
Biolegend |
301842 |
dilute 1:83 |
| Mouse Anti-Human CD16 BV510 clone 3G8 |
Biolegend |
302048 |
dilute 1:167 |
| Mouse Anti-Human CD20 BV510 clone 2H7 |
Biolegend |
302340 |
dilute 1:37 |
| Anti-CD38-R PE clone OKT10 |
NHP reagent recource |
N/A |
dilute 1:100 |
| Mouse Anti-Human CD69 BUV395 clone FN50 |
BD Biosciences |
564364 |
dilute 1:10 |
| Mouse Anti-Human HLA-DR APC-H7 clone G46-6 |
BD Biosciences |
561358 |
dilute 1:20 |
| Mouse Anti-Human ICOS Alexa Fluor 700 clone C398.4A |
Biolegend |
313528 |
dilute 1:80 |
| Instruments |
|||
| BioPrptect Containment Enclosure |
Baker |
||
| BD FACS Aria |
BD Biosciences |
||
| ProtoFlex Dual 96-well PCR system |
Applied Biosystems/ThermoFisher |
4484076 |
|
| Quant Studio 6 qPCR instrument |
Applied Biosystems/ThermoFisher |
4485694 |
|
| IFC controller HX |
Fluidigm |
IFC-HX |
|
| Biomark HD |
Fluidigm |
BMKHD-BMKHD |
References
- Macaulay, I. C., Ponting, C. P., Voet, T. Single-Cell Multiomics: Multiple Measurements from Single Cells. Trends Genet. 33 (2), 155-168 (2017).
- Pasternak, A. O., Lukashov, V. V., Berkhout, B. Cell-associated HIV RNA: a dynamic biomarker of viral persistence. Retrovirology. 10, 41 (2013).
- Mailler, E., et al. The Life-Cycle of the HIV-1 Gag-RNA Complex. Viruses. 8 (9), (2016).
- Varmus, H. Retroviruses. Science. 240 (4858), 1427-1435 (1988).
- Frankel, A. D., Young, J. A. HIV-1: fifteen proteins and an RNA. Annu Rev Biochem. 67, 1-25 (1998).
- Dominguez, M. H., et al. Highly multiplexed quantitation of gene expression on single cells. J Immunol Methods. 391 (1-2), 133-145 (2013).
- Tokarev, A., Guatelli, J. Misdirection of membrane trafficking by HIV-1 Vpu and Nef: Keys to viral virulence and persistence. Cell Logist. 1 (3), 90-102 (2011).
- Malim, M. H., Bieniasz, P. D. HIV Restriction Factors and Mechanisms of Evasion. Cold Spring Harb Perspect Med. 2 (5), a006940 (2012).
- Sugden, S. M., Bego, M. G., Pham, T. N., Cohen, E. A. Remodeling of the Host Cell Plasma Membrane by HIV-1 Nef and Vpu: A Strategy to Ensure Viral Fitness and Persistence. Viruses. 8 (3), 67 (2016).
- Simon, V., Bloch, N., Landau, N. R. Intrinsic host restrictions to HIV-1 and mechanisms of viral escape. Nat Immunol. 16 (6), 546-553 (2015).
- Kirchhoff, F. Immune evasion and counteraction of restriction factors by HIV-1 and other primate lentiviruses. Cell Host Microbe. 8 (1), 55-67 (2010).
- Wigzell, H. Immunopathogenesis of HIV infection. J Acquir Immune Defic Syndr. 1 (6), 559-565 (1988).
- Reynolds, M. R., et al. Ex vivo analysis of SIV-infected cells by flow cytometry. Cytometry A. 77 (11), 1059-1066 (2010).
- Baxter, A. E., et al. Single-Cell Characterization of Viral Translation-Competent Reservoirs in HIV-Infected Individuals. Cell Host Microbe. 20 (3), 368-380 (2016).
- Grau-Exposito, J., et al. A Novel Single-Cell FISH-Flow Assay Identifies Effector Memory CD4+ T cells as a Major Niche for HIV-1 Transcription in HIV-Infected Patients. MBio. 8 (4), (2017).
- Eriksson, S., et al. Comparative analysis of measures of viral reservoirs in HIV-1 eradication studies. PLoS Pathog. 9 (2), e1003174 (2013).
- Finzi, D., et al. Identification of a reservoir for HIV-1 in patients on highly active antiretroviral therapy. Science. 278 (5341), 1295-1300 (1997).
- Chomont, N., et al. HIV reservoir size and persistence are driven by T cell survival and homeostatic proliferation. Nat Med. 15 (8), 893-900 (2009).
- DeMaster, L. K., et al. A Subset of CD4/CD8 Double-Negative T Cells Expresses HIV Proteins in Patients on Antiretroviral Therapy. J Virol. 90 (5), 2165-2179 (2015).
- Bolton, D. L., et al. Combined single-cell quantitation of host and SIV genes and proteins ex vivo reveals host-pathogen interactions in individual cells. PLoS Pathog. 13 (6), e1006445 (2017).
- Quintans, J., Lefkovits, I. Precursor cells specific to sheep red cells in nude mice. Estimation of frequency in the microculture system. Eur J Immunol. 3 (7), 392-397 (1973).
- Finak, G., et al. MAST: a flexible statistical framework for assessing transcriptional changes and characterizing heterogeneity in single-cell RNA sequencing data. Genome Biol. 16, 278 (2015).
- McDavid, A., et al. Modeling bi-modality improves characterization of cell cycle on gene expression in single cells. PLoS Comput Biol. 10 (7), e1003696 (2014).
- McDavid, A., Finak, G., Gottardo, R. The contribution of cell cycle to heterogeneity in single-cell RNA-seq data. Nat Biotechnol. 34 (6), 591-593 (2016).
- Kok, Y. L., Ciuffi, A., Metzner, K. J. Unravelling HIV-1 Latency, One Cell at a Time. Trends Microbiol. , (2017).
- Rato, S., Golumbeanu, M., Telenti, A., Ciuffi, A. Exploring viral infection using single-cell sequencing. Virus Res. 239, 55-68 (2017).
- Wagner, A., Regev, A., Yosef, N. Revealing the vectors of cellular identity with single-cell genomics. Nat Biotechnol. 34 (11), 1145-1160 (2016).
- Nestorowa, S., et al. A single-cell resolution map of mouse hematopoietic stem and progenitor cell differentiation. Blood. 128 (8), e20-e31 (2016).
- Soh, K. T., et al. Simultaneous, Single-Cell Measurement of Messenger RNA, Cell Surface Proteins, and Intracellular Proteins. Curr Protoc Cytom. 75, 41-47 (2016).
- Kochan, J., Wawro, M., Kasza, A. Simultaneous detection of mRNA and protein in single cells using immunofluorescence-combined single-molecule RNA FISH. Biotechniques. 59 (4), 209-212 (2015).
- Stahlberg, A., Thomsen, C., Ruff, D., Aman, P. Quantitative PCR analysis of DNA, RNAs, and proteins in the same single cell. Clin Chem. 58 (12), 1682-1691 (2012).
- Assarsson, E., et al. Homogenous 96-plex PEA immunoassay exhibiting high sensitivity, specificity, and excellent scalability. PLoS One. 9 (4), e95192 (2014).
- Fredriksson, S., et al. Protein detection using proximity-dependent DNA ligation assays. Nat Biotechnol. 20 (5), 473-477 (2002).
- Genshaft, A. S., et al. targeted profiling of single-cell proteomes and transcriptomes in a single reaction. Genome Biol. 17 (1), 188 (2016).
- Mahnke, Y. D., Roederer, M. Optimizing a multicolor immunophenotyping assay. Clin Lab Med. 27 (3), 469-485 (2007).
- Liang, C., Hu, J., Russell, R. S., Kameoka, M., Wainberg, M. A. Spliced human immunodeficiency virus type 1 RNA is reverse transcribed into cDNA within infected cells. AIDS Res Hum Retroviruses. 20 (2), 203-211 (2004).
- Stegle, O., Teichmann, S. A., Marioni, J. C. Computational and analytical challenges in single-cell transcriptomics. Nat Rev Genet. 16 (3), 133-145 (2015).
- Wu, M., Singh, A. K. Single-cell protein analysis. Curr Opin Biotechnol. 23 (1), 83-88 (2012).
- Haque, A., Engel, J., Teichmann, S. A., Lonnberg, T. A practical guide to single-cell RNA-sequencing for biomedical research and clinical applications. Genome Med. 9 (1), 75 (2017).
