Summary
Yumurtalık dokusu kültürler folikül gelişim, yumurtlama ve folikül atrezi modelleri olarak kullanılabilir ve düzenleyici mekanizmaları dinamik yumurtalık işlemleri gösterir.
Abstract
Memeli kadın düzenli olarak her estrus döngüsü sırasında yumurtalar hemen hemen sabit bir sayıda yumurtlamak. Böyle düzenlilik ve periyodik olarak sürdürmek için düzenleme hipofiz gonad hipotalamik eksen düzeyinde ve follikül yumurtalık içinde geliştirme ortaya çıkar. Etkin çalışmalar rağmen folikül gelişim mekanizmaları çeşitli adımlar uyuyan ilkel folikül etkinleştirme gelen yumurtlama için ve foliküler her aşamada farklı yönetmelik karmaşıklığı yüzünden net değildir. Folikül gelişim mekanizmaları ve köklerinin estrus döngüsü boyunca dinamikleri araştırmak için bir mikroskop kullanarak folikül gelişim gözlemlemek için kullanılabilir bir fare yumurtalık doku kültürü modeli geliştirdi. Sistematik folikül gelişim, periyodik yumurtlama ve folikül atrezi tek kültürlü yumurtalık modelinde çoğaltılabilir ve kültür koşulları deneysel olarak modüle. Burada, biz, folikül gelişim düzenleyici mekanizmaları ve diğer yumurtalık olayları bu yöntemde yararlılığı göstermek.
Introduction
Dişi fare yumurtalık birkaç bin köklerinin1içeren ve düzenli yumurtlama her estrus döngüsü yaklaşık on yumurtalar olgunlaşır. Köklerinin çeşitli gelişim aşamalarında sınıflandırılır: ilkel, İlköğretim, ortaöğretim, antral ve her oosit çevreleyen granulosa hücresel tabaka şeklinde bağlı olarak Graafian köklerinin. En ilkel köklerinin uykuda ve biraz-in onları aktif hale gelir ve her estrus döngüsü2birincil foliküller içine büyümek. İkincil foliküler aşamadan sonra folikül gelişim gonadotropins tarafından uyarıcı hormon (FSH) ve luteinizan hormon (LH) foliküler esas olarak düzenlenir. Ancak, ilkel ve birincil folikül gelişim gonadotropin bağımsız ve bu aşamaların yöneten düzenleyici mekanizmaları kötü inderstood3,4,5kalır. Büyüme faktörleri ve hormonlar ek olarak, ilkel ve birincil folikül köklerinin6,7arasındaki etkileşimler tarafından düzenlenmiştir. Bu nedenle, biz folikül dinamiklerini analiz mouse ovarium dokularda gerçekleştirilen ve yumurtalık dokusu kültürler8,9,10kullanarak ilişkili düzenleyici mekanizmaları araştırıldı.
Burada, biz iki yumurtalık doku kültürü modeli yöntemleri tanıtmak. İlk foliküler alanlarda ölçüm tarafından folikül gelişim analiz etmek için kullanılır ve ikinci transgenik fareler ile ikincil folikül aşamasına gelen ilkel erken folikül gelişimi sırasında düzenleyici mekanizma incelemek için kullanılır. Çünkü onlar köklerinin kolay görselleştirme için izin folikül gelişim analiz için Biz esas olarak yumurtalık 4 - hafta eski dişi farelerin kullanılır. Periyodik yumurtlama ve modeli içinde vivo folikül gelişim ikna etmek için LH dalgalanma ve gözlenen yumurtlama, folikül atrezi ve doku kültürü koşullar altında estradiol salgılanmasını çoğaltılamaz. Kültürlü yumurtalık görüntüleri ele geçirildi ve folikül gelişim süreçleri izleme değişiklikleri foliküler alanında tarafından analiz edildi. Ancak, parlak alan Mikroskobu analizleri, ilkel ve erken birincil foliküller ayrımı belirsiz. Bu nedenle, biz küçük köklerinin algılayıp birincil, ilkel arasında ayırt etmek için bir yöntem geliştirdi ve ikincil folikül kültürlü yumurtalık dokuları kullanarak Oogenesin1 (Oog1) pro3. 9 ve 0 ile 4 gün sonra Doğum11, R26-H2B-mCherry transgenik fareler yumurtalık. Oog1 ifade mayoz girmesinden sonra yumurta algılanabilir ve folikül gelişimi, ilkel geçiş kültürlü yumurtalık dokusunun11 hızlandırılmış görüntüleri kullanarak birincil köklerinin gözlenmesi izin ile yavaş yavaş artar ,12. Morfolojik yöntemleri uyuyan ilkel köklerinin13,14,15,16etkinleştirmek faktörler eğitim için kullanılan, yumurtalık fizyolojik folikül gelişiminde olsa gözlemlemek, zor ve çeşitli faktörlerin etkilerini uncharacterized kalır. Mevcut kültür yöntemleri bu yetersizlik hedef faktörler gerçek zamanlı analizlerde yönelik olarak tasarlanmıştır.
Bu da çalışmanın, biz foliküler gelişim hızlandırılmış bir görüntüleme yöntemi kullanarak izleniyor ve folikül gelişim süreci ile karakterizedir. Roman yöntemlerimiz yumurtalıkların fizyolojisi soruşturma için benzeri görülmemiş bir aracı sağlar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Fareler 23 ±1 ° C 12 h ışık/12 s karanlık döngüsü ile çevre kontrollü bir odada muhafaza. Hayvan bakım protokolleri ve deneyler kılavuzlarınıza uygun olarak Aichi Tıp Üniversitesi'nde hayvan deneme için yapılmıştır ve görevdeki hayvan bakım ve kullanım Komitesi tarafından kabul edildi.
1. hazırlanması kültür orta ve yemekleri
- Temel kültür ortamı hazırlamak için fetal Sığır serum (FBS, % 5 v/v), FSH ekleyin (100 mIU/mL), LH (10 mU/mL) ve penisilin-streptomisin (penisilin, 100 U/mL; streptomisin, 100 mg/mL) asgari temel orta Alfa (MEM-alfa) ve mix 50 mL tüpler için.
Not: Gerekli kültür ortamının toplam birimleri deneyler arasında değişir, ancak kültür orta 1 mL 3.5 cm cam-alt kültür yemekleri için genellikle yeterli oluyor. - 1 mL aliquots karma kültür ortamının 3.5 cm cam-alt kültür yemekleri dökün ve yer 30 mm hücre kültür ekler yemekleri ayarlayın. Önceden sıcak ortam ve yemekleri bir kuluçka (%5 CO2 ve 37 ° C).
2. yumurtalık dokusu hazırlanması
- Önceden sıcak fosfat arabelleğe alınmış serum (PBS) (−) ve MEM-Alfa %5 FBS, 100 U/mL penisilin ve 100 mg/mL streptomisin bir kuluçka (%5 CO2 ve 37 ° C) içeren.
Not: Yaklaşık 3 mL aliquots yumurtalık PBS (−) yumurtalık diseksiyonu sırasında kullanım için yeterli ve 1 mL aliquots MEM-Alfa 3.5 cm yemeklerinde tek yumurtalık geçici depolama için yeterlidir. -
Yumurtalık 4 - hafta eski kadın (-den sonra Kanser Araştırma Enstitüsü olarak adlandırılır) ICR fareler gelen tüketim ve makas ve stereoskopik mikroskop altında Cımbız kullanarak yumurtalık çevreleyen dokuların trim. Rezerv kültür orta kaldırılan yumurtalıklarda (bkz. Adım 2.1) kullanımı kadar.
- Filtre kağıdı üzerine tek yumurtalık nemlendirilmiş ile yer önceden ısınmış PBS (−) (bkz. Adım 2.1) ve 4 adet stereoskopik bir mikroskop altında microtome bıçak kullanma dilim.
Not: 4 - hafta eski ICR fareler yumurtalık yaklaşık 2 mm çapında geçerlidir. Parça sayısı yumurtalık boyutuna bağlıdır; Ancak, yaklaşık 500 µm kalınlığında parçalar uygun folikül gözlemler için izin (500 mm daha kalın parçalar halinde doku şeffaflık azalır; 500 mm ince parçalar halinde birçok antral folikül kırık ve kaybetti). - Diseksiyon sonra önceden ısıtılmış kültür orta (bkz. Adım 2.1) 3.5 cm yemeklerinde dilimlenmiş yumurtalık numuneler yerleştirin.
- Filtre kağıdı üzerine tek yumurtalık nemlendirilmiş ile yer önceden ısınmış PBS (−) (bkz. Adım 2.1) ve 4 adet stereoskopik bir mikroskop altında microtome bıçak kullanma dilim.
3. yumurtalık doku kültürü
- Yumurtalık dokusu yumurtalık dokusu nerede olacak hücre kültür Ekle dilimlenmiş kültür orta yaklaşık 0.5 µL damla bir micropipette kullanarak ayarlayın.
- Kültür orta Cımbız kullanarak hücre kültür ekler üzerinde bir damla her dilimlenmiş numune yerleştirin.
- 37 ° C'de % 5 CO2 yumurtalık dokularda kültür
- Kültür orta ile taze önceden ısıtılmış orta yerine 2 günde.
Not: 4 - hafta eski ICR fareler bölümlerden yumurtalık kültür için orta değişiklikler için zamanlamayı Şekil 1' de sunulmuştur.- LH dalgalanma çoğaltmak, kültürlü 4 - hafta eski ICR fareler yumurtalık 100 mU/mL FSH ve LH 12 h için her 4 gün (Şekil 1) içeren orta ile tedavi.
4. mikroskop görüntüleri kültürlü yumurtalık
- 1. ne zaman belgili tanımlık doku hücre kültür ekler yapıştırılır gün sonra kültürlü yumurtalık görüntüleme başlatın ve zaman puan arasında yeterli folikül büyüme sağlamak için 24 saat aralıklarla confocal veya ters mikroskop çözümlemesi.
Not: Confocal mikroskobu köklerinin bütün kültürlü yumurtalık içinde gözlemlemek için ters mikroskobu üstündür.
5. kültürlü yumurtalık hızlandırılmış görüntüleme
-
Hızlandırılmış görüntüleme koşulları, lazer yoğunluklarda ve görüntüleme sistemi (Tablo 1) için pozlama süreleri dahil olmak üzere en iyi duruma getirme.
- Eşleştirilmiş yumurtalık numuneler tek fare kullanımı için tedavi ve kontrol grupları olarak seçin. Lazer yoğunluklarda ve en iyi görüntü (Tablo 1) elde etmek için çekim hızı değişir.
- Folikül gelişim her kültür koşul altında folikülü alanları kontrol örnekleri 24 h aralıklarla görüntülerini ve hızlandırılmış görüntüleme örnekleri (bkz. Adım 6) ölçerek karşılaştırın. Aynı anda, her yumurtalık sette ovulated yumurta sayısını saymak ve uygun zaman hata görüntüleme koşulları seçin.
- Hızlandırılmış görüntüleme sistemi (Tablo 1) belirlenen koşullarda kullanarak 30 dk aralıklarla esir alma imge.
6. folikülü büyüme Analizi
-
Folikül gelişim analiz etmek için ImageJ yazılım (http://resbweb.nih.gov/ij/) kullanarak çektiğiniz resimleri folikül alanlarında ölçmek.
- Başlangıçta, araç çubuğunda "Ölçeği Ayarla" altında "Analiz" tıklatarak görüntü ölçeğini ayarlayın. Yakaladığınız görüntüyü ve piksel karşılık gelen sayıların yan uzunlukları sırasıyla "Bilinen mesafe" ve "Uzaklığını piksel", boş alanlara girin.
- "Serbest el" araç çubuğunda tıklatın ve köklerinin yakalanan parlak alan görüntüler anahat.
- "Ölçü" altında "analiz" araç çubuğunda'i tıklatın.
Not: diğer ölçüm verileri isterseniz, "ölçü"Analiz"altında araç çubuğunda ayarla"'ı tıklatın ve listeden uygun kutuları işaretleyin.
7. analiz transgenik fareler kullanarak folikül gelişimi
- Yumurtalık 0 ile 4 (P0 ve P4) içeren transgenik fareler transgenes Oog1pro3.9 ve R26-H2B-mCherrve kültür ekler üzerinde açıklandığı gibi adımlar 1.1-3.2 değil dışında Kadın Doğum sonrası gün dilim P0 ve P4 yumurtalık toplamak.
- Taze, önceden ısıtılmış orta 3.5 cm yemekleri içeren % 5 CO2 37 ° C'de 2 günde bir kuluçka kültür orta yerine.
Not: LH dalgalanmaları P0 ve P4 farelerde meydana gelmez çünkü LH konsantrasyonu P0 ve P4 yumurtalık kültür orta sabit kalabilir. - Sadece AcGFP1 pozitif birincil foliküller kültürlü P4 yumurtalık (Tablo 1) içinde görselleştirmek için mikroskop ayarlayın.
Not: Sadece ilkel ve birincil foliküller P4 dişi fare yumurtalıklarda mevcuttur. - Kültürlü P0 Oog1pro3.9çekim /R26-H2B-mCherry transgenik fareler yumurtalık 30 dk aralıklarla kullanarak (bkz. Adım 5.2) P4 yumurtalık için kullanılan ayarlar.
- İzleme ve folikül gelişim AcGFP1 ve H2B-mCHerry sinyallerini kullanarak çözümleyebilirsiniz.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Şekil 1 yumurtalık doku kültürü sırasında medya iletişim kuralı için değişiklikleri gösterir. Aşağıdaki bu program, 4-hafta-yaşlı ICR fareler yumurtalık kültürlü ve confocal mikroskobu (Şekil 2) kullanarak 24-h aralıklarla görüntüsü. 3 hafta boyunca kültür yumurtalık dokuları sırasında en antral ve ikincil foliküller folikül atrezi tarafından dejenere ve bazı ovulated (Şekil 2D ve Tablo 2) idi. ImageJ (Şekil 3) kullanarak folikül alanları analizinde bazı köklerinin gruplarında (Şekil 3B ve takıma giren film 1) her LH dalgalanma döngüsü sırasında geliştirdi. Ayrıca, yumurtlama tek fare sağ ve sol yumurtalık neredeyse aynı anda ayrı kültürlü yumurtalıklarda oluştu. Oysa, yumurtlama ve ovulated yumurta (Tablo 2) sayıda zamanlaması fare yumurtalık (veri gösterilmez) farklılık, yumurtlama kültürlü yumurtalıklar üzerinden ağırlıklı olarak LH dalgalanmaları (Şekil 3ve ek içinde 48 h oluştu Film 1). Ancak, tüm ovulated yumurta ilk kutup organları (Şekil 2E ve Tablo 2) ovulasyon sonra yayımlanan ve ovulated yumurta döllenmiş rağmen geliştirme, kesildiği tarih 4 hücreli sahne (veri gösterilmez). Mekanizmaları tarafından uyuyan ilkel köklerinin fare yumurtalıklarda etkinleştirdiği aydınlatmak için biz primordial follikül harekete geçirmek taşıyan Oog1pro3.9 ve R26-H2B-mCherry transgenes (transgenik fareler kültürlü dokulardan tespit Şekil 4, Şekil 5ve takıma giren film 2). Yumurta Oog1 gen ilkel folikül sahne alanı'ndan çok az düzeyde hızlı ve hızlandırılmış görüntüleme düşük AcGFP1 ifade ilkel köklerinin yüksek AcGFP1 ifade birincil foliküller ayırt. Sadece ilkel köklerinin P0 yumurtalıklarda (Şekil 4A, B) mevcut ise ilkel ve birincil foliküller aynı anda P4 fare yumurtalıklarda, mevcut. Böylece, yalnızca birincil foliküller kültürlü P4 yumurtalıklarda (Şekil 4C) algılamak için hızlandırılmış görüntüleme koşulları optimize. Daha sonra aynı koşullarda (Şekil 4D-G) 10 gün için kültürlü P0 yumurtalık görüntülerini yakaladık. AcGFP1 birincil foliküller transgenik farelerde bu dizini olarak kullanılabilir ve AcGFP1 pozitif birincil foliküller sonra 30-40 h Kültür (Şekil 4, Şekil 5A-Fve ek kültürlü P0 yumurtalıklarda tespit edildi Film 2). Kültürlü yumurtalıklarda ilkel ve birincil foliküller aynı zamanda granulosa hücreleri (Şekil 5B, E) mCherry-pozitif çekirdekleri tarafından ayırt edildi. Özellikle, mCherry sinyalleri formları köklerinin belirtmek ve gözlem folikül Etap kültürlü yumurtalıklarda (Şekil 5B, E ve H) sağlar. Bu nedenle, bu kültür sistemi yumurtalık Oog1pro3.9üzerinden kullanarak /R26-H2B-mCherry fareler ortaya erken ikincil folikül aşamaları primordial follikül geliştirme süreci. Bu yöntemler düzenleyici mekanizmaları gonadotropin bağımsız folikül gelişim çalışmaları kolaylaştıracaktır.
Resim 1 : Orta değişiklikleri zaman ders. Orta A %5 10 mU FBS, 100-mU FSH, LH, 100-U/mL penisilin ve MEM-alpha 100 mg/mL streptomisin içeriyorsa. Orta B %5 100-mU FBS, 100-mU FSH, LH, 100-U/mL penisilin ve MEM-alpha 100 mg/mL streptomisin içerir. Orta B LH dalgalanmaları her 4 şarkısında kullanıldı. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Resim 2 : Kültürlü yumurtalık dokuları görüntülerini. Görüntüleri confocal mikroskobu kullanarak 24 h aralıklarla ele geçirildi. (A)kültür gün 1; (B) kültür gün 5; (C) kültür gün 10; (D) kültür gün 13; (E) (D); meydanda simgesiyle bölgesi görüntüsünü Magnified Yumurtalar d B, C ve bir kutup vücut sonra yumurtlama bırakmadan D. (F) yumurta ok ile gösterilen köklerinin üzerinden ovulated; Ölçek çubuğu 200 µm. = Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 3 : Kültürlü yumurtalıklarda folikül alanlarda ölçümleri. Kültürlü yumurtalık(a)görüntü; noktalı çizgiler ImageJ tarafından ölçülen alanı temsil eder. (B) 3 hafta sonra kültürlü yumurtalık foliküler alanlarında; gri çizgiler 100-mM LH (LH dalgalanma) ek kültür dönemi temsil eder. Satırları göstermek kültürlü yumurtalık içinde her folikül gelişim aşamaları; Ölçek çubuğu 200 µm. = Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 4 : Hematoksilen ve eozin (H & E) boyama P0 ve P4 yumurtalıklar ve görüntülerini zaman hata görüntüleme. (A)H & E P0 yumurtalık boyama; (B) H & E P4 yumurtalık boyama; (C) bir Oog1pro3.6 transgenik fare sonra 10 h kültür P4 yumurtalıktan görüntüsünü. Oku bir AcGFP1 pozitif birincil folikül gösterir. (D-G) P0 yumurtalık transgenik fareler Oog1pro3.9 ve R26-H2B-mCherryifade üzerinden görüntülerini; yeşil ve kırmızı sinyalleri D ve F sırasıyla AcGFP1 ve mCherry, temsil eder. Beyaz içinde E ve G AcGFP1 D ve F, sırasıyla temsil sinyalleri. D ve E kültürlü yumurtalık 0,5 h kültür sonra görüntülerdir. F ve G 180 h kültür sonra Yumurtalık gösterisi; Ölçek çubuğu 100 µm. = Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 5: görüntüleri kültürlü yumurtalıklarda ilkel, birincil ve ikincil köklerinin oog1pro3.9/R26-H2B-mCherry fareler. (A-C) Görüntüleri kültürlü P0 yumurtalıklarda ilkel köklerinin; (D-F) P0 kültürlü yumurtalık içinde birincil foliküller görüntülerini; (G-H) İkincil foliküller kültürlü 4-hafta-yaşlı fare yumurtalık içinde görüntüler. A, D ve G sırasıyla B ve C, E ve F ve H ve ben, birleştirilmiş görüntüler vardır. Yeşil, AcGFP1; kırmızı, mCherry; Ölçek çubuğu 100 µm. = Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
| mikroskop | objektif lens | Lazer | Pozlama (ms) | Kazanç | zaman aralığı | z-yığını | diğerleri | Resimler ve filmler |
| CV1000 | X10 | 488 nm: 30, 561 nm: 20 | 488 nm: 700, 561 nm: 600 | 488 nm: 90, 561nm: 20 | 30 dk | 5 mm | 4 C-G, film 1 ve 2 rakam | |
| BZ-X700 | X20 (ile toplama yaka) | % 40 | Otomatik | X4 | 30 dk | 10 mm | 3 x 3 binning | Film 3 |
| LSM710 | X10 | 488 nm: % 6, 564 nm: % 5 | çekim hızı: 4 | 488 nm: 850, 564 nm: 850 | 24 h | 10 mm | Dijital kazanç, 488 nm: 2, 564 nm:1 | Şekil 2, 3 ve 5 |
Tablo 1: hızlandırılmış koşulları Imaging. Confocal ve parlak bir alan mikroskoplar için hızlandırılmış görüntüleme koşulu.
| Yumurtalık yok. | Toplam ovulated yumurta sayısı | MII yumurta sayısı |
| 1 | 7 | 2 |
| 2 | 19 | 9 |
| 3 | 14 | 6 |
| 4 | 7 | 3 |
| 5 | 12 | 4 |
| 6 | 15 | 6 |
| 7 | 25 | 11 |
| 8 | 13 | 3 |
| 9 | 11 | 7 |
| 10 | 19 | 8 |
| 11 | 18 | 4 |
| 12 | 7 | 1 |
Tablo 2: ovulated yumurta kültürlü yumurtalık içinde numaralarını. Üzerinden on iki kültürlü yumurtalıkların yumurta ovulated sayıda; MII ilk kutup organları ovulasyon sonra yayımlanan ovulated yumurta numaralarını gösterir.
Takıma giren film 1: kültürlü bir yumurtalık hızlandırılmış film. Yumurtalık 4 - hafta eski fareler toplanmıştır ve dilimlenmiş ve 3 hafta boyunca kültürlü. Film bir kültür dönemi kapsayan 0-200 h 10 kare/s burayı tıklayın Bu videoyu izlemek için. (İndirmek için sağ tıklatın.)
Takıma giren film 2: Transgenik bir fare kültürlü P0 yumurtalıktan hızlandırılmış film. Yeşil, AcGFP1; kırmızı, mCherry. Film bir kültür dönemi kapsayan 0-180 h 10 kare/s burayı tıklayın Bu videoyu izlemek için. (İndirmek için sağ tıklatın.)
Takıma giren film 3: 4 haftalık bir fare kültürlü yumurtalıktan hızlandırılmış film. Yeşil, AcGFP1; kırmızı; mCherry; Film 9 – 13 kültür günleri 10 kare/s hızında bir kültür süre yayılmıştır. İlk resimdeki oklar köklerinin gösterir içinde hangi atrezi kültür sırasında oluştu. Bu videoyu izlemek için lütfen buraya tıklayın. (İndirmek için sağ tıklatın.)
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bu çalışmada, fare yumurtalıklarda folikül gelişiminde eğitim için iki yeni yöntem geliştirdik. İlk yöntem kültür folikül gelişim analizleri tarafından takip dilimlenmiş yumurtalık yetişkin fareler dokuların içerir ve ikinci ön folikül gelişim gonadotropin bağımsız aşamasında görselleştirmek için hızlandırılmış Imaging kullanımını içerir. Daha önce biz lösemi inhibitör faktörü ve progesteron folikül gelişim8,9üzerindeki etkisini değerlendirmek için kullanılan mevcut yumurtalık doku kültürü Yöntem ve etkileri ile konsantrasyon ve folikül sahne farklılık gösterdi. Bu da çalışmanın, yumurtalık dokuları sergilenen folikül dinamikleri, daha fazla analizleri yumurtalık folikül gelişim mekanizması bu modeli kullanan mevsimlerinde dilimlenmiş.
Yumurtalık--dan daha--dan 5 hafta-in yaş fareler mikroskobik gözlemler engel corpus lutea içerir. Bu nedenle, 4-hafta-yaşlı fare yumurtalıklarda folikül gelişim ve yumurtlama gözlemleri için tercih edilir ve sonraki geç birincil, ikincil ve antral folikül parlak alan mikroskobu kullanarak daha kolay ayırt edilirler. Bizim yöntemleri differentially tedavi yumurtalık (Şekil 3) arasında folikül gelişiminde discernable değişikliklerle Kültür medya, ilaç ve büyüme faktörlerinin etkileri karşılaştırmaları sunuyoruz.
Transgenik farelerde yumurta CRE veya floresein proteinler ifade önceki çalışmaları18,19,20içinde tarif edilmistir. Ancak, foliküler sahne sınıflandırma granulosa hücre şekiller, sayılar granulosa hücre katmanların dahil olmak üzere histolojik özellikleri üzerinde bağlıdır olup granulosa hücreleri oluşmaya başlar. Böylece, ilkel ve birincil foliküller arasında ayrımlar yumurta yalnız gözlemler sınırlı olabilir. Burada, transgenik fareler Oog1pro3.9 ve R26-H2B-mCherry transgenes11,17 içeren kullanılan ve ilkel üzerinden erken folikül gelişimi kültürlü yumurtalık aşamada ikincil folikül görselleştirin. Oog1 ifade ilkel folikül aşamasında yumurta içinde algılanabilir hale gelir ve belirgin birincil foliküller artar. Bu nedenle, yumurta AcGFP1 sinyal yoğunluklarda folikül sahne (Şekil 5) ile ilişkili olan ve ilkel birincil folikül geçişler (Şekil 4, takıma giren film 2) gözlemlemek için kullanılmıştır. Hücre çekirdeği R26-H2B-mCherry transgenik fareler (Şekil 4, takıma giren film 2ve takıma giren film 3) izin gözlemleri folikül aşamaları granulosa hücre (sayıda göre kırmızı lekeli Şekil 5). Böylece, topluca mevcut yöntemleri folikül geliştirme ilkel Oog1pro3.9kullanarak yumurtlama analizlerini sağlar /R26-H2B-mCherry transgenik fareler. Apoptotik hücre kromatin yoğun çünkü Ayrıca, mCherry atretic köklerinin bu normal folikül (Tamamlayıcı film 3) daha güçlü sinyaller.
Metodolojik inceliklerini arasında dilimlenmiş doku doğru kalınlıkları başarılı, artan hücre ölümü çok kalındır yumurtalık dilimleri ve çok ince yumurtalık dilimleri içinde büyük antral folikül kayıpları ile kültür için gereklidir. Folikül büyüme hızı yavaş; Bu nedenle, izleme ve her folikül 24 saat aralığı gözlem yoluyla süreci analiz etmek kolaydır. Ayarı, lazer yoğunluğu, aralığını saat ve dijital kazanç da dahil olmak üzere mevcut confocal mikroskop mikroskop moduna bağlı ama hızlandırılmış görüntüleri edinirken dikkate almak önemlidir. Özellikle, güçlü lazer yoğunluklarda ve uzun pozlama süreleri net fotoğraflar çekmek için gerekli ancak kültürlü hücreleri etkileyebilir. Bu nedenle, ılımlılık fototoksisite önlemek için bu ayarları önemlidir. 4-hafta-yaşlı farelerin dilimlenmiş yumurtalık dokuları kültürlü yaklaşık 4 hafta için ilkel ve birincil köklerinin daha sonra mevcut kalır, ancak artık büyürler. Buna ek olarak, P0 ve P4 yumurtalık yaklaşık 10 gün boyunca, hangi sırasında birincil veya ikincil foliküller sırasıyla ilkel ve birincil foliküller geliştirmek kültürlü. Ancak, köklerinin kültürlü P0 ve P4 yumurtalık içinde antral folikül geliştirmek mi. Bu nedenle, yumurtalık eksizyon araştırmalar tüm yumurtalık folikül gelişimi ile ilişkili düzenleyici mekanizmaları çeşitli aşamalarında gereklidir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar ifşa gerek yok.
Acknowledgments
Dr. Naojiro Minami (Kyoto Üniversitesi) Oog1pro3.9 fareler verdiğiniz için teşekkür ederiz. Bu araştırma JSP'ler (KAKENHI # JP15H06275) ve Nitto Vakfı tarafından desteklenmiştir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Follicle stimulating hormone from human pituitary | SIGMA | F4021 | |
| Lutenizing hormone from equine pituitary | SIGMA | L9773 | |
| Penicillin-streptomycin solution | Wako Pure Chemical Industries | 168-23191 | |
| MEM a, GlutaMax, no nucleotides | Thermo Fisher | 32561037 | |
| Glass bottom dish | MatTek | P35G-0-10-C | 35mm dish, No. 0 coverslip, 10mm glass diameter |
| Millicell cell culture insert | Merck Millipore | PICM0RG50 | Diameter: 315 mm, pore size: 0.4 mm, material: hydrophilic PTTE |
| 3.5cm cell culture dishes | greiner bio-one | 627160 | |
| 50ml / centrifuge tube with triple seal cap | IWAKI | 2345-050 | |
| Low-profile disposable blades 819 | Leica | 14035838925 | |
| LSM 710 | Carl Zeiss | Confocal microscope | |
| CellVoyager, CV1000 | Yokogawa Electric Corporation | Time-lapse imaging | |
| BZ-X700 | KEYENCE | Time-lapse imaging |
References
- Myers, M., Britt, K. L., Wreford, N. G., Ebling, F. J., Kerr, J. B. Methods for quantifying follicular numbers within the mouse ovary. Reproduction. 127 (5), 569-580 (2004).
- Adams, G. P., Jaiswal, R., Singh, J., Malhi, P. Progress in understanding ovarian follicular dynamics in cattle. Theriogenology. 69 (1), 72-80 (2008).
- Palma, G. A., et al. Biology and biotechnology of follicle development. Sci World J. , (2012).
- Knight, P. G., Glister, C. TGF-beta superfamily members and ovarian follicle development. Reproduction. 132 (2), 191-206 (2006).
- Picton, H. M., Harris, S. E., Muruvi, W., Chambers, E. L. The in vitro growth and maturation of follicles. Reproduction. 136 (6), 703-715 (2008).
- Spears, N., de Bruin, J. P., Gosden, R. G. The establishment of follicular dominance in co-cultured mouse ovarian follicles. J Reprod Fertil. 106 (1), 1-6 (1996).
- Baker, S. J., Srsen, V., Lapping, R., Spears, N. Combined effect of follicle-follicle interactions and declining follicle-stimulating hormone on murine follicle health in vitro. Biol Reprod. 65 (4), 1304-1310 (2001).
- Komatsu, K., et al. Analysis of the Effect of Leukemia Inhibitory Factor on Follicular Growth in Cultured Murine Ovarian Tissue. Biol Reprod. 93 (1), 18 (2015).
- Komatsu, K., Masubuchi, S. The concentration-dependent effect of progesterone on follicle growth in the mouse ovary. J Reprod Dev. 63 (3), 271-277 (2017).
- Murase, T., et al. Follicle dynamics: visualization and analysis of follicle growth and maturation using murine ovarian tissue culture. J Assist Reprod Genet. , 1-5 (2017).
- Ishida, M., et al. The promoter of the oocyte-specific gene, Oog1, functions in both male and female meiotic germ cells in transgenic mice. PLoS One. 8 (7), 68686 (2013).
- Minami, N., et al. Oogenesin is a novel mouse protein expressed in oocytes and early cleavage-stage embryos. Biol Reprod. 69 (5), 1736-1742 (2003).
- Nilsson, E. E., Skinner, M. K. Growth and differentiation factor-9 stimulates progression of early primary but not primordial rat ovarian follicle development. Biol Reprod. 67 (3), 1018-1024 (2002).
- Nilsson, E. E., Kezele, P., Skinner, M. K. Leukemia inhibitory factor (LIF) promotes the primordial to primary follicle transition in rat ovaries. Mol Cell Endocrinol. 188 (1-2), 65-73 (2002).
- Nilsson, E. E., Skinner, M. K. Bone morphogenetic protein-4 acts as an ovarian follicle survival factor and promotes primordial follicle development. Biol Reprod. 69 (4), 1265-1272 (2003).
- Nilsson, E. E., Skinner, M. K. Kit ligand and basic fibroblast growth factor interactions in the induction of ovarian primordial to primary follicle transition. Mol Cell Endocrinol. 214 (1-2), 19-25 (2004).
- Abe, T., et al. Establishment of conditional reporter mouse lines at ROSA26 locus for live cell imaging. Genesis. 49 (7), 579-590 (2011).
- Lan, Z. J., Xu, X., Cooney, A. J. Differential oocyte-specific expression of Cre recombinase activity in GDF-9-iCre, Zp3cre, and Msx2Cre transgenic mice. Biol Reprod. 71 (5), 1469-1474 (2004).
- Payer, B., et al. Generation of stella-GFP transgenic mice: a novel tool to study germ cell development. Genesis. 44 (2), 75-83 (2006).
- Ohinata, Y., Sano, M., Shigeta, M., Yamanaka, K., Saitou, M. A comprehensive, non-invasive visualization of primordial germ cell development in mice by the Prdm1-mVenus and Dppa3-ECFP double transgenic reporter. Reproduction. 136 (4), 503-514 (2008).
