Summary
डिम्बग्रंथि ऊतक संस्कृतियों कूप विकास, ovulation, और कूप अविवरता के मॉडल के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है और गतिशील डिम्बग्रंथि प्रक्रियाओं के विनियामक तंत्र से संकेत मिलता है ।
Abstract
स्तनधारी महिलाओं को समय पर प्रत्येक मद चक्र के दौरान अंडाणुओं की एक लगभग निरंतर संख्या ovulation । इस तरह की नियमितता और आवधिकता बनाए रखने के लिए, विनियमन हाइपोथैलेमस-पिट्यूटरी-जननांगों अक्ष स्तर पर और अंडाशय में विकसित कूप पर होता है । सक्रिय अध्ययन के बावजूद, कूप विकास तंत्र कई कदम निष्क्रिय मौलिक कूप सक्रियण से ovulation के लिए शामिल की वजह से स्पष्ट नहीं हैं, और विनियमन जटिलता की वजह से है कि प्रत्येक तोंसिल्लितिस मंच पर अलग है । कूप विकास के तंत्र की जांच करने के लिए, और मद चक्र भर में रोम के गतिशीलता, हम एक माउस डिम्बग्रंथि ऊतक संस्कृति मॉडल है कि एक खुर्दबीन का उपयोग कूप विकास का पालन किया जा सकता है विकसित की है । व्यवस्थित कूप विकास, आवधिक ovulation, और कूप अविवरता सभी प्रसंस्कृत अंडाशय मॉडल में reproduced किया जा सकता है, और संस्कृति की स्थिति प्रयोग संग्राहक किया जा सकता है । यहां, हम कूप विकास और अंय डिंबग्रंथि घटना के विनियामक तंत्र के अध्ययन में इस पद्धति की उपयोगिता का प्रदर्शन ।
Introduction
महिला माउस अंडाशय कई हजार रोम1होते हैं, और आवधिक ovulation प्रत्येक मद चक्र में लगभग दस अंडाणुओं परिपक्व होती है । रोम कई विकास चरणों में वर्गीकृत कर रहे हैं: मौलिक, प्राथमिक, माध्यमिक, कोटरीय, और Graafian कूप, granulosa सेलुलर प्रत्येक oocyte के आसपास परत के रूप पर निर्भर करता है । अधिकांश मौलिक कूप निष्क्रिय कर रहे हैं, और उनमें से कुछ सक्रिय और प्रत्येक मद चक्र2में प्राथमिक कूप में विकसित कर रहे हैं । माध्यमिक तोंसिल्लितिस चरण के बाद, कूप विकास मुख्य रूप से गोनैडोट्रॉपिंस, तोंसिल्लितिस उत्तेजक हार्मोन (FSH), और luteinizing हार्मोन (LH) द्वारा विनियमित है । हालांकि, मौलिक और प्राथमिक कूप विकास गोनॉडोट्रॉफिन से स्वतंत्र है, और विनियामक तंत्र है कि इन चरणों को नियंत्रित3,4,5inderstood खराब रहते हैं । वृद्धि कारकों और हार्मोन के अलावा, मौलिक और प्राथमिक कूप रोम6,7के बीच बातचीत के द्वारा विनियमित है । इसलिए, हम माउस अंडाशय के ऊतकों में कूप गतिशीलता का विश्लेषण किया, और डिम्बग्रंथि ऊतक संस्कृतियों8,9,10का उपयोग कर जुड़े विनियामक तंत्र की जांच की ।
साथ ही, हम दो डिंबग्रंथि ऊतक संस्कृति मॉडल तरीकों परिचय । पहले के लिए फुफ्फुसीय क्षेत्रों की माप द्वारा कूप विकास का विश्लेषण किया जाता है, और दूसरा ट्रांसजेनिक चूहों के साथ माध्यमिक कूप चरण के लिए मौलिक से जल्दी कूप विकास के दौरान विनियामक तंत्र का अध्ययन करने के लिए प्रयोग किया जाता है । कूप विकास विश्लेषण के लिए, हम मुख्य रूप से 4 सप्ताह पुराने मादा चूहों के अंडाशय का इस्तेमाल किया, क्योंकि वे रोम के आसान दृश्य के लिए अनुमति देते हैं । vivo कूप विकास में आवधिक ovulation और मॉडल प्रेरित करने के लिए, हम LH वृद्धि reproduced और ovulation मनाया, कूप अविवरता, और ऊतक संस्कृति की स्थिति के तहत एस्ट्राडियोल के स्राव । संस्कृतिपूर्ण अंडाशय की छवियाँ कैप्चर किए गए थे, और कूप विकास प्रक्रियाओं को तोंसिल्लितिस क्षेत्र में परिवर्तन अनुरेखण द्वारा विश्लेषण किया गया । हालांकि, चमकीले क्षेत्र माइक्रोस्कोपी विश्लेषण में, मौलिक और प्रारंभिक प्राथमिक कूप के बीच भेद अस्पष्ट था । इस प्रकार, हम छोटे रोम का पता लगाने के लिए एक विधि विकसित की है, और मौलिक, प्राथमिक, और Oogenesin1 (Oog1) pro3 का उपयोग कर संस्कृतिपूर्ण डिम्बग्रंथि ऊतकों में माध्यमिक कूप के बीच भेद । 9 और R26-H2B-mCherry ट्रांसजेनिक चूहों अंडाशय के दिनों में 0 और 4 जन्म के बाद11. Oog1 अभिव्यक्ति अंडाणुओं में अर्धसूत्रीविभाजन में प्रवेश के बाद पता लगाने में है, और धीरे से कूप विकास के साथ बढ़ जाती है, मौलिक से प्राथमिक कूप के लिए संक्रमण के अवलोकन की अनुमति समय का उपयोग करते हुए, संस्कृतिपूर्ण अंडाशय ऊतक 11 के चूक छवियों ,12. हालांकि रूपात्मक तरीके कारकों है कि निष्क्रियमौलिक कूप13,14,15,16, अंडाशय में शारीरिक कूप विकास सक्रिय अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया गया है मुश्किल निरीक्षण करने के लिए, और विभिंन कारकों के प्रभाव के लक्षण रहते हैं । वर्तमान संस्कृति के तरीकों को लक्षित कारकों में से वास्तविक समय विश्लेषण में इस धनाभाव का पता डिजाइन किए गए थे ।
वर्तमान अध्ययन में, हम एक समय चूक इमेजिंग विधि का उपयोग कर तोंसिल्लितिस के विकास पर नज़र रखी और कूप विकास की प्रक्रिया की विशेषता । हमारे उपंयास तरीकों अंडाशय के फिजियोलॉजी की जांच के लिए एक अभूतपूर्व उपकरण प्रदान करते हैं ।
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Protocol
चूहों एक 12 ज प्रकाश/12 एच अंधेरे चक्र के साथ 23 ± 1 ° c में एक पर्यावरण की दृष्टि से नियंत्रित कमरे में स्थित थे । पशु देखभाल प्रोटोकॉल और प्रयोगों के अनुसार आईची चिकित्सा विश्वविद्यालय में पशु प्रयोग के लिए दिशा निर्देशों के साथ आयोजित किया गया और वर्तमान पशु देखभाल और उपयोग समिति द्वारा अनुमोदित किया गया ।
1. संस्कृति माध्यम और व्यंजन तैयार करना
- बुनियादी संस्कृति माध्यम तैयार करने के लिए, भ्रूण गोजातीय सीरम जोड़ें (FBS, 5% v/v), FSH (१०० mIU/एमएल), LH (10 mU/एमएल), और पेनिसिलिन-streptomycin (पेनिसिलिन, १०० U/एमएल; streptomycin, १०० मिलीग्राम/एमएल) ंयूनतम आवश्यक मध्यम अल्फा (मेम-अल्फा) और ५० मिलीलीटर ट्यूबों में मिश्रण ।
नोट: आवश्यक संस्कृति मीडिया की कुल मात्रा प्रयोगों के बीच बदलती हैं, लेकिन संस्कृति माध्यम के 1 मिलीलीटर आम तौर पर ३.५ सेमी गिलास नीचे संस्कृति व्यंजन के लिए पर्याप्त है । - ३.५ सेमी ग्लास-नीचे संस्कृति व्यंजन में मिश्रित संस्कृति माध्यम के 1 मिलीलीटर aliquots डालो और जगह सेट 30 मिमी सेल संस्कृति व्यंजन में आवेषण । पूर्व गर्म मीडिया और एक मशीन में व्यंजन (5% सह2 और ३७ डिग्री सेल्सियस) ।
2. डिम्बग्रंथि ऊतक की तैयारी
- पूर्व गर्म फॉस्फेट (पंजाब) (−) और मेम-अल्फा 5% FBS, १०० यू/एमएल पेनिसिलिन, और १०० मिलीग्राम/एमएल streptomycin एक मशीन में (5% सह2 और ३७ डिग्री सेल्सियस) युक्त ।
नोट: (−) अंडाशय प्रति पंजाब के लगभग 3 मिलीलीटर aliquots अंडाशय विच्छेदन के दौरान उपयोग के लिए पर्याप्त हैं, और मेम-अल्फा के 1 मिलीलीटर aliquots ३.५ सेमी व्यंजन में एकल अंडाशय के क्षणिक भंडारण के लिए पर्याप्त हैं । -
4 सप्ताह पुरानी महिला ICR से उत्पाद शुल्क अंडाशय (कैंसर अनुसंधान संस्थान के नाम पर) चूहों और एक त्रिविम माइक्रोस्कोप के तहत कैंची और चिमटी का उपयोग कर अंडाशय के आसपास के ऊतकों ट्रिम कर दीजिए । हटाया अंडाशय संस्कृति मध्यम (२.१ चरण देखें) में उपयोग तक आरक्षित ।
- फ़िल्टर कागज पर एक अंडाशय प्लेस पूर्व गर्म पंजाब के साथ गीला (−) (चरण २.१ देखें) और एक त्रिविम माइक्रोस्कोप के तहत एक microtome ब्लेड का उपयोग कर 4 टुकड़ों में टुकड़ा ।
नोट: 4 सप्ताह पुराने ICR चूहों के अंडाशय व्यास में लगभग 2 मिमी हैं । टुकड़ों की संख्या अंडाशय आकार पर निर्भर करता है; हालांकि, के बारे में ५०० µm मोटे टुकड़े उचित कूप टिप्पणियों के लिए अनुमति देते हैं (टुकड़ों में ५०० मिमी से मोटा, ऊतक पारदर्शिता में कमी आई है; टुकड़ों में ५०० mm से पतले, कई कोटरीय कूप टूट रहे है और खो) । - विच्छेदन के बाद, पहले से गरम संस्कृति मध्यम में कटा हुआ अंडाशय नमूनों प्लेस ३.५ cm व्यंजन (२.१ कदम देखें) ।
- फ़िल्टर कागज पर एक अंडाशय प्लेस पूर्व गर्म पंजाब के साथ गीला (−) (चरण २.१ देखें) और एक त्रिविम माइक्रोस्कोप के तहत एक microtome ब्लेड का उपयोग कर 4 टुकड़ों में टुकड़ा ।
3. डिम्बग्रंथि ऊतक संस्कृति
- सेल संस्कृति डालने पर कटा हुआ डिंबग्रंथि ऊतक प्रति संस्कृति मध्यम के लगभग ०.५ µ एल ड्रॉप जहां डिम्बग्रंथि ऊतक एक micropipette का उपयोग कर सेट किया जाएगा ।
- सेल संस्कृति पर संस्कृति माध्यम की एक बूंद में प्रत्येक कटा हुआ नमूना जगह चिमटी का उपयोग आवेषण ।
- संस्कृति 5% सह2 में अंडाशय के ऊतकों ३७ डिग्री सेल्सियस पर ।
- संस्कृति माध्यम को ताजा पूर्व गर्म माध्यम से हर 2 दिन बदलें ।
नोट: 4-सप्ताह पुराने ICR चूहों से अंडाशयी वर्गों की संस्कृति के लिए मध्यम परिवर्तन के लिए अनुसूची चित्रा 1में प्रस्तुत किया गया है ।- lh वृद्धि को पुन: पेश करने के लिए, 4-FSH म्यू हर 4 दिन (चित्रा 1) 12 एच के लिए १०० ंयू युक्त मध्यम के साथ ICR चूहों अंडाशय सप्ताह पुराने व्यवहार करते हैं ।
4. कल्चरल अंडाशय के माइक्रोस्कोप छवियां
- इमेजिंग शुरू 1 दिन के बाद प्रसंस्कृत अंडाशय जब ऊतकों सेल संस्कृति आवेषण पर पालन किया है, और फोकल या औंधा माइक्रोस्कोप विश्लेषण पर 24 घंटे के अंतराल के समय अंक के बीच पर्याप्त कूप विकास की अनुमति है ।
ध्यान दें: फोकल माइक्रोस्कोपी पूरी संस्कृतिपूर्ण अंडाशय में रोम देख के लिए औंधा माइक्रोस्कोपी से बेहतर है ।
5. कल्चरल अंडाशय की समय-चूक इमेजिंग
-
इमेजिंग प्रणाली (तालिका 1) के लिए, लेजर तीव्रता और जोखिम बार सहित समय-चूक इमेजिंग शर्तों का अनुकूलन ।
- उपचार और नियंत्रण समूहों के रूप में उपयोग के लिए एकल चूहों से युग्मित अंडाशय नमूनों का चयन करें । लेजर तीव्रता और जोखिम समय के लिए सबसे अच्छा चित्र (तालिका 1) को प्राप्त करने के लिए बदलती हैं ।
- एक संस्कृति की स्थिति के तहत कूप विकास की तुलना में नियंत्रण नमूनों की छवियों में 24 एच अंतराल पर और समय-चूक इमेजिंग नमूनों में कूप क्षेत्रों को मापने के द्वारा (6 कदम देखें) । समवर्ती, प्रत्येक अंडाशय में ovulation अंडाणुओं की संख्या की गणना सेट और इष्टतम समय चूक इमेजिंग शर्तों का चयन करें ।
- निर्धारित शर्तों (तालिका 1) के तहत समय चूक इमेजिंग प्रणाली का उपयोग 30 मिनट के अंतराल पर छवियों पर कब्जा ।
6. कूप विकास विश्लेषण
-
कूप विकास का विश्लेषण करने के लिए, ImageJ सॉफ्टवेयर (http://resbweb.nih.gov/ij/) का उपयोग कर कब्जा कर लिया छवियों में कूप क्षेत्रों को मापने ।
- शुरू में, उपकरण पट्टी में "विश्लेषण" के तहत "सेट पैमाने" पर क्लिक करके छवि के पैमाने पर सेट । कैप्चर की गई छवि की ओर लंबाई दर्ज करें और "ज्ञात दूरी" और "पिक्सेल में दूरी", क्रमशः की रिक्त फ़ील्ड में पिक्सेल की इसी संख्या ।
- उपकरण पट्टी में "मुक्त हाथ" पर क्लिक करें और कब्जा कर लिया उज्ज्वल क्षेत्र छवियों में रोम रूपरेखा ।
- टूल बार में "विश्लेषण" के अंतर्गत "माप" पर क्लिक करें.
नोट: अन्य माप डेटा वांछित हैं, तो उपकरण पट्टी में "विश्लेषण" के अंतर्गत "सेट माप" क्लिक करें, और सूची में उपयुक्त बक्से की जाँच.
7. ट्रांसजेनिक चूहों का उपयोग कर कूप विकास का विश्लेषण
- जन्मोत्तर दिनों से अंडाशय ले लीजिए 0 और 4 (P0 और पी 3) महिला ट्रांसजेनिक चूहों transgenes oog1pro युक्त 3.9 और R26-H2B-mCherr, और के रूप में आवेषण पर संस्कृति कदम 1.1 – 3.2 में वर्णित है, सिवाय P0 और पी 4 अंडाशय टुकड़ा नहीं है ।
- एक मशीन में ३.५ cm व्यंजन में ताजा, पूर्व गरम मध्यम के साथ संस्कृति माध्यम की जगह ३७ डिग्री सेल्सियस हर 2 दिन में2 % सह से युक्त ।
नोट: lh वृद्धि P0 और पी 4 चूहों में नहीं होती है क्योंकि P0 और पी 4 अंडाशय के संस्कृति माध्यम में lh की एकाग्रता स्थिर रह सकते हैं । - सेट माइक्रोस्कोप कल्पना करने के लिए केवल AcGFP1-में सकारात्मक प्राथमिक रोम के कल्चरल पी 4 अंडाशय (तालिका 1).
नोट: केवल मौलिक और प्राथमिक कूप पी 4 महिला माउस अंडाशय में मौजूद हैं । - पर कब्जा छवियों के कल्चरल P0 oog1pro 3.9/R26-H2B-mCherry ट्रांसजेनिक चूहों 30 मिनट में अंडाशय पी 4 अंडाशय के लिए इस्तेमाल किया सेटिंग्स का उपयोग (५.२ कदम देखें) ।
- ट्रेस और AcGFP1 और H2B-mCHerry संकेतों का उपयोग कर कूप विकास का विश्लेषण ।
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Representative Results
चित्रा 1 डिम्बग्रंथि ऊतक संस्कृति के दौरान मीडिया में परिवर्तन के लिए प्रोटोकॉल से पता चलता है. इस कार्यक्रम के बाद, 4 सप्ताह पुराने ICR चूहों अंडाशय और संस्कृति 24-एच में imaged थे फोकल माइक्रोस्कोप (चित्रा 2) का उपयोग कर अंतराल । 3 सप्ताह के लिए अंडाशय के ऊतकों की संस्कृति के दौरान, सबसे कोटरीय और माध्यमिक कूप कूप अविवरता द्वारा पतित थे और कुछ (चित्रा 2डी और 2 तालिका) ovulation थे । कूप ImageJ (चित्रा 3) का उपयोग क्षेत्रों के विश्लेषण में, कुछ रोम प्रत्येक LH वृद्धि चक्र के दौरान समूहों में विकसित (चित्रा 3बी और अनुपूरक फिल्म 1) । इसके अलावा, ovulation लगभग एक साथ एक ही चूहों के दाएँ और बाएँ अंडाशय से अलग प्रसंस्कृत अंडाशय में हुई । जबकि, ovulation के समय और ovulation अंडाणुओं की संख्या (तालिका 2) माउस अंडाशय (डेटा नहीं दिखाया गया) के बीच मतभेद, कल्चरल अंडाशय से ovulation मुख्य रूप से LH बढ़ने के ४८ ज के भीतर हुई (चित्रा 3, और अनुपूरक फिल्म 1). हालांकि, नहीं सभी ovulation अंडाणुओं ovulation के बाद पहले ध्रुवीय निकायों जारी (चित्रा 2ई और 2 तालिका), और यद्यपि ovulation अंडाणुओं निषेचित किया जा सकता है, विकास 4 में बंद-सेल स्टेज (डेटा दिखाया नहीं) । स्पष्ट तंत्र द्वारा जो निष्क्रिय मौलिक कूप माउस अंडाशय में सक्रिय कर रहे हैं, हम oog1pro 3.9 और R26 -H2B- mCherry transgenes ले जाने वाले चूहों से ट्रांसजेनिकed ऊतकों में मौलिक कूप सक्रियण का पता चला ( चित्रा 4, चित्रा 5, और अनुपूरक फिल्म 2) । अंडाणुओं व्यक्त मौलिक कूप चरण से Oog1 जीन के बहुत कम स्तर, और समय चूक इमेजिंग उच्च मौलिक-व्यक्त प्राथमिक कूप से कम AcGFP1-व्यक्त AcGFP1 रोम के विशिष्ट । मौलिक और प्राथमिक कूप पी 4 माउस अंडाशय में एक साथ मौजूद हैं, जबकि केवल मौलिक कूप P0 अंडाशय (चित्रा 4ए, बी) में मौजूद हैं । इस प्रकार, हम समय चूक इमेजिंग शर्तों को अनुकूलित करने के लिए केवल प्राथमिक कूप में पता लगाने के कल्चरल पी 3 अंडाशय (चित्रा 4सी) । बाद में, हम एक ही परिस्थितियों में 10 दिनों के लिए संस्कृतिपूर्ण P0 अंडाशय की छवियों पर कब्जा कर लिया (चित्रा 4डी – जी) । AcGFP1 इन ट्रांसजेनिक चूहों में प्राथमिक कूप के एक सूचकांक के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है और AcGFP1-सकारात्मक प्राथमिक रोम के बाद कल्चरल P0 अंडाशय में detectable थे 30 – 40 ज संस्कृति (चित्रा 4, चित्रा 5ए-एफ, और अनुपूरक फिल्म 2). कल्चरल अंडाशय में मौलिक और प्राथमिक कूप भी granulosa कोशिकाओं के mCherry-पॉजिटिव नाभिक द्वारा प्रतिष्ठित किए गए (चित्रा ५बी, ई). विशेष रूप से, mCherry संकेत रोम के रूपों का संकेत है और संस्कृतिपूर्ण अंडाशय में कूप चरणों के अवलोकन की अनुमति (चित्रा 5बी, ई, और एच) । इसलिए, इस संस्कृति प्रणाली oog1pro से अंडाशय का उपयोग 3.9/R26-H2B-mCherry चूहों माध्यमिक कूप चरणों के लिए मौलिक से जल्दी कूप विकास की प्रक्रिया का पता चला । इन तरीकों गोनॉडोट्रॉफिन-स्वतंत्र कूप विकास के विनियामक तंत्र के अध्ययन की सुविधा होगी ।
चित्रा 1 : मध्यम परिवर्तन का समय पाठ्यक्रम । मध्यम एक शामिल है 5% FBS, १००-म्यू FSH, 10-म्यू LH, 100-U/एमएल पेनिसिलिन, और १०० मिलीग्राम/एमएल streptomycin मेम-अल्फा में । मध्यम बी शामिल है 5% FBS, १००-म्यू FSH, १००-म्यू LH, 100-U/एमएल पेनिसिलिन, और १०० मिलीग्राम/एमएल streptomycin मेम-अल्फा में । मध्यम बी को LH वृद्धि हर 4 उत्पादन के लिए इस्तेमाल किया गया था । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।
चित्रा 2 : संस्कृतिपूर्ण डिंबग्रंथि के ऊतकों की छवियां । छवियां 24 घंटे फोकल माइक्रोस्कोपी का उपयोग कर अंतराल पर कब्जा कर लिया गया । (A) संस्कृति दिवस 1; (ख) संस्कृति दिवस 5; (ग) संस्कृति दिवस 10; (घ) संस्कृति दिवस 13; (ङ) (घ) में वर्ग द्वारा इंगित क्षेत्र की छवि बढ़ाया; डी में अंडाणुओं, बी, सी, और डी (एफ) में तीर द्वारा संकेत कूप से ovulation थे Oocyte ovulation के बाद एक ध्रुवीय शरीर को रिहा; स्केल बार = २०० µm. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।
चित्रा 3 : प्रसंस्कृत अंडाशय में कूप क्षेत्रों की माप । (क) संस्कृतिपूर्ण अंडाशय की छवि; डॉटेड रेखाएं ImageJ द्वारा मापी गई क्षेत्र का प्रतिनिधित्व करती हैं । (ख) 3 सप्ताह के बाद संस्कृतिपूर्ण अंडाशय में फुफ्फुसीय क्षेत्र; धूसर पंक्तियाँ १००-mM lh (LH उछाल) के अलावा से संस्कृति अवधि का प्रतिनिधित्व करते हैं । रेखाएं cultureed अंडाशय में प्रत्येक कूप में विकास चरणों को दिखाने; स्केल बार = २०० µm. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।
चित्र 4 : Hematoxylin और Eosin (एच एंड ई) P0 और पी 4 अंडाशय और समय चूक इमेजिंग की छवियों धुंधला । (क) P0 अंडाशय के एच एंड ई धुंधला; (ख) एच पी 4 अंडाशय के धुंधला और ई; (ग) 10 ज संस्कृति के बाद एक oog1pro 3.6 ट्रांसजेनिक माउस से एक पी 4 अंडाशय की छवि । तीर एक AcGFP1-धनात्मक प्राथमिक कूप दिखाता है । (डी – जी) ट्रांसजेनिक चूहों से P0 अंडाशय की छवियाँ oog1pro 3.9 और R26-H2B-mCherryव्यक्त; डी और एफ में हरे और लाल संकेतों क्रमशः AcGFP1 और mCherry का प्रतिनिधित्व करते हैं । ई और जी में सफेद संकेतों क्रमशः डी और एफ में AcGFP1 का प्रतिनिधित्व करते हैं । डी और ई ०.५ ज संस्कृति के बाद संस्कृतिपूर्ण अंडाशय की छवियां हैं । F और G शो अंडाशय के बाद १८० h culture; स्केल बार = १०० µm. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।
चित्रा 5: oog1pro 3.9/R26-H2B-mCherry चूहों से संस्कृतिपूर्ण अंडाशय में मौलिक, प्राथमिक, और माध्यमिक कूप की छवियां । (A-C) मौलिक के रोम में imaged P0 अंडाशय की छवियां; (डीएफ) P0 प्रसंस्कृत अंडाशय में प्राथमिक कूप की छवियां; (जी-एच) संस्कृति में माध्यमिक कूप के चित्र 4 सप्ताह पुराने माउस अंडाशय । ए, डी, जी और बी और सी, ई और एफ, और एच और मैं, क्रमशः की छवियों को विलय कर रहे हैं । हरा, AcGFP1; लाल, mCherry; स्केल बार = १०० µm. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।
| माइक्रोस्कोप | उद्देश्य लेंस | लेजर | एक्सपोजर (एमएस) | लाभ | समय-अंतराल | z-स्टैक | दूसरों | आंकड़े और फिल्में |
| CV1000 | X10 | ४८८ एनएम: 30, ५६१ एनएम: 20 | ४८८ एनएम: ७००, ५६१ एनएम: ६०० | ४८८ एनएम: ९०, 561nm: 20 | 30 min | 5 मिमी | चित्र 4c-G, चलचित्र 1 और 2 | |
| BZ-X700 | X20 (संग्रह कॉलर के साथ) | ४०% | ऑटो | X4 | 30 min | 10 एमएम | बिन्नी 3x3 | फिल्म 3 |
| LSM710 | X10 | ४८८ एनएम: 6%, ५६४ एनएम: 5% | कैमरा स्पीड: 4 | ४८८ एनएम: ८५०, ५६४ एनएम: ८५० | 24 ज | 10 एमएम | डिजिटल लाभ, ४८८ एनएम: 2, ५६४ एनएम: 1 | चित्रा 2, 3 और 5 |
तालिका 1: समय-चूक इमेजिंग शर्तें । फोकल और चमकीले क्षेत्र माइक्रोस्कोप के लिए समय चूक इमेजिंग हालत ।
| अंडाशय नहीं । | कुल ovulation अंडाणुओं की संख्या | की संख्या मिि अंडाणुओं |
| 1 | 7 | 2 |
| 2 | 19 | 9 |
| 3 | 14 | 6 |
| 4 | 7 | 3 |
| 5 | 12 | 4 |
| 6 | 15 | 6 |
| 7 | 25 | 11 |
| 8 | 13 | 3 |
| 9 | 11 | 7 |
| 10 | 19 | 8 |
| 11 | 18 | 4 |
| 12 | 7 | 1 |
तालिका 2: प्रसंस्कृत अंडाशय में ovulation अंडाणुओं की संख्या। बारह प्रसंस्कृत अंडाशय से ovulation अंडाणुओं की संख्या; मिि ovulation के बाद पहली ध्रुवीय निकायों जारी की है कि ovulation अंडाणुओं की संख्या इंगित करता है ।
अनुपूरक मूवी 1: एक संस्कृतिपूर्ण अंडाशय की समय चूक फिल्म । अंडाशय 4 सप्ताह पुराने चूहों से एकत्र किए गए थे और 3 सप्ताह के लिए कटा हुआ और संस्कृति । इस फिल्म के 10 फ्रेम में 0-200 एच की एक संस्कृति अवधि तक फैला है/ कृपया यहां क्लिक करें इस वीडियो को देखने के लिए । (डाउनलोड करने के लिए राइट-क्लिक करें.)
अनुपूरक मूवी 2: एक ट्रांसजेनिक माउस से एक संस्कृतिपूर्ण P0 अंडाशय की समय चूक फिल्म । हरा, AcGFP1; लाल, mCherry । फिल्म के एक संस्कृति अवधि में फैले 0 – 180 h पर 10 फ़्रेम/ कृपया इस वीडियो को देखने के लिए यहां क्लिक करें । (डाउनलोड करने के लिए राइट-क्लिक करें.)
अनुपूरक मूवी 3: एक 4 सप्ताह पुराने माउस से एक संस्कृतिपूर्ण अंडाशय की समय चूक फिल्म। हरा, AcGFP1; लाल mCherry; फिल्म 9-13 संस्कृति दिन के 10 फ्रेम में एक संस्कृति अवधि तक फैला/ पहली छवि में तीर रोम जिसमें अविवरता संस्कृति के दौरान हुई संकेत मिलता है । कृपया इस वीडियो को देखने के लिए यहां क्लिक करें । (डाउनलोड करने के लिए राइट-क्लिक करें.)
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Discussion
इस अध्ययन में, हम माउस अंडाशय में कूप विकास के अध्ययन के लिए दो नए तरीके विकसित की है । पहली विधि कटा हुआ डिम्बग्रंथि वयस्क चूहों कूप विकास के विश्लेषण के द्वारा पीछा ऊतकों की संस्कृति शामिल है, और दूसरा समय के उपयोग के लिए-चूक इमेजिंग गोनॉडोट्रॉफिन-स्वतंत्र मंच के दौरान जल्दी कूप विकास कल्पना शामिल है । इससे पहले, हम कूप विकास8,9पर ल्यूकेमिया निरोधात्मक कारक और प्रोजेस्टेरोन के प्रभाव का आकलन करने के लिए वर्तमान अंडाशय ऊतक संस्कृति विधि का इस्तेमाल किया, और पता चला कि उनके प्रभाव एकाग्रता और कूप चरण के साथ बदलती हैं । वर्तमान अध्ययन में, कटा हुआ डिंबग्रंथि के ऊतकों कूप गतिशीलता का प्रदर्शन, डिम्बग्रंथि कूप विकास तंत्र के इस मॉडल का उपयोग कर आगे विश्लेषण वारंट ।
अंडाशय के चूहों से अधिक उम्र के 5 से अधिक सप्ताह lutea सूक्ष्म टिप्पणियों में बाधा डालता है कि कॉर्प्स होते हैं । इसलिए, 4 सप्ताह पुराने माउस अंडाशय कूप विकास और ovulation की टिप्पणियों के लिए पसंद कर रहे हैं, और बाद में देर प्राथमिक, माध्यमिक, और कोटरीय कूप और अधिक आसानी से उज्ज्वल क्षेत्र माइक्रोस्कोपी का उपयोग कर प्रतिष्ठित कर रहे हैं । हमारे तरीके विकास कारकों और संस्कृति मीडिया में दवाओं के प्रभाव की तुलना की पेशकश, विभेदक इलाज अंडाशय (चित्रा 3) के बीच कूप विकास में समझदार परिवर्तन के साथ ।
अंडाणुओं में Cre या fluorescein प्रोटीन्स व्यक्त करने ट्रांसजेनिक चूहों का वर्णन पिछले अध्ययनों में18,19,20में किया गया है. हालांकि, तोंसिल्लितिस स्टेज वर्गीकरण granulosa कक्ष आकार, granulosa सेल परतों की संख्या सहित ऊतकवैज्ञानिक विशेषताओं पर निर्भर करता है, और क्या theca कोशिकाओं का गठन कर रहे हैं । इस प्रकार, मौलिक और प्राथमिक रोम के बीच भेद अकेले अंडाणुओं की टिप्पणियों से सीमित हो सकता है । इस के साथ साथ, हम ट्रांसजेनिक oog1pro 3.9 और R26-H2B-mCherry transgenes11,17 युक्त चूहों का इस्तेमाल किया और मौलिक से प्रारंभिक कूप विकास कल्पनात्मक अंडाशय में माध्यमिक कूप चरणों के लिए । Oog1 अभिव्यक्ति मौलिक कूप चरण के दौरान अंडाणुओं में detectable हो जाता है, और स्पष्ट रूप से प्राथमिक कूप में वृद्धि हुई है । इसलिए, AcGFP1 संकेत अंडाणुओं में तीव्रता कूप चरण (चित्रा 5) के साथ जुड़े रहे है और मौलिक प्राथमिक कूप संक्रमण (4 चित्रा, अनुपूरक फिल्म 2) का पालन करने के लिए इस्तेमाल किया गया । सेल नाभिक R26-H2B-mCherry ट्रांसजेनिक चूहों (चित्रा 4, अनुपूरक फिल्म 2, और अनुपूरक फिल्म 3) में दाग लाल हैं, granulosa कोशिकाओं की संख्या के अनुसार कूप चरणों की टिप्पणियों की अनुमति ( चित्रा 5) । इस प्रकार, सामूहिक रूप से वर्तमान तरीकों oog1pro 3.9/R26-H2B-mCherry ट्रांसजेनिक चूहों का उपयोग कर ovulation के माध्यम से मौलिक से कूप विकास के विश्लेषण की अनुमति देते हैं । इसके अलावा, क्योंकि अपोप्तोटिक कोशिका क्रोमेटिन गाढ़ा है, atretic कूप के mCherry संकेतों सामांय रोम (अनुपूरक फिल्म 3) की तुलना में मजबूत हैं ।
methodological बारीकियों के बीच, कटा हुआ ऊतकों की सही मोटाई में सफल संवर्धन के लिए आवश्यक हैं, अंडाशय स्लाइस कि बहुत मोटी हैं में वृद्धि हुई कोशिका मृत्यु के साथ, और अंडाशय स्लाइस में बड़े कोटरीय कूप की हानि है कि बहुत पतली हैं । कूप विकास की गति धीमी है; इसलिए, यह पता लगाने और 24-एच अंतराल अवलोकन के माध्यम से प्रत्येक कूप की प्रक्रिया का विश्लेषण करने के लिए आसान है । वर्तमान फोकल माइक्रोस्कोप की स्थापना, लेजर तीव्रता, अंतराल समय, और डिजिटल लाभ सहित, माइक्रोस्कोप मोड पर निर्भर हैं, लेकिन समय चूक छवियों को प्राप्त करने पर विचार करने के लिए महत्वपूर्ण हैं. विशेष रूप से, मजबूत लेजर तीव्रता और लंबे समय जोखिम बार स्पष्ट छवियों पर कब्जा करने के लिए आवश्यक हैं, लेकिन प्रसंस्कृत कोशिकाओं को प्रभावित कर सकते हैं. इसलिए, phototoxicity से बचने के लिए इन सेटिंग्स की मॉडरेशन महत्वपूर्ण है । 4 सप्ताह पुराने चूहों के कटा हुआ डिंबग्रंथि के ऊतकों को लगभग 4 सप्ताह के लिए प्रसंस्कृत किया जा सकता है, जबकि मौलिक और प्राथमिक कूप बाद में मौजूद रहते हैं, वे अब नहीं बढ़ेगा । इसके विपरीत, P0 और पी 4 अंडाशय लगभग 10 दिनों के लिए, जो के दौरान मौलिक और प्राथमिक कूप प्राथमिक या माध्यमिक कूप, क्रमशः में विकसित करने के लिए किया जा सकता है । हालांकि, P0 और पी 4 अंडाशय में रोम कोटरीय कूप में विकसित नहीं है । इसलिए, अंडाशय के उत्पाद पूरे अंडाशय कूप विकास के साथ जुड़े विनियामक तंत्र के अध्ययन के लिए विभिन्न चरणों में आवश्यक है ।
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Disclosures
लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।
Acknowledgments
oog1pro 3.9 चूहों को उपलब्ध कराने के लिए हम डॉ॰ Naojiro Minami (क्योटो विश्वविद्यालय) को धन्यवाद देते हैं । इस शोध को JSPS (KAKENHI # JP15H06275) और Nitto फाउंडेशन ने सपोर्ट किया था ।
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Follicle stimulating hormone from human pituitary | SIGMA | F4021 | |
| Lutenizing hormone from equine pituitary | SIGMA | L9773 | |
| Penicillin-streptomycin solution | Wako Pure Chemical Industries | 168-23191 | |
| MEM a, GlutaMax, no nucleotides | Thermo Fisher | 32561037 | |
| Glass bottom dish | MatTek | P35G-0-10-C | 35mm dish, No. 0 coverslip, 10mm glass diameter |
| Millicell cell culture insert | Merck Millipore | PICM0RG50 | Diameter: 315 mm, pore size: 0.4 mm, material: hydrophilic PTTE |
| 3.5cm cell culture dishes | greiner bio-one | 627160 | |
| 50ml / centrifuge tube with triple seal cap | IWAKI | 2345-050 | |
| Low-profile disposable blades 819 | Leica | 14035838925 | |
| LSM 710 | Carl Zeiss | Confocal microscope | |
| CellVoyager, CV1000 | Yokogawa Electric Corporation | Time-lapse imaging | |
| BZ-X700 | KEYENCE | Time-lapse imaging |
References
- Myers, M., Britt, K. L., Wreford, N. G., Ebling, F. J., Kerr, J. B. Methods for quantifying follicular numbers within the mouse ovary. Reproduction. 127 (5), 569-580 (2004).
- Adams, G. P., Jaiswal, R., Singh, J., Malhi, P. Progress in understanding ovarian follicular dynamics in cattle. Theriogenology. 69 (1), 72-80 (2008).
- Palma, G. A., et al. Biology and biotechnology of follicle development. Sci World J. , (2012).
- Knight, P. G., Glister, C. TGF-beta superfamily members and ovarian follicle development. Reproduction. 132 (2), 191-206 (2006).
- Picton, H. M., Harris, S. E., Muruvi, W., Chambers, E. L. The in vitro growth and maturation of follicles. Reproduction. 136 (6), 703-715 (2008).
- Spears, N., de Bruin, J. P., Gosden, R. G. The establishment of follicular dominance in co-cultured mouse ovarian follicles. J Reprod Fertil. 106 (1), 1-6 (1996).
- Baker, S. J., Srsen, V., Lapping, R., Spears, N. Combined effect of follicle-follicle interactions and declining follicle-stimulating hormone on murine follicle health in vitro. Biol Reprod. 65 (4), 1304-1310 (2001).
- Komatsu, K., et al. Analysis of the Effect of Leukemia Inhibitory Factor on Follicular Growth in Cultured Murine Ovarian Tissue. Biol Reprod. 93 (1), 18 (2015).
- Komatsu, K., Masubuchi, S. The concentration-dependent effect of progesterone on follicle growth in the mouse ovary. J Reprod Dev. 63 (3), 271-277 (2017).
- Murase, T., et al. Follicle dynamics: visualization and analysis of follicle growth and maturation using murine ovarian tissue culture. J Assist Reprod Genet. , 1-5 (2017).
- Ishida, M., et al. The promoter of the oocyte-specific gene, Oog1, functions in both male and female meiotic germ cells in transgenic mice. PLoS One. 8 (7), 68686 (2013).
- Minami, N., et al. Oogenesin is a novel mouse protein expressed in oocytes and early cleavage-stage embryos. Biol Reprod. 69 (5), 1736-1742 (2003).
- Nilsson, E. E., Skinner, M. K. Growth and differentiation factor-9 stimulates progression of early primary but not primordial rat ovarian follicle development. Biol Reprod. 67 (3), 1018-1024 (2002).
- Nilsson, E. E., Kezele, P., Skinner, M. K. Leukemia inhibitory factor (LIF) promotes the primordial to primary follicle transition in rat ovaries. Mol Cell Endocrinol. 188 (1-2), 65-73 (2002).
- Nilsson, E. E., Skinner, M. K. Bone morphogenetic protein-4 acts as an ovarian follicle survival factor and promotes primordial follicle development. Biol Reprod. 69 (4), 1265-1272 (2003).
- Nilsson, E. E., Skinner, M. K. Kit ligand and basic fibroblast growth factor interactions in the induction of ovarian primordial to primary follicle transition. Mol Cell Endocrinol. 214 (1-2), 19-25 (2004).
- Abe, T., et al. Establishment of conditional reporter mouse lines at ROSA26 locus for live cell imaging. Genesis. 49 (7), 579-590 (2011).
- Lan, Z. J., Xu, X., Cooney, A. J. Differential oocyte-specific expression of Cre recombinase activity in GDF-9-iCre, Zp3cre, and Msx2Cre transgenic mice. Biol Reprod. 71 (5), 1469-1474 (2004).
- Payer, B., et al. Generation of stella-GFP transgenic mice: a novel tool to study germ cell development. Genesis. 44 (2), 75-83 (2006).
- Ohinata, Y., Sano, M., Shigeta, M., Yamanaka, K., Saitou, M. A comprehensive, non-invasive visualization of primordial germ cell development in mice by the Prdm1-mVenus and Dppa3-ECFP double transgenic reporter. Reproduction. 136 (4), 503-514 (2008).
