Summary
Les cultures de tissus ovariens peuvent être utilisés comme modèles de l’atrésie folliculaire développement, ovulation et follicule et indiquer les mécanismes de régulation de processus ovariens dynamiques.
Abstract
Chez les mammifères femelles ovulent périodiquement un nombre d’ovocytes presque constant au cours de chaque cycle oestrus. Pour soutenir cette régularité et la périodicité, la régulation se fait au niveau de l’axe hypothalamo-hypophyso-gonadique et sur le développement de follicules dans l’ovaire. Malgré des études actives, les mécanismes de développement folliculaire ne sont pas claires, en raison des plusieurs étapes de l’activation de dormance follicule primordial à l’ovulation et la complexité de la réglementation qui diffère à chaque phase folliculaire. Afin d’étudier les mécanismes de développement folliculaire et la dynamique des follicules au cours du cycle oestral, nous avons développé un modèle de culture de tissus ovariens de souris qui peut être utilisé pour observer le développement folliculaire à l’aide d’un microscope. Développement systématique de follicule, l’ovulation périodique et l’atrésie folliculaire peuvent être reproduits dans le modèle de l’ovaire cultivées, et les conditions de culture peuvent être modulées de façon expérimentale. Ici, nous démontrons l’utilité de cette méthode dans l’étude des mécanismes de régulation du développement folliculaire et d’autres phénomènes ovariennes.
Introduction
Ovaires de souris femelles contiennent plusieurs milliers de follicules1, et l’ovulation périodique mûrit environ dix ovocytes à chaque cycle oestrus. Follicules sont classées en plusieurs stades de développement : primordial, primaire, secondaire, antre et follicules de Graaf, selon la forme de la couche cellulaire de la granulosa entourant chaque ovocyte. La plupart des follicules primordiaux sont en dormance, et certains d'entre eux sont activent et se développer dans les follicules primaires à chaque cycle oestrus2. Après la phase folliculaire secondaire, le développement folliculaire est principalement régie par gonadotrophines, folliculaires stimulante (FSH) et l’hormone lutéinisante (LH). Cependant, développement du follicule primordial et primaire est indépendant de gonadotrophine et les mécanismes de régulation qui régissent ces étapes restent mal inderstood3,4,5. En plus de facteurs de croissance et les hormones, le follicule primordial et primaire est régi par les interactions entre les follicules6,7. Donc, nous avons effectué des analyses de la dynamique du follicule dans les tissus de souris ovaire et a étudié les mécanismes de régulation associés à l’aide de cultures de tissus ovariens8,9,10.
Ici, nous présentons deux méthodes de modèle de culture de tissu ovarien. Le premier est utilisé pour analyser le développement folliculaire par mesure des zones folliculaires, et le second est utilisé pour étudier le mécanisme de régulation au début du développement folliculaire de primordiale au stade de follicule secondaire avec des souris transgéniques. Pour l’analyse du développement folliculaire, nous avons utilisé principalement ovaires de souris femelles 4 - semaine vieux parce qu’ils permettent de faciliter la visualisation des follicules. Pour induire l’ovulation périodique et élaboration d’un modèle in vivo follicule, nous avons reproduit de LH et l’ovulation observée, l’atrésie folliculaire et la sécrétion d’estradiol dans des conditions de culture de tissus. Images des ovaires cultivées ont été capturés, et les processus de développement du follicule ont été analysées par des changements de traçage dans la région folliculaire. Toutefois, dans les analyses de champ lumineux de la microscopie, la distinction entre les follicules primaires primordiales et au début n’était pas claire. Ainsi, nous avons développé une méthode pour détecter les petits follicules et faire la distinction entre le primordial, principal, et follicule secondaire en culture des tissus ovariens à l’aide de Oogenesin1 pro3 (Oog1). 9 et les ovaires de souris transgéniques R26-H2B-mCherry 0 et 4 jours après la naissance,11. Oog1 expression est détectable dans les ovocytes après l’entrée en méiose et augmente progressivement avec le développement du follicule, permettant l’observation de la transition de primordial à follicules primaires en utilisant des images de Time-lapse du tissu de l’ovaire cultivées11 ,,12. Même si les méthodes morphologiques ont servi à étudier les facteurs qui activent des follicules primordiaux dormants13,14,15,16, développement physiologique de follicules dans les ovaires est difficile à observer, et les effets de divers facteurs restent indéterminés. Les méthodes actuelles de culture ont été conçus pour répondre à cette pénurie en temps réel des analyses de facteurs de la cible.
Dans la présente étude, nous avons suivi le développement folliculaire à l’aide d’une méthode d’imagerie Time-lapse et caractérisé le processus du développement folliculaire. Nos nouvelles méthodes offrent un outil sans précédent pour l’étude de la physiologie des ovaires.
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Protocol
Souris ont été logés dans une environnement contrôlée chambre à 23 ± 1 ° C, avec un cycle foncé h de lumière/12 12 h. Expériences et protocoles de soins des animaux ont été effectuées conformément aux directives pour l’expérimentation animale à l’Université médicale de Aichi et ont été approuvés par le Comité de l’emploi et les animalerie titulaires.
1. préparation du milieu de Culture et de la vaisselle
- Pour préparer le milieu de culture de base, ajoutez le sérum fœtal (SVF, 5 % v/v), FSH (100 mUI/mL), LH (10 mU/mL) et la pénicilline-streptomycine (pénicilline, 100 U/mL, streptomycine, 100 mg/mL) au minimum indispensable moyen alpha (MEM-alpha) et mélanger en tubes de 50 mL.
Remarque : Le volume Total de milieux de culture requis varie selon les expériences, mais 1 mL de milieu de culture est généralement suffisant pour récipients de culture 3,5 cm fond en verre. - Verser 1 ml de milieu de culture mixte dans Pétri de 3,5 cm fond en verre et placer des inserts de culture cellulaire lieu 30 mm en plats. Réchauffez les plats dans un incubateur (5 % de CO2 et 37 ° C) et les médias.
2. préparation de tissu ovarien
- Tamponnée au phosphate Préchauffez salin (PBS) (−) et MEM-alpha contenant 5 % FBS, 100 U/mL de pénicilline et de streptomycine 100 mg/mL dans un incubateur (5 % de CO2 et 37 ° C).
NOTE : Environ 3 mL aliquotes de PBS (−) par l’ovaire sont suffisants pour une utilisation au cours de la dissection de l’ovaire, et 1 ml de MEM-alpha n’est pas pour stockage transitoire des ovaires unique dans les plats de 3,5 cm. -
Exciser les ovaires des 4 - semaine vieilles souris ICR (nommé d’après l’Institut du cancer) femelles et couper les tissus entourant l’ovaire à l’aide de ciseaux et pince à épiler sous un microscope stéréoscopique. Réserver les ovaires retirés en milieu de culture (Voir l’étape 2.1) jusqu'à utilisation.
- Place des ovaires unique sur papier filtre imbibés de préchauffée PBS (−) (reportez-vous à l’étape 2.1) et tranche en 4 morceaux à l’aide d’une lame microtome sous un microscope stéréoscopique.
Remarque : Les ovaires de 4 - semaine vieilles souris ICR sont environ 2 mm de diamètre. Le nombre de pièces dépend de la taille des ovaires ; Cependant, environ 500 µm morceaux épais permettant observations bon follicule (en morceaux plus épais que 500 mm, transparence du tissu est diminuée ; en morceaux plus mince que 500 mm, de nombreux follicules antraux sont brisés et perdus). - Après dissection, placer les spécimens de l’ovaire en tranches dans le milieu de culture pré chauffé dans les plats de 3,5 cm (reportez-vous à l’étape 2.1).
- Place des ovaires unique sur papier filtre imbibés de préchauffée PBS (−) (reportez-vous à l’étape 2.1) et tranche en 4 morceaux à l’aide d’une lame microtome sous un microscope stéréoscopique.
3. ovaire Culture de tissus
- Déposer environ 0,5 µL de milieu de culture par tranches de tissus ovariens sur l’insert de culture cellulaire où le tissu ovarien sera définie à l’aide d’une micropipette.
- Placer chaque échantillon en tranches dans une goutte de milieu de culture sur les inserts de culture cellulaire à l’aide de la pince à épiler.
- La culture des tissus de l’ovaire à 5 % de CO2 à 37 ° C.
- Remplacer le milieu de culture avec un milieu frais préchauffé tous les 2 jours.
NOTE : Le calendrier des changements moyens pour la culture des sections d’ovaire de 4 - semaine vieilles souris ICR est présenté dans la Figure 1.- Pour reproduire le pic de LH, traiter cultivées 4 - semaine vieux ovaires de souris ICR avec un milieu contenant 100 mU/mL FSH et LH pendant 12 h tous les 4 jours (Figure 1).
4. microscope Images d’ovaires cultivées
- Démarrez les ovaires cultivées d’imagerie après jour 1 lorsque les tissus ayant adhéré aux traités sur les inserts de culture cellulaire et effectuer des analyses de microscopie confocale ou ombiliqués à intervalles de 24 heures pour permettre la croissance folliculaire suffisante entre les points dans le temps.
NOTE : Microscopie confocale est supérieure à la microscopie inversée pour l’observation des follicules dans les ovaires de toute cultures.
5. Time-lapse imagerie des ovaires cultivées
-
Optimiser les conditions d’imagerie Time-lapse, y compris le laser des intensités et des durées d’exposition, pour le système d’imagerie (tableau 1).
- Sélectionnez ovaire appariés échantillons provenant de souris unique pour une utilisation comme groupes de traitement et de contrôle. Varier les intensités de laser et de la durée d’exposition pour obtenir les meilleures images (tableau 1).
- Comparer la croissance folliculaire dans chaque condition de culture de mesurer des surfaces de follicule en images des échantillons témoins à 24 h d’intervalle et en Time-lapse échantillons d’imagerie (voir étape 6). En même temps, compter le nombre d’ovocytes ovulés dans chaque ovaire et choisir les conditions optimales d’imagerie Time-lapse.
- Capturer des images à des intervalles de 30 min à l’aide du système d’imagerie Time-lapse dans les conditions déterminées (tableau 1).
6. analyse de la croissance folliculaire
-
Pour analyser le développement du follicule, mesurer les surfaces de follicule dans les images capturées à l’aide de logiciels ImageJ (http://resbweb.nih.gov/ij/).
- Au début, définissez l’échelle de l’image en cliquant sur « Définir échelle » sous « Analyze » dans la barre d’outils. Écrire les longueurs de côté de l’image capturée et les numéros correspondants de pixels dans les champs vides de « Distance connue » et « Distance en pixels », respectivement.
- Cliquez sur « Mains libres » dans la barre d’outils et précisent les follicules dans les images capturées champ lumineux.
- Cliquez sur « Mesure » sous « Analyze » dans la barre d’outils.
Remarque : Si d’autres données de mesure sont souhaitées, cliquez sur « Set mesure » sous « Analyze » dans la barre d’outils et cochez les cases appropriées dans la liste.
7. l’analyse du développement folliculaire à l’aide de souris transgéniques
- Recueillir des ovaires de 0 et 4 (P0 et P4) femelles transgéniques contenant les transgènes Oog1pro3.9 et R26-H2B-mCherret la culture sur plaquettes comme décrit dans étapes 1.1 – 3.2, sauf ne pas jours tranche le P0 et ovaires P4.
- Remplacer le milieu de culture avec milieu frais, préchauffé dans les plats de 3,5 cm dans un incubateur contenant 5 % de CO2 à 37 ° C tous les 2 jours.
Remarque : La concentration de LH dans le milieu de culture des ovaires P0 et P4 peut rester constante car les surtensions LH n’existent pas chez les souris P0 et P4. - Régler le microscope de visualiser les follicules primaires à seulement AcGFP1-positifs dans les ovaires de P4 (tableau 1).
Remarque : Les follicules primaires et seulement primordiales sont présents dans les ovaires de souris femelle P4. - Capturer des images de la culture P0 Oog1pro3.9/ ovaires de souris transgéniquesR26-H2B-mCherry à des intervalles de 30 min en utilisant les paramètres utilisés pour les ovaires P4 (voir étape 5.2).
- Retracer et analyser le développement folliculaire à l’aide de signaux AcGFP1 et H2B-mCHerry.
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Representative Results
La figure 1 montre le protocole pour les changements dans les médias au cours de la culture de tissus ovarienne. Suite à ce programme, les ovaires de souris ICR 4 semaines ont été cultivés et imagé à intervalles de 24 h à l’aide de la microscopie confocale (Figure 2). Au cours de la culture de tissus de l’ovaire pendant 3 semaines, plus de follicules antrums et secondaires ont dégénéré de l’atrésie folliculaire et certains étaient ovulés (Figure 2D et tableau 2). Dans l’analyse des zones de follicule à l’aide de ImageJ (Figure 3), certains follicules mis au point en groupes au cours de chaque cycle de montée de LH (Figure 3B et 1 de film supplémentaire). En outre, l’ovulation ont eu lieu presque simultanément distincts des ovaires d’ovaires droit et gauche de souris unique. Considérant que, le moment de l’ovulation et le nombre d’ovocytes ovulés (tableau 2) différente entre les ovaires de souris (données non présentées), l’ovulation des ovaires cultivées principalement a eu lieu sous 48 h des ondes de choc LH (Figure 3et complémentaires Film 1). Cependant, pas tous les ovocytes ovulés sorti premiers corps polaires après l’ovulation (Figure 2E et tableau 2), et bien que les ovocytes ovulés pourraient être fécondés, développement a cessé à l’étape 4 cellules (données non présentées). Afin d’élucider les mécanismes par lesquels des follicules primordiaux dormants sont activés dans les ovaires de souris, nous avons décelé activation de follicule primordial dans les tissus des souris transgéniques portant Oog1pro3.9 et R26-H2B-mCherry (de transgènes La figure 4, Figure 5et film supplémentaire 2). Ovocytes expriment des niveaux très faibles du gène Oog1 dès le stade de follicule primordial, et Time-lapse imagerie distingue faible AcGFP1 exprimant des follicules primordiaux des follicules primaires exprimant le AcGFP1 élevés. Les follicules primordiaux et primaires sont présents simultanément dans les ovaires de souris P4, alors que seulement les follicules primordiaux sont présents dans les ovaires de P0 (Figure 4A, B). Ainsi, nous avons optimisé le Time-lapse conditions d’imagerie pour détecter uniquement les follicules primaires dans les ovaires de P4 cultivées (Figure 4C). Par la suite, nous avons capté des images de cultivées P0 ovaires pendant 10 jours dans les mêmes conditions (Figure 4D-G). AcGFP1 peut être utilisé comme un index des follicules primaires chez ces souris transgéniques et follicules primaires AcGFP1 positif étaient détectables dans les ovaires de P0 cultivés après la culture de 30 à 40 h (Figure 4, Figure 5A-Fet supplémentaire Film 2). Des follicules primordiaux et primaires dans les ovaires ont été distingués également par mCherry séropositifs des noyaux des cellules de la granulosa (Figure 5B, E). Plus précisément, les signaux de mCherry indiquent les formes des follicules et permettent l’observation des phases folliculaire dans les ovaires (Figure 5B, E et H). Par conséquent, ce système de culture à l’aide d’ovaires de Oog1pro3.9/R26-H2B-mCherry souris ont révélé le processus du début développement follicule primordial au stade de follicule secondaire. Ces méthodes facilitera les études sur les mécanismes de régulation du développement folliculaire gonadotrophine indépendant.
Figure 1 : Évolution temporelle des variations moyennes. A moyenne contient 5 % FBS, 100-mU FSH, LH de 10-mU, la pénicilline 100 U/mL et 100 mg/mL de streptomycine en MEM-alpha. Le milieu B contient 5 % FBS, 100-mU FSH, LH de 100-mU, 100 U/mL pénicilline et la streptomycine 100 mg/mL en MEM-alpha. Milieu B a été utilisé pour produire des ondes de LH tous les 4. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 2 : Images de tissus ovariens cultivés. Des images ont été capturées à intervalles de 24 h à l’aide de la microscopie confocale. (A) journée Culture 1 ; (B) jour de Culture 5 ; (C) jour de Culture 10 ; (D) jour de Culture 13 ; (E) Magnified image de la région indiquée par la place de (D) ; les ovocytes en ré ont ovulé des follicules indiquées par des flèches en B, C et d. (F) ovocyte, libérant un globule polaire après l’ovulation ; Echelle = 200 µm. s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 3 : Mesures des zones de follicules dans les ovaires. (A) Image d’ovaire cultivée ; lignes en pointillés représentent la surface mesurée par ImageJ. (B) les zones folliculaires dans ovaire cultivée après 3 semaines ; les lignes grises représentent la période de culture de l’addition de 100 mM LH (pic de LH). Lignes montrent les étapes de développement dans chaque follicule dans l’ovaire cultivée ; Echelle = 200 µm. s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 4 : Hématoxyline et éosine (H & E) coloration images des ovaires P0 et P4 et imagerie Time-lapse. (A) H & E coloration de P0 ovaire ; (B) H & E coloration de P4 ovaire ; (C) Image d’un ovaire P4 d’une Oog1pro3.6 de souris transgénique après culture de 10 h. La flèche indique un follicule primaire AcGFP1 positifs. (D-G) Images de P0 ovaires de souris transgéniques exprimant Oog1pro3.9 et R26-H2B-mCherry; des signaux rouges et verts D et F représentent les AcGFP1 et mCherry, respectivement. Blanc des signaux à E et G représentent AcGFP1 D et F, respectivement. D et E sont des images d’ovaires cultivées après culture de 0,5 h. F et G montrent des ovaires après culture de 180 h ; Echelle = 100 µm. s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 5: Images de follicules primordiaux, primaires et secondaires dans les ovaires oog1pro3.9/R26-H2B-mCherry souris. A–(C) Images des follicules primordiaux dans les ovaires de P0 cultivées ; (D–F) Images des follicules primaires dans P0 ovaire cultivée ; (G–H) Images de follicules secondaires dans les ovaires de souris cultivées de 4 semaines. A, D et G sont des images fusionnées de B et C, E et F et H et I, respectivement. Vert, AcGFP1 ; rouge, mCherry ; Echelle = 100 µm. s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
| microscope | porte-objectif | laser | exposition (ms) | Gain | intervalles de temps | z-pile | d’autres | Chiffres et films |
| CV1000 | X10 | 488 nm : 30, 561 nm : 20 | 488 nm : 700, 561 nm : 600 | 488 nm : 90, 561nm : 20 | 30 min | 5 mm | Figure 4C-G, film 1 et 2 | |
| BZ-X700 | X20 (avec collier de collection) | 40 % | Auto | X4 | 30 min | 10 mm | binning 3 x 3 | Film 3 |
| LSM710 | X10 | 488 nm : 6 %, 564 nm : 5 % | Vitesse de la caméra : 4 | 488 nm : 850, 564 nm : 850 | 24h | 10 mm | le gain de Digital, 488 nm : 2, nm:1 564 | La figure 2, 3 et 5 |
Tableau 1 : Time-lapse imagerie conditions. Time-lapse condition d’imagerie pour microscopes de champ confocal et lumineux.
| Ovaire pas. | Nombre d’ovocytes ovulés totales | Nombre d’ovocytes MII |
| 1 | 7 | 2 |
| 2 | 19 | 9 |
| 3 | 14 | 6 |
| 4 | 7 | 3 |
| 5 | 12 | 4 |
| 6 | 15 | 6 |
| 7 | 25 | 11 |
| 8 | 13 | 3 |
| 9 | 11 | 7 |
| 10 | 19 | 8 |
| 11 | 18 | 4 |
| 12 | 7 | 1 |
Tableau 2 : nombre d’ovocytes ovulés dans les ovaires. Nombre d’ovocytes ovulés de douze des ovaires ; MII indique le nombre d’ovocytes ovulés qui sort le premiers corps polaires après l’ovulation.
Supplémentaire 1 film : film de Time-lapse d’un ovaire cultivé. Ovaires ont été prélevés chez des souris 4 - semaine vieux et ont été tranchés et mis en culture pendant 3 semaines. Le film s’étend sur une période de culture de 0 à 200 h à 10 images/s. veuillez cliquer ici pour visionner cette vidéo. (Clic droit pour télécharger.)
Supplémentaire Movie 2 : film de Time-lapse d’un ovaire P0 cultivé d’une souris transgénique. Vert, AcGFP1 ; rouge, mCherry. Le film s’étend sur une période de culture de 0 à 180 h à 10 images/s. veuillez cliquer ici pour visionner cette vidéo. (Clic droit pour télécharger.)
Film supplémentaire 3 : Time-lapse film d’un ovaire cultivé par un souris âgés de 4 semaines. Vert, AcGFP1 ; rouge ; mCherry ; le film s’étend sur une période de culture de 9 à 13 journées de la culture à 10 images/s. Les flèches dans la première image indiquent les follicules dans lequel l’atrésie a eu lieu au cours de la culture. S’il vous plaît cliquez ici pour voir cette vidéo. (Clic droit pour télécharger.)
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Discussion
Dans cette étude, nous avons développé deux nouvelles méthodes pour l’étude de développement folliculaire dans les ovaires de souris. La première méthode consiste en l’élevage des tissus en tranches ovarienne chez la souris adulte suivie d’analyses du développement folliculaire, et la seconde implique l’utilisation de Time-lapse d’imagerie afin de visualiser le développement folliculaire précoce pendant la phase de gonadotrophine indépendant. Auparavant, nous avons utilisé la méthode de culture de tissus ovaire présente pour évaluer l’effet du facteur inhibiteur de leucémie et de la progestérone sur le follicule développement8,9et a montré que leurs effets varient avec l’étape de concentration et de follicule. Dans la présente étude, tranches de tissus ovariens exposées follicule dynamique, justifiant de plus amples analyses du mécanisme pour un développement de follicules ovariens à l’aide de ce modèle.
Ovaires de souris de plus de 5 semaines d’âge contiennent lutea de corpus qui fait obstacle à l’observation au microscope. Par conséquent, ovaires de souris de 4 semaines sont préférés pour les observations de développement folliculaire et l’ovulation, et ultérieures follicules primaires, secondaires et antrales fin sont distinguent plus facilement à l’aide de la microscopie en champ clair. Nos méthodes offrent des comparaisons des effets des facteurs de croissance et de la drogue dans des milieux de culture, avec des changements discernables dans le follicule développement entre ovaires traitées différemment (Figure 3).
Des souris transgéniques exprimant des protéines de Cre ou de fluorescéine dans les ovocytes ont été décrites dans précédentes études18,19,20. Classification de la phase folliculaire dépend toutefois histologiques caractéristiques, y compris des formes de cellules granuleuses, nombre de couches de cellules de la granulosa, et que sont forment les cellules de la thèque. Ainsi, des distinctions entre les follicules primordiaux et primaires peuvent être limitées d’après des observations d’ovocytes seuls. Dans les présentes, nous avons utilisé des souris transgéniques contenant le Oog1pro3.9 et R26-H2B-mCherry transgènes11,17 et visualiser le développement précoce de follicule de primordiale au stade de follicule secondaire dans les ovaires. Oog1 expression devient détectable dans les ovocytes durant le stade de follicule primordial et est nettement augmentée dans les follicules primaires. Par conséquent, les intensités de signal AcGFP1 dans les ovocytes sont associées à la phase folliculaire (Figure 5) et ont été utilisées pour l’observation des transitions de follicule primordial-primaire (Figure 4, le film supplémentaire 2). Noyaux cellulaires sont colorés rouge R26-H2B-mCherry des souris transgéniques (Figure 4, supplémentaire Movie 2et complémentaire Movie 3), permettant aux observations du stade follicule selon les chiffres de (cellules de la granulosa La figure 5). Ainsi, collectivement, les méthodes actuelles permettent des analyses du développement follicule primordial par le biais de l’ovulation à l’aide de Oog1pro3.9/R26-H2B-mCherry de souris transgéniques. En outre, parce que l’apoptose cellulaire la chromatine est condensée, mCherry signaux des follicules atrésiques sont plus forts que ceux des follicules normaux (3 de film supplémentaire).
Parmi les subtilités méthodologiques, corrects épaisseurs de tissus en tranches sont nécessaires pour une culture réussie, avec la mort cellulaire accrue dans les tranches de l’ovaire qui sont trop épais et les pertes de gros follicules antrums dans des tranches d’ovaire qui sont trop minces. La vitesse de croissance du follicule est lente ; par conséquent, il est facile de retracer et analyser le processus de chaque follicule par observation de l’intervalle de 24 h. Le microscope confocal présent définition, y compris l’intensité du laser, intervalle de temps et gain numérique, dépendent de la mode microscope, mais sont essentiel à prendre en considération lors de l’obtention d’images de Time-lapse. En particulier, laser fortes intensités et longs temps d’exposition sont tenus de saisir des images claires, mais peuvent affecter les cellules cultivées. Modération de ces paramètres afin d’éviter la phototoxicité est donc critique. Des tissus ovariens en tranches de 4 semaines souris peuvent être cultivées pendant environ 4 semaines, alors que les follicules primordiaux et primaires restent présents par la suite, ils ne sont plus grandissent. En revanche, les ovaires P0 et P4 peuvent être cultivées pendant environ 10 jours, au cours de laquelle les follicules primordiaux et primaires se développent en follicules primaires ou secondaires, respectivement. Cependant, follicules dans les ovaires de P0 et P4 cultivées ne se transforment pas en follicules antraux. Par conséquent, l’excision des ovaires est nécessaire à divers stades d’études des mécanismes de réglementation associés de développement folliculaire ovaire entier.
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Disclosures
Les auteurs n’ont rien à divulguer.
Acknowledgments
Nous remercions le Dr Naojiro Minami (Université de Kyoto) pour fournir les souris Oog1pro3.9 . Cette recherche a été financée par la SJPS (KAKENHI # JP15H06275) et la Fondation de Nitto.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Follicle stimulating hormone from human pituitary | SIGMA | F4021 | |
| Lutenizing hormone from equine pituitary | SIGMA | L9773 | |
| Penicillin-streptomycin solution | Wako Pure Chemical Industries | 168-23191 | |
| MEM a, GlutaMax, no nucleotides | Thermo Fisher | 32561037 | |
| Glass bottom dish | MatTek | P35G-0-10-C | 35mm dish, No. 0 coverslip, 10mm glass diameter |
| Millicell cell culture insert | Merck Millipore | PICM0RG50 | Diameter: 315 mm, pore size: 0.4 mm, material: hydrophilic PTTE |
| 3.5cm cell culture dishes | greiner bio-one | 627160 | |
| 50ml / centrifuge tube with triple seal cap | IWAKI | 2345-050 | |
| Low-profile disposable blades 819 | Leica | 14035838925 | |
| LSM 710 | Carl Zeiss | Confocal microscope | |
| CellVoyager, CV1000 | Yokogawa Electric Corporation | Time-lapse imaging | |
| BZ-X700 | KEYENCE | Time-lapse imaging |
References
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