Cultivos de tejido ováricos se puede utilizar como modelos de la atresia de desarrollo, la ovulación y el folículo folículo e indicar mecanismos reguladores de procesos dinámicos de ovarianos.
Se requiere una suscripción a JoVE para ver este contenido. Inicie sesión o comience su prueba gratuita.
Artículo de método
Cultivo de tejido ovárico para visualizar fenómenos en ovario de ratón
En este artículo
Resumen
Resumen
Las hembras mamíferas ovulan periódicamente una cantidad casi constante de ovocitos durante cada ciclo estral. Para sostener tal regularidad y periodicidad, regulación ocurre a nivel de eje hipotalámico-pituitario-gonadal y en el desarrollo de los folículos en el ovario. A pesar de estudios activos, mecanismos de desarrollo del folículo no son claros debido a los varios pasos de la activación del folículo primordial inactiva a la ovulación y debido a la complejidad de la regulación que difiere en cada fase folicular. Para investigar los mecanismos de desarrollo folicular y la dinámica de los folículos durante el ciclo estral, se desarrolló un modelo de cultura de tejido ovárico de ratón que puede ser utilizado para observar el desarrollo folicular utilizando un microscopio. Desarrollo sistemático del folículo, la ovulación periódica y atresia del folículo pueden todas reproducidas en el modelo de ovario cultivadas, y las condiciones de cultivo pueden ser moduladas experimentalmente. Aquí, demostramos la utilidad de este método en el estudio de los mecanismos de regulación del desarrollo folicular y otros fenómenos de ovarianos.
Introducción
Los ovarios de la hembra del ratón contienen varios mil folículos1, y la ovulación periódica madura aproximadamente diez ovocitos en cada ciclo estral. Los folículos se clasifican en varias etapas del desarrollo: primordial, primaria, secundaria, antral y los folículos de Graaf, dependiendo de la forma de la capa celular granulosa que rodean a cada ovocito. La mayoría de los folículos primordiales están inactivos, y algunos de ellos se activan y se convierten en folículos primarios en cada estro ciclo2. Después de la etapa folicular secundaria, desarrollo folicular está regulado principalmente por gonadotropinas, folicul....
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Protocolo
Ratones fueron alojados en una sala de ambiente controlada a 23 ± 1 ° C con un ciclo oscuro h 12 h luz/12. Protocolos de cuidado de los animales y los experimentos se llevaron a cabo con arreglo a las directrices para la experimentación Animal en la Universidad médica de Aichi y fueron aprobados por el Comité de uso y cuidado Animal titular.
1. preparación de medio de cultivo y platos
- Para preparar medio de cultivo base, agregar suero bovino fetal (FBS, 5% v/v), FSH (100 mIU/mL), LH (10 mU/mL) y penicilina-estreptomicina (penicilina 100 U/mL, estreptomicina, 100 mg/mL) al mínimo esencial medio (MEM-alfa) y la mezcla en tubos de 50....
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Resultados
La figura 1 muestra el protocolo para los cambios en los medios de comunicación en cultura del tejido ovárica. Siguiendo este programa, ovarios de ratones ICR 4 semanas de edad fueron cultivadas e imagen a intervalos de 24 h mediante microscopía confocal (figura 2). Durante el cultivo de tejidos de ovario durante 3 semanas, más folículos antrales y secundarios fueron degenerados por atresia del folículo y algunos fueron ovuladas .......
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Discusión
En este estudio, hemos desarrollado dos nuevos métodos para estudiar el desarrollo folicular en ovarios de ratón. El primer método implica el cultivo de los tejidos de ratones adultos ovárico en rodajas seguida por análisis del desarrollo del folículo, y el segundo involucra el uso de Time-lapse de imágenes para visualizar el desarrollo folicular temprano durante la etapa independiente de la gonadotropina. Anteriormente, utiliza el método de cultivo de tejidos de ovario presente para evaluar el efecto del factor inhibido.......
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Divulgaciones
Los autores no tienen nada que revelar.
Agradecimientos
Agradecemos a Dr. Naojiro Minami (Universidad de Kioto) para proporcionar los ratones Oog1pro3.9 . Esta investigación fue apoyada por el JSP (KAKENHI # JP15H06275) y la Fundación de Nitto.
....Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Hormona folículo estimulante de la hipófisis humana | SIGMA | F4021 | |
| Hormona lutinizante de la hipófisis equina | SIGMA | L9773 | |
| Solución de penicilina-estreptomicina | Wako Pure Chemical Industries | 168-23191 | |
| MEM a, GlutaMax, sin nucleótidos | Thermo Fisher | 32561037 | |
| Plato con fondo de vidrio | MatTek | P35G-0-10-C | Plato de 35 mm, cubreobjetos n.º 0, diámetro de vidrio de 10 mm |
| Inserto de cultivo celular Millicell | Merck Millipore | PICM0RG50 | Diámetro: 315 mm, tamaño de poro: 0,4 mm, material: PTTE hidrófilo |
| Placas de cultivo celular de 3,5 cm | Greiner Bio-One | 627160 | |
| 50 ml / tubo de centrífuga con tapón de triple sellado | IWAKI | 2345-050 | |
| Cuchillas desechables de perfil bajo 819 | Leica | 14035838925 | |
| LSM 710 | Carl Zeiss | Microscopio confocal | |
| CellVoyager, CV1000 | Yokogawa Electric Corporation | Imágenes time-lapse | |
| BZ-X700 | KEYENCE | Time-lapse imaging |
Referencias
- Myers, M., Britt, K. L., Wreford, N. G., Ebling, F. J., Kerr, J. B. Methods for quantifying follicular numbers within the mouse ovary. Reproduction. 127 (5), 569-580 (2004).
- Adams, G. P., Jaiswal, R., Singh, J., Malhi, P. Progress in understanding ovarian follicular dynamics in cattle.<....
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Reimpresiones y permisos
