Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

Rask, skalerbar montering og lasting av bioaktive proteiner og Immunostimulants i ulike syntetisk Nanocarriers Via Flash Nanoprecipitation

Published: August 11, 2018 doi: 10.3791/57793
Automatic Translation
1, 1, 1,2
1Interdisciplinary Biological Sciences, Northwestern University, 2Department of Biomedical Engineering, Northwestern University

Summary

Nanomaterialer har allsidige mekanismer kontrollert terapeutiske leveringsdatoen for både grunnleggende vitenskap og translasjonsforskning programmer, men deres fabrikasjon ofte krever kompetanse som er tilgjengelig i de fleste biomedisinsk laboratorier. Her presenterer vi protokoller for skalerbare fabrikasjon og terapeutiske lasting av ulike selv montert nanocarriers bruker flash nanoprecipitation.

Abstract

Nanomaterialer presenterer en rekke alternativer for å tilpasse kontrollert levering av enkelt og kombinert molekylær nyttelast for terapeutisk og bildebehandling programmer. Denne økte spesifisitet kan ha klinisk inkludert redusert bivirkninger og lavere doser med sterkere. Videre kan i situ målretting og kontrollert modulering av bestemt celle delsett forbedre i vitro og i vivo undersøkelser av grunnleggende biologisk fenomen og undersøke celle-funksjonen. Dessverre har den nødvendige kompetanse i nanoskala vitenskap, kjemi og ingeniører ofte forbyr laboratorier uten erfaring i disse feltene fra fabrikasjon og tilpasse nanomaterialer som verktøy for sine undersøkelser eller kjøretøy for deres strategier. Her gir vi protokoller for syntese og skalerbar montering av et allsidig giftfri blokk copolymer system mottakelig for lettvinte dannelse og lasting av nanoskala biler for biomedisinsk programmer. Flash nanoprecipitation er presentert som en metode for rask fabrikasjon av ulike nanocarriers fra poly(ethylene glycol) -bl-poly (propylen sulfide) copolymers. Disse protokollene vil tillate laboratorier med et bredt spekter av kompetanse og ressurser til å enkelt og reproduserbar dikte avanserte nanocarrier leveringssystemer for programmer. Design og bygging av et automatisert instrument som sysselsetter en høyhastighets sprøytepumpe å lette flash nanoprecipitation prosessen og for å tillate forbedret kontroll over homogenitet, størrelse, morfologi og lasting av polymersome nanocarriers er beskrevet.

Introduction

Nanocarriers tillate kontrollert levering av små og macromolecular Last, inkludert aktive enheter som, hvis ikke innkapslet, ville være enten svært nedbrytbart og/eller for hydrofobe for administrasjon i vivo. Nanocarrier morphologies regelmessig fabrikkert, tilby polymere blemmer tilsvarende liposomer (også kalt polymersomes) muligheten til å samtidig laste hydrofile og hydrofobe Last1,2. Til tross for deres lovende fordeler er polymersomes fremdeles sjeldne i klinisk bruk skyldes, delvis, flere viktige utfordringer i sin produksjon. For klinisk bruk må polymersome formuleringer gjøres i store, sterile og konsekvent grupper.

En rekke teknikker kan brukes til skjemaet polymersomes fra en diblock kopolymer, som poly(ethylene glycol) -blokk-poly (propylen sulfide) (PEG -bl- PPS), som inkluderer løsemiddel spredning3, tynnfilm rehydrering1 , 4, microfluidics 5,6og direkte hydration7. Løsemiddel spredning innebærer lang incubation ganger i nærvær av organiske løsemidler, som kan denature noen bioaktive payloads, som proteiner. Tynnfilm rehydrering tilbyr ikke kontroll over polydispersity av det dannet polymersomes, ofte krever dyre og tidkrevende ekstrudering teknikker for å oppnå akseptabel monodispersity. Videre er både microfluids og direkte hydrering vanskelig å skalere opp større produksjonsvolumer. Av ulike nanocarrier fabrikasjon metoder tilbyr flash nanoprecipitation (FNP) muligheten til å gjøre store og reproduserbar formuleringer8,9,10. Mens FNP var tidligere reservert for utformingen av solid kjerner nanopartikler, vår lab har nylig utvidet bruk av FNP med konsekvent dannelsen av ulike PEG -bl- PPS nanostructure morphologies11, 12, inkludert polymersomes11 og bicontinuous nanospheres12. Vi fant at FNP var stand til å danne monodisperse formuleringer av polymersomes uten behov for ekstrudering, noe som resulterer i overlegen polydispersity indeksverdier sammenlignet med ikke-ekstruderte polymersomes dannet av tynnfilm rehydrering og løsemiddel dispersjon 11. Bicontinuous nanospheres, med sine store hydrofobe domener, klarte ikke å være dannet av tynnfilm rehydration, til tross for danner under en rekke løsemiddel forhold med FNP12.

Her vil vi gi en detaljert beskrivelse for syntese av PEG -bl- PPS diblock copolymer brukes i polymersome-formasjonen, trange impingement jetfly (CIJ) blandebatteri brukes for FNP, FNP protokollen selv, og gjennomføringen av et automatisert system for å redusere bruker variasjon. Inkludert er informasjon om hvordan sterilize systemet tilstrekkelig for å produsere endotoxin-fri formuleringer for bruk i vivoog representant data om karakterisering av polymersomes dannet av FNP. Med denne informasjonen, vil leserne med interesse i å utnytte polymersomes for i vitro og vivo arbeid kunne dikte egne steril, monodisperse formuleringer. Lesere med erfaring i nanocarrier formuleringer og polymer syntese kompetanse vil kunne raskt teste sine egne polymer systemer bruker FNP som et potensielt alternativ til deres nåværende formulering teknikker. Protokollene beskrevet her kan i tillegg brukes som pedagogisk verktøy for utformingen av nanocarriers i nanoteknologi laboratorium kurs.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. syntese av Poly(ethylene glycol) -blokk-poly (propylen sulfide)-Thiol

  1. Syntetisere metoksy-poly(ethylene glycol) mesylate (Mn: 750) (MeO-pinne17- MULTIPLE SCLEROSIS, jeg).
    1. Oppløse 10 g MeO-pinne17-OH i 200 mL av toluen 100% innen en 3-hals runde bunnen kolbe (RBF) under magnetiske omrøring på 600 rpm.
    2. 3-hals RBF tilkobles en Dean-Stark apparater, selv knyttet til en kondensator, holde hele systemet under dekkgass nitrogen eller argon.
    3. Sett 3-hals RBF i et bad av olje, varme til 165 ° C under omrøring på 600 rpm.
    4. Fjerne spor vann og 100 mL av toluen bruker azeotropic destillasjon.
    5. Fjern 3-hals RBF fra olje, koble Dean-Stark apparatet mens inert gass forhold og la den avkjøles til romtemperatur.
    6. Legge til 5,6 mL av 100% triethylamine (3 molar eq.) og 300 mL vannfri 100% toluen MeO-pinne17-OH løsning under omrøring på 600 rpm.
    7. Flytte 3-hals RBF til en isbadet, opprettholde omrøring på 600 rpm og inertgass forhold.
    8. Fortynne 3.1 mL av 100% methanesulfonyl klorid (3 molar eq.) i 30 mL av 100% toluen, sakte legge til 3-hals RBF via en tillegg trakt stirring på 600 rpm.
    9. Rør over natten på 600 rpm ved romtemperatur under inert forhold.
    10. Filteret løsning gjennom en Buchner trakt fullpakket med kiselgur (se Tabell for materiale) fjerne salter.
    11. Fjerne toluen via en roterende fordamperen med vannbad satt til 40 ° C, rotasjon på 120 rpm og press satt til mellom 50-100 millibar.
    12. Nytt oppløse produktet i 200 mL 100% diklormetan (DCM) og filtrere gjennom en Buchner trakt fullpakket med kiselgur (se Tabell for materiale).
    13. Fjerne DCM via en roterende fordamperen med vannbad satt til 40 ° C, rotasjon på 120 rpm og press satt til mellom 450-600 millibar.
    14. Sparsomt å oppløse produktet i 100% DCM og sakte føre produktet ved å legge den dropwise (via Pasteur pipette) til 500 mL iskald 100% diethyl Ether. Opprettholde omrøring på 300 rpm.
    15. Dekanter eller Sug opp for å fjerne diethyl Eter fra utfelt produkt, MeO-pinne17- Mesylate, og store overnatting i vakuum desiccator tørke helt.
    16. Bruke produktet umiddelbart, eller lagre under inert gass på 20 ° C i flere måneder.
  2. Syntetisere metoksy-poly(ethylene glycol) thioacetate (MeO-pinne17-TA, II).
    1. Oppløse 5 g av MeO-pinne17-Ms (I) i 200 mL 100% vannfri vannistedenfor (DMF) i en 3-hals RBF, rør på 600 rpm ved romtemperatur under inert gass.
    2. Legge til 2.5 g 100% kalium karbonat (3 molar eq.) røring løsning.
      Merk: kalium karbonat vil ikke helt løses i løsningen.
    3. Fortynne 1.3 mL av 100% thioacetic acid (3 molar eq.) i 100 mL 100% vannfri DMF, og legge dropwise til løsning via en tillegg trakt.
      Merk: Thioacetic syre har en sterk, mishager lukt. Hensyn må tas å holde alle skitne objekter i den kjemiske avtrekksvifte natten før disposisjon eller rengjøring.
    4. Røre kraftig (rpm 600 eller høyere) over natten i romtemperatur.
      Merk: Salt formasjonen kan lett forstyrre omrøring av denne løsningen. Hensyn må tas å opprettholde røring over natten.
    5. Filteret løsning gjennom en Buchner trakt fullpakket med kiselgur (se Tabell for materiale).
    6. Fjerne DMF via en roterende fordamperen med vannbad satt til 60 ° C, rotasjon på 120 rpm og press satt til mellom 5-15 millibar.
    7. Oppløse produktet i 100 mL 100% tetrahydrofuran (THF) og legge til en kolonne fullpakket med nøytral alumina fjerne rød/oransje fargede urenheter.
    8. Fjerne THF via en roterende fordamperen med vannbad satt til 40 ° C, rotasjon på 120 rpm og press satt til mellom 200-300 millibar.
    9. Sparsomt oppløse nytt produkt i 100% DCM. Hvis en salt bunnfall former, filter løsning gjennom 6 μm pore størrelse filter papir med Buchner trakt.
    10. Sakte utløse produktet ved å legge dropwise via Pasteur Pipetter til 500 mL iskald 100% diethyl Eter, røring på 300 rpm. Diethyl Eter måtte bli ytterligere kjølt til-20 ° C i en eksplosjonssikre fryser i flere timer hvis bunnfall ikke does sammenbruddet av løsningen på 4 ° C.
    11. Dekanter eller Sug opp for å fjerne diethyl Eter fra utfelt produkt, MeO-PEG17-Thioacetate. Lagre produkt over natten i et vakuum desiccator, og senere under inert gass på 20 ° C.
  3. Syntetisere diblock copolymer poly(ethylene glycol) -block -poly(propylene sulfide)-thiol (PEG17-bl- PPS35-SH, III).
    1. Oppløse MeO-pinne17-TA (II) i 10 mL av 100% vannfri DMF innenfor en Schlenk kolbe under argon, stirring på 400 rpm i et vannbad romtemperatur.
    2. Legg 1.1 molar eq i natrium methoxide (0,5 M løsning i metanol), tillate for å røre på 400 rpm i 5 minutter.
    3. Legge til 35 molar eq i 100% propylen sulfide, raskt, løsning. Tillat for å røre på 400 rpm i 10 minutter.
    4. Legge til 10 molar eq 100% iseddik, la rør på 400 rpm i 5 minutter.
    5. Fjerne DMF via en roterende fordamperen med vannbad satt til 60 ° C, rotasjon på 120 rpm og press satt til mellom 5-15 millibar.
    6. Nytt oppløse produktet sparsomt på 100% DCM, utløse i 80 mL av 100% metanol, delt mellom to 50 mL konisk sentrifuge rør.
    7. Sentrifuger konisk rør 7500 x g i 5 minutter ved 4 ° C. Sug opp bort nedbryting.
    8. Store produktet, PEG17-bl- PPS35-SH, overnatting i et vakuum desiccator, og senere under inert gass på 20 ° C.

2. montere PEG -bl -PPS Nanocarriers via Hand-Powered Flash Nanoprecipitation

  1. (Valgfritt) Sterilisere trange impingement jetfly (CIJ) blandebatteri.
    1. I en biologisk sikkerhet regjering (BSC), Senk blandebatteri med alle deler demontert i 0.1 M NaOH over natten.
    2. Montere CIJ mikser og strømme gjennom endotoxin-fritt vann med engangssprøyter med luer-lock.
    3. Test pH i vannet, og fortsetter å flyte vann gjennom til pH registre som nøytrale.
  2. Oppløse PEG17-bl- PPS35-SH polymer og hydrofobe Last i THF (impingement løsning 1).
    1. Veie 20 mg av PEG17-bl- PPS35-SH i en 1,5 mL tube.
    2. Legge til hydrofobe fargestoffer (f.eksDiI, ICG) narkotika (f.eksrapamycin) eller andre Last.
      Merk: Last kan være tørt eller oppløst i en vann-blandbar løsemiddel, fortrinnsvis THF. Hvis lasten er uløselig i THF eller DMF, kan en vann-blandbar løsemiddel brukes, men sparingly, polymer er neppe være vannløselig. Last som kan lastes er avhengig av egenskapene Last seg (f.eks Molekylvekten, hydrophobicity, steric hensyn), og bør utforskes på et sak-til-sak grunnlag11,12.
    3. Legge til 500 µL av 100% THF polymer og Last, vortex kraftig å oppløse.
  3. Oppløse hydrofile Last i vandig buffer (impingement løsning 2). For dette, løses hydrofile Last skal lastes inn i polymer blemmer i 500 µL av en vandig buffer (f.eks fosfat-bufret saltvann, rent vann, etc.) etter behov.
  4. Legge til buffer i reservoaret.
    1. Legg 2,5 mL av en vandig buffer valgfrihet (f.eks 1 x fosfat bufret saltvann) til en passende størrelse reservoaret (f.eks en 20 mL scintillation hetteglass). Plasser reservoaret under CIJ mikser slik at strøm fra blandebatteri går direkte inn i reservoaret.
  5. Legg impingement løsninger i separate 1 mL plast engangssprøyter.
  6. Impinge løsninger mot hverandre for å danne nanostrukturer og laste dem med nyttelast samtidig.
    1. Sprøyter inn Luer-lock-kort på toppen av CIJ blandebatteri.
    2. I en enkelt, glatte og rask bevegelse, trykker du begge sprøyter og samtidig med like stor kraft.
      Merk: Hvis utfører flere sekvensielle impingements, først samle utløp i et tomt reservoar.
    3. (Valgfritt) Utføre flere impingements. Delt begynnende nanostructure løsning mellom to sprøyter, og gjenta trinn 2.6.1-2.6.2 opptil 4 ganger.
    4. Samle utløp i vandig buffer-fylt reservoaret i 2.4.1 og forsiktig røre slik miksing.
  7. Fjern losset Last og organiske løsemidler.
    1. (Alternativ 1) Dialyze nanocarrier formulering i samme vandig bufferen for impingement og i reservoaret rør av en passende MW cutoff i minst 24 timer med minst 2 buffer endringer. Dette kan utføres ved romtemperatur.
      Merk: Nanocarriers vil beholdes av rør med en MW cutoff < 100.000 kDa og kan potensielt beholdes av høyere konsentrasjon også. Dette alternativet bevarer sterilitet når utført i en BSC bruker sterilt buffer.
    2. (Alternativ 2) Filtrere formulering gjennom en størrelse utelukkelse eller avsalte/buffer exchange kolonne (f.eks Sepharose 6B kolonne) med 1 x PBS som vandig bufferen.
      Merk: Dette alternativet bevarer sterilitet når utført i en BSC-maskin med en kolonne som har blitt grundig sterilisert.
    3. (Alternativ 3) Fjerne flyktige organiske løsemidler bruker vakuum uttørking over natten.
    4. (Alternativ 4) Filtrere formulering med en tangentiell flyt filtreringssystem bruker et 50-100 kDa filter på en 20-60 mL/min flow rate i 15 minutter til 1 time, avhengig av molekylvekt av unencapsulated lasten blir renset unna (større Last vil ta lengre tid).
  8. (Valgfritt) Konsentrere seg nanocarrier formulering.
    1. (Alternativ 1) Konsentrere seg med en spinn konsentrator system (f.eks spinn kolonne med MW cutoff > 100.000), brukt som beskrevet av produsenten.
      Merk: Nanocarriers må være resuspended mellom spinnene og kan kreve flere spinn å konsentrere seg ned ønskede volumet. Spin konsentrasjon kan redusere sterilitet nanocarrier formuleringer.
    2. (Alternativ 2) Redusere volumet ved hjelp av vakuum uttørking.
      Merk: Volum endringen er vanskelig å kontrollere under disse forholdene, og må være forsiktig å opprettholde osmolaritet før og etter konsentrasjon.
  9. Lagre nanocarriers på 4 ° C for uker til måneder. Før bruk etter lagring, kort vortex nanocarrier formuleringer.

3. karakterisere Nanocarrier formuleringer

  1. Måle lasting effektivitet
    1. Hvis lasten er fluorescerende eller absorberer sterkt på en bestemt bølgelengde utenfor 260-450 nm, måle fluorescens/absorbansen ved hjelp av et fluorimeter/spektrofotometer.
      Merk: Pinne -bl- PPS absorberer sterkt fra 260-310 nm og polymersome formuleringer absorbere fra 310-450 nm, som kan komplisere kvantifisering av Last som absorberer på en lignende bølgelengde.
    2. Hvis Last absorberer innen 260-450 nm og hydrofile, forstyrre PEG -bl- PPS nanostrukturer ved å legge 25 μL utformingen til en like volum 1% H2O2 eller 1% Triton X-100 og deretter skille og skille Last fra polymer absorbansen via høy ytelse flytende kromatografi (HPLC) bruker en størrelse utelukkelse kolonne kompatibel med vandig buffere (f.eks en Sepharose 6B kolonne) 11.
    3. Hvis Last absorberer innen 260-450 nm og løselig i THF eller DMF, lyophilize utformingen av fryser 100 μL i et 1,5 mL plastrør ved-80 ° C over natten. Deretter sett røret i en glassbeholder vakuum og sted på en lyophilizer. Tillat 24 timer for lyophilization og senere re løses i 50 μL av DMF eller THF før separasjon og oppdagelsen via HPLC.
  2. Måle nanocarrier størrelse og morfologi
    1. Bruk dynamisk lysspredning (DLS)11 eller hydrogenion sporing analyse13 til å måle nanocarrier størrelse.
      Merk: Nanocarriers dannet fra PEG17-bl- PPS35-SH er forventet å ha en gjennomsnittlig diameter mellom 100-200 nm, med en polydispersity indeks < 0,3.
    2. Bestemme nanocarrier morfologi bruk kryogene overføring elektronmikroskop (cryoTEM)14.
      Merk: Nanocarriers dannet fra PEG17-bl- PPS35-SH er forventet å være polymer blemmer (polymersomes) med en klart synlig polymere membranen og i stor grad sfærisk form.
  3. (Valgfritt) Teste formuleringer for endotoxin
    1. (Alternativ 1) Bruke en cellebasert analysen for tilstedeværelse av endotoxin, f.eks rå blå celler eller HEK blå TLR4 celler (se Tabell for materiale), som beskrevet av produsenten, enten et kvantitativt eller kvalitativt analysen for lipopolysaccharides (LPS)13 .
    2. (Alternativ 2) Bruk en Limulus Amebocyte Lysate (LAL)15 analysen kit, som beskrevet av produsenten.

4. fabrikasjon av et høyhastighets Sprøytepumpe for FNP

  1. Dikte tilpasset Maskinkomponenter.
    Merk: 3D modeller for maskinering alle tilpassede deler er gitt i supplerende materiale.
    1. Maskinen flerlags instrument chassis fra ¾" akryl ark og montere (se Utfyllende filer 1-5).
      Merk: Akryl har dårlig kjemisk motstand. Hvis apparatet brukes med sterke løsemidler, maskin basen fra en metall anses egnet for programmet.
    2. 3D ut deler med trykt med polylactide (PLA) plast.
      1. Skrive ut sprøyten utvisning (SE) 2-part apparatet: SE del 1 - bak FNP blokk holder vogn (figur 5F, grå del; Supplerende filen 6) og en del 2 - Front utvisning guide (figur 5F, svarte delen; Supplerende filen 7). Se utfyllende fil 2 for skjemaer.
      2. Skrive ut infrarødsensor klammeparentesene (figur 5I, svarte bokser; Supplerende filer 8 og 9).
      3. (Valgfritt) Skrive ut to sprøyte stempelet spenne.
  2. Fest instrument kabinett lag med M5 hex bolter og legge gummiføtter til basen.
  3. Konfigurere datamaskinen enkelt bord med Raspbian GNU/Linux 8.0 (Jessie) operativsystemet (basert på Linux Debian).
    Merk: Programvaren til å drive maskinen er tilgjengelig på forespørsel. Instrumentet programvare kildekoden tilgjengelig på forespørsel. Ved mottak zippet fil, laster du ned alle avhengigheter angitt i viktig-filen. Denne programvaren inneholder et enkelt grafisk brukergrensesnitt som gir kontroll over instrument operasjon, inkludert grunnleggende kjøre parametere (motor hastighet, retning, osv.). Brukere oppfordres til å utvide den eksisterende kildekoden og egendefinerte programmoduler skreddersydd for bruk i egne eksperimenter. All programvare ble skrevet med Python 2.7.12 og er ikke kompatibelt med Python 3. RPi, PicoBorgRev, kivy og multiprocessing moduler benyttes. Viktig-filen inneholder detaljert informasjon om distribusjon programvarelisensen.
  4. Installere en 24 V børstet DC motor (figur 5A) og presisjon lysbildet (4,5"(114.3 mm) slag, 1.27 mm-skruen føre) (figur 5C).
    Note 24 V DC motor brukt her har en RPMmax, jegMaks, og full-Beregnigner dreiemoment på 4,252 RPM, 4.83 A, og ~0.2 N * m, henholdsvis.
    1. (Valgfritt) Sett polstring under motoren for å dempe vibrasjoner under bruk.
      Merk: Det anbefales at en 2-3 mm tykk gummi pad er kuttet slik at de passer motor befordring av instrumentet base.
    2. Montere presisjon lysbildet til instrumentet basen.
      1. Fjerne den gjenget stangen midlertidig.
      2. Montere lysbilde med to #8-32 flate maskin skruer.
    3. Mount DC motor til presisjon lysbilde ved hjelp av skruen strålen kopling (1-1/4" lengde) som inneholder 6/16" og 1/4" diameter kjeder.
      Merk: Avhengig av tykkelsen av akryl til maskinen instrument base lag, mellomlegg kan være nødvendig nivå motor og presis slide sjakter.
  5. Samle utvisning plattform fra metallplater og L-formet hjørnet seler (figur 5 d). Montere basismetallet plattform å skyve plattform (festet til gjenget stang) bruker #6-32 skruene. Se presisjon lysbildet skjematisk levert av produsenten for detaljer om montering begrensninger.
  6. Monter sprøyten utvisning systemoppsettet.
    1. Fest lineær bevegelse pute blokker (montering plattformer + lineær bevegelse peiling) på M8 rustfritt rustfritt stål rails (parallell stål skinnene kan lett observeres i figur 5).
    2. Tråden skinner gjennom lineær aksel guide/støtte og lås skinner. Bruk tre guidene jernbanen. Mount SE del 1 og 2 på pute blokker bruker M4 maskin skruene.
    3. Løst delta SE del 1 og 2 med M8 hex bolter. Konfigurere avstanden mellom SE del 1 og 2 med spiralformede komprimering fjærer dekker hver bolt som er sikret mellom to innover mot nylon foringer (se figur 5F). Monter disse foringer på utsiden av en del 1 og SE del 2.
  7. Wire krets (se figur 6 core koblingsskjemaet)
    1. Koble motor kontrolleren til I2C/SDA, 3,3 V og GND pins på enkelt styre datamaskinen.
    2. Koble DC motor terminaler til M- og M + blokker av motor kontrollerkortet. Koble 24 V, 2,5 A strømforsyning (figur 5B) til V + og GND blokker av motor kontrolleren (kontrolleren er innkapslet i en enkelt elektronikk i den endelige utformingen, se figur 5 H).
    3. Koble 3V3 og 5V pinnene styrets motorstyring til respektive pinnene på enkelt styre datamaskinen. Koble SDA og SCL pins av motor kontrolleren til pinnene 3 og 5 av enkelt styre datamaskinen, henholdsvis.
      Merk: Kommandoene sendes til den DC motoren fra enkelt styre datamaskinen via en motor kontroller. Motorhastighet styres av regulerer spenningen over motor terminalene via pulse width moduleringshjul. I dette oppsettet, den maksimale gjeldende kjører gjennom 24 V DC motor (full-Beregnigner strømstyrke: 4.83 A) er begrenset å 2.5 et 24 V strømforsyningen. Det anbefales at motor kretsen er kablet gjennom et normalt stengt (NC) Nødstopp (figur 5J). Dermed gir et middel til å forstyrre motor krets for å aktivere en grunnleggende nødavstengning operasjon.
    4. Koble foran og bak infrared nærhet sensor (digital avstand sensorer, figur 5I) til RPi GPIO pinner 24 og 23, henholdsvis.
      1. Ruten sensor ledninger igjennom oppførsel i instrumentet basen.
        Merk: IR sensorer er ikke-kontakt pause-beam bevegelsesdetektorer med en rekkevidde på 2-10 cm.
      2. 4.7.4.2 snapper kablet IR sensorer i 3D-trykt infrarødsensor klammeparenteser (figur 5I, svarte bokser) og montere på instrumentet bunnen. Når riktig satt i spenne, bør sensor ansiktet stikker ut fra den 14 x 7 mm rektangulære åpningen spenne.
        Merk: disse sensor klammeparenteser kan midlertidig montert med Velcro eller lim (montering er nyttig å riktig justere og optimalisere IR sensor plassering). Alternativt, montere permanent ved boring liten guide hull i instrumentet base og sikre klammeparentesene med M2 skruer.
    5. Koble en 7" touchscreen LCD display til 5V, GND, og vise serielt grensesnitt (DSI) pins enkelt styre datamaskinen. De 7" RPi og LCD-displayet montering er vist i figur 5G.

5. utvikle Polymersomes via FNP med skreddersydde høyhastighets sprøytepumpen

  1. (Alternativ 1) Bruke automatisk kjøre.
    1. Velg Auto Run fra hovedmenyen. Systemet vil be brukerne tillate motoren å automatisk plassere sprøyte utvisning plattformen til begynnelsen av presisjon lysbildet. Kontroller at banen foran og bak metallplaten er klart før du fortsetter.
    2. Last 1 mL plast sprøyter som beskrevet i delen 2.5 og mount sprøyter på Luer-hunnkontakter av CIJ blandebatteri. Laste CIJ blandebatteri (med sprøyter festet) i rektangulære åpningen av bakre utvisning transport (se figur 5E).
    3. Angi ønsket motor hastighet (enheter: rpm) ved å bruke glidebryteren i GUI (se merknaden nedenfor for viktig informasjon). Den optimale motorhastighet vil avhenge av bestemte pumpen og oppsett men må sikre en strømningshastighet på minst 1 mL/s for CIJ blandebatteri kanal dimensjonene her.
      Merk: Vurdere følgende innstilling strømningshastighet. Loddrett hånd-opererte FNP konfigurasjonen, reaktantene er utvist fra sprøyter med en hastighet på ~ 1 mL/s, men kan være svært variabel når hånden drevet. Dette er bare infusjonshastigheten gjennom sprøytesylinderen, som kontrolleres av frekvensen som brukeren fremskritt sprøytestempelet. Merk at 1 mL/s er ikke refererer til infusjonshastigheten exit fra mindre diameter munnstykket. På ovenfor angitt kanal dimensjoner, ~ 1 mL/s bør opprettholdes for å sikre en passende Reynold nummer for turbulente blande10. Forskjellige strømningshastigheter kan brukes så lenge kanalen diameter er justert tilsvarende for å opprettholde en Reynold tall som støtter turbulent forhold. Sprøyte stempler er avanserte av en vinkelrett metallplate som beveger seg langs en høy presisjon aluminium lysbildet kombinert til 24 V børstet DC motor. I denne konfigurasjonen maksimal fat infusjonshastigheten er påvirket av en rekke faktorer, inkludert (1) motor maksimumshastigheten (4,252 rpm) og skruen ledelsen til presisjon lysbildet (1.27 mm) er koblet til motoren aksel (2) dreiemomentet fra motoren (~0.2 N * m av full-l OAD dreiemoment), som er nødvendig for å overvinne motstand mot flyt (3) mottrykk bidrag fra væske inn i og avslutte CIJ blandebatteri, og (4) styrke sprøyter brukes (brukere bør være oppmerksom på kreftene som virker på sprøyter og bruker sprøyter passende styrke). Når det gjelder punkt (2), ved å øke flyten er hastighet nok dreiemoment nødvendig for å unngå stoppet motoren samtidig jevn utvisning under økende mottrykk. Fat strømningshastigheter-å illustrere fat flyten vurdere at nevnte systemet kan oppnå, tilfellet der FNP utføres ved hjelp av reaktantene lastet inn i to én-milliliter sprøyter. For å oppnå en 1 mL/s flyt må hastighet gjennom fat, motoren forhånd metallplaten avstand definert av stempelet lengden (~ 68 mm for en typisk en mL sprøyte) i ett sekund. Forutsatt 1.27 mm skruen ledelsen presisjon lysbildet, det følger at en DC motor opererer på 4,252 rpm er i stand til å fremme plattformen til ~ 90 mm/s (71 rev/s * 1.27 mm/rev). Dette tilsvarer en fat flow rate av ~1.3 mL/s, som overstiger 1 mL/s målet prisen.
    4. Før du kjører maskinen, sjekk systemet å sikre at banen til plattformen er klar av hindringer, og at de forside og bak IR nærhet detektorer er klar av hindringer (IR sensorer er de små, svarte boksene nær presisjon lysbildet terminaler; se figur 5I). Kontroller også at kapillær slangen uttaket fra CIJ blandebatteri rutes i en passende samling beholder (ex: glass beaker, etc.).
    5. For å slippe ut reaktantene fra sprøyter og inn i CIJ-mikseren, trykk kjøre i programvaregrensesnittet.
  2. (Alternativ 2) Bruk manuell kjøremodus. Se Kjøre automodus retningene over og Merk følgende endring for å gå 5.1.5: Trykk på frem-knappen trykkes kontinuerlig til ferdigstillelse av kjøringen (dvs. plattformen fremskritt svar på trykk hendelse, og motoren vil stoppe svar på-release hendelse).
  3. (Alternativ 3) Bruke manuell plattform posisjonering modus; Denne modusen lar brukere å posisjonere plattformen ved å kjøre motoren ved lav hastighet (20% strøm) svar på knappene revers på port.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Her har vi presentert en enkel protokoll for utformingen av nanocarriers i stand til å laste hydrofile og hydrofobe Last som er trygge for i vivo musen og ikke-menneskelige primas administrasjon11,13. Vi har også inkludert en detaljert protokoll for syntese av polymer brukes i vår representant resultater, sammen med en beskrivelse til fabrikasjon av et egendefinert instrument for mekanisk-kontrollerte impingement løsninger i CIJ mikseren. Figur 1 gir en oversikt over syntese trinnene utføres for å produsere PEG17-bl- PPS35-SH, diblock copolymer brukes selv sette sammen polymersome nanocarriers. En oversikt over FNP protokollen for montering av PEG-bl-PPS polymersomes lastet med legemiddelselskap og/eller bildebehandling agenter er diagramed i figur 2. Polymer var impinged i en CIJ blandebatteri (skjematisk vist i figur 3a, opprinnelig beskrevet i 10) for å danne monodisperse polymersomes som samlet morfologi, som kan være godkjent av dynamiske lys spredning (DLS) og kryogene overføring elektronmikroskop (cryoTEM) (figur 3b-3 c). Polymersomes dannet av FNP blir mindre (figur 3d) og flere monodisperse (figur 3e) med påfølgende impingements, og kan være lastet med hydrofile og hydrofobe Last (f.eks gjorde lipofile fargestoff, små molekyl Therapeutics, protein osv; Figur 4a). Nanocarriers dannet under sterilt forholdene beskrevet ovenfor er endotoxin gratis ved både rå blå og LAL endotoxin analyser og dermed egnet for en rekke i vitro og vivo programmer (figur 4b, data ikke vist).

Til slutt, vi har designet og bygget et instrument mekanisk-kontroll flow rate og resulterende impingement løsninger i CIJ blandebatteri (figur 5). Etableringen av dette instrumentet er viktig, som kommersielt tilgjengelig sprøyte pumper ikke kan oppnå strømningshastigheter nødvendig for FNP. Med unntak av modifiseringer har kommersielt tilgjengelig sprøyte pumper fart begrensningene ved bruk av lav hastighet stepper motors, som er utformet for pålitelig dispensere væske i en langsom og jevn måte. I våre instrument styres reactant utvisning av en presisjon lysbildet under kontroll av en 24 V børstet DC motor, som kan oppnå mye større hastigheter (4,252 rpm) enn treg stepper motors funnet i kommersielle sprøyte pumper. Tilpasset programvare kjører på en enkelt maskinen brukes til å operere maskinen (figur 6). 2D-tegninger har fått i tillegg til 3D-modeller av deler. Alle tegninger og modeller ble opprettet i FreeCAD (åpen kildekode parametrisk 3D CAD modellering programvare) å sikre at de er svært tilgjengelig å forskningen fellesskapet. Programvaren til å drive instrumentet ble skrevet i Python 2.7.12, slik at for rask utvikling av egendefinerte FNP prosedyrer å sikre congruous produksjonen av nanocarriers (størrelse, morfologi, osv.). Programvaren til å drive maskinen vil bli gjort tilgjengelig på forespørsel. Brukere bør være oppmerksom på at programvaren ikke er kompatibelt med Python 3; Imidlertid kan dette endres i fremtidige oppdateringer. Ved å kontrollere reactant utvisning rate, eliminerer dette instrumentet variabelen av menneskelig feil fra hånd-operasjon.

Figure 1
Figur 1. Syntese skjema for syntese av PEG17- bl-PPS36-SH. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 2
Figur 2. Produksjon av polymersomes via FNP i en hånd-drevet CIJ blandebatteri. For dannelsen av polymersomes bruker FNP. PEG-bl-PPS polymer er oppløst i organisk løsemiddel med hydrofobe Last og er impinged mot vandig løsemiddel med oppløst hydrofile Last. Rask blande skjer innen CIJ blandebatteri og middelklasseinnbyggere kan gjentatte ganger impinged eller lov til å fullføre formasjon gjennom fortynning i et reservoar vandig løsemiddel. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 3
Figur 3. Karakterisering av polymersomes dannet av FNP. (a) Design skjematisk av CIJ blandebatteri brukt i denne studien. Alle mål er i millimeter. (b) størrelse distribusjon av polymersomes dannet av FNP etter 1 til 5 impingements, målt ved DLS. n = 6 formuleringer, mener prøvene er grafisk. (c) eksempel cryoTEM bilder av polymersomes dannet etter 1 til 5 impingements gjennom CIJ blandebatteri, skalere bar = 100 nm. Diameter (d) og polydispersity indeks (e) av polymersomes dannet av FNP, målt ved DLS. Til sammenligning polymersomes dannet av tynnfilm rehydration, med (TF-E) eller uten (TF-NE) påfølgende ekstrudering, og dannet av løsemiddel spredning (SD) var også målt, n = 3, feilfelt representerer standardavvik. Subfigures (c)-(e) tatt med tillatelse fra Allen et al. 11. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 4
Figur 4. Laster inn effektivitet og endotoxin karakterisering. (a) lasting effektiviteten av små og makromolekyler innen polymersomes, n = 3, feilfelt representerer standardavvik. (b) rå blå LPS analysen av polymersomes dannet av sterile FNP, n = 6, feilfelt representerer standardavvik. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 5
Figur 5. Instrument for mekanisk kontroll av løsning impingement i CIJ mikseren. (a) 24 V børstet DC Motor. (b) strømforsyning (24 V, 2.5 et). (c) 4,5" slag presisjon lysbildet med 1.27 mm skruen bly (koblet til motorakselen av en skrue strålen kopling). (d) utvisning plattform konstruert av rektangulære metallplater og L-formet hjørnet seler. (e) CIJ blandebatteri. (f) utvisning vogn. (g) enkelt styre datamaskinen og 7" touchscreen. (h) mMotor kontrollen styret innkapslet i plast boliger (83 mm x 53 x 35 mm). (i) IR sensorer (ikke-kontakt pause-beam bevegelsesdetektorer). (j) Emergency stopp (NC). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 6
Figur 6. Kjernen koblingsskjemaet. De primære tilkoblingene mellom enkelt råd computer, motor kontrolleren og IR sensorer vises. LCD touchscreen tilkoblinger ikke vises her, som denne komponenten er uvesentlig (brukere kan velge å bruke en vanlig dataskjerm og mus i stedet). Merk at i vises konfigurasjonen, 24 V motor strømforsyningen og enkelt styre datamaskin strømforsyning er separat. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Vi gir detaljerte instruksjoner for rask fabrikasjon av polymersomes med PEG17-bl- PPS35-SH som diblock copolymer. Vesicula polymersomes er primære samlet morfologi samlet på dette forholdet hydrofile pinne og hydrofobe PPS blokk molekylvekt. Når impinged flere ganger, de har en diameter og polydispersity som tilsvarer polymersomes ekstrudert gjennom en 200 nm membran etter å ha blitt dannet via tynnfilm hydration. Denne protokollen dermed eliminerer behovet for ytterligere ekstrudering trinnene under fabrikasjon av monodisperse polymersome nanocarriers. Polymersomes dannet via FNP laste både hydrofile og hydrofobe lasten og vedlikeholde bioactivity av disse molekyler til formulering prosessen11. Ytterligere protokoller er beskrevet å sikre steriliteten når det er nødvendig, slik at dannelsen av polymersome formuleringer som er endotoxin-fri og derfor egnet for biokjemisk og immunologiske analyser samt sikker administrasjon i vivo . Hånd-opererte CIJ blandebatteri er enkel å sette opp og gir brukeren lette-av-bruk, men introduserer potensielle kvalitetskontroll problemer på grunn av brukeren variasjon. For å opprettholde flyten konsistens, ønsket vi å skape et instrument i stand til å oppnå og opprettholde reproduserbar en sammenlignbare flow rate. Viktigere på ovenfor angitt kanal dimensjoner, kommersielle sprøyte pumper kan ikke oppnå tilstrekkelig høy flow priser (~ 1 mL/s) på grunn av å være utstyrt med lav hastighet stepper motors. Å bekjempe denne utsendelse, og råd til større kontroll over infusjonshastigheten, ble fabrikasjon av et høyhastighets Sprøytepumpe for FNP beskrevet. Care ble tatt for å benytte åpen kildekode og lett tilpasses programvare for system OS og kode.

Kontroll over alternative strømningshastigheter tilbyr potensial til å finjustere nanocarrier formulering og gir muligheter til å utforske videre montering av ulike nanocarrier morphologies. Hvor Reynolds og tilsvarende blande tid ble tidligere vist å påvirke størrelsen på solid kjerner nanocarriers dannet via FNP9, men det er ikke klart hvilken innvirkning det ville ha på dannelsen av polymersomes. Dette er et tema av gjeldende undersøkelse, med gjeldende anbefalte rate 0,5 2 mL/s, med representative resultatene utføres på ca 1 mL/s. For å øke kontroll over infusjonshastigheten ytterligere, kan det være nødvendig å erstatte Linux-basert OS med sanntid kontroll over sprøyte pumpen motoren.

Bortsett fra justere infusjonshastigheten, finnes det flere måter denne FNP-protokollen kan endres til suite behov eller programmer. Mindre eller større mengder polymer kan brukes. Konsentrasjoner som lavt som 1 mg/mL og så høyt som 100 mg/mL har blitt brukt til å danne stabil nanocarriers. Større volumer kan brukes for impingement, men konsekvent bruk av press under hånd-drevet FNP er vanskeligere på volumer større enn 1 mL per sprøyten. Volumet av reservoaret kan også endres. Finalen organisk: vandig løsemiddel ratio større enn 1:3 kan resultere i ufullstendige dannelsen av nanocarriers, og som sådan bekymre burde være tatt å ikke redusere volumet av reservoaret uten å bekrefte dannelsen av nanocarriers. Aggregering kan oppstå når du forsøker å belaste høye konsentrasjoner av hydrofobe Last, som generelt kan lindres ved å øke molar forholdet av polymer: Last.

En ekstra emnet åpne for leting er ytterligere utvidelse av FNP polymersome formasjon med andre polymer systemer utenfor PEG -bl-PPS. Faktisk er andre systemer brukt tidligere i dannelsen av micelles og solid kjerner narkotika nanocarriers16,17. Det er imidlertid ikke klart om det er et sett av parametere som kan føre til dannelse av polymersomes via FNP bruker disse andre polymer-systemene. Gitt antall potensielle variabler å utforske, er det fullt mulig at andre polymerer kan danne polymersomes eller andre myke nanoarchitectures via FNP med justerte eksperimentelle parametere, for eksempel flyt, temperatur, løsemiddel utvalg og polymer konsentrasjon.

Som med alle formulering teknikker, det er begrensninger FNP og begrensninger som kan gjøre enkelte programmer uholdbar. Rask miksing krever at organisk og vandig løsemidlene er blandbar, som utelukker bruk av noen vanlige løsemidler brukes for oppløsningen av mange diblock copolymers, f.eks diklormetan og kloroform. Noen polymerer kan derfor bli gjengitt uforenlig med FNP hvis de ikke klarer å bli oppløst i en vann-blandbar organiske løsemidler. FNP protokollen beskrevet her benytter en 1:1 ratio av organisk til vandig solvent, noe som kan redusere aktiviteten av payloads følsomme for høye konsentrasjoner av organisk løsemiddel, som noen bioaktive proteiner. Det bør bemerkes at påvirkninger på bioactivity vil avhenge av protein, som vi tidligere har funnet minimal effekter den enzymatiske aktiviteten av alkalisk fosfatase etter lasting i polymersomes av FNP11. Flere innløp vortex blandebatterier18 er en dyrere, men mer passelig FNP-plattform som gir ytterligere kontroll over forholdet mellom organisk vandig løsningsmidler, tilbyr et allsidig alternativ til CIJ Blandere for disse sammenhenger.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne erklærer at de har ingen konkurrerende økonomiske interesser.

Acknowledgments

Erkjenner vi ansatte og instrumentering støtte fra strukturell biologi anlegget ved Northwestern University. Støtten fra det R.H. Lurie omfattende Cancer Center av Northwestern universitetet og Northwestern University strukturell biologi fasilitetene er anerkjent. Et K2 direkte elektron detektoren ble kjøpt med midler gitt av Chicago biomedisinsk Consortium med støtte fra Searle midlene på The Chicago samfunnet Trust. Vi takker også følgende fasiliteter ved Northwestern University: Keck tverrfaglig overflaten Science anlegget, strukturell biologi anlegget, biologiske Imaging anlegget, Center for avansert molekylær Imaging og Analytical Bionanotechnology utstyr kjerne. Denne forskningen ble støttet av National Science Foundation grant 1453576, nasjonale institutter for helse direktør nye innovatør Award 1DP2HL132390-01, Center for regenerativ Nanomedicine Catalyst Award og 2014 McCormick katalysator Award. SDA var støttes delvis av NIH predoctoral bioteknologi trening Grant T32GM008449.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
CanaKit Raspberry Pi 3 Ultimate Starter Kit - 32 GB Edition CanaKit UPC 682710991511
Linear Bearing Platform (Small) - 8mm Diameter Adafruit 1179
Linear Motion 8 mm Shaft, 330 mm Length, Chrome Plated, Case Hardened, Metric VXB kit11868
Linear Rail Shaft Guide/Support - 8 mm Diameter Adafruit 1182
Manual-Position Precision Slide 4.5" Stroke, 15 lb load capacity McMaster-Carr 5236A16
MTPM-P10-1JK43 Iron Horse DC motor Iron Horse MTPM-P10-1JK43
Official Raspberry Pi Foundation 7" Touchscreen LCD Display Raspberry Pi B0153R2A9I (ASIN)
PicoBorg Reverse - Advanced motor control for Raspberry Pi PiBorg BURN-0011
Pololu Carrier with Sharp GP2Y0D810Z0F Digital Distance Sensor 10cm Pololu 1134
Ruland PSR16-5-4-A Set Screw Beam Coupling, Polished Aluminum, Inch, 5/16" Bore A Diameter, 1/4" Bore B Diameter, 1" OD, 1-1/4" Length, 44 lb-in Nominal Torque Ruland PSR16-5-4-A
Polyethylene glycol monomethyl ether Sigma Aldrich 202495
Methanesulfonyl chloride Sigma Aldrich 471259
Toluene Sigma Aldrich 179418
Toluene, Anhydrous Sigma Aldrich 244511
Triethylamine Sigma Aldrich T0886
Celite 545 (Diatomaceous Earth) Sigma Aldrich 419931
Dichloromethane Sigma Aldrich 320269
Diethyl ether Sigma Aldrich 296082
N,N-Dimethylformamide, anhydrous Sigma Aldrich 227056
Potassium carbonate Sigma Aldrich 791776
Thioacetic acid Sigma Aldrich T30805
Tetrahydrofuran Sigma Aldrich 360589
Aluminum oxide, neutral, activated, Brockmann I Sigma Aldrich 199974
Sodium methoxide solution, 0.5 M in methanol Sigma Aldrich 403067
Propylene sulfide Sigma Aldrich P53209
Acetic acid Sigma Aldrich A6283
Methanol Sigma Aldrich 320390
Sodium hydroxide solution 1.0 N Sigma Aldrich S2770
Endotoxin-free water GE Healthcare Life Sciences SH30529.01
Paper pH strips Fisher Scientific 13-640-508
Endotoxin-free Dulbecco's PBS Sigma Aldrich TMS-012
Borosilicate glass scintillation vials Fisher Scientific 03-337-4
1 mL all-plastic syringe Thermo Scientific S75101
Sepharose CL-6B Sigma Aldrich CL6B200
Liquid chromatography column Sigma Aldrich C4169
CIJ mixer, HDPE Custom
Triton X-100 Sigma Aldrich X100
Hydrogen peroxide solution Sigma Aldrich 216763
HEK-Blue hTLR4 InvivoGen hkb-htlr4
RAW-Blue Cells InvivoGen raw-sp
QUANTI-Blue InvivoGen rep-qb1
PYROGENT Gel Clot LAL Assays Lonza N183-125

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Stano, A., Scott, E. A., Dane, K. Y., Swartz, M. A., Hubbell, J. A. Tunable T cell immunity towards a protein antigen using polymersomes vs. solid-core nanoparticles. Biomaterials. 34 (17), 4339-4346 (2013).
  2. Discher, B. M., et al. Polymersomes: tough vesicles made from diblock copolymers. Science. 284 (5417), 1143-1146 (1999).
  3. Vasdekis, A. E., Scott, E. A., O'Neil, C. P., Psaltis, D., Hubbell, J. A. Precision intracellular delivery based on optofluidic polymersome rupture. ACS Nano. 6 (9), 7850-7857 (2012).
  4. Yi, S., et al. Tailoring Nanostructure Morphology for Enhanced Targeting of Dendritic Cells in Atherosclerosis. ACS Nano. 10 (12), 11290-11303 (2016).
  5. Shum, H. C., Kim, J. W., Weitz, D. A. Microfluidic fabrication of monodisperse biocompatible and biodegradable polymersomes with controlled permeability. Journal of the American Chemical Society. 130 (29), 9543-9549 (2008).
  6. Pessi, J., et al. Microfluidics-assisted engineering of polymeric microcapsules with high encapsulation efficiency for protein drug delivery. International Journal of Pharmaceutics. 472 (1-2), 82-87 (2014).
  7. O'Neil, C. P., Suzuki, T., Demurtas, D., Finka, A., Hubbell, J. A. A novel method for the encapsulation of biomolecules into polymersomes via direct hydration. Langmuir. 25 (16), 9025-9029 (2009).
  8. Saad, W. S., Prud'homme, R. K. Principles of nanoparticle formation by flash nanoprecipitation. Nano Today. 11 (2), 212-227 (2016).
  9. Johnson, B. K., Prud'homme, R. K. Mechanism for rapid self-assembly of block copolymer nanoparticles. Physical Review Letters. 91 (11), 118302 (2003).
  10. Han, J., et al. A simple confined impingement jets mixer for flash nanoprecipitation. Journal of Pharmaceutical Sciences. 101 (10), 4018-4023 (2012).
  11. Allen, S., Osorio, O., Liu, Y. G., Scott, E. Facile assembly and loading of theranostic polymersomes via multi-impingement flash nanoprecipitation. Journal of Controlled Release. 262, 91-103 (2017).
  12. Bobbala, S., Allen, S. D., Scott, E. A. Flash nanoprecipitation permits versatile assembly and loading of polymeric bicontinuous cubic nanospheres. Nanoscale. 10 (11), 5078-5088 (2018).
  13. Allen, S. D., et al. Polymersomes scalably fabricated via flash nanoprecipitation are non-toxic in non-human primates and associate with leukocytes in the spleen and kidney following intravenous administration. Nano Research. , (2018).
  14. Karabin, N. B., et al. Sustained micellar delivery via inducible transitions in nanostructure morphology. Nature Communications. 9 (1), 624 (2018).
  15. Mascoli, C. C., Weary, M. E. Limulus amebocyte lysate (LAL) test for detecting pyrogens in parenteral injectable products and medical devices: advantages to manufacturers and regulatory officials. Journal of the Parenteral Drug Association. 33 (2), 81-95 (1979).
  16. Pustulka, K. M., et al. Flash nanoprecipitation: particle structure and stability. Molecular Pharmaceutics. 10 (11), 4367-4377 (2013).
  17. Tang, C., Amin, D., Messersmith, P. B., Anthony, J. E., Prud'homme, R. K. Polymer directed self-assembly of pH-responsive antioxidant nanoparticles. Langmuir. 31 (12), 3612-3620 (2015).
  18. Gindy, M. E., Panagiotopoulos, A. Z., Prud'homme, R. K. Composite block copolymer stabilized nanoparticles: simultaneous encapsulation of organic actives and inorganic nanostructures. Langmuir. 24 (1), 83-90 (2008).

Tags

Bioteknologi problemet 138 nanomaterial nanocarrier biomateriale kontrollerte levering selv-montering flash nanoprecipitation fabrikasjon polymer blokkere copolymer
Rask, skalerbar montering og lasting av bioaktive proteiner og Immunostimulants i ulike syntetisk Nanocarriers Via Flash Nanoprecipitation
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Allen, S., Vincent, M., Scott, E.… More

Allen, S., Vincent, M., Scott, E. Rapid, Scalable Assembly and Loading of Bioactive Proteins and Immunostimulants into Diverse Synthetic Nanocarriers Via Flash Nanoprecipitation. J. Vis. Exp. (138), e57793, doi:10.3791/57793 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter