Summary
Eierstöcke Gewebekulturen als Modelle der Follikel Entwicklung, Eisprung und Follikel Atresie einsetzbar und regulatorische Mechanismen der Eierstöcke Dynamiken zeigen.
Abstract
Säugetier-Frauen Eisprung in regelmäßigen Abständen eine nahezu konstante Anzahl von Eizellen bei jedem Brunst-Zyklus. Um solche Regelmäßigkeit und Häufigkeit zu erhalten, tritt die Verordnung auf die Hypothalamus-Hypophysen-Gonaden Achse-Ebene und auf die Entwicklung der Follikel in den Eierstöcken. Trotz aktiven Studien sind Follikel Fördermechanismen nicht klar wegen der mehrere Schritte aus der ruhenden primordialen Follikel-Aktivierung zur Ovulation und aufgrund der Komplexität der Verordnung, die in jeder follikuläre Phase unterscheidet. Um die Mechanismen der Entwicklung der Follikel und die Dynamik der Follikel während des Östrus Zyklus zu untersuchen, entwickelten wir ein Mausmodell ovariellen Gewebe-Kultur, die verwendet werden, um die Entwicklung der Follikel mit einem Mikroskop zu beobachten. Systematische Follikel Entwicklung und regelmäßigen Eisprung Follikel Atresie können alle im kultivierten Eierstock Modell reproduziert werden, und die Kulturbedingungen experimentell moduliert werden können. Hier zeigen wir die Nützlichkeit dieser Methode in der Studie die regulatorischen Mechanismen der Entwicklung der Follikel und anderen Eierstock Phänomene.
Introduction
Weibliche Maus Eierstöcke enthalten mehrere tausend Follikel1und regelmäßigen Eisprung reift etwa zehn Eizellen bei jedem Brunst-Zyklus. Follikel sind in mehrere Entwicklungsstufen eingeteilt: Primordial, Primar-, Sekundar-, antral, und Graafian Follikel, abhängig von der Form der Granulosa zellulärer Ebene rund um jede Eizelle. Die meisten primordialfollikel ruhen, und einige von ihnen werden aktiviert und wachsen in primären Follikel bei jeder Östrus Zyklus2. Nach der sekundären follikuläre Phase ist Follikel Entwicklung vor allem von Gonadotropinen, follikuläre stimulierende Hormon (FSH) und Luteinisierendes Hormon (LH) geregelt. Jedoch ursprüngliche und primäre Follikel Entwicklung ist unabhängig von der Gonadotropin und Regulationsmechanismen, die diese Stufen Regeln bleiben schlecht Inderstood3,4,5. Die ursprüngliche und primäre Follikel ist zusätzlich Wachstumsfaktoren und Hormone die Interaktionen zwischen den Follikeln6,7geregelt. Daher wir Analysen der Follikel Dynamik in Maus Eierstock Gewebe durchgeführt, und die damit verbundenen Regulationsmechanismen mit Eierstockkrebs Gewebekulturen8,9,10untersucht.
Hier stellen wir zwei Eierstöcke Gewebekultur Modell Methoden. Die erste dient zur Follikel Entwicklung analysieren durch Messung der follikulären Bereiche, und die zweite wird verwendet, um den Regulierungsmechanismus in frühen Entwicklung der Follikel aus ur auf sekundäre Follikel Bühne mit transgenen Mäusen zu studieren. Für Follikel Entwicklungsanalyse benutzten wir hauptsächlich Eierstöcke der 4 - Wochen alten weiblichen Mäusen, weil sie für einfache Visualisierung der Follikel ermöglichen. Um regelmäßige Ovulation und Modellentwicklung in Vivo Follikel zu induzieren, reproduziert wir LH-Anstieg und beobachteten Eisprung Follikel Atresie und Sekretion von Estradiol Gewebekultur Bedingungen. Bilder der kultivierten Eierstöcke wurden gefangen genommen, und die Follikel Entwicklungsprozesse durch Rückverfolgung Veränderungen im Bereich follikulären analysiert wurden. Allerdings war die Unterscheidung zwischen ursprünglicher und frühen primären Follikel im Hellfeld Mikroskopieren Analysen, unklar. So wir entwickelten eine Methode, um kleine Follikel zu erkennen und zu unterscheiden zwischen dem ursprünglichen, primäre, und sekundäre Follikel in kultivierten ovariellen Gewebe mit Oogenesin1 (Oog1) pro3. 9 und R26-H2B-mCherry Transgene Mäuse Eierstöcke bei 0 und 4 Tage nach Geburt11. Oog1 Ausdruck ist nachweisbar in Eizellen nach Inkrafttreten der Meiose und allmählich mit der Entwicklung der Follikel, so dass Beobachtung des Übergangs vom ursprünglichen primären Follikel mit Zeitraffer-Bilder der kultivierten eierstockgewebe11 ,12. Obwohl morphologische Methoden verwendet wurden, um Faktoren zu untersuchen, die ruhende primordialfollikel13,14,15,16aktivieren, ist die Entwicklung der physiologischen Follikel in den Eierstöcken schwer zu beobachten, und die Effekte verschiedener Faktoren bleiben fußgelenkes. Die gegenwärtige Kulturmethoden wurden entwickelt, um diesen Mangel in Echtzeit Analysen Ziel Faktoren anzugehen.
In der vorliegenden Studie wir follikulären Entwicklung mit einem Zeitraffer bildgebenden Methode verfolgt und charakterisiert den Prozess der Entwicklung der Follikel. Unsere neuartigen Methoden bieten ein noch nie da gewesenen Instrument zur Erforschung der Physiologie der Eierstöcke.
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Protocol
Mäuse wurden in einem ökologisch kontrollierten Raum 23 ±1 ° C mit einem 12 h Licht/12 h dunklen Zyklus untergebracht. Tierbetreuung Protokolle und Experimente wurden gemäß den Richtlinien für Tier-Experimente an der Aichi Medical University durchgeführt und von der etablierten Tier Pflege und Nutzung Ausschuss angenommen wurden.
1. Vorbereitung des Kulturmediums und Gerichte
- Fügen Sie um grundlegende Kulturmedium vorzubereiten, fetalen bovine Serum (FBS, 5 % V/V), FSH (100 mIU/mL), LH (10 mU/mL) und Penicillin-Streptomycin (Penicillin, 100 U/mL; Streptomycin, 100 mg/mL), minimale wesentliche mittlere Alpha (MEM-Alpha) und mischen in 50 mL Röhrchen.
Hinweis: Gesamtvolumen der erforderlichen Nährmedien variieren zwischen Experimente, aber 1 mL Kulturmedium ist in der Regel ausreichend für 3,5 cm Glasboden Kultur Gerichte. - Gießen Sie 1 mL Aliquote gemischte Kulturmedium in 3,5 cm Glasboden Kultur Gerichte und Gerichte eingelassen Sie statt 30 mm Zelle Kultur Einsätze. Wärmen Sie vor, Medien und Gerichte in einem Inkubator (5 % CO2 und 37 ° C).
2. Vorbereitung von Eierstockgewebe
- Pre-warme Phosphat gepufferte Kochsalzlösung (PBS) (−) und MEM-Alpha mit 5 % FBS, 100 U/mL Penicillin und 100 mg/mL Streptomycin im Inkubator (5 % CO2 und 37 ° C).
Hinweis: Etwa 3 mL Aliquote von PBS (−) pro Eierstock sind ausreichend für den Einsatz im Eierstock Sezierungen, und 1 mL Aliquots der MEM-Alpha sind ausreichend für die vorübergehende Speicherung einzelner Eierstöcke in 3,5 cm Gerichte. -
Verbrauchsteuern Sie Eierstöcke aus 4 - Wochen alten weiblichen ICR (benannt nach dem Institute of Cancer Research) Mäusen und trimmen Sie das Gewebe um den Eierstock mit Schere und Pinzette stereoskopische Mikroskop zu. Reservieren Sie die entfernten Eierstöcken in Kulturmedium (siehe Punkt 2.1) bis zur Verwendung.
- Statt einzelne Eierstöcke auf Filterpapier befeuchtet mit vorgewärmt PBS (−) (siehe Punkt 2.1) und in Scheiben schneiden in 4 Stücke, die mit einem Mikrotom Klinge unter dem stereoskopische Mikroskop.
Hinweis: Eierstöcke der 4 - Wochen alten ICR Mäuse sind ca. 2 mm im Durchmesser. Die Anzahl der Stücke hängt von der Eierstock-Größe; etwa 500 µm Dicke Stücke erlauben jedoch für korrekte Follikel Beobachtungen (in Stücke dicker als 500 mm, Gewebe Transparenz wird verringert; in Stücke dünner als 500 mm, viele antrale Follikel sind gebrochen und verloren). - Legen Sie nach Dissektion die in Scheiben geschnittenen Eierstock Exemplare in vorgewärmten Kulturmedium in 3,5 cm Gerichte (siehe Punkt 2.1).
- Statt einzelne Eierstöcke auf Filterpapier befeuchtet mit vorgewärmt PBS (−) (siehe Punkt 2.1) und in Scheiben schneiden in 4 Stücke, die mit einem Mikrotom Klinge unter dem stereoskopische Mikroskop.
(3) Eierstock Gewebekultur
- Fallen etwa 0,5 µL Kulturmedium pro geschnitten eierstockgewebe auf die Zelle Kultur einfügen wo werden die ovarielle Gewebe mit einer Mikropipette eingestellt.
- Platzieren Sie jedes geschnittene Muster zu einem Tropfen Kulturmedium auf die Zelle-Kultur-Einsätze mit einer Pinzette.
- Kultur der Eierstock-Gewebe in 5 % CO2 bei 37 ° C.
- Ersetzen Sie das Kulturmedium mit frischen vorgewärmten Medium alle 2 Tage.
Hinweis: Der Zeitplan für mittlere Veränderungen für die Kultur der Eierstock Abschnitte von 4 - Wochen alten ICR Mäusen ist in Abbildung 1dargestellt.- Für die Reproduktion den LH-Anstieg behandeln Sie kultivierten 4 - Wochen alten ICR Mäuse Eierstöcke mit dem Medium mit 100 mU/mL FSH und LH für 12 h alle 4 Tage (Abbildung 1).
(4) Mikroskopaufnahmen kultivierten Eierstöcke
- Starten Sie imaging die kultivierten Eierstöcke nach Tag 1 Wenn das Gewebe auf die Zelle Kultur Einsätze geklebt haben und konfokale oder umgekehrtes Mikroskop Analysen in 24 h Abständen ausreichend Follikelwachstums zwischen Zeitpunkten zu ermöglichen.
Hinweis: Konfokale Mikroskopie ist besser als invertierte Mikroskopie zur Beobachtung von Follikeln in ganzen kultivierten Eierstöcke.
(5) Zeitraffer Imaging kultivierten Eierstöcke
-
Optimieren Sie die Time-Lapse imaging Bedingungen, einschließlich Laser-Intensitäten und Belichtungszeiten für die imaging-System (Tabelle 1).
- Wählen Sie gepaarten Eierstock Proben von einzelnen Mäusen für den Einsatz als Behandlung und Kontrollgruppen. Variieren Sie Laser Intensitäten und Belichtungszeit, die besten Bilder (Tabelle 1) zu erreichen.
- Vergleichen Sie Follikelwachstums unter jeder Bedingung Kultur durch die Messung der Follikel Bereiche in Bildern von Kontrollproben in 24-Stunden-Intervallen und in Zeitraffer bildgebenden Proben (siehe Schritt 6). Gleichzeitig die Anzahl der Eisprung Eizellen in jedem Eierstock-Satz und wählen Sie die optimale Zeitraffer imaging Bedingungen.
- Die Aufnahmen Sie in 30 min Abständen mit Zeitraffer-imaging-System unter den festgelegten Bedingungen (Tabelle 1).
(6) Follikel Wachstum Analyse
-
Um die Entwicklung der Follikel zu analysieren, Messen Sie die Follikel Bereiche der aufgenommenen Bilder mit ImageJ-Software (http://resbweb.nih.gov/ij/).
- Zunächst legen Sie den Maßstab des Bildes durch Klicken auf "Set Scale" unter "Analysieren" in der Symbolleiste. Geben Sie die Seitenlängen der das aufgenommene Bild und der entsprechenden Anzahl von Pixel in die leeren Felder der "Bekannten Abstand" und "Abstand in Pixel", beziehungsweise.
- Klicken Sie auf "Freie Hand" in der Symbolleiste und skizzieren Sie die Follikel in den erfassten Hellfeld-Bildern zu.
- Klicken Sie auf "Messen" unter "Analysieren" in der Symbolleiste.
Hinweis: Wenn andere Messdaten gewünscht werden, klicken Sie auf "Messung" unter "Analysieren" in der Werkzeugleiste, und überprüfen Sie die entsprechenden Felder in der Liste.
7. Analyse der Entwicklung der Follikel mit transgenen Mäusen
- Sammeln Sie Eierstöcke von postnatalen Tagen 0 und 4 (P0 und P4) weibliche Transgene Mäuse mit den transgenen Oog1pro3.9 R26-H2B-mCherrund Kultur auf Einsätze wie in beschrieben Schritte 1.1 – 3.2, außer nicht Slice der P0 und P4 Eierstöcke.
- Ersetzen Sie das Kulturmedium mit frischen, vorgewärmten Medium in 3,5 cm Gerichte in einem Inkubator mit 5 % CO2 bei 37 ° C alle 2 Tage.
Hinweis: Die Konzentration von LH in das Kulturmedium P0 und P4 Eierstöcke kann konstant bleiben, weil LH Überspannungen in P0 und P4 Mäuse nicht vorkommen. - Legen Sie das Mikroskop nur AcGFP1-positiven primären Follikel in kultivierten P4 Eierstöcken (Tabelle 1) zu visualisieren.
Hinweis: Nur ursprüngliche und primäre Follikel sind in P4 weibliche Maus Eierstöcke. - Die Aufnahmen der kultivierten P0 Oog1pro3.9/R26-H2B-mCherry Transgene Mäuse Eierstöcke in 30 min Abständen mit den Einstellungen für P4 Eierstöcke (siehe Punkt 5.2).
- Verfolgen Sie und analysieren Sie Follikel Entwicklung mit AcGFP1 und H2B-mCHerry Signale.
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Representative Results
Abbildung 1 zeigt das Protokoll für Änderungen in den Medien während der ovariellen Gewebe-Kultur. Nach diesem Programm 4 Wochen alten ICR Mäuse Eierstöcke wurden kultiviert und in 24-Stunden-Abständen mit konfokalen Mikroskopie (Abbildung 2) abgebildet. Während der Kultur der Eierstock Gewebe für 3 Wochen die meisten antral und sekundäre Follikel wurden durch Follikel Atresie degeneriert und einige waren Eisprung (Abbildung 2D und Tabelle 2). Bei Analyse der Follikel Flächen mithilfe von ImageJ (Abbildung 3) einige Follikel in Gruppen bei jedem LH-Anstieg-Zyklus (Abbildung 3B und ergänzende Film 1) entwickelt. Darüber hinaus ist Eisprung fast zeitgleich in getrennten kultivierten Eierstöcke aus rechten und linken Eierstöcken von einzelnen Mäusen aufgetreten. In der Erwägung, dass der Zeitpunkt der Ovulation und die Zahl der Eisprung Eizellen (Tabelle 2) unterschieden zwischen Maus Eierstöcke (Daten nicht gezeigt), aufgetreten Eisprung aus kultivierten Eierstöcken überwiegend innerhalb von 48 h von LH Überspannungen (Abbildung 3, und zusätzliche Film 1). Jedoch nicht alle ovulated Eizellen veröffentlicht erste Polkörper nach dem Eisprung (Abbildung 2E und Tabelle 2), und obwohl Eisprung Eizellen befruchtet werden, könnte die Entwicklung eingestellt auf 4-Zell-Stadium (Daten nicht gezeigt). Um Mechanismen zu erhellen durch die ruhende primordialfollikel in Maus Eierstöcke aktiviert werden, erkannt wir ursprüngliche Follikel Aktivierung in kultivierten Gewebe aus transgenen Mäuse tragen Oog1pro3.9 und R26-H2B-mCherry transgene. Abbildung 4 Abbildung 5und ergänzende Film 2). Eizellen express sehr niedriges Niveau des Oog1 Gens von der primordialen Follikel-Bühne und Zeitraffer Bildgebung ausgezeichnet niedrigen AcGFP1 exprimierenden primordialfollikel aus dem hohen AcGFP1 exprimierenden primären Follikel. Ursprüngliche und primäre Follikel sind gleichzeitig im P4 Maus Eierstöcke vorhanden, während nur primordialfollikel in P0 Eierstöcke (Abbildung 4A, B) vorhanden sind. So haben wir optimiert Zeitraffer Image Bedingungen nur primäre Follikel in kultivierten P4 Eierstöcke (Abb. 4C) erkennen. Anschließend haben wir Bilder von kultivierten P0 Eierstöcke für 10 Tage unter den gleichen Bedingungen (Abbildung 4-D-G). AcGFP1 kann verwendet werden, als Index der primären Follikel in diesen transgenen Mäusen und AcGFP1-positiven primären Follikel waren nachweisbar in kultivierten P0 Eierstöcken nach 30-40 h Kultur (Abbildung 4, Abbildung 5A-Fund zusätzliche Film 2). Ursprüngliche und primäre Follikel in den Eierstöcken gebildete zeichneten sich auch durch mCherry-positiven Kerne der Granulosa Zellen (Abbildung 5B, E). Insbesondere mCherry Signale zeigen Formen der Follikel und Beobachtung der Follikel Stadien in kultivierten Eierstöcken (Abbildung 5B, E und H) zu ermöglichen. Daher dieses Kultursystem mit Eierstöcke aus Oog1pro3.9/R26-H2B-mCherry Mäusen zeigte den Prozess der frühen Entwicklung der Follikel von ur, sekundäre Follikel Phasen. Diese Methoden werden Studien über die regulatorischen Mechanismen der Gonadotropin-unabhängige Follikel Entwicklung erleichtern.
Abbildung 1 : Zeitlicher Verlauf der mittleren Änderungen. Mittlere A enthält 5 % FBS, 100-mU FSH, 10-mU LH, 100 U/mL Penicillin und 100 mg/mL Streptomycin in MEM-Alpha. Medium B enthält 5 % FBS, 100-mU FSH, 100-mU LH, 100 U/mL Penicillin und 100 mg/mL Streptomycin in MEM-Alpha. Medium B wurde zur LH Überspannungen alle 4 produzieren. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 2 : Bilder der kultivierten ovariellen Gewebe. Die Bilder wurden in 24-Stunden-Abständen mit konfokalen Mikroskopie aufgenommen. (A) Kultur Tag 1; (B) Tag der Kultur 5; (C) Tag der Kultur 10; (D) Tag der Kultur 13; (E) Magnified Image der Region gekennzeichnet durch das Quadrat (d); Eizellen in D waren aus den Follikeln angezeigt durch Pfeile in B, C und D. (F) Eizelle freigeben ein Polkörper nach dem Eisprung Eisprung; Maßstabsleiste = 200 µm. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 3 : Messungen der Follikel Gebiete in kultivierten Eierstöcke. (A) Bild der kultivierten Eierstock; gepunktete Linien stellen den Bereich von ImageJ gemessen. (B) follikulären Gebiete in kultivierten Eierstock nach 3 Wochen; graue Linien repräsentieren die kulturdauer von der Zugabe von 100 mM LH (LH-Anstieg). Linien zeigen die Entwicklungsstadien in jedes Follikel in den Eierstöcken gebildete; Maßstabsleiste = 200 µm. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 4 : Hämatoxylin und Eosin (H & E) Färbung Bilder von P0 und P4 Eierstöcke und Zeitraffer Imaging. (A) H & E Färbung der P0 Eierstock; (B) H & E Färbung des P4 Eierstock; (C) Bild von einem P4 Eierstock aus einer Oog1pro3.6 transgenen Maus nach 10 h Kultur. Der Pfeil zeigt einen AcGFP1-positiven primären Follikel. (D-G) Bilder von P0 Eierstöcke von transgenen Mäusen mit dem Ausdruck Oog1pro3.9 und R26-H2B-mCherry; grüne und rote Signale in D und F stehen für AcGFP1 und mCherry, beziehungsweise. White-Signale in E und G AcGFP1 in D und F, bzw. vertreten. D und E sind Bilder der kultivierten Eierstöcke nach 0,5 h Kultur. F und G zeigen die Eierstöcke nach 180 h Kultur; Maßstabsleiste = 100 µm. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 5: Bilder der primordialen, Primär und Sekundär Follikel in kultivierten Ovarien von oog1pro3.9/R26-H2B-mCherry Mäuse. (A–C) Bilder der primordialfollikel in kultivierten P0 Eierstöcke; (D–F) Bilder der primären Follikel in P0 kultivierten Eierstock; (G–H) Bilder der sekundäre Follikel in den Eierstöcken gebildete 4 Wochen alten Maus. A, D und G sind zusammengeführten Bilder von B und C, E und F und H und I, beziehungsweise. Grün, AcGFP1; rot, mCherry; Maßstabsleiste = 100 µm. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
| Mikroskop | Objektivlinse | Laser | Exposition (ms) | Zu gewinnen | Zeitintervall | Z-Stapel | andere | Figuren und Filme |
| CV1000 | X10 | 488 nm: 30, 561 nm: 20 | 488 nm: 700, 561 nm: 600 | 488 nm: 90, 561nm: 20 | 30 min | 5 mm | Abbildung 4C-G, Movie 1 und 2 | |
| BZ-X700 | X20 (mit Sammlung Kragen) | 40 % | Auto | X4 | 30 min | 10 mm | Binning 3 x 3 | Film 3 |
| LSM710 | X10 | 488 nm: 6 %, 564 nm: 5 % | Kamerageschwindigkeit: 4 | 488 nm: 850, 564 nm: 850 | 24 h | 10 mm | Digital zu gewinnen, 488 nm: 2, 564 Nm:1 | Abbildung 2, 3 und 5 |
Tabelle 1: Zeitraffer imaging Bedingungen. Time-Lapse bildgebenden Voraussetzung für konfokale und hellen Bereich Mikroskope.
| Eierstock keine. | Anzahl der insgesamt Eisprung Eizellen | Anzahl der MII Eizellen |
| 1 | 7 | 2 |
| 2 | 19 | 9 |
| 3 | 14 | 6 |
| 4 | 7 | 3 |
| 5 | 12 | 4 |
| 6 | 15 | 6 |
| 7 | 25 | 11 |
| 8 | 13 | 3 |
| 9 | 11 | 7 |
| 10 | 19 | 8 |
| 11 | 18 | 4 |
| 12 | 7 | 1 |
Tabelle 2: Anzahl der Eisprung Eizellen in den Eierstöcken gebildete. Zahl der Eisprung Eizellen aus zwölf kultivierten Eierstöcken; MII zeigt die Nummern der Eisprung Eizellen, die erste Polkörper nach dem Eisprung freigegeben.
Ergänzende Film 1: Zeitrafferfilm des kultivierten fruchtknotens. Eierstöcke waren wurden gesammelt von den 4 - Wochen alten Mäusen in Scheiben geschnitten und für 3 Wochen kultiviert. Der Film umfasst eine kulturdauer von 0 – 200 h bei 10 Frames/s. Klicken Sie hier um dieses Video anzuzeigen. (Rechtsklick zum download)
Ergänzende Movie 2: Zeitraffer-Film von einem kultivierten P0 Eierstock aus einer transgenen Maus. Grün, AcGFP1; rot, mCherry. Der Film umfasst eine kulturdauer von 0 – 180 h bei 10 Frames/s. Klicken Sie hier um dieses Video anzuzeigen. (Rechtsklick zum download)
Ergänzende Film 3: Zeitraffer-Film von einem kultivierten Eierstock aus einer 4-Wochen alten Maus. Grün, AcGFP1; rot; mCherry; der Film umfasst eine kulturdauer von 9 – 13 Kulturtage mit 10 Frames/s. Zeigen die Pfeile in das erste Bild Follikel in die Atresie während Kultur eingetreten ist. Bitte klicken Sie hier, um dieses Video anzusehen. (Rechtsklick zum download)
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Discussion
In dieser Studie haben wir zwei neue Methoden für die Untersuchung der Entwicklung der Follikel in den Eierstöcken Maus entwickelt. Die erste Methode beinhaltet Kultur der geschnittenen Eierstock Erwachsener Mäuse Gewebe gefolgt von Analysen zur Entwicklung der Follikel, und die zweite beinhaltet die Verwendung von Time-Lapse imaging zu visualisieren, frühe Entwicklung der Follikel bei der Gonadotropin-unabhängig. Zuvor wir verwendet das vorliegende Eierstock Gewebekultur Verfahren zur Beurteilung der Wirkung von hemmenden Faktor Leukämie und Progesteron am Follikel Entwicklung8,9, und ergab, dass deren Auswirkungen mit Konzentration und Follikel Bühne. In der vorliegenden Studie in Scheiben geschnitten ovariellen Gewebe ausgestellt Follikel Dynamik, rechtfertigt weitere Analysen des Mechanismus der Follikel-Entwicklung unter Verwendung dieses Modells.
Eierstöcke von Mäusen von mehr als 5 Wochen alt enthalten Korpus Lutea, die mikroskopische Beobachtungen behindert. Daher 4 Wochen altes Baby Maus Eierstöcke werden bevorzugt für die Beobachtung der Entwicklung der Follikel und Eisprung, und nachfolgende späten primär-, Sekundär- und antrale Follikel unterscheiden sich leichter mit Hellfeld Mikroskopieren. Unsere Methoden bieten Vergleiche der Effekte von Wachstumsfaktoren und Drogen in Kulturmedien, mit erkennbaren Veränderungen der Follikel Entwicklung zwischen differentiell behandelten Eierstöcke (Abbildung 3).
Transgene Mäuse, die mit dem Ausdruck Cre oder Fluorescein Proteine in Eizellen wurden in früheren Studien18,19,20beschrieben. Follikulären Etappenklassement hängt jedoch von histologischen Eigenschaften einschließlich Granulosa Zelle Formen, Zahlen von Granulosa Zellschichten und ob Theca-Zellen gebildet werden. Demzufolge möglicherweise Unterscheidungen zwischen ursprünglicher und primären Follikel aus den Beobachtungen der Eizellen allein beschränkt. Hierin, wir benutzten Transgene Mäuse, die mit den Oog1pro3.9 und R26-H2B-mCherry transgene11,17 und Follikel Frühentwicklung von ur, sekundäre Follikel Stadien in kultivierten Eierstöcke zu visualisieren. Oog1 Ausdruck wird nachweisbar in Eizellen während der primordialen Follikel-Phase und wird in primären Follikel deutlich erhöht. Daher die AcGFP1 Signalintensitäten in Eizellen sind Follikel Phase (Abbildung 5) zugeordnet und wurden verwendet, um den ursprünglichen primären Follikel Übergänge (Abbildung 4, ergänzende Movie 2) zu beobachten. Zellkerne sind in R26-H2B-mCherry Transgene Mäuse (Abbildung 4, ergänzende Movie 2und ergänzende Movie 3), so dass Beobachtungen der Follikel Stufen nach Zahlen der Granulosa Zellen (rot gefärbt. ( Abbildung 5). Gemeinsam die heutigen Methoden ermöglichen so Analysen der Follikel Entwicklung vom ursprünglichen durch zum Eisprung mit Oog1pro3.9/R26-H2B-mCherry transgenen Mäusen. Darüber hinaus da Apoptotic Zelle Chromatin verdichtet wird, sind mCherry Signale der atretic Follikel stärker als die normalen Follikel (ergänzende Movie 3).
Unter methodischen Feinheiten sind richtige dicken Scheiben Gewebe erforderlich für die erfolgreiche Kultivierung mit verstärkten Zelltod im Eierstock-Scheiben, die zu dick sind und Verluste von großen antrale Follikel im Eierstock-Scheiben, die zu dünn sind. Die Wachstumsgeschwindigkeit der Follikel ist langsam; Daher ist es leicht zu verfolgen und analysieren den Prozess der jedes Follikel durch 24-h-Intervall Beobachtung. Die vorliegende confocal Mikroskop einstellen, einschließlich der Laserintensität Intervallzeit und digitale Verstärkung sind abhängig von der mikroskopmodus, aber sind kritisch zu prüfen, beim Zeitraffer Bilder abrufen. Vor allem starke Laser Intensitäten und lange Belichtungszeiten sind erforderlich, um klare Bilder zu erfassen, aber kultivierte Zellen beeinflussen können. Moderation von diesen Einstellungen Phototoxizität zu vermeiden ist daher entscheidend. In Scheiben geschnittene ovariellen Gewebe der 4 Wochen alten Mäusen gezüchtet werden können für ca. 4 Wochen, während die ursprüngliche und primäre Follikel anschließend anwesend bleiben sie nicht mehr wachsen. Im Gegensatz dazu können P0 und P4 Eierstöcke für etwa 10 Tage kultiviert werden, während die ursprüngliche und primäre Follikel in primäre oder sekundäre Follikel, bzw. zu entwickeln. Follikel in kultivierten P0 und P4 Eierstöcken entwickeln sich jedoch nicht in antrale Follikel. Daher ist die Exzision der Eierstöcke in verschiedenen Stadien für Studien der Regulationsmechanismen, die im Zusammenhang mit ganzen Eierstock Follikel Entwicklung erforderlich.
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Disclosures
Die Autoren haben nichts preisgeben.
Acknowledgments
Wir danken Dr. Naojiro Minami (Kyoto University) für die Bereitstellung der Oog1pro3.9 Mäuse. Diese Forschung wurde von der JSPS (KAKENHI # JP15H06275) und der Nitto-Stiftung unterstützt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Follicle stimulating hormone from human pituitary | SIGMA | F4021 | |
| Lutenizing hormone from equine pituitary | SIGMA | L9773 | |
| Penicillin-streptomycin solution | Wako Pure Chemical Industries | 168-23191 | |
| MEM a, GlutaMax, no nucleotides | Thermo Fisher | 32561037 | |
| Glass bottom dish | MatTek | P35G-0-10-C | 35mm dish, No. 0 coverslip, 10mm glass diameter |
| Millicell cell culture insert | Merck Millipore | PICM0RG50 | Diameter: 315 mm, pore size: 0.4 mm, material: hydrophilic PTTE |
| 3.5cm cell culture dishes | greiner bio-one | 627160 | |
| 50ml / centrifuge tube with triple seal cap | IWAKI | 2345-050 | |
| Low-profile disposable blades 819 | Leica | 14035838925 | |
| LSM 710 | Carl Zeiss | Confocal microscope | |
| CellVoyager, CV1000 | Yokogawa Electric Corporation | Time-lapse imaging | |
| BZ-X700 | KEYENCE | Time-lapse imaging |
References
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