Summary
난소 조직 문화 여 포 개발, 배 란, 그리고 여 포가 폐쇄 증의 모델로 사용할 수 있습니다 하 고 동적 난소 프로세스의 규제 메커니즘을 나타냅니다.
Abstract
포유류 암컷은 정기적으로 각 발 정기 주기 동안 oocytes의 거의 일정 한 수 배 란. 이러한 규칙과 주기 유지, 규정 hypothalamic-뇌 하 수 체-gonadal 축 수준 및 난소에서 난 포 개발에 발생 합니다. 활성 연구에도 불구 하 고 여러 단계 휴면 원시 여 포 활성화에서 배 란을 및 각 소 낭 모양 단계에서 다른 규제 복잡성 때문에 여 포 개발 메커니즘이 명확 하지 않다. 여 포 발달의 기계 장치 그리고 발 정기 주기 낭의 역학 조사, 우리는 관찰 하는 현미경을 사용 하 여 여 포 개발 하는 데 사용할 수 있는 마우스 난소 조직 문화 모델을 개발 했다. 체계적인 여 포 개발, 정기 배 란 및 여 포가 폐쇄 증 모두 재생 될 수 있다 경작된 난소 모델에 그리고 문화 조건을 실험적으로 변조 될 수 있습니다. 여기, 우리 여 포 개발의 규제 메커니즘 및 다른 난소 현상의 연구에서이 방법의 유용성을 보여 줍니다.
Introduction
여성 마우스 난소 포함 몇 천 포1, 그리고 주기적인 배 란 각 발 정기 주기에서 약 10 oocytes를 성숙. 낭 여러 발달 단계로 분류 됩니다: 원시, 기본, 보조, antral, 및 각 oocyte 둘러싸고 granulosa 세포 층의 형태에 따라 Graafian 낭. 대부분 원시 낭은 휴면, 그들 중 일부는 활성화 하 고 각 발 정기 주기2주 낭으로 성장. 보조 소 낭 모양 단계 후 여 포 개발은 주로 gonadotropins, follicular 자극 호르몬 (FSH)과 황 호르몬 (LH)에 의해 규제 됩니다. 그러나, 원시 및 기본 모 근 개발 생식 샘 자극 호르몬, 독립적 이며 이러한 단계를 제어 하는 규제 메커니즘 남아 제대로 inderstood3,,45. 성장 인자와 호르몬, 원시 및 기본 여 포 여 포6,7간의 상호 작용에 의해 통제 된다. 따라서, 우리가 마우스 난소 조직, 뿌리 역동성의 분석을 수행 하 고 난소 조직 문화8,,910을 사용 하 여 관련된 규제 메커니즘을 조사 합니다.
여기, 두 개의 난소 조직 문화 모델 방법을 소개합니다. 첫 번째 follicular 분야의 측정에 의해 여 포 개발 분석 하 사용 되 고 두 번째는 유전자 변형 마우스 보조 뿌리 단계로 원시에서 초기 여 포 개발 하는 동안 규제 메커니즘을 연구 하는 데 사용 됩니다. 여 포 개발 분석, 우리가 주로 사용 4 주 오래 된 여성 쥐의 난소 낭의 쉽게 시각화를 허용 하기 때문에. 정기 배 란 및 모델 vivo에서 여 포 개발 유도, 우리 LH 서 지 및 관찰된 배 란, 여 포는이 폐쇄 증, 및 조직 배양 조건에서 estradiol의 분 비를 재현. 교양된 난소의 이미지 체포 되었다, 그리고 여 포 개발 프로세스 follicular 지역 변경 내용을 추적 하 여 분석 되었다. 그러나, 밝은 분야 현미경 검사 법 분석, 원시 및 초기 기본 모 공 사이의 구별 불분명 했다. 따라서, 우리 작은 낭을 감지 하 고 원시, 기본, 사이 구별 하는 방법을 개발 하 고 보조 뿌리에 배양 난소 조직을 사용 하 여 Oogenesin1 (Oog1) pro3. 9 그리고 0와 4 일 탄생11후 R26-H2B-mCherry 유전자 변형 쥐 난소. Oog1 식 oocytes에서 감지 감수 분열, 입국 후 고 주 낭 교양된 난소 조직의11 시간 경과 이미지를 사용 하 여 원시에서 전환의 관찰 수 있도록 뿌리 발달로 점차 증가 ,12. 형태학 상 방법을 휴면 원시 낭13,14,,1516활성화 요인 연구에 사용 되었습니다, 하지만 난소에 생리 여 포 개발은 관찰 하기 어려운 다양 한 요인의 효과 유지 새롭거나. 현재 문화 방법 실시간으로 분석 대상 요소의이 부족을 해결 하기 위해 설계 되었습니다.
현재 연구에서 우리가 follicular 개발 시간 경과 화상 진 찰 방법을 사용 하 여 추적 하 고 여 포 개발 과정 특징. 우리의 소설 메서드는 전례 없는 난소의 생리학을 조사 하기 위한 도구를 제공 합니다.
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Protocol
마우스는 23 ± 1 ° C 12 h 빛/12 h 어두운 사이클 환경 제어 실에서 보관 되어 있었다. 동물 보호 프로토콜 및 실험 아이치 의과대학에서 동물 실험에 대 한 지침에 따라 실시 했다 고 현 동물 관리 및 사용 위원회에 의해 승인 했다.
1입니다. 배양 및 요리 준비
- 기본적인 문화 매체를 준비 하려면 추가 태아 둔감 한 혈 청 (FBS, 5 %v / v), FSH (100 mIU/mL), LH (10 mU/mL), 그리고 페니실린-스 (페니실린, 100 U/mL; 스, 100 mg/mL) 최소 필수 중간 알파 (MEM-알파)을 50 mL 튜브에 혼합.
참고: 필요한 문화 미디어의 총 볼륨 실험, 사이 다르지만 문화 매체의 1 mL는 3.5 c m 유리 하단 문화 요리에 일반적으로 충분 합니다. - 3.5 c m 유리 하단 문화 요리에 혼합된 문화 매체의 1 mL aliquots를 부 어 하 고 요리에 장소 30 mm 셀 문화 삽입을 설정 합니다. 미리 따뜻한 미디어와 인큐베이터 (5% CO2 와 37 ° C)에서 요리.
2입니다. 난소 조직 준비
- 미리 따뜻한 인산 염 (PBS) (−) 및 메모리-알파 5 %FBS, 100 U/mL 페니실린 그리고 인큐베이터 (5% CO2 와 37 ° C)에서 100 mg/mL 스 버퍼링.
참고: 약 3 mL 난소 당 aliquots PBS (−)의 사용에 대 한 충분 한 난소 해 동안 되며 MEM-알파의 1 mL aliquots는 3.5 cm 요리에서 단일 난소의 일시적인 저장을 위해 충분 한. -
4 주 오래 된 여성 (후 암 연구소 라는) ICR 마우스에서 난소를 소비 세와 손질가 위 핀셋 입체 현미경을 사용 하 여 난소를 둘러싼 조직. 예약 문화 매체의 제거 난소 (단계 2.1 참조) 사용까지.
- 필터 종이에 단일 난소 적신 장소는 PBS (−)에 미리 예 열 (단계 2.1 참조)와 입체 현미경 톰 블레이드를 사용 하 여 4 조각으로 조각.
참고: 4 주 오래 된 ICR 생쥐의 난소는 지름 약 2 m m. 조각의 수; 난소 크기에 따라 달라 집니다. 그러나, 약 500 µ m 두꺼운 조각 적절 한 뿌리 관찰에 대 한 허용 (500 m m 보다 두꺼운 조각, 조직 투명도 감소; 500 m m 보다 얇은 조각, 많은 antral 낭은 깨진 손실). - 해 부, 후 슬라이스 난소 표본 3.5 cm 요리 (단계 2.1 참조) 미리 데워 진된 문화 매체에 놓습니다.
- 필터 종이에 단일 난소 적신 장소는 PBS (−)에 미리 예 열 (단계 2.1 참조)와 입체 현미경 톰 블레이드를 사용 하 여 4 조각으로 조각.
3. 난소 조직 문화
- 난소 조직에 셀 문화 삽입 슬라이스 난소 조직 될 것입니다 약 0.5 µ L 당 문화 매체의 삭제는 micropipette를 사용 하 여 설정.
- 문화 매체 핀셋을 사용 하 여 셀 문화 삽입에의 한 방울으로 각 슬라이스 견본을 놓습니다.
- 37 ° c.에 5% CO2 난소 조직 문화
- 2 일 마다 신선한 미리 따뜻하게 매체와 문화 매체를 교체 합니다.
참고: 4 주 오래 된 ICR 마우스에서 난소 섹션의 문화에 대 한 중간 변경 내용에 대 한 일정은 그림 1에 표시 됩니다.- LH 큰 파도 재현 하려면 (그림 1) 4 일 마다 100 mU/mL FSH 및 LH 12 h를 포함 하는 매체와 교양된 4 주 오래 된 ICR 마우스 난소를 취급 합니다.
4. 현미경 이미지 교양된 난소의
- 교양된 난소 조직 세포 문화 삽입에 준수는 때 1 일 후 이미징 시작 하 고 시간 점 사이 충분 한 뿌리 성장 수 있도록 24 시간 간격 또는 거꾸로 confocal 현미경 분석을 수행.
참고: Confocal 현미경 검사 법은 거꾸로 현미경 관찰 전체 교양된 난소 여 포에 대 한 우수.
5. 시간 경과 영상 교양된 난소의
-
레이저 농도 및 노출 시간, 이미징 시스템 (표 1)를 포함 하 여 시간 경과 이미징 조건 최적화.
- 치료 및 제어 그룹으로 사용 하기 위해 단일 마우스에서 쌍된 난소 견본을 선택 합니다. 레이저 농도 노출 시간 (표 1) 최고의 이미지를 달성 하기 위해 변화 한다.
- 각 문화 조건 하에서 여 포 성장 뿌리 지역 24 시간 간격 제어 샘플의 이미지와 시간 경과 영상 샘플 (6 단계 참조)를 측정 하 여 비교 합니다. 동시에, 각 난소 세트에서 ovulated oocytes의 수를 계산 하 고 최적의 시간 경과 이미징 조건을 선택 합니다.
- 30 분 간격으로 결정된 조건 (표 1)에서 시간 경과 이미징 시스템을 사용 하 여 이미지를 캡처하십시오.
6. 여 포 성장 분석
-
여 포 개발 분석, ImageJ 소프트웨어 (http://resbweb.nih.gov/ij/)를 사용 하 여 캡처한 이미지에 뿌리 영역을 측정 합니다.
- 처음에, 도구 모음에서 "분석" 아래 "비율 설정"을 클릭 하 여 이미지의 규모를 설정 합니다. "알려진 거리"와 "픽셀에서 거리"의 빈 필드에는 캡처된 이미지와 픽셀의 해당 번호의 측면 길이 각각 입력 합니다.
- 도구 모음에서 "자유 재량"를 클릭 하 고 캡처된 밝은 필드 이미지에 낭 개요.
- 도구 모음에서 "분석"에서 "측정"을 클릭 합니다.
참고: 다른 측정 데이터를 원하는 경우 "측정" "분석" 아래에서 설정 도구 모음을 클릭 하 고 목록에서 적절 한 확인란.
7. 유전자 변형 쥐를 사용 하 여 여 포 개발의 분석
- 출생 후 일 0과 4 (P0, P4) 여성 유전자 변형 쥐를 포함 하는 transgenes Oog1pro3.9 및 R26-H2B-mCherr, 그리고 삽입에서 문화에 설명 된 대로 단계 1.1-3.2, 하지 않습니다 제외 하 고 슬라이스는 P0, P4 난소에서 난소를 수집 합니다.
- 매 2 일 37 ° C에서 5% CO2 를 포함 하는 인큐베이터에서 3.5 cm 요리에 신선 하 고, 미리 데워 진 매체와 문화 매체를 교체 합니다.
참고: P0, P4 난소의 문화 매체에서 LH의 농도 수 일정 남아 있다 P0, P4 쥐에 LH 서 지 발생 하지 않기 때문에. - 교양된 P4 난소 (표 1)에 AcGFP1 양성 주 낭을 시각화 하기 위해 현미경을 설정 합니다.
참고:만 원시 및 기본 모 공은 P4 여성 마우스 난소에 존재 한다. - 교양된 P0 Oog1pro3.9의 이미지를 캡처 / 30 분 간격R26-H2B-mCherry 유전자 변형 쥐 난소 P4 난소 (단계 5.2 참조)에 사용 되는 설정을 사용 하 여.
- 추적 하 고 분석 하는 AcGFP1 및 H2B mCHerry 신호를 사용 하 여 여 포 개발.
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Representative Results
그림 1 난소 조직 문화 중 미디어에서 변경에 대 한 프로토콜을 보여 줍니다. 이 프로그램, 4 주 된 ICR 마우스 난소 배양 되었고 24 시간 간격으로 confocal 현미경 검사 법 (그림 2)를 사용 하 여 몇 군데. 3 주 동안 난소 조직의 문화, 동안 가장 antral 및 보조 모 공 여 포가 폐쇄 증으로 전락 했다 고 일부 ovulated (그림 2D 및 표 2) 했다. ImageJ (그림 3)를 사용 하 여 여 포 분야의 분석, 일부 낭 각 LH 서 지 주기 (그림 3B 와 보충 영화 1) 동안 그룹에서 개발. 또한, 배 란 단일 마우스의 왼쪽과 오른쪽 난소에서 별도 교양된 난소에서 거의 동시에 발생. 반면, 배 란과 ovulated oocytes (표 2)의 숫자의 타이밍 마우스 난소 (데이터 표시 되지 않음) 사이 달랐다, 교양된 난소에서 배 란 주로 LH 서 지 (그림 3및 보의 48 h 이내 발생 영화 1). 그러나, 모든 ovulated oocytes (그림 2E 와 표 2), 배 란 후 첫 번째 극 시체를 발표 하 고 개발에서 정지 ovulated oocytes 수정 된 수, 있지만 4 세포 단계 (데이터 표시 되지 않음). 휴면 원시 낭 마우스 난소에서 활성화 되는 메커니즘, 명료 하 우리는 Oog1pro3.9 및 R26-H2B-mCherry transgenes (운반 하는 유전자 변형 쥐에서 교양된 조직에서 원시 여 포 활성화를 감지 그림 4, 그림 5, 하며 보충 영화 2) Oocytes 원시 여 포 단계에서 Oog1 유전자의 매우 낮은 수준을 표현 하 고 시간 경과 영상 높은 AcGFP1 표현 주 낭에서 낮은 AcGFP1 표현 원시 낭을 구별. 원시 및 기본 모 공만 원시 난 포는 (그림 4A, B) P0 난소에 존재 하는 반면 P4 마우스 난소에 동시에 존재 하는. 따라서, 우리가 교양된 P4 난소 (그림 4C)에서 주 낭 검색 시간 경과 이미징 조건 최적화. 그 후, 우리는 동일한 조건 (그림 4D-G)에 10 일 동안 교양된 P0 난소의 이미지를 점령. AcGFP1는 이러한 유전자 변형 마우스에 기본 모 공에 대 한 인덱스로 사용할 수 있습니다 및 AcGFP1 양성 주 낭은 30-40 h 문화 (그림 4, 그림 5A-F, 그리고 보 후 교양된 P0 난소에서 감지 영화 2). 교양된 난소에서 원시 및 기본 모 공 또한 granulosa 셀 (그림 5B, E)의 mCherry-긍정적인 핵 구별 했다. 특히, mCherry 신호 형태의 낭 나타내고 교양된 난소 (그림 5B, E, 및 H)에서 여 포 단계의 관찰을 허용 합니다. Oog1pro3.9에서 난소를 사용 하 여이 문화 시스템 따라서,R26-H2B-mCherry 마우스 보조 뿌리 단계를 원시에서 초기 여 포 개발 과정 공개 /. 이러한 메서드는 생식 샘 자극 호르몬 독립 여 포 개발의 규제 메커니즘의 연구를 촉진 한다.
그림 1 : 중간 변경에의 시간 과정. 중간 A 5 %FBS, 100-무 FSH, LH 10-무, 100-U/mL 페니실린 및 MEM-알파에서 100 mg/mL 스에 포함 되어 있습니다. 매체 B 5 %FBS, 100-무 FSH, LH 100-무, 100-U/mL 페니실린 및 MEM-알파에서 100 mg/mL 스에 포함 되어 있습니다. 매체 B LH 서 지 모든 4를 생산 하기 위해 사용 되었다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 2 : 교양 난소 조직의 이미지. 이미지는 24 시간 간격으로 confocal 현미경 검사 법을 사용 하 여 점령 했다. (A) 문화의 날 1; (B) 문화의 날 5; (C) 문화의 날 10; (D) 문화의 날 13; (E) (d); 사각형으로 표시 된 영역의 확대 이미지 oocytes d에서 B, C 및 D. (F) Oocyte 배 란; 후 극 체 방출에 화살표로 표시 된 모 낭에서 ovulated 했다 눈금 막대 = 200 µ m. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 3 : 교양된 난소의 여 포 영역의 측정. (A) 이미지의 교양된 난소; 점선은 ImageJ로 측정 하는 영역을 나타냅니다. (B) Follicular 영역 교양된 난소; 3 주 후에 회색 선은 100 mM LH (LH 서 지)의 추가에서 문화 기간을 나타냅니다. 라인 교양된 난소;에서 각 여 포에서 개발 단계를 표시 눈금 막대 = 200 µ m. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 4 : Hematoxylin 및 오신 (H & E) 얼룩의 이미지 P0, P4 난소와 시간 경과 영상. (A) H & E P0 난소;의 얼룩 (B) H & E p 4 난소;의 얼룩 (C) 10 h 문화 후 Oog1pro3.6 유전자 변형 마우스에서 P4 난소의 이미지. 화살표는 AcGFP1 양성 기본 뿌리를 보여 줍니다. (D-G) 유전자 변형 마우스 Oog1pro3.9 와 R26-H2B-mCherry;에서 P0 난소의 이미지 D와 F에 녹색과 적색 신호 AcGFP1와 mCherry, 각각 나타냅니다. 화이트 신호에서 E와 G D와 F, AcGFP1을 각각 나타냅니다. D와 E는 0.5 h 문화 후 교양된 난소의 이미지. F와 G 180 h 배양 후 난소를 표시 눈금 막대 = 100 µ m. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 5: 이미지에서 교양된 난소에서 원시, 기본 및 보조 모 낭의 oog1pro3.9/R26-H2B-mCherry 쥐. A-(C) 교양된 P0 난소; 원시 낭의 이미지 (-DF) P0 교양된 난소; 기본 낭의 이미지 (HG-) 교양된 4 주 오래 된 마우스 난소에서 보조 낭의 이미지. A, D, G는 각각 B와 C, E와 F, 및 H와 I의 병합 된 이미지. 녹색, AcGFP1; 빨간색, mCherry; 눈금 막대 = 100 µ m. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
| 현미경 | 대물 렌즈 | 레이저 | 노출 (ms) | 이득 | 시간 간격 | z-스택 | 다른 사람 | 피 규 어와 영화 |
| CV1000 | X10 | 488 nm: 30, 561 nm: 20 | 488 nm: 700, 561 nm: 600 | 488 nm: 90, 561nm: 20 | 30 분 | 5 mm | 그림 4 C-G, 영화 1, 2 | |
| BZ-X700 | (로 컬렉션 칼라) X20 | 40% | 자동 | X4 | 30 분 | 10 m m | 범주화 3 x 3 | 영화 3 |
| LSM710 | X10 | 488 nm: 6%, 564 nm: 5% | 카메라 속도: 4 | 488 nm: 850, 564 nm: 850 | 24 h | 10 m m | 디지털 이득, 488 nm: 2, 564 nm:1 | 그림 2, 3 및 5 |
표 1: 시간 경과 조건 이미징. 시간 경과 영상 조건 confocal 밝은 분야 현미경입니다.
| 난소 없음. | 총 ovulated oocytes의 수 | MII oocytes의 수 |
| 1 | 7 | 2 |
| 2 | 19 | 9 |
| 3 | 14 | 6 |
| 4 | 7 | 3 |
| 5 | 12 | 4 |
| 6 | 15 | 6 |
| 7 | 25 | 11 |
| 8 | 13 | 3 |
| 9 | 11 | 7 |
| 10 | 19 | 8 |
| 11 | 18 | 4 |
| 12 | 7 | 1 |
표 2: 교양된 난소에서 ovulated oocytes의 숫자. 12 교양된 난소;에서 ovulated oocytes의 숫자 MII는 배 란 후 처음 북극 시체를 릴리스 ovulated oocytes의 번호를 나타냅니다.
보충 영화 1: 교양된 난소의 시간 경과 영화. 난소 4 주 된 쥐에서 수집 된 슬라이스 하 고 3 주 동안 배양 했다. 영화 문화 기간에 걸쳐 0-200의 h 10 프레임/s. 에 여기를 클릭 하십시오이 비디오를 볼. (다운로드 오른쪽 클릭.)
보충 영화 2: 유전자 변형 마우스에서 교양된 P0 난소의 시간 경과 영화. 녹색, AcGFP1; 빨간색, mCherry입니다. 영화 문화 기간에 걸쳐 0-180의 h 10 프레임/s. 에 여기를 클릭 하십시오이 비디오를 볼. (다운로드 오른쪽 클릭.)
보충 영화 3: 4 주 오래 된 마우스에서 교양된 난소의 시간 경과 영화. 녹색, AcGFP1; 레드; mCherry; 영화에서 10 프레임/s 9-13 문화 일의 문화 기간에 걸쳐. 첫 번째 이미지에 화살표 표시 여 포는이 폐쇄 증 중에 발생 한 문화에서. 이 비디오를 보려면 여기 클릭 하십시오 (다운로드 오른쪽 클릭.)
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Discussion
이 연구에서 우리는 마우스 난소의 여 포 개발을 공부 하는 두 가지 새로운 방법 개발. 첫 번째 방법은 포함 한다 여 포 개발의 분석 뒤 슬라이스 난소 성인 쥐 조직의 문화 그리고 생식 샘 자극 호르몬 독립 단계 초기 여 포 개발을 시각화 하 시간 경과 화상 진 찰의 사용을 포함 하는 두 번째. 이전에 우리 여 포 개발8,9, 백혈병 금지 요인 및 호르몬의 효과 평가 하기 위해 현재 난소 조직 문화 방법을 사용 하 고 그들의 효과 집중력과 뿌리 단 다 보여주었다. 현재 연구에서 전시 하는 난소 조직 뿌리 역학,이 모델을 사용 하 여 난소 여 포 개발 메커니즘의 분석을 더 보증 슬라이스.
5 주 이상의 쥐에서 난소에 신체 lutea의 현미경 관찰을 방해 하는 포함 되어 있습니다. 따라서, 4 주 된 마우스 난소 여 포 개발 및 배 란의 관찰에 대 한 선호는 하 고 이후의 늦은 1 차, 이차, 및 antral 낭 더 쉽게 밝은 분야 현미경 검사 법을 사용 하 여 구분 됩니다. 우리의 방법 성장 요인 및 여 포 개발 차동 치료 난소 (그림 3) 사이에서 뚜렷한 변화 문화 미디어, 약물의 효과의 비교를 제공합니다.
유전자 변형 쥐 oocytes에 Cre 또는 fluorescein 단백질을 표현 이전 연구18,,1920에서 설명 했습니다. 그러나, 소 낭 모양 단계 분류 granulosa 셀 모양, granulosa 셀 층의 숫자를 포함 하는 조직학 특성에 따라 달라 집니다 여부 티크 세포 형성 됩니다. 따라서, 원시 및 기본 모 공 사이의 구분 oocytes 혼자의 관측에서 제한 될 수 있습니다. 여기, 우리 Oog1pro3.9 및 R26-H2B-mCherry transgenes11,17 를 포함 하는 유전자 변형 쥐를 사용 하 고 교양된 난소에 보조 뿌리 단계를 원시에서 초기 여 포 개발을 시각화. Oog1 식 원시 여 포 단계 oocytes에서 감지 되 고 주 낭에 현저 하 게 증가 했다. 따라서, oocytes에서 AcGFP1 신호 강도 뿌리 단계 (그림 5)와 연결 하 고 원시 기본 뿌리 전환 (그림 4, 보충 영화 2)를 관찰 하는 데 사용 했다. 세포 핵은 스테인드 R26-H2B-mCherry 유전자 변형 마우스 (그림 4, 보충 영화 2및 보조 영화 3), 허용의 관측 granulosa 셀 (숫자 뿌리 단계에서 레드 그림 5)입니다. 현재 메서드 Oog1pro3.9를 사용 하 여 배 란을 통해 원시에서 여 포 개발의 분석을 허용 하는 총칭 따라서 /R26-H2B-mCherry 유전자 변형 쥐. 또한, apoptotic 세포 염색 질 응축 때문에 mCherry 신호 atretic 낭의 정상적인 낭 (보충 영화 3) 보다 강해 있습니다.
방법론 미묘, 중 슬라이스 조직의 정확한 두께 너무 두꺼운 난소 조각에 너무 얇은 난소 조각에서 큰 antral 낭의 손실 증가 세포 죽음으로 성공적인 경작을 위해 필요 합니다. 여 포 성장 속도가 느린; 따라서, 추적 하 고 24 h 간격 관찰을 통해 각 뿌리의 프로세스를 분석 하기 쉽습니다. 설정, 레이저 강도와 간격 시간, 디지털 이득를 포함 하 여 현재 confocal 현미경 현미경 모드에 의존 하지만 시간 경과 영상을 얻기 때 고려해 야 할 중요 한. 특히, 강한 레이저 농도 긴 노출 시간 명확한 이미지를 캡처하는 데 필요한 있지만 경작된 한 세포에 영향을 미칠 수 있습니다. 따라서, phototoxicity을 피하기 위해 이러한 설정을 검토가 중요 합니다. 4 주 오래 된 쥐의 슬라이스 난소 조직 배양 수 약 4 주 동안, 반면 원시 및 기본 모 공 남아 그 후, 그들은 더 이상 성장. 반면, P0, P4 난소는 원시 및 기본 모 공 개발, 기본 또는 보조 낭으로 각각 약 10 일 동안 배양 수 있습니다. 그러나, 교양된 P0, P4 난소에 낭 antral 낭으로 개발 하지 않습니다. 따라서 난소의 절제는 전체 난소 여 포 개발와 관련 된 규제 메커니즘의 연구에 대 한 다양 한 단계에서 필요 합니다.
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Disclosures
저자는 공개 없다.
Acknowledgments
박사 Naojiro 미나미 (교토대학)는 Oog1pro3.9 마우스를 제공 하는 감사 합니다. 이 연구는 JSP (KAKENHI # JP15H06275)와 닛토 재단에 의해 지원 되었다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Follicle stimulating hormone from human pituitary | SIGMA | F4021 | |
| Lutenizing hormone from equine pituitary | SIGMA | L9773 | |
| Penicillin-streptomycin solution | Wako Pure Chemical Industries | 168-23191 | |
| MEM a, GlutaMax, no nucleotides | Thermo Fisher | 32561037 | |
| Glass bottom dish | MatTek | P35G-0-10-C | 35mm dish, No. 0 coverslip, 10mm glass diameter |
| Millicell cell culture insert | Merck Millipore | PICM0RG50 | Diameter: 315 mm, pore size: 0.4 mm, material: hydrophilic PTTE |
| 3.5cm cell culture dishes | greiner bio-one | 627160 | |
| 50ml / centrifuge tube with triple seal cap | IWAKI | 2345-050 | |
| Low-profile disposable blades 819 | Leica | 14035838925 | |
| LSM 710 | Carl Zeiss | Confocal microscope | |
| CellVoyager, CV1000 | Yokogawa Electric Corporation | Time-lapse imaging | |
| BZ-X700 | KEYENCE | Time-lapse imaging |
References
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