Summary
Cultivos de tejido ováricos se puede utilizar como modelos de la atresia de desarrollo, la ovulación y el folículo folículo e indicar mecanismos reguladores de procesos dinámicos de ovarianos.
Abstract
Las hembras mamíferas ovulan periódicamente una cantidad casi constante de ovocitos durante cada ciclo estral. Para sostener tal regularidad y periodicidad, regulación ocurre a nivel de eje hipotalámico-pituitario-gonadal y en el desarrollo de los folículos en el ovario. A pesar de estudios activos, mecanismos de desarrollo del folículo no son claros debido a los varios pasos de la activación del folículo primordial inactiva a la ovulación y debido a la complejidad de la regulación que difiere en cada fase folicular. Para investigar los mecanismos de desarrollo folicular y la dinámica de los folículos durante el ciclo estral, se desarrolló un modelo de cultura de tejido ovárico de ratón que puede ser utilizado para observar el desarrollo folicular utilizando un microscopio. Desarrollo sistemático del folículo, la ovulación periódica y atresia del folículo pueden todas reproducidas en el modelo de ovario cultivadas, y las condiciones de cultivo pueden ser moduladas experimentalmente. Aquí, demostramos la utilidad de este método en el estudio de los mecanismos de regulación del desarrollo folicular y otros fenómenos de ovarianos.
Introduction
Los ovarios de la hembra del ratón contienen varios mil folículos1, y la ovulación periódica madura aproximadamente diez ovocitos en cada ciclo estral. Los folículos se clasifican en varias etapas del desarrollo: primordial, primaria, secundaria, antral y los folículos de Graaf, dependiendo de la forma de la capa celular granulosa que rodean a cada ovocito. La mayoría de los folículos primordiales están inactivos, y algunos de ellos se activan y se convierten en folículos primarios en cada estro ciclo2. Después de la etapa folicular secundaria, desarrollo folicular está regulado principalmente por gonadotropinas, foliculares estimulante hormona (FSH) y hormona luteinizante (LH). Sin embargo, desarrollo del folículo primordial y principal es independiente de la gonadotropina, y los mecanismos de regulación que rigen estas etapas siguen siendo mal inderstood3,4,5. Además de factores de crecimiento y hormonas, el folículo primordial y primario está regulado por las interacciones entre los folículos de6,7. Por lo tanto, se realizaron análisis de la dinámica folicular en los tejidos de ovario de ratón e investigaron los mecanismos de regulación asociados con cultivos de tejido ovárico8,9,10.
Adjunto, presentamos dos métodos del modelo de cultivo de tejido ovárico. El primero se utiliza para analizar el desarrollo del folículo por la medida de áreas foliculares, y la segunda se utiliza para estudiar el mecanismo de regulación durante el desarrollo temprano del folículo de primordial a la etapa de folículo secundario con ratones transgénicos. Para el análisis del desarrollo del folículo, utilizan principalmente ovarios de ratones hembra 4 - semanas de edad debido a que permiten la fácil visualización de los folículos. Para inducir la ovulación periódica y desarrollo de modelos en vivo del folículo, reproducen de LH y la ovulación observada, la atresia del folículo y secreción de estradiol bajo condiciones de cultivo de tejidos. Imágenes de los ovarios cultivados fueron capturados, y los procesos de desarrollo del folículo se analizaron por los cambios de trazado en la zona folicular. Sin embargo, en los análisis de microscopía de campo claro, la distinción entre folículos primordiales y principios primarios era claro. Así, se desarrolló un método para detectar folículos pequeños y distinguir entre el primordial, primario, y folículo secundario en cultiva tejidos ováricos usando Oogenesin1 pro3 (Oog1). 9 y R26-H2B-mCherry ovarios de ratones transgénicos a los 0 y 4 días después del nacimiento11. Oog1 expresión es detectable en ovocitos después de entrada en meiosis y aumenta gradualmente con el desarrollo del folículo, lo que permite la observación de la transición de primordial a primarios folículos con imágenes de Time-lapse de tejido de ovario cultivadas11 ,12. Aunque se han utilizado métodos morfológicos para estudiar factores que activan los folículos primordiales inactivos13,14,15,16, desarrollo fisiológico del folículo en los ovarios es difícil de observar, y los efectos de varios factores siendo desacostumbrados. Los métodos actuales de la cultura fueron diseñados para abordar esta falta en tiempo real Análisis de factores objetivos.
En el presente estudio, con desarrollo folicular utilizando un método de imagen Time-lapse y había caracterizado el proceso de desarrollo folicular. Nuestros nuevos métodos ofrecen una herramienta sin precedentes para la investigación de la fisiología de los ovarios.
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Protocol
Ratones fueron alojados en una sala de ambiente controlada a 23 ± 1 ° C con un ciclo oscuro h 12 h luz/12. Protocolos de cuidado de los animales y los experimentos se llevaron a cabo con arreglo a las directrices para la experimentación Animal en la Universidad médica de Aichi y fueron aprobados por el Comité de uso y cuidado Animal titular.
1. preparación de medio de cultivo y platos
- Para preparar medio de cultivo base, agregar suero bovino fetal (FBS, 5% v/v), FSH (100 mIU/mL), LH (10 mU/mL) y penicilina-estreptomicina (penicilina 100 U/mL, estreptomicina, 100 mg/mL) al mínimo esencial medio (MEM-alfa) y la mezcla en tubos de 50 mL.
Nota: Volumen Total requiere de medios de cultivo varía entre experimentos y 1 mL de medio de cultivo es generalmente suficiente para platos de cultura de fondo de cristal de 3,5 cm. - Verter alícuotas de 1 mL de medio de cultivo mezclado en platos de cultura de fondo de cristal de 3,5 cm y coloque lugar 30 mm de la célula cultura insertos en platos. Precaliente los platos en una incubadora (5% CO2 y 37 ° C) y los medios de comunicación.
2. preparación del tejido ovárico
- Pre-warm fosfato tampón salino (PBS) (−) y MEM-alfa que contiene 5% FBS, 100 U/mL de penicilina y estreptomicina 100 mg/mL en una incubadora (5% CO2 y 37 ° C).
Nota: Aproximadamente 3 mL alícuotas de PBS (−) por ovario son suficientes para el uso durante la disección del ovario, y alícuotas de 1 mL de MEM-alfa son suficientes para el almacenamiento transitorio de los ovarios solo en platos de 3,5 cm. -
Suprimir los ovarios de ratones femeninos 4 semana - el viejo del ICR (nombrado después de Instituto de investigación del cáncer) y de los tejidos que rodean al ovario usando tijeras y pinzas en un microscopio estereoscópico. Reserva los ovarios retirados en medio de cultivo (véase el paso 2.1) hasta su uso.
- Lugar los ovarios solo sobre el papel de filtro humedecidos con pre calentado PBS (−) (véase el paso 2.1) y cortar en 4 pedazos con una cuchilla de micrótomo en un microscopio estereoscópico.
Nota: Los ovarios de ratones ICR 4 semana - el viejo son unos 2 mm de diámetro. El número de piezas depende del tamaño de ovario; sin embargo, trozos gruesos de alrededor de 500 μm permiten observaciones de folículo apropiado (en piezas más gruesas que 500 mm, se disminuye la transparencia del tejido, en pedazos más finos de 500 mm, se rompen y se perdieron muchos folículos antrales). - Después de la disección, coloque a las muestras de ovario en rodajas con medio de cultivo en platos de 3,5 cm (vea el paso 2.1).
- Lugar los ovarios solo sobre el papel de filtro humedecidos con pre calentado PBS (−) (véase el paso 2.1) y cortar en 4 pedazos con una cuchilla de micrótomo en un microscopio estereoscópico.
3. ovario cultivo de tejidos
- Gota aproximadamente 0,5 μl de medio de cultivo por rebanadas de tejido ovárico en la inserción de la cultura de célula donde estará el tejido ovárico mediante una micropipeta.
- Coloque a cada muestra en rodajas en una gota de medio de cultivo sobre los insertos de la cultura de célula con unas pinzas.
- Cultura de los tejidos del ovario de 5% CO2 a 37 ° C.
- Reemplazar el medio de cultivo con medio fresco precalentado cada 2 días.
Nota: El horario para los cambios de medio para el cultivo de secciones de ovario de 4 semana - viejos ratones ICR se presenta en la figura 1.- Para reproducir la oleada de LH, tratar cultivadas 4 semana - viejos ovarios de ratones ICR con el medio que contiene 100 mU/mL FSH y LH de 12 h cada 4 días (figura 1).
4. microscopio imágenes de ovarios cultivados
- Iniciar la proyección de imagen los ovarios cultivados después de día 1 cuando los tejidos han adherido en los insertos de la cultura de célula y realizar análisis de microscopio confocal o invertida en intervalos de 24 h para permitir un crecimiento suficiente del folículo entre puntos de tiempo.
Nota: La microscopia Confocal es superior a la microscopía invertida para la observación de los folículos en los ovarios todo cultos.
5. Time-lapse proyección de imagen de ovarios cultivados
-
Optimizar las condiciones de proyección de imagen de Time-lapse, incluyendo láser intensidades y tiempos de exposición, para el sistema de proyección de imagen (tabla 1).
- Seleccione muestras pareadas ovario de ratones solo para el uso como los grupos tratamiento y control. Variar intensidades láser y tiempo de exposición para lograr las mejores imágenes (tabla 1).
- Comparar el crecimiento del folículo bajo cada condición de cultivo mediante la medición de áreas de folículo en imágenes de muestras de control a intervalos de 24 h y en time-lapse de muestras (ver paso 6). Al mismo tiempo, contar el número de ovuladas ovocitos en cada ovario conjunto y seleccionar las condiciones óptimas de imagen Time-lapse.
- Capturar imágenes a intervalos de 30 min con el sistema Time-lapse de imágenes bajo las condiciones determinadas (tabla 1).
6. Análisis de crecimiento de folículo
-
Para analizar el desarrollo del folículo, medir las áreas de folículo en las imágenes utilizando el software ImageJ (http://resbweb.nih.gov/ij/).
- Inicialmente, establecer la escala de la imagen haciendo clic en "Set escala" debajo de "Analizar" en la barra de herramientas. Introduzca las longitudes de lado de la imagen capturada y el correspondiente número de píxeles en los campos en blanco de "Distancia del conocido" y "Distancia en píxeles", respectivamente.
- Haga clic en "Mano libre" en la barra de herramientas y contorno de los folículos en las imágenes capturadas de campo brillante.
- Haga clic en "Medida" en "Analizar" en la barra de herramientas.
Nota: Si desean otros datos de medición, haga clic en "Configurar medición" debajo de "Analizar" en la barra de herramientas y marque las casillas apropiadas en la lista.
7. análisis del desarrollo folicular utilizando ratones transgénicos
- Recoger los ovarios de postnatal días 0 y 4 (P0 y P4) hembra de ratones transgénicos que contienen los transgenes Oog1pro3.9 R26-H2B-mCherry cultura en partes movibles como se describe en los pasos 1.1, 3.2, excepto no rodaja la P0 y ovarios de P4.
- Reemplazar el medio de cultivo con medio fresco, precalentado en platos de 3,5 cm en una incubadora con 5% CO2 a 37 ° C cada 2 días.
Nota: La concentración de LH en el medio de cultivo de ovarios P0 y P4 puede seguir siendo constante debido a las oleadas de LH no ocurre en ratones P0 y P4. - Ajuste del microscopio para visualizar solamente AcGFP1-positivo primario los folículos en ovarios P4 cultivados (tabla 1).
Nota: Sólo primarios y primordiales de los folículos están presentes en ovarios de ratón hembra P4. - Captura de imágenes de culto P0 Oog1pro3.9R26-H2B-mCherry ovarios de ratones transgénicos en intervalos de 30 minutos utilizando la configuración utilizada para ovarios P4 (ver paso 5.2).
- Rastrear y analizar el desarrollo del folículo de señales AcGFP1 y H2B mCHerry.
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Representative Results
La figura 1 muestra el protocolo para los cambios en los medios de comunicación en cultura del tejido ovárica. Siguiendo este programa, ovarios de ratones ICR 4 semanas de edad fueron cultivadas e imagen a intervalos de 24 h mediante microscopía confocal (figura 2). Durante el cultivo de tejidos de ovario durante 3 semanas, más folículos antrales y secundarios fueron degenerados por atresia del folículo y algunos fueron ovuladas (D ,figura 2y tabla 2). En el análisis de las áreas del folículo con ImageJ (figura 3), algunos folículos desarrollaron en grupos durante cada ciclo de la oleada de la LH (figura 3B y complementario 1 película). Por otra parte, la ovulación se produjo casi simultáneamente en ovarios cultivados separados de ovarios derecho e izquierdos de ratones solo. Mientras que la sincronización de la ovulación y el número de ovocitos ovuladas (tabla 2) diferenció entre ovarios de ratón (datos no mostrados), la ovulación de los ovarios cultivadas ocurrió predominante dentro de las 48 h de picos de LH (figura 3y complementario Película 1). Sin embargo, no todos los ovocitos ovulados lanzado primer cuerpo polar después de la ovulación (E ,figura 2y tabla 2), y aunque podrían fertilizar ovocitos ovuladas, dejado de desarrollo en la etapa de 4 celdas (datos no mostrados). Para aclarar los mecanismos por los cuales los folículos primordiales inactivos se activan en ovarios de ratón, detectamos activación del folículo primordial en tejidos cultivados de ratones transgénicos que llevan Oog1pro3.9 y R26-H2B-mCherry (transgenes Figura 4 figura 5y complementario película 2). Ovocitos expresan niveles muy bajos del gene Oog1 de la etapa de folículo primordial, y proyección de imagen de Time-lapse distingue baja folículos primordiales expresan AcGFP1 de los folículos primarios expresando AcGFP1 alta. Folículos primordiales y primarios están presentes simultáneamente en ovarios de ratón P4, mientras que sólo los folículos primordiales están presentes en los ovarios de P0 (figura 4A, B). Así, hemos optimizado Time-lapse condiciones de proyección de imagen para detectar sólo folículos primarios en ovarios de P4 cultivados (figura 4C). Posteriormente, captaron imágenes de ovarios P0 cultivados durante 10 días en las mismas condiciones (figura 4D – G). AcGFP1 puede ser utilizado como un índice de folículos primarios en estos ratones transgénicos y folículos primarios AcGFP1-positivos eran perceptibles en ovarios P0 cultivados después de cultivo de 30-40 h (figura 4, figura 5A-Fy complementario Película 2). Folículos primordiales y primarios en ovarios cultivados fueron distinguidos también por mCherry positivo los núcleos de células de la granulosa (figura 5B, E). Específicamente, mCherry señales indican las formas de los folículos y permitan una observación de las etapas del folículo en los ovarios cultivados (figura 5B, E y H). Por lo tanto, este sistema de cultivo con ovarios de Oog1pro3.9/R26-H2B-mCherry ratones revelaron el proceso del desarrollo del folículo de primordial a las etapas del folículo secundario. Estos métodos le facilitará los estudios de los mecanismos de regulación del desarrollo folicular de la gonadotropina-independiente.
Figura 1 : Curso de tiempo de cambios medio. A medio contiene 5% FBS, 100 mU de FSH, LH de 10 mU, 100 U/mL penicilina y estreptomicina 100 mg/mL de MEM-alfa. B el medio contiene 5% FBS, 100 mU de FSH, LH de 100-mU, 100 U/mL penicilina y estreptomicina 100 mg/mL de MEM-alfa. Medio B fue utilizado para producir picos de LH cada 4. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2 : Imágenes de tejidos ovarianos cultivados. Imágenes fueron capturadas a intervalos de 24 h mediante microscopía confocal. (A) día de la cultura 1; (B) día de la cultura 5; (C) cultura día 10; (D) día de la cultura 13; (E) imagen ampliada de la región indicada por el cuadrado de (D); ovocitos en D se ovularon de los folículos que indican las flechas en B, C y D. oocito (F) liberación de un cuerpo polar después de la ovulación; Barra de escala = 200 μm. haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3 : Las mediciones de áreas de folículo en los ovarios cultivadas. (A) imagen de ovario cultivada; las líneas punteadas representan el área medida por ImageJ. (B) áreas folicular en ovario cultivada después de 3 semanas; las líneas grises representan el período de la cultura de la adición de LH (pico de LH) de 100 mM. Las líneas muestran las etapas de desarrollo en cada folículo en el ovario cultivado; Barra de escala = 200 μm. haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4 : Hematoxilina y eosina (H & E) tinción imágenes de ovarios P0 y P4 y proyección de imagen de Time-lapse. (A) H & E tinción de ovario P0; (B) H & E tinción de ovario P4; (C) imagen de ovario P4 de un ratón transgénico Oog1pro3.6 después de la cultura de 10 h. La flecha muestra un folículo primario AcGFP1-positivo. (D – G) Imágenes de P0 ovarios de ratones transgénicos que expresaban Oog1pro3.9 y R26-H2B-mCherry; las señales verdes y rojas en D y F son respectivamente AcGFP1 y mCherry. Blanco señales en E y G representan AcGFP1 en D y F, respectivamente. D y E son imágenes de ovarios cultivados después de cultura h 0,5. F y G muestran los ovarios después de la cultura 180 h; Barra de escala = 100 μm. haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 5: imágenes de folículos primordiales, primarios y secundarios en ovarios cultivados de oog1pro3.9/R26-H2B-mCherry ratones. (A–C) Imágenes de folículos primordiales en los ovarios de P0 cultivados; (FdeD–) Imágenes de folículos primarios en ovario cultivada P0; (G–H) Imágenes de folículos secundarios en ovarios de ratón cultivadas de 4 semanas de edad. A, D y G son imágenes combinadas de B y C, E y F y H y I, respectivamente. Verde, AcGFP1; rojo, mCherry; Barra de escala = 100 μm. haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
| microscopio | lente del objetivo | láser | exposición (ms) | Ganancia | intervalo de tiempo | z-stack | otros | Figuras y peliculas |
| CV1000 | X10 | 488 nm: 30, 561 nm: 20 | 488 nm: 700, 561 nm: 600 | 488 nm: 90, 561nm: 20 | 30 min | 5 mm | Figura 4C-G, cine 1 y 2 | |
| BZ-X700 | X20 (con el collar de la colección) | 40% | Automático | X4 | 30 min | 10 mm | binning 3 x 3 | Película 3 |
| LSM710 | X10 | 488 nm: 6%, 564 nm: 5% | velocidad de la cámara: 4 | 488 nm: 850, 564 nm: 850 | 24 h | 10 mm | digital ganar, 488 nm: 2, nm:1 564 | Figura 2, 3 y 5 |
Tabla 1: lapso de tiempo las condiciones de la proyección de imagen. Condición de Time-lapse para microscopios confocal y brillante campo.
| Ovario no. | Número de ovocitos ovuladas total | Número de ovocitos MII |
| 1 | 7 | 2 |
| 2 | 19 | 9 |
| 3 | 14 | 6 |
| 4 | 7 | 3 |
| 5 | 12 | 4 |
| 6 | 15 | 6 |
| 7 | 25 | 11 |
| 8 | 13 | 3 |
| 9 | 11 | 7 |
| 10 | 19 | 8 |
| 11 | 18 | 4 |
| 12 | 7 | 1 |
Tabla 2: número de ovuladas ovocitos en ovarios cultivos. Número de ovocitos ovuladas de doce ovarios cultivados; MII indica el número de ovocitos ovuladas que lanzó el primer cuerpo polar después de la ovulación.
Adicional 1 de la película: película Time-lapse de un ovario cultivado. Ovarios fueron recogidos en 4 semana - viejos ratones y fueron cortados y cultivados durante 3 semanas. La película abarca un período de cultivo de 0 – 200 h a 10 fotogramas/s. haga clic aquí para ver este video. (Clic derecho para descargar)
Adicional 2 de la película: película Time-lapse de un ovario de P0 culto de un ratón transgénico. Verde, AcGFP1; rojo, mCherry. La película abarca un período de cultivo de 0 – 180 h a 10 fotogramas/s. haga clic aquí para ver este video. (Clic derecho para descargar)
Película adicional 3: Película Time-lapse de un ovario cultivado de un ratón de 4 semanas de edad. Verde, AcGFP1; rojo; mCherry; la película abarca un periodo de la cultura de 9 a 13 días de cultura en 10 cuadros/s. Las flechas en la primera imagen muestran folículos en atresia que ocurrió durante la cultura. Por favor haga clic aquí para ver este video. (Clic derecho para descargar)
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Discussion
En este estudio, hemos desarrollado dos nuevos métodos para estudiar el desarrollo folicular en ovarios de ratón. El primer método implica el cultivo de los tejidos de ratones adultos ovárico en rodajas seguida por análisis del desarrollo del folículo, y el segundo involucra el uso de Time-lapse de imágenes para visualizar el desarrollo folicular temprano durante la etapa independiente de la gonadotropina. Anteriormente, utiliza el método de cultivo de tejidos de ovario presente para evaluar el efecto del factor inhibidor de leucemia y de la progesterona en el folículo desarrollo8,9y demostró que sus efectos varían con la etapa de concentración y el folículo. En el presente estudio, rodajas de tejidos ováricos exhibió folículo dinámica, garantizando más análisis del mecanismo de desarrollo del folículo ovárico usando este modelo.
Los ovarios de ratones de más de 5 semanas de edad contienen lutea de la recopilación que observaciones microscópicas. Por lo tanto, los ovarios de ratón de 4 semanas de edad se prefieren para las observaciones del desarrollo folicular y la ovulación y posterior tardíos folículos primarios, secundarios y antrales se distinguen más fácilmente mediante microscopía de campo brillante. Nuestros métodos ofrecen comparaciones de los efectos de factores de crecimiento y fármacos en medios de cultivo, con cambios discernibles en el desarrollo del folículo entre ovarios diferencialmente tratados (figura 3).
Ratones transgénicos que expresaban las proteínas Cre o fluoresceína en ovocitos se han descrito en anteriores estudios18,19,20. Sin embargo, clasificación de la fase folicular depende de las características histológicas incluyendo granulosa célula formas, número de capas de células granulosas, y si se forman las células de la teca. Así, distinciones entre folículos primordiales y primarios pueden ser limitados de observaciones de ovocitos solo. Aquí, se utilizan ratones transgénicos que contienen la Oog1pro3.9 y R26-H2B-mCherry transgenes11,17 y visualizar el desarrollo temprano del folículo de primordial a las etapas del folículo secundario en ovarios cultivadas. Oog1 expresión llega a ser perceptible en los ovocitos durante la etapa de folículo primordial y se incrementa notablemente en folículos primarios. Por lo tanto, las intensidades de la señal AcGFP1 en ovocitos están asociadas con la etapa de folículo (figura 5) y se utilizaron para observar la transición de folículo primordial primario (figura 4, adicional 2 de la película). Núcleos celulares se tiñen rojo R26-H2B-mCherry ratones transgénicos (figura 4, adicional 2 de la películay complementario 3 película), que permite observaciones de etapas del folículo según número de células de granulosa ( Figura 5). Así, colectivamente los métodos actuales permiten análisis del desarrollo del folículo de primordial a través de la ovulación utilizando Oog1pro3.9/R26-H2B-mCherry ratones transgénicos. Además, porque se condensa la cromatina de la célula apoptótica, mCherry señales de folículos atretic son más fuertes que las de los folículos normales (adicional 3 de la película).
Entre sutilezas metodológicas, correcto espesor de tejidos en rodajas es necesarios para un cultivo exitoso, con muerte celular mayor en rebanadas de ovario que son demasiado gruesos y las pérdidas de folículos antrales grandes en rebanadas de ovario que son demasiado delgadas. La velocidad de crecimiento del folículo es lenta; por lo tanto, es fácil de rastrear y analizar el proceso de cada folículo mediante observación 24 h intervalo. El microscopio confocal presente ajuste, incluyendo el láser de intensidad, tiempo y ganancia digital, depende el modo de microscopio, pero son fundamental para tener en cuenta al obtener imágenes de lapso de tiempo. En particular, laser fuerte intensidades y tiempos de exposición largos son necesarios para capturar imágenes claras, pero pueden afectar las células cultivadas. Por lo tanto, la moderación de estos valores para evitar fototoxicidad es fundamental. En rodajas los tejidos ováricos de ratones de 4 semanas de edad pueden ser cultivados por aproximadamente 4 semanas, mientras que los folículos primordiales y primarios permanecen presente posteriormente, ya no crecen. Por el contrario, P0 y P4 los ovarios pueden ser cultivados durante aproximadamente 10 días, durante los cuales los folículos primordiales y primarios se convierten en folículos primarios o secundarios, respectivamente. Sin embargo, los folículos en ovarios P0 y P4 cultivados no se convierten en folículos antrales. Por lo tanto, la extirpación de los ovarios se requiere en las distintas etapas de estudios de los mecanismos de regulación asociados con el desarrollo del folículo de ovario entero.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Agradecemos a Dr. Naojiro Minami (Universidad de Kioto) para proporcionar los ratones Oog1pro3.9 . Esta investigación fue apoyada por el JSP (KAKENHI # JP15H06275) y la Fundación de Nitto.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Follicle stimulating hormone from human pituitary | SIGMA | F4021 | |
| Lutenizing hormone from equine pituitary | SIGMA | L9773 | |
| Penicillin-streptomycin solution | Wako Pure Chemical Industries | 168-23191 | |
| MEM a, GlutaMax, no nucleotides | Thermo Fisher | 32561037 | |
| Glass bottom dish | MatTek | P35G-0-10-C | 35mm dish, No. 0 coverslip, 10mm glass diameter |
| Millicell cell culture insert | Merck Millipore | PICM0RG50 | Diameter: 315 mm, pore size: 0.4 mm, material: hydrophilic PTTE |
| 3.5cm cell culture dishes | greiner bio-one | 627160 | |
| 50ml / centrifuge tube with triple seal cap | IWAKI | 2345-050 | |
| Low-profile disposable blades 819 | Leica | 14035838925 | |
| LSM 710 | Carl Zeiss | Confocal microscope | |
| CellVoyager, CV1000 | Yokogawa Electric Corporation | Time-lapse imaging | |
| BZ-X700 | KEYENCE | Time-lapse imaging |
References
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