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Biochemistry

Una schermata di 2-ibrido del lievito in Batch per confrontare interazioni proteina

Published: June 6, 2018 doi: 10.3791/57801
Automatic Translation
1, 1, 1
1Molecular Physiology and Biophysics, University of Iowa

Summary

Elaborazione batch delle schermate di lievito 2-ibrido consente di confronto diretto tra i profili di interazione delle proteine multiple esca con un insieme molto complesso di proteine di fusione di preda. Qui, descriviamo raffinati metodi, nuovi reagenti e come implementare il loro utilizzo per tali schermi.

Abstract

Lo screening per le interazioni proteina-proteina usando il dosaggio di 2-ibrido del lievito è stato a lungo uno strumento efficace, ma il suo utilizzo in gran parte è stato limitato alla scoperta di interattori di alto-affinità che sono altamente arricchito nella biblioteca di candidati interagenti. In un formato tradizionale, il dosaggio di 2-ibrido del lievito può produrre troppo molte colonie per analizzare quando condotto presso stringenza dove potrebbero essere trovati Interactiani bassa affinità. Inoltre, senza un interrogatorio esaustivo e completo della stessa libreria contro esca diversi plasmidi, un'analisi comparativa non possono essere realizzata. Anche se alcuni di questi problemi possono essere risolto utilizzando librerie allinearono preda, il costo e l'infrastruttura necessaria per far funzionare questi schermi possono essere proibitivi. In alternativa, abbiamo adattato il dosaggio di 2-ibrido del lievito per scoprire contemporaneamente decine di transitori e interazioni proteina statico all'interno di un unico schermo che utilizzano una strategia definita profondo (arricchimento dinamico per la valutazione della proteina reti), che incorpora il sequenziamento del DNA di alto-rendimento e calcolo per seguire l'evoluzione di una popolazione di plasmidi che codificano interattori. Qui, descriviamo su misura reagenti e protocolli che consentono un profondo schermo per essere eseguito facilmente e a costi contenuti.

Introduction

Una comprensione completa dei processi biologici delle cellule si basa sull'individuazione delle reti di interazione della proteina che sono alla base della loro meccanismi molecolari. Un approccio per identificare interazioni della proteina è il dosaggio di lievito 2-ibrido (Y2H), che funziona con l'assemblaggio di un fattore di trascrizione chimerica funzionante una volta due dominii della proteina di interesse associare ad uno altro1. Una tipica schermata di Y2H viene eseguita mediante la creazione di una popolazione di lievito che ospita sia una libreria di plasmidi che codificano le proteine interagenti fuse ad un attivatore trascrizionale (ad es., 'preda' proteina di fusione) e un plasmide dato 'esca' composta la proteina di interesse fusa a un dominio di legame del DNA (per esempio, il dominio legante il DNA di Gal4 che lega la sequenza d'attivazione Gal4-upstream). Uno dei principali vantaggi dell'approccio Y2H è che è relativamente facile e poco costoso per condurre in un tipico laboratorio attrezzato per lavoro biologico molecolare routine2. Tuttavia, quando tradizionalmente eseguita, un utente campioni diverse colonie che sorgono al momento della selezione per una positiva interazione Y2H. Questo limita fortemente il numero di cloni 'preda' libreria che può essere oggetto di indagine. Questo problema è aggravato quando l'abbondanza di una particolare preda interagente è molto alta rispetto alle altre, diminuendo la possibilità di rilevare l'interazione da plasmidi preda abbondanza bassa.

Una soluzione per l'utilizzo del principio di Y2H in una copertura completa del proteoma è l'uso di un approccio di matrice-formattato in cui una matrice contenente noto preda singoli plasmidi possa essere interrogata digitalmente. Tuttavia, tale approccio richiede un'infrastruttura che non è facilmente accessibile e conveniente per diversi ricercatori che sono interessati nella definizione Interactoma di un piccolo numero di proteine o domini3. Inoltre, librerie di prede molto complessa che possono codificare più frammenti di proteine interagenti sarebbero espandere le dimensioni di tali matrici matrice ai formati impraticabile. Un'alternativa consiste nell'eseguire saggi con librerie complesse in lotti e valutare la presenza di cloni interagenti mediante sequenziamento massivo di high throughput parallelo4. Questo può essere applicato per analizzare la presenza di prede plasmidi che sorgono nelle colonie multiple utilizzando un tipico Y2H formattato approccio nel quale lievito cellule alloggiamento un interagenti delle proteine di fusione sono autorizzate a crescere su una piastra5,6. Questa idea generale può essere accentuata per aumentare query di entrambi più esche e prede componenti al stesso tempo7,8.

Ancora, molte indagini richiedono che un più facile ancora più concentrati sforzo sulla proteina a pochi 'esche' e possono beneficiare più di una query esaustiva e semi-quantitativa di una libreria singola preda complessi. Abbiamo sviluppato e convalidato un metodo per eseguire gli studi di interazione della proteina su vasta scala utilizzando un principio di Y2H in batch formato4. Questo utilizza il tasso di espansione di un plasmide particolare preda come un proxy per la forza relativa di Y2H interazione9. Sequenziamento profondo di tutti i plasmidi all'interno di una popolazione sottoposta alla normale crescita o condizioni di crescita selettiva produce una mappa completa dei cloni che producono interazioni Y2H forti e deboli. Il repertorio di interattori possa essere ottenuto e confrontato direttamente attraverso più esca plasmidi. Il flusso di lavoro risultante definito profondo (arricchimento dinamico per la valutazione della proteina reti) quindi utilizzabile per identificare differenziale Interattomi dalle stesse librerie di preda per identificare le proteine, permettendo un confronto tra una proteina contro un altro.

Qui, noi dimostrare profondo e introdurre miglioramenti nei metodi di laboratorio che facilitano l'uso, che sono illustrati nella Figura 1. Miglioramenti significativi includono:

Generazione di popolazioni lievito preda. Uno dei requisiti chiavi di profondo sta generando popolazioni di lievito con i plasmidi di esche diverse che hanno la stessa distribuzione delle librerie preda del plasmide. Popolazioni di equivalente della linea di base della libreria plasmide preda sono essenziali per effettuare confronti accurati tra l'interattomi di diverse esche. Ciò si ottiene quando un plasmide di biblioteca occupa già una popolazione di lievito aploidi e lo spostamento di un plasmide dato esca in quella popolazione è ottenuto dall'accoppiamento per produrre un diploide. Qui, forniamo una guida chiara su come rendere tali popolazioni utilizzando librerie commerciali ospitate in lievito aploide. Anche se abbiamo trovato metodi che generano un elevato numero di diploidi, l'efficienza complessiva degli amori di questi ceppi di lievito commerciale libreria-contenente era basso. Di conseguenza, abbiamo costruito un nuovo ceppo che può ospitare la preda librerie che produce molto più diploidi per reazione di accoppiamento.

Nuovo set di plasmidi di esca. Molti plasmidi corrente che esprimono proteine di fusione 'esca' comprende della proteina di interesse e un dominio di legame al DNA sono basati su 2 µ, permettendo loro di amplificare il loro numero di copia. Questo numero di copia può essere abbastanza variabile nella popolazione e portare alla variabilità della risposta trascrizionale di Y2H. Questo a sua volta potrebbe inclinare la capacità di misurare la forza di un'interazione proteina data sulla base della risposta di crescita delle cellule in selezione. Questo può essere parzialmente indirizzo utilizzando un plasmide copia basso, alcuni dei quali precedentemente sono stati descritti come il pDEST32 commercialmente disponibili10. Abbiamo costruito un nuovo plasmide esca (pTEF-GBD) che produce proteine di fusione di dominio Gal4-DNA-binding all'interno di un plasmide copia basso basato su centromero TRP1 che trasporta il gene di resistenza Kanr che permette anche la clonazione di frammenti di esca sia a Monte e a valle del dominio legante il DNA di Gal4.

Libreria di frammento di nuovo ad alta densità Y2H. Abbiamo costruito un nuovo plasmide per librerie di casa Y2H preda e usato per costruire una libreria di Y2H altamente complessa composta casualmente tranciati frammenti di DNA genomico da Saccharomyces cerevisiae. Analisi di sequenza ha indicato che questa libreria ha avuto oltre 1 milione di elementi diversi, molto più complessi di lievito precedentemente descritti genomica Y2H plasmide biblioteche11. Con questa nuova libreria, siamo stati in grado di dimostrare che il flusso di lavoro profondo è abbastanza robusto per ospitare librerie complesse con molti plasmidi differenti in modo che sia affidabile e riproducibile.

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Protocol

1. preparazione di supporti e piastre

Nota: Tutte le piastre devono essere effettuata come minimo 2 giorni prima dell'inizio del protocollo. I mezzi di comunicazione può essere fatto in qualsiasi punto. Tuttavia, il buffer lievito estratto peptone destrosio dell'adenina (bYPDA) deve essere effettuato il giorno in cui verrà utilizzato. Alcuni media è realizzata con un mix di supplemento che contiene un livello di adenina è maggiore di quello che viene in genere utilizzato. Maggior parte dei supplementi media minimi specificare adenina 10 mg/L. I supplementi identificati '+ 40Ade' specificare un totale di adenina 40 mg/L.

  1. Preparare la soluzione di glucosio (50% p/v). Per 1 L, sciogliere 500 g di D-(+)-glucosio in 800 mL di acqua distillata in un becher da 1.000 mL. Regolare il volume a 1.000 mL di utilizzando un cilindro graduato e filtro attraverso un filtro sterile di 0,2 µm in una bottiglia di archiviazione media sterile da 1.000 mL.
  2. Preparare a Estratto di lievito peptone destrosio (YPD) piastre. Per 1 L, sciogliere 20 g di Peptone e 10 g di Estratto di lievito in 800 mL di acqua distillata in un becher da 1.000 mL. Versare in un cilindro graduato, riempire fino a 960 mL con acqua distillata. Versare in una beuta da 2.000 mL e aggiungere 15 g di agar. Autoclave e raffreddare a bagnomaria a 37 ° C fino a quando la temperatura del bagnomaria è raffreddato a circa 42-50 ° C. Utilizzare una pipetta per aggiungere 40 mL di glucosio di 50%. Miscelare bene agitando.
    1. Versare una serie di piastre di 100 mm con 20 mL di media di pipetta.
  3. Preparazione completi sintetici media minimi (CSM)-Trp piastre. Per 1 L, sciogliere 6,7 g di lievito azoto Base senza aminoacidi in 800 mL di acqua distillata in un becher da 1.000 mL. Versare in un cilindro graduato, riempiono fino a 960 mL di acqua distillata. Versare in un 2.000 mL di beuta e aggiungere 0,7 g di - Trp-incontrato mix di dropout, 20 mg di metionina e 15 g di agar. Autoclave e raffreddare a bagnomaria a 37 ° C fino a quando la temperatura del bagnomaria è raffreddato a circa 42-50 ° C. Utilizzare una pipetta per aggiungere 40 mL di glucosio di 50%. Miscelare bene agitando.
    1. Versare una serie di piastre di 100 mm con 20 mL di media di pipetta.
  4. Preparare piatti CSM-Leu-Met. Per 1 L, sciogliere 10,05 g di lievito azoto Base senza aminoacidi in 800 mL di acqua distillata in un becher da 1.000 mL. Versare in un cilindro graduato e riempia fino a 940 mL di acqua distillata. Versare in un 2.000 mL di beuta e aggiungere 1,005 g di - Leu-Met dropout mix e 15 g di agar. Autoclave e raffreddare a bagnomaria a 37 ° C fino a quando la temperatura del bagnomaria è raffreddato a circa 42-50 ° C. Utilizzare una pipetta per aggiungere 60 mL di glucosio di 50%. Miscelare bene agitando.
    1. Versare una serie di piastre di 100 mm con 20 mL di media di pipetta.
  5. Preparare piatti CSM-Leu-Trp. Per 1 L, sciogliere 10,05 g di lievito azoto Base senza aminoacidi in 800 mL di acqua distillata in un becher da 1.000 mL. Versare in un cilindro graduato, riempiono fino a 940 mL di acqua distillata. Versare in un 2.000 mL di beuta e aggiungere 1,005 g di - Trp-Leu + 40Ade dropout mix, 240 mg di adenina e 15 g di agar. Autoclave e raffreddare a bagnomaria a 37 ° C fino a quando la temperatura del bagnomaria è raffreddato a circa 42-50 ° C. Utilizzare una pipetta per aggiungere 60 mL di glucosio di 50%. Miscelare bene agitando.
    1. Versare una serie di piastre di 100 mm con 20 mL di media di pipetta.
  6. Preparare piatti CSM-Leu-Trp-His. Per 1 L, sciogliere 10,05 g di lievito azoto Base senza aminoacidi in 800 mL di acqua distillata in un becher da 1.000 mL. Versare in un cilindro graduato, riempiono fino a 940 mL di acqua distillata. Versare in un 2.000 mL di beuta e aggiungere 0,975 g di - Trp-Leu-la sua + 40Ade dropout mix, 240 mg di adenina e 15 g di agar. Autoclave e raffreddare a bagnomaria a 37 ° C fino a quando la temperatura del bagnomaria è raffreddato a circa 42-50 ° C. Utilizzare una pipetta per aggiungere 60 mL di glucosio di 50%. Miscelare bene agitando.
    1. Versare una serie di piastre di 100 mm con 20 mL di media di pipetta.
  7. Preparare piatti CSM-Leu-Trp-His-3AT. Per 1 L, sciogliere 10,05 g di lievito azoto Base senza aminoacidi in 800 mL di acqua distillata in un becher da 1.000 mL. Versare in un cilindro graduato, riempiono fino a 940 mL di acqua distillata. Versare in un 2.000 mL di beuta e aggiungere 0,975 g di - Trp-Leu-la sua + 40Ade dropout mix, 240 mg di adenina e 15 g di agar. Autoclave e raffreddare a bagnomaria a 37 ° C fino a quando la temperatura del bagnomaria è raffreddato a circa 42-50 ° C. Utilizzare una pipetta per aggiungere 60 mL di glucosio di 50%. Miscelare in 100 µ l di uno stock di sterile 1 M di 3-amino-1, 2,4 triazolo (3AT) agitando.
    1. Versare una serie di piastre di 100 mm con 20 mL di media di pipetta.
  8. Preparare piastre LB-Kanr. Per 1 L, Estratto di sciogliere 10 g di triptone, 5 g di lievito e 10 g di NaCl in 800 mL di acqua distillata acqua in un becher da 1.000 mL. Versare in un cilindro graduato, riempiono fino a 1.000 mL di acqua distillata. Versare in un 2.000 mL di beuta e aggiungere 15 g di agar. Autoclave e raffreddare a bagnomaria a 37 ° C fino a quando la temperatura del bagnomaria è raffreddato a circa 42-50 ° C. Aggiungere 50 mg kanamicina e mescolare agitando.
    1. Versare una serie di piastre di 100 mm con 20 mL di media di pipetta.
  9. Preparare YPD, CSM-Leu-Met, CSM-Trp, CSM-Leu-Trp e CSM-Leu-Trp-i suoi supporti. Utilizzare la procedura sopra per piastre tranne che invece di riversare in un matraccio di Erlenmeyer, versare in una bottiglia di archiviazione multimediale e omettere l'agar.
  10. Preparare bYPDA (memorizzato nel buffer YPDA). Prendere terreno YPD sterile e aggiungere adenina 200 mg/L in acqua distillata sterile. Regolare il pH a 3,7 con HCl. filtro attraverso un filtro sterile di 0,2 µm in una bottiglia sterile.
  11. Preparare il tampone di trasformazione: sorbitolo 2 M, 1 M litio acetato diidrato, 10 mM Tris-HCl pH 7,6, 0,5 mM EDTA, 0,2 mM di cloruro di calcio in acqua distillata. Filtrare attraverso un filtro sterile 0,2 µm in una bottiglia sterile.
  12. Preparare la soluzione di PEG: 70% w/v polietilene glicole 3350 in acqua distillata. Sterilizzare in autoclave.
  13. Preparare Twirl: glicerolo a 8m urea, SDS 4% w/v, 50 mM Tris-HCl pH 6.8, 10% v/v, 0,02% w/v bromofenolo in sterile di acqua distillata.
  14. Preparare sTE (forte TE): 50 mM Tris, 20 mM EDTA, pH 8.0 in acqua distillata. Filtrare attraverso un filtro sterile 0,2 µm in una bottiglia sterile.
  15. Preparare la soluzione di riserva di Zymolase: 10 mg/mL Zymolase 100T a 50mm potassio fosfato bibasico pH 7.5, buffer di glicerolo 50% v/v in sterile distillata acqua (conservato a-20 ° C).

2. clonazione e verifica dei plasmidi esca

Nota: Costruzione del dominio di legame del DNA, Gal4 plasmidi. Attualmente, ci sono una varietà di sistemi di Y2H commercialmente disponibile e accademicamente. PROFONDO può ospitare molti di questi, purché il plasmide esca esprimenti la proteina di interesse fusa a un dominio di legame al DNA è in un TRP1-contenenti il plasmide. Altri requisiti a valle che sono la sequenza immediatamente a Monte della biblioteca preda inserto è noto e che un'interazione positiva di Y2H può essere segnata dalla produzione di His3 consentendo selezione media privo di istidina. Qui descriveremo l'uso di un nuovo plasmide esca di Y2H (pTEF-GBD, Figura 2), tuttavia, altri plasmidi di esca Y2H tra cui pGBKT7 possono essere usati pure. Per la costruzione e valutazione di esca plasmidi, descriveremo uso di pTEF-GBD. Come nota generale, si consiglia di sintesi di geni per la produzione di un telaio aperto-lettura che aderisce per il bias di codone lievito per garantire buona espressione e la facilità con la clonazione. Garantire che il regime di clonazione consente dell'esca per essere in-frame con il dominio di legame al DNA di Gal4 e che quando la clonazione nel sito 3', un codone di arresto segue la regione di codificazione di esca.

  1. Preparare il vettore plasmidico. Plasmide pTEF-GBD permette per la clonazione di un frammento che codifica per la proteina di interesse 5' o 3' della regione che codifica per il dominio di legame al DNA di Gal4 utilizzando un metodo di assemblaggio rapido. Per inserimento al 5' luogo, digerire 3 µ g di pTEF-GBD con NarI ed EcoRI o per l'inserimento nel sito 3', digerire con BamHI e XhoI per 2-4 h. Electrophorese campione in agarosio all'1% del DNA del gel contenente 0,2 - 0,5 µ g/mL etidio bromuro (EtBr) a 100 V. asportare la bp taglio 5.630 TEF-GBD e purificare utilizzando un kit di estrazione del gel del DNA in conformità con le istruzioni del produttore e quantificare il DNA di assorbanza a 260 nm di spettrofotometro12.
    Nota: Generazione di inserti esca-codifica. Frammenti di DNA codifica proteine o frammenti della proteina di interesse possono essere realizzato utilizzando sintesi di geni e disponibile come frammenti non duplicate. È consigliabile che i codoni sono ottimizzati per l'espressione in Saccharomyces cerevisiae e strumenti online per l'ottimizzazione del codone sono inclusi nell'elenco dei materiali.
  2. Per 5' inserimento, fiancheggiano il frammento di DNA che codifica un codone di inizio ATG da 5'-TTAAGAAAAACAAACTGTAACGAATTC-3 'e 5'-GCGCCTATGTGTGAACAAAAGCTTATT-3, rispettivamente. Per 3' inserimento nel telaio con dominio di legame al DNA di Gal4, fiancheggiano il frammento codifica di 5'-ctgcatatggccatggaggccgaa-3 'e 5'-tagtaactagcataaccccttggggcc-3'.
  3. Per la costruzione del plasmide, utilizzare il metodo di assemblaggio rapido come specificato nelle istruzioni del produttore per clonazione frammenti in taglio pTEF-GBD.
    1. Piastra tutto trasformato e. coli sulle piastre di LB-Kanr e incubare per 16-20 h a 37 ° C. Colonie di alloggiamento pTEF-GBD con l'inserto desiderato possono essere identificati dall'amplificazione di PCR usando i oligonucleotides: 5'-CGGTCTTCAATTTCTCAAGTTTCAG-3 ' e 5'-GAGTAACGACATTCCCAGTTGTTC-3' 5' inserto e 5'-CACCGTATTTCTGCCACCTCTTCC-3' e 5'-GCAACCGCACTATTTGGAGCGCTG-3' per 3' inserto. Questi oligonucleotidi possono anche servire come primer per la sequenziazione l'inserto.
    2. Piano sulla preparazione > 10 µ g di ogni derivato pTEF-GBD e pTEF-GBD da soli a fornire materiale per le trasformazioni di sequenziamento e lievito.
    3. Utilizzare le seguenti condizioni PCR: 3 min a 98 ° C, seguita da 25 cicli di 30 s a 98 ° C, 30 s a 55 ° C e a 2 minuti a 72 ° C, seguita da 5 min a 72 ° C, utilizzando un buffer contenente 2,5 mM MgCl2 , U/100 0,5 µ l DNA polimerasi e buffer proprietarie.

3. espressione di proteine di fusione Gal4-DNA-binding Domain

  1. Rendere il lievito competente.
    1. Stock e strofinarlo delicatamente su tutta la piastra YPD congelati striscia fuori PJ69-4A lievito su una piastra di YPD prendendo un applicatore di legno sterile, raschiando 1 mm3 di a-80 ° C. Spostare l'applicatore di legno giù la piastra in modo che ogni passaggio attraversa una parte incontaminata della superficie del supporto. Incubare la piastra YPD a 30 ° C per 2 giorni o fino a quando le singole colonie sono visibili. Rendere il brodo congelato di lievito PJ69-4A di sospensione di lievito in acqua o crescita media, completando con DMSO al 7% e alla conservazione a-80 ° C.
    2. Inoculare una singola Colonia in 5 mL di coltura di YPD in un tubo di cultura 20 x 150 mm utilizzando un applicatore di legno sterile e crescere durante la notte a 30 ° C in un incubatore d'agitazione a 200 giri/min.
    3. Inoculare 50ml di YPD in un 250 mL di beuta sterile con 4 mL di cultura durante la notte del ceppo di lievito PJ69-4A. Crescere in un incubatore d'agitazione a 30 ° C, 200 giri/min per una densità ottica (OD600) di circa 1.2, come determinato mediante spettrofotometria con un percorso di luce standard da 1 cm. Crescita di solito prende 5-7 h.
    4. Isolare lievito di sedimentazione in un 50 mL di tubo conico a 4.696 x g per 5 min a temperatura ambiente in una centrifuga da banco. Gettare il surnatante di dumping in rifiuti liquidi. Utilizzando una pipetta, risospendere il pellet in 5 mL di tampone di trasformazione e trasferimento a 15 mL di tubo conico. Resediment per eliminare il surnatante e risospendere il lievito in 1 mL di volume finale del buffer di trasformazione con una pipetta di 1000 µ l.
    5. Incubare le cellule di lievito per 60 min a 30 ° C mentre si stringono a 200 giri/min e poi metterli su ghiaccio per 30-90 min.
  2. Trasformazione del plasmide di lievito.
    1. In 1,5 mL di tubo del microcentrifuge sterili, aggiungere 1 µ g di plasmide pTEF-GBD-basato e 5 µ l di vettore di sperma di salmone 10 mg/mL soluzione di DNA. Includono anche una provetta contenente solo del DNA di vettore di sperma di salmone come controllo negativo trasformazione. Aggiungere 100 µ l della sospensione delle cellule di lievito ghiacciata in ogni provetta mediante pipetta. Aggiungere 100 µ l del 70% soluzione PEG con una pipetta 1000 µ l e mescolare delicatamente, spostando il tubo di 5 - 10 volte (Centrifugare).
    2. Incubare a 30 ° C, in un incubatore d'agitazione a 200 giri/min per 45 min.
    3. Shock termico a 42 ° C per 15 min.
    4. Sedimenti in una microcentrifuga a 845 x g per 3 min a temperatura ambiente, pipettare fuori ed eliminare il surnatante, risospendere il pellet in 150 µ l di acqua sterile pipettando su e giù e si sviluppa su una superficie di una piastra di CSM-Trp.
    5. Posto sul lato destro di piastre fino in incubatore a 30 ° C ed incubare per 2-3 giorni fino a quando le colonie sono visibili. Piastre possono essere capovolto per evitare formazione di condensa sulla superficie della piastra dopo incubazione a 30 ° C per 6-12 h.
    6. Prendere 2-3 colonie per trasformazione e striscia come un cerotto su una piastra di CSM-Trp utilizzando uno stuzzicadenti sterile. Permettono di crescere per 24 h a 30 ° C.
  3. Fare lisati per l'espressione della proteina.
    1. Inoculare 3 mL di liquido media CSM-Trp con un match-testa-dimensioni di lievito dalla patch e crescere durante la notte a 30 ° C in un tubo di cultura 20 x 150 mm, mentre si stringono a 200 giri/min. Fare due culture durante la notte per esche e vettore vuoto pTEF-GBD.
    2. Aggiungere 1 mL di YPD per ogni 3 mL di CSM-Trp cultura durante la notte. Crescere per 1 h a 30 ° C, mentre si stringono a 200 giri/min. Controllare il diametro esterno delle cellule mediante lo spettrofotometro.
    3. Sedimento un numero equivalente di cellule, normalizzazione secondo il diametro esterno. Utilizzare sterili da 1,5 mL di microcentrifuga con un giro di 5 min a 2.348 x g a temperatura ambiente in una microcentrifuga. Utilizzare una pipetta per eliminare il surnatante. Lo stock finale corrisponde a un minimo di 2,1 OD.
      Nota: Quando si calcola il numero equivalente di cellule, può accadere che diversi volumi possono essere richiesti da ogni cultura durante la notte per raggiungere il minimo OD 2,1.
    4. Risospendere il pellet in 450 µ l di 0.2 M NaOH pipettando su e giù. Incubare per 5 min a temperatura ambiente. Recentrifugare cellule per 2 min a 2.348 x g a temperatura ambiente e scartare il surnatante mediante pipetta.
    5. Risospendere il pellet con 50 µ l di tampone TWIRL pipettando su e giù con attenzione tale da non rendere le bolle. Campione di calore per 5 min a 70 ° C.
  4. Verifica per l'espressione della proteina da SDS-PAGE.
    1. Uso di un gel di pendenza di 4-20% per garantire una vasta gamma di pesi molecolari possono essere risolti. Carico equivalente importo (stesso OD) dei campioni in una SDS-PAGE gel e assicurarsi di includere almeno un campione contenente le non modificato pTEF-GBD vettoriale13,14,15.
    2. Dopo la separazione elettroforetica, trasferimento gel a nitrocellulosa e immunoblot utilizzando anticorpi monoclonali o policlonali anti--myc e soluzione di rilevamento ECL (Figura 3).

4. auto-attivazione Test

  1. Striscia fuori il lievito MATalpha dello stock di-80 ° C corrispondente al ceppo ospita la biblioteca di preda di interesse su un piatto YPD prendendo un applicatore di legno sterile, raschiando una piccola quantità di lievito dal flaconcino e colpi di luce su tutta la piastra YPD. Incubare la piastra YPD a 30 ° C per 2 giorni o fino a quando le singole colonie sono visibili. Patch un paio singole colonie su una piastra di YPD e incubare per una notte a 30 ° C.
    Nota: Il nuovo ceppo sviluppato qui alla libreria di casa preda è PLY5725 considerando che alcune librerie compatibili di Y2H disponibili in commercio sono alloggiati in Y187.
  2. Seguire le procedure in 3.3.1 - 3.3.4 per trasformare PLY5725 con LEU2-basato del plasmide utilizzato per ospitare la biblioteca desiderata preda. Per le librerie sviluppate qui, il plasmide corrispondente è pGal4AD (pPL6343). Per recuperare il lievito trasformanti, piastra al CSM-Leu-Met piastre. Dopo colonie derivano, streak come patch su una piastra di CSM-Leu-Met e incubare per 24 h a 30 ° C.
  3. Seguire il protocollo in 3.4 per confermare l'espressione di pPL6343 vettore vuoto utilizzando-HA anticorpi monoclonali o policlonali e soluzione di rilevamento ECL.
  4. Striatura che ciascuno del lievito PJ69-4A trasformato in uno schema a croce con PLY5725 costruisce su una piastra YPD che è stata confermata di esprimere la proteina nel protocollo sezione 3.4 e 4.3 e incubare a 30 ° C durante la notte. Prendere 1 mm3 delle cellule dove i due ceppi sono cresciuti insieme e patch sul separati CSM-Leu-Met, CSM-Trp e CSM-Trp-Leu piastre e crescere 24h.
    Nota: Desiderate diploidi crescerà sulle piastre CSM-Trp-Leu. Crescita sul CSM-Leu-Met e CSM-Trp piastre servono come controllo positivo per la crescita del lievito.
  5. Crescere diploidi in 1 mL di media di CSM-Trp-Leu durante la notte a 30 ° C. Celle di 500 µ l di sedimento in un 1,5 mL di microcentrifuga tubo a 2.348 x g, 3 min a temperatura ambiente in una microcentrifuga. Gettare il surnatante mediante pipetta. Risospendere le cellule in 1 mL di acqua sterile e ripetere la sedimentazione e la risospensione. Verifica il OD600 delle cellule.
  6. Effettuare una serie di 01:10 diluizioni seriali di ogni sospensione cellulare utilizzando acqua sterile con la maggior parte a partire concentrato soluzione di ciascuno a un OD di 0,5. Spot 5 µ l di ciascuna diluizione in un piatto di CSM-Leu-Trp, un piatto CSM-Leu-Trp-His e un CSM-Leu-Trp-suo + 3AT piastra. Incubare a 30 ° C e per ispezionare i crescita ogni giorno oltre 3 giorni (Figura 4).
    Nota: per le 01:10 diluizione seriale, Pipettare 10 µ l di provetta contenente un OD 0,5 in 90 µ l di acqua e Miscelare pipettando su e giù. Continuare a fare 01:10 diluizioni seriali fino a quando c'è un totale di sei diverse concentrazioni da individuare.

5. creare lievito popolazioni con esche e prede biblioteca

Nota: Il ceppo di Y187 che ospita plasmidi biblioteca commerciale preda non accoppiarsi bene. Così, le seguenti condizioni ottimizzate sono tenute a mantenere la complessità della biblioteca. Il PLY5725 ceppo contenenti Y2H preda librerie compagni meglio e la stessa procedura di accoppiamento può essere utilizzata con questo ceppo (Figura 5).

  1. Inoculare un 3 mL di culture di ciascuno dei transformants di PJ69-4A che trasportano i vari TRP1-contenente del plasmide esca pTEF-GBD CSM-Trp media in un tubo di cultura. Sono due culture separate contenenti il plasmide vettore pTEF-GBD da solo per fungere da controlli procedurali. Incubare le colture a 30 ° C, 200 giri/min per 6 h e poi diluire in un 25 mL di coltura in una beuta sterile per la crescita durante la notte.
  2. Scongelare una fiala di congelati (-80 ° C) delle cellule MATalpha contenente il LEU2-che trasportano "preda" biblioteca a temperatura ambiente. Inoculare un 125 mL di CSM-Leu-Met media in una beuta sterile con la fiala intera scongelata. Crescono tutte le culture una notte a 30 ° C con agitazione a 200 giri/min.
    Nota: Il OD600 delle culture durante la notte deve essere compresa tra 1,0-1,5 prima di procedere ai passaggi successivi.
  3. Centrifugare 21 equivalenti OD di ognuna delle culture PJ69-4A transformant con un giro di 5 min a 4.696 x g a temperatura ambiente. Per ogni 10 reazioni di accoppiamento desiderato, pellet 39 OD600 equivalenti del ceppo MATalpha che trasportano i plasmidi di biblioteca in separato 50 mL di provette coniche.
    1. Risospendere le cellule in 10 mL di acqua sterile e ri-pellet in 50 mL di nuovo tubo conico 4.696 x g 5 min a temperatura ambiente in una centrifuga da banco. Utilizzando una pipetta, rimuovere delicatamente il supernatante senza interrompere le cellule pellettate.
    2. Risospendere il pellet di cellule PJ69-4A in 4 mL di e cellule PLY5725 in 10 mL di bYPDA (pH 3,7).
  4. Reazioni di accoppiamento, aggiungere 1 mL di PJ69-4A trasformato cellule, 1 mL di MATalpha biblioteca contenente cellule e 1 mL di bYPDA pH 3,7 a nuovo 50 mL di tubo conico a set-up. Incubare a 30 ° C con agitazione orbitale delicato (100-130 giri/min) per 90 min.
    1. Centrifugare le cellule per 5 min a 4.696 x g, a temperatura ambiente in una centrifuga da banco. Rimuovere il surnatante mediante pipetta e risospendere il pellet in 2 mL di 1:1 bYPDA:YPD. Piastra ogni 2 mL di su un piatto YPD 100 mm mediante pipetta e incubare a 30 ° C per circa 20 h.
  5. Raccogliere le cellule dalle piastre YPD utilizzando un raschietto di cella per sloggiare le cellule in 2-3 mL di CSM-Leu-Trp media. Pipettare sloggiato le cellule in un 50 mL di tubo conico. Sciacquare le piastre 4 - 5 volte con 2-3 mL di CSM-Leu-Trp media pipettaggio fino il supporto utilizzando un 1000 µ l pipette ed espellendo delicatamente i media attraverso la superficie della piastra YPD.
    1. Centrifugare le cellule per 5 min a 4.696 x g e a temperatura ambiente in una centrifuga da banco. Gettare il surnatante mediante pipetta e risospendere le cellule in 40 mL di CSM-Leu-Trp media pipettando su e giù (non centrifugare).
  6. Per stimare il numero di cellule diploidi formata, diluire 4 µ l della miscela diploide in 200 µ l e 2000 µ l CSM-Trp-Leu media. Piastra di 200 µ l di ciascuna diluizione in un piatto di CSM-Leu-Trp.
    Nota: Le due piastre rappresentano una diluizione 1: 10.000 e 1: 100.000 di piega dello stock di diploidi raccolte e ottenendo un previsto ~ 9.000-27.000 colonie sulla piastra di diluizione di 1: 10.000 dopo incubazione a 30 ° C per 36-40 h. Check piastre dopo passo 5.7. È richiesto un numero minimo di 200 colonie sulla piastra di diluizione di 1: 10.000 per procedere al passaggio 5.8
  7. Immediatamente prendere il resto di ogni 40 mL di risospensione delle cellule e inoculare un 1.000 mL di beuta contenente 500 mL di CSM-Leu-Trp media. Prendere un iniziale OD600. Incubare queste boccette a 30 ° C con agitazione a 180 giri/min fino a quando non raggiungono la saturazione (~2.0 OD/mL). Questo richiede in genere circa 36-40 h. crescita di Monitor a 24 h poi di nuovo a 36 h OD600.
  8. Utilizzando una pipetta, rimuovere 20 mL di aliquote da ciascuno dei saturi 500ml di culture e innoculate 2.000 mL di matracci di Erlenmeyer, uno da 750 mL di CSM-Leu-Trp media e la seconda contenente 750 mL di CSM-Leu-Trp-His con livello più basso della 3AT che Elimina sfondo (stabilito in precedenza nella sezione 4.5). Mescolare le nuove culture (770 mL) accuratamente agitando e prendere un iniziale OD600.
  9. Incubare le colture a 30 ° C mentre si stringono a 180 giri/min fino a raggiungere la saturazione, che in genere si verifica entro 24 h per la cultura di CSM-Leu-Trp non selezionata e può prendere oltre 70 h per culture sotto selezione per Y2H interazioni.
  10. Una volta culture hanno raggiunto la saturazione (OD ~ 2.0), rimuovere 11 mL di pipetta, sedimenti le cellule con un giro di 5 min a 4.696 x g a temperatura ambiente, scartare il surnatante mediante pipetta e congelare a-20 ° C o continuare sulla estrazione del DNA. I campioni selezionati e non selezionati saranno entrambi utilizzati per sequenziamento profondo.

6. preparazione del campione per profondo Deep Sequencing

  1. Estrazione del DNA.
    1. Utilizzare una pipetta per risospendere il pellet cellulare da protocollo sezione 5.7 in 500 µ l di tampone di sTE e trasferimento a un 1,5 mL di tubo del microcentrifuge. Aggiungere 3 µ l di betamercaptoethanol e 10 µ l di brodo di Zymolase. Mescolare bene e incubare nell'incubatore 37 ° C per 24-36 h.
    2. Estrarre il campione due volte con 500 µ l fenolo/cloroformio/alcool isoamilico durante l'utilizzo di un cappuccio di fumi16.
    3. Aggiungere 7 µ l di 4 M di NaCl, 900 µ l di ghiaccio freddo 100% di etanolo (ETOH), mix di inversione e o congelare a-20 ° C o continuare a sedimenti del DNA di filatura a 21.130 x g per 10 min a temperatura ambiente in una microcentrifuga.
    4. Gettare il surnatante mediante pipetta. Lavare la pallina tre volte con 900 µ l di 70% ETOH.
    5. Sedimento a pellet 21.130 x g per 2 minuti e rimuovere il residuo lavaggio ETOH mediante pipetta. Pellet asciutto per 7 min a 42 ° C.
    6. Risospendere il pellet in 120 µ l di 0.1 x sTE in bagnomaria a 37 ° C per 90 min, scorri le provette per mescolare ogni 30 min.
    7. Pipettare 60 µ l di DNA estratto in una sterile 1,5 mL di tubo del microcentrifuge. Aggiungere 120 µ l di sTE, 3,5 µ l di brodo di RNasi A, flick di miscelare e incubare a 37 ° C per 1 h.
    8. Precipitato di etanolo come precedentemente fatto nella sezione 6.1.3 - 6.1.5, ma utilizzare 7 µ l di acetato di ammonio 5m invece di 4 M di NaCl.
    9. Risospendere RNasi DNA un trattato in 55 µ l di 0.1 x sTE in bagnomaria a 37 ° C per 90 min, scorri le provette per mescolare ogni 30 min. quantificare DNA di assorbanza a 260 nm in uno spettrofotometro.
  2. Inserti di cDNA PCR.
    1. Eseguire due, reazioni di PCR di 50 µ l per campione di DNA. Ogni reazione contiene 25 pmoli di ciascun primer forward e reverse, il plasmide preda-biblioteca di corrispondenza (Vedi materiali). Reazioni anche contenere 25 µ l di x PCR ad alta fedeltà 2 Master Mix, 5 µ g di campione di DNA e acqua fino a 50 µ l. Amplify reazioni per 25 cicli con tempi di estensione di 3 min a 72 ° C, una temperatura di ricottura di 55 ° C per 30 s e denaturare a 98 ° C per 10 s. Precede ciclismo da una denaturazione s 30 a 98 ° C e seguire con un'incubazione di 5 min a 72 ° C.
    2. Analizzare 4 µ l di ogni reazione di PCR mediante elettroforesi in gel dell'agarosi del DNA 1% con il DNA dell'agarosi gel contenente 0,2 - 0,5 µ g/mL di EtBr17. Visualizzare campione di DNA con transilluminazione UV. Campioni mostrerà una sbavatura del DNA circa 1-3 kb, dove il disegno a strisce può essere trovata per campioni dove un'interazione di Y2H è stata selezionata (Figura 6).
    3. Combinare i campioni duplicati di PCR e purificare utilizzando il kit di purificazione di PCR in accordo con le istruzioni del produttore e quantificare il DNA di assorbanza a 260 nm in uno spettrofotometro.

7. deep sequencing

Nota: La preparazione del campione e l'ordinamento su una piattaforma di sequenziamento profondo è in genere disponibile in commerciali e accademiche delle strutture di nucleo del sequenziamento del DNA.

  1. Taglio 600 ng del prodotto PCR utilizzando un rendimento elevato ultra-sonicatore per dare frammenti di una lunghezza media di ~ 300 bp.
  2. Indicizzata sequenziamento librerie utilizzando un kit di preparazione per sequenziamento profondo che aggiunge linker codifica codici a barre, adescamento siti, di generare e acquisire sequenze asimmetricamente sulle estremità dei frammenti del DNA.
  3. Eseguire la libreria preparazione secondo le istruzioni del produttore. Piscina indicizzati in librerie e sequenza come lungo accoppiato-fine letture su una piattaforma di sequenziamento profondo (ad es., 2 x 150 bp PE letture). Il numero desiderato di letture mirate per ogni campione è compreso tra 10 e 40 milioni, con letture più desiderate per le popolazioni non selezionate che sono in genere più complesse. Si consiglia di almeno 20 milioni o più letture per le popolazioni non selezionate.

8. Bioinformatic elaborazione e verifica

  1. Ordinamento dei dati in forma di fastq con un insieme di software stand-alone programmi costruite per (1) tracciare la sequenza di leggere i file in un formato universale di SAM (2) quantificare del DNA processo arricchimento gene tra DataSet (3) effettuare analisi statistiche dei dati in ordine di rango quale candidato geni sono positivi per l'interazione Y2H (4) fornire informazioni per quanto riguarda che cosa regione e cosa traslazionale frame del cDNA preda al gene frammenti che resa positiva Y2H interazioni sono composti da (5) strumenti per ricostruire non solo il 5' ma anche all'estremità 3' dei frammenti d'interazione permette loro ricostruzione e la verifica in un formato di Y2H tradizionale. Funzionamento di questi programmi è dettagliato nello studio d'accompagnamento.

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Representative Results

Il dosaggio di Y2H è stato ampiamente utilizzato per la ricerca di interazioni proteina/proteina e diversi adattamenti e sistemi sono stati sviluppati. Per la maggior parte, le stesse considerazioni che aiutano a garantire il successo con questi approcci precedenti sono importanti per profondo. Sono alcuni dei punti di riferimento importanti: garantire espressione del dominio di legame al DNA proteine di fusione, garantendo un basso fondo di spurie suo + crescita in diploidi contenente l'esca di interesse con un plasmide vuoto preda, un'alta efficienza di accoppiamento dell'esca contenenti lievito MATA con la libreria contenente MATalpha lievito, e infine, condizioni di bassa stringenza che consentono la popolazione a crescere in condizioni tali da selezionare per molte reazioni positive di Y2H, anche quelle che producono bassi livelli di attività His3 e un debole Y2H risposta trascrizionale.

Uno degli aspetti critici del profondo è riproducibile introdurre la libreria Y2H ceppi contenenti esca diversi plasmidi e di selezionare in modo affidabile quelle popolazioni per tali plasmidi di libreria che creano interazioni positive Y2H. Questo diventa più difficile quando aumenta la complessità della biblioteca Y2H poiché è più difficile garantire adeguato trasferimento di tutta la libreria in diverse popolazioni iniziale. Inoltre, la dimensione delle popolazioni scelto di crescere in condizioni di selezione e profondità di sequenziamento deve essere abbastanza grande per osservare i cambiamenti riproducibili nella composizione del plasmide Y2H per identificare in maniera affidabile vero positivo Y2H interazioni. Negli studi precedenti, abbiamo usato commercialmente disponibili librerie di cDNA di Y2H. Abbiamo trovato la variabilità nella distribuzione libreria Y2H tra popolazioni separate che trasportano lo stessa esca plasmidi è bassa, con un overdispersion fra le due popolazioni iniziale prima selezione di < 0.01 in genere e 0,35 - 0,55 per separato popolazioni dopo selezione4. Tuttavia, la complessità di alcune di queste librerie di Y2H disponibili in commercio è abbastanza bassa (Figura 7). Inoltre, molti dei cloni all'interno di esso (~ 60%) sono fatti interamente di frammenti di cDNA che sono 3' della regione di codificazione, che limita ulteriormente la loro utilità. Per dimostrare che i metodi di cui sopra sono stati in grado di accogliere più complessi Y2H librerie, abbiamo creato una nuova libreria di Y2H nel semplificata vettore plasmidico 'preda' (pGal4AD) contenenti frammenti di DNA genomico da Saccaromyces cerevisiae (ceppo PLY5725). Il DNA genomico è stato frammentato da taglio, dimensione selezionata per gamme di 600-1500 bp, modificato con adattatori e inserito in pGal4AD per creare la libreria di SacCer_TAB Y2H (Figura 8). La biblioteca fu trasformata in PLY5725, che ha prodotto una popolazione di lievito che è stato poi abbinata per separare i campioni di PJ69-4A MATA che trasportano il plasmide pTEF-GBD da solo. Popolazioni diploidi duplicati sono state coltivate in condizioni selettive e non selettivi. Gli inserti di biblioteca del plasmide Y2H sono stati analizzati tramite sequenziamento profondo. Quando associati a DNA genomico che comprende 100 bp a Monte e a valle di ogni regione (84% dell'intero genoma), di codificazione della proteina abbiamo trovato > 1,1 milioni diversi plasmidi nella libreria per una dimensione totale stimata della biblioteca di lievito di ~1.35 diversi milioni plasmidi. Come termine di paragone, abbiamo anche trasformato un lievito precedentemente descritti genomica Y2H biblioteca11 (PJ_C1, C2, C3 Y2H libreria) in MATalpha lievito e sottoposto ad analisi stessa come sopra. Abbiamo trovato che la complessità della nostra libreria di Y2H lievito casuale frammento è stato di gran lunga superiore e aveva molto più plasmidi codifica frammenti in-struttura di ciascun gene rispetto alla libreria precedentemente pubblicata (Figura 9). Cosa importante, la generazione della libreria iniziale contenente popolazioni diploidi era molto riproducibile con un overdispersion di < 0.01 (Figura 10). Inoltre, la riproducibilità di avere le due popolazioni separate lievito produrre simili ridistribuzioni di plasmidi dopo selezione per interazioni positive Y2H era molto buona, producendo un overdispersion di 0,3. Così, i metodi qui ospitare grandi biblioteche di Y2H di maggiore complessità rispetto a quelli precedentemente utilizzati.

In termini di aumento della facilità di profondo, preferiamo utilizzare sintesi di geni per fare inserti codifica per la proteina esca di interesse. Questo permette di regioni per domini proteici, chimere e mutanti per essere facilmente incorporati nelle Y2H esca plasmidi codificanti, ma permette anche loro codoni essere ottimizzato per espressione in S. cerevisiae. Espressione di due diverse proteine di fusione di dominio di Gal4-DNA-binding è dimostrato nella Figura 3. Due differenti lievito trasformanti, esprimendo una delle due proteine di fusione di esca sono stati preparati e sottoposti a SDS-PAGE e immunoblotting con gli anticorpi anti--myc. Nota i livelli di espressione delle proteine di esca relativo al dominio di legame al DNA di Gal4 solo dal vettore vuoto. Abbiamo trovato che è importante non solo per verificare l'espressione della proteina di fusione di esca, ma anche per verificare l'espressione della colonia di transformant lievito MATA esatta che verrà utilizzato per espandere e accoppiarsi al preda libreria contenenti lievito. Una volta individuata una transformant, è possibile bloccarlo giù e memorizzare per un uso successivo.

La figura 4 Mostra un test per l'auto-attivazione dove una diluizione seriale di cellule diploidi sono piastrate su CSM-Leu-Trp (+ suo), CSM-Trp-Leu-His (-sua) e CSM-Trp-Leu-la sua + 3AT (-suo + 3AT) piastre e ha permesso di crescere a 30 ° C per 3 giorni. Il risultato desiderato è quello di osservare la crescita in presenza, ma non assenza di istidina indipendentemente dal fatto che c'è 3AT. Ciò consentirà l'uso di CSM-Trp-Leu-His per selezionare per il lievito con un'interazione di 2-ibrido del lievito positivo. Se non c'è crescita il CSM-Leu-Trp-His piastre, quindi una selezione di Y2H ancora ottenibile utilizzando la minor concentrazione di 3AT che impedisce la crescita. Troviamo che se la crescita può essere bloccato in CSM-Trp-Leu-His + 0.1 mM 3AT, allora il dosaggio di profondo può procedere utilizzando questa condizione per selezionare per le interazioni di Y2H. Se, tuttavia, l'inibizione della crescita di diploidi contenenti pGal4AD o altri plasmide vuoto preda e il plasmide pTEF-GBD-esca fusione richiede concentrazioni più elevate di 3AT, comprometterà le prestazioni della procedura profondo e un plasmide esca diversi dovrebbe essere cercata. Nota che la sua + crescita è l'unica selezione per una positiva interazione Y2H. Abbiamo trovato che questo è sufficiente per arricchire per Y2H interazioni nel batch.

Una delle procedure più critiche del flusso di lavoro profondo è quello di ottenere alta efficienza di accoppiamento del lievito MATA portando il plasmide dell'esca con il lievito di MATalpha portando la libreria di preda Y2H. Abbiamo trovato che alcuni ceppi (ad esempio, Y187)18, alloggiamento di librerie di cDNA disponibili in commercio, hanno relativamente scarsa efficienza di accoppiamento. Per questo motivo, abbiamo progettato un ceppo per trasportare Y2H biblioteche. Questo ceppo è basato su BY4742, un derivato del S288c. Questo ceppo manca GAL4, GAL80, TRP1, LEU2e HIS3. Esso non contiene nessun reporter che rispondono ad una proteina di Gal4 ibrido né un ibrido differente (ad es., LexA-VP16). Invece, la fonte di produzione His3 Y2H-indotto è stata ricavata il ceppo MATA che avrebbe portato il plasmide esca particolare. Questo semplifica il sistema e consente una maggiore flessibilità in quanto uno può utilizzare le stesse cellule di MATalpha contenenti biblioteca ad accoppiarsi con un ceppo che esprime una proteina di fusione di LexA-esca e un reporter di LexA(UAS) -HIS3 o una proteina di fusione Gal4-DBD-esca e un Gal4 (UAS)-HIS3 reporter.

Una volta che le popolazioni diploidi che trasportano sia un plasmide esca e la biblioteca sono generate, sono diluiti e ha permesso di crescere in condizioni che basta selezionare per entrambi plasmidi (ad es., CSM-Trp-Leu) o per plasmidi e una positiva interazione Y2H che unità di produzione di His3 (ad es., CSM-Leu-Trp-His). È importante iniziare con una grande quantità della popolazione iniziale per evitare un evolutivo ', collo di bottiglia', che possono distorcere la popolazione risultante dopo la selezione per una positiva interazione Y2H. Così, la nostra procedura specifica utilizzando 20 mL di fuori i 500 mL di cultura popolazione diploide può essere coltivata in 750 mL di fresco CSM-Leu-Trp-His media per evitare questo problema. Con pTEF-GBD come il plasmide dell'esca, abbiamo trovato che un singolo round di diluizione e di crescita era sufficiente a evolvere una popolazione ben informativa. Utilizzando esche differenti plasmidi precedentemente, abbiamo usato due turni di diluizione e di crescita, un'iniziale 20 mL di in 750 mL, e poi 2 mL di da che saturi cultura diluito in 75 mL. La figura 6 Mostra i risultati dall'amplificazione di PCR attraverso gli inserti di biblioteca per la popolazione diploide coltivate in condizioni non-selettivi, nonché un primo e secondo round successivo di diluizione e di crescita in condizioni selettivo per due differenti esca plasmidi. Si noti che con nessuna selezione, c'è una sbavatura generalizzata dei prodotti di PCR indicativo di una miscela complessa e relativamente ben normalizzata di frammenti. Al momento della selezione, quel modello viene modificato, con alcune specie arricchendo notevolmente affinché singole bande possono essere individuate. Un certo grado di bendaggio è tipico di successo esperimenti condotti finora, ancora un modello di striscio in aggiunta o al posto di un disegno a strisce, è indicativo di una miscela complessa di preda inserti ed è auspicabile se si vuole massimizzare il numero di candidati che rileva profondo. Disegno a strisce molto forte, dove la maggior parte del prodotto della PCR è trovato in bande di 1-3, indica che la maggior parte dei dati di sequenziamento sarà dominata da inserti di preda solo 1-3. Uno può compensare parzialmente dedicando più letture da questo esempio. Uno può vedere che, se la popolazione è diluita e cresciuta ulteriormente (Vedi 'd2 selezionato' nella Figura 5), il disegno a strisce è più prominente, che indica che preda plasmidi che conferisce debole ma autentici Y2H interazioni sono essendo diminuiti mentre pochi eletti in preda plasmidi stanno aumentando la loro abbondanza. Crescita a questo livello eccessivo e successiva diluizione viene considerata controproducente per l'obiettivo di catturare il maggior numero di potenziali candidati e così con il protocollo qui, si consiglia di impiegare un round di diluizione e di crescita.

Figure 1
Figura 1: schema di flusso di lavoro profondo. La struttura generale delle procedure di laboratorio è mostrata sulla sinistra insieme il tempo approssimativo necessario per completare l'attività corrispondente. Sulla destra è il flusso di lavoro di bioinformatica utilizzando i pacchetti software profondo e Stat_Maker. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 2
Figura 2: schematico di pTEF-GBD. Il TRP1-contenenti il plasmide di espressione proteina di fusione di copia basso Gal4 DNA-binding dominio è mostrato. È dotato di un promotore costitutivo TEF1 , myc epitopo tag, dominio di legame al DNA di Gal4 seguita un sito di legame di T7 RNA polimerasi, grado e terminator PRM9 all'interno di un centromero (CEN)-basato del plasmide. Questo plasmide trasporta anche resistenza alla kanamicina e l'origine batterica ColE1 di replicazione. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 3
Figura 3: espressione di proteine di fusione Gal4-esca. Lisati dal lievito che esprimono le proteine diverse esche fuse per il dominio di legame al DNA di Gal4 espresso in pTEF-GBD sono stati sottoposti a SDS-PAGE e immunoblotting con gli anticorpi anti--myc. pTEF-GBD esprime solo il dominio di Gal4-DNA-vincolante solo; pTEF-GBD-bait1 esprime il dominio Gal4-DNA-vincolante fuso ad un RhoA carente proprio sito prenilazione C-terminale e alloggiamento una mutazione bloccandolo in una conformazione di GTP associato; pTEF-GBD-bait2 esprime il dominio Gal4-DNA-vincolante fuso ad un RhoA carente proprio sito prenilazione C-terminale e alloggiamento una mutazione bloccandolo in una conformazione PIL associati. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 4
Figura 4: test di auto-attivazione Diploidi fatta da PJ69-4A cellule che trasportano i plasmidi indicato esca e PLY5725 cellule che trasportano il plasmide preda indicata in serie erano diluiti e macchiati su CSM-Leu-Trp, le piastre CSM-Leu-Trp-His e CSM-Leu-Trp-suo + 3AT piastre e coltivate per 3 giorni a 30 ° C. I PJ69-4A trasformanti utilizzati per l'accoppiamento sono stati i primi di ogni coppia illustrato nella Figura 3. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 5
Figura 5: accoppiamento efficienza di Y187 vs. PLY5725. La reazione di accoppiamento tra PJ69-4A contenente un TRP1-contenenti esche vettoriale e plasmide preda trasportante, Y187 o PLY5725 è stato effettuato. diluizioni 1: 10.000 sono state piastrate su CSM-Trp-Leu per selezionare per diploidi. Il ceppo di PLY5725 dimostra un'alta efficienza di accoppiamento che il ceppo di Y187 con piega ~ 10 colonie più prodotta. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 6
Figura 6: PCR di preda biblioteca inserti. DNA è stato isolato da diploide lievito contenente una libreria di preda che è stata coltivata in condizioni di non-selettivi (CSM-Leu-Trp media) o condizioni di selezione per una positiva interazione Y2H (CSM-Leu-Trp-His media). PCR in tutta la libreria inserisce rivela differenze nel repertorio di inserti selezionati. Due cicli di crescita selettiva sono stati usati. Un giro iniziale di crescita effettuata diluendo 20 mL 500 ml di coltura diploide in 750 mL di CSM-Leu-Trp non-selettivi e un altro 20 mL di in 750 mL di CSM-Leu-Trp-His media per un ciclo iniziale di crescita selettiva (d1). Ciò è stata seguita da un turno aggiuntivo di crescita (d2) fatto prendendo 2 mL della cultura d1 e diluire in 75 mL di terreni selettivi CSM-Leu-Trp-His. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 7
Figura 7: complessità della libreria del cDNA Y2H. Analisi del contenuto di un mouse commercialmente disponibili Y2H preda di cDNA: una libreria di cDNA di cervello di topo e uno da tessuti multipli del mouse. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 8
Figura 8: generazione di Y2H lievito frammento genomic libreria. R. schematico che descrivono assembly della libreria frammento genomic lievito in pGal4AD. Il DNA di Genomic dal ceppo PLY5725 era casualmente Tosato, legato con il Y-adattatori indicati e legato in SfiI-taglio pGal4AD. Legature sono state trasformate in batteri di rendimento 2.2 x 106 colonie indipendenti che sono stati combinati e cresciuti prima di isolamento del loro plasmide DNA alla libreria dei SacCer_TAB Y2H. B. il LEU2-contenenti il plasmide (pGal4AD) ospita il dominio di attivazione trascrizionale è mostrato Gal4. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 9
Figura 9: complessità della libreria genomica di lievito Y2H. La libreria genomica di SacCer_TAB fu trasformata nel ceppo MATalpha di PLY5725 e il PJ_C1, C2, C3 libreria genomica del lievito è stata trasformata nel ceppo di ΜΑΤalpha di Υ187. Diploidi di queste popolazioni sono state fatte da corrispondersi al ceppo PJY69-4A. Popolazioni sono state coltivate per 10 generazioni e preda frammenti amplificati di PCR sono stati sottoposti ad analisi e sequenziamento di alto-rendimento. R. indica l'ordine di letture per ogni gene nelle librerie Y2H divise per le letture al gene trovato dal sequenziamento del genoma di lievito. Data equivalente abbondanza di ogni gene, ogni gene avrebbe un valore di 1. B. istogramma che mostra il numero di plasmidi unici al gene che codifica un frammento che è la regione (ORF) di codificazione della proteina sia nel telaio della corretta lettura traslazionale. C. confronto tra il numero di plasmidi differenti in ogni libreria che codificano geni di lievito e la proporzione di questi che sono e non sono nel telaio della corretta lettura traslazionale o sono inseriti all'indietro. D. Piazzole indicano posizioni e abbondanza delle giunzioni che eseguono il mapping ai geni di esempio (VPS8 e VPS16) trovati per i plasmidi in ogni libreria. Plasmidi con fusioni del gene che sono nel telaio della corretta lettura traslazionale sono designati blu. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 10
Figura 10: riproducibilità di profondo con complessi Y2H libreria genomica di lievito. R. quattro popolazioni diploidi differenti di lievito sono stati creati con l'accoppiamento con la libreria SacCer_TAB Y2H ospitato in PLY5725, allevati in condizioni non-selettivi e sequenziato. Le letture al gene per ogni popolazione individualmente è rappresentato graficamente in funzione del valore dell'ordine di rango medio attraverso tutte le popolazioni. B. Mostra le letture al gene fra due campioni dopo selezione per interazioni positive Y2H. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Discussion

Qui forniamo una guida per come eseguire le analisi di Y2H in batch utilizzando metodi ottimizzati. Ci sono pochi passaggi critici nella procedura per garantire che la popolazione di lievito che sarebbe stato posto sotto selezione è rappresentante della libreria di partenza e che basta con la popolazione di lievito partenza viene utilizzato per subire la selezione per limitare la variabilità . D'importanza, questi benchmark sono relativamente facili da realizzare a fianco di adattare i metodi e i materiali per un dosaggio di Y2H tradizionale, rendendo questo approccio accessibile alla maggior parte dei laboratori attrezzati per la biologia molecolare standard. PROFONDO consente la selezione dalla stessa popolazione biblioteca preda durante l'utilizzo di esche differenti plasmidi. Quindi, l'insieme di candidati interagenti che producono un'interazione Y2H con un'esca contro un altro possa essere confrontato direttamente. Poiché viene utilizzato il sequenziamento profondo, uno può verificare la composizione libreria partenza per ogni popolazione esca specifico lievito e seguire l'arricchimento di ogni gene di preda del candidato nella libreria in modo indipendente. Elaborazione batch consente l'esecuzione di query nella stessa libreria contro diverse esche in maniera semi-quantitativa che permette quindi di calcolare una statistica classifica4.

Ci sono diversi punti in questo protocollo che sono critici per il successo. Uno è che un gran numero di diploidi deve essere ottenuto per garantire un'adeguata rappresentanza della biblioteca Y2H preda è mescolata con ogni plasmide esca di interesse. La procedura di accoppiamento descritta qui è stata ottimizzata variando diversi parametri. Abbiamo trovato che alcuni ceppi che librerie commerciali di Y2H casa accoppiano male in generale, tuttavia, la procedura di accoppiamento descritta qui può generare 2 x 106- 2 x 107 diploidi quando seguito, consentendo un trasferimento adeguato e riproducibile della Y2H libreria nella popolazione. Un altro aspetto critico della procedura è garantire che il plasmide esca di interesse non creare una positiva interazione Y2H sul proprio o con il dominio di attivazione Gal4 vuoto preda del plasmide. Il metodo per la selezione di un'interazione di Y2H è esigente crescita in assenza di istidina in cui una positiva interazione Y2H induce la trascrizione di HIS3 per consentire alle cellule di essere suo +. Mentre ordinariamente i saggi di Y2H tradizionali possono aggiungere il 3AT inibitore competitivo per diminuire la crescita di sfondo o utilizzare altri reporter3 , questa procedura funziona meglio quando le cellule con debole Y2H interazioni possono crescere e aumentando così il rigore per la crescita e selezionando solo per le celle con forti interazioni Y2H limita il repertorio dei plasmidi di prede che possono essere identificati. Un altro aspetto critico è quello di assicurarsi che una grande quantità della popolazione diploide iniziale usato per crescere in condizioni selettive e non selettivi per evitare colli di bottiglia evolutivi dal campionamento errore4 . In seguito i volumi di cultura e cella numeri specificati qui verranno aiuterà a garantire riproducibilità e diminuire il rumore.

Uno dei motivi per che l'approccio profondo è potente è che possono seguire completamente tutti i plasmidi in una libreria di determinata preda per la loro capacità di interagire con l'esca di interesse. Così, uno dei limiti del profondo è la complessità della libreria utilizzata. Per alcune delle librerie commerciali come quelli che abbiamo usato qui, abbiamo trovato che il numero di plasmidi che codificano buona fede frammenti di cDNA ORF che sono nello stesso frame di lettura del dominio di attivazione Gal4 è tra 3-6 x 104 con rappresentazione di ~ 6.000 - 8,00 0 geni differenti. Abbiamo trovato che quasi il 75% di queste librerie conteneva frammenti corrispondenti esclusivamente alle regioni di cDNA che erano 3' della sequenza di DNA codifica (CD/ORF). Inoltre, quasi un terzo dei geni che aveva frammenti nella libreria non aveva nessuno che hanno corrisposto alle regioni nel ORF o a Monte del ORF.

Abbiamo fatto tre altre modifiche al metodo profondo. Uno è un nuovo ceppo di MATalpha che può portare a 'preda' librerie ospitate all'interno di un plasmide TRP1 e che compagni di gran lunga migliore di alcuni ceppi di libreria contenente commercialmente disponibile come Y187. Questo consente di garantire il completo trasferimento della popolazione libreria per ogni esca di interesse. Abbiamo anche fatto un nuovo plasmide di espressione, che differisce da plasmidi precedentemente descritti che utilizzano una copia variabile basato su 2 µ spina dorsale10' bait'. Qui descriviamo un plasmide di basso-copia CEN (pTEF-GBD) e trovare un singolo turno di crescita selettiva è sufficiente per arricchire per interagenti preda plasmidi. Infine, costruiamo un vettore di libreria snella 'prey' e utilizzata per produrre una libreria ad alta densità del Y2H casuale-frammento genomic per Saccharomces cerevisiae, che dovrebbe essere utile in futuro per l'individuazione e caratterizzazione amonst interazioni proteine del lievito. Nel complesso, i miglioramenti nei materiali e strumenti bioinformatici (descritti nel lavoro d'accompagnamento) rendono il profondo approccio un modo accessibile, fattibile ed efficiente di esecuzione completi e comparativi Y2H schermi.

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Disclosures

Gli autori non hanno nulla a rivelare

Acknowledgments

Ringraziamo il personale all'interno l'Istituto di genetica umana per il sequenziamento e preparazione di biblioteca NGS. Ringraziamo Einat Snir per la sua esperienza nella preparazione di frammenti di libreria genomica per la libreria di plasmide Y2H fatta qui. Questo lavoro è stato supportato dal National Institutes of Health: R21 NIH EB021870-01A1 e da NSF Research Project Grant: 1517110.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Illumina HiSeq 4000 Illumina deep sequencing platform
Monoclonal anti-HA antibodies Biolegend 901514 Primary Antibody to detect expression of HA in pGal4AD constructs
Polyclonal anti-myc antibodies QED Biosciences Inc 18826 Primary Antibody to detect expression of MYC in pTEF-GBD constructs
NarI New England BioLabs R0191S
EcoRI-HF New England BioLabs R3101S
BamHI-HF New England BioLabs R3236S
XhoI New England BioLabs R0146S
Polyethylene Glycol 3350, powder J.T. Baker U2211-08
Salmon Sperm DNA Trevigen, Inc sold by Fisher Scientific 50-948-286 carrier DNA for yeast transformation section 3.2.1.
Kanamycin Monosulfate Research Products International K22000
LE Agarose GeneMate E-3120-500 used for making DNA agarose gels
Sodium Chloride Research Products International S23025
Tryptone Research Products International T60060
D-Sorbitol Research Products International S23080
Lithium Acetate Dihydrate MP Biomedicals 155256
Calcium Chloride ThermoFisher C79
EDTA Sodium Salt Research Products International E57020
Yeast Extract Powder Research Products International Y20020
Yeast Nitrogen Base (ammonium sulfate) w/o amino acids Research Products International Y20040
CSM-Trp-Leu+40ADE Formedium DCS0789
CSM-Trp-Leu-His+40ADE Formedium DCS1169
CSM-Leu-Met Formedium DCS0549
CSM-Trp-Met Bio 101, Inc 4520-922
L-Methionine Formedium DOC0168
Adenine Research Products International A11500
D-(+)-Glucose Research Products International G32045
Bacto Agar BD 214010 used for making media plates in section 1
Peptone Research Products International P20240
3-amino-1,2,4 Triazole Sigma A8056
2-Mercaptoehanol (BME) Sigma-Aldrich M6250
Zymolyase 100T USBiological Z1004
Potassium phosphate dibasic Sigma P8281
Phenol:Chloroform:IAA Ambion AM9732
Ammonium Acetate Sigma-Aldrich 238074
Ethanol Decon Laboratories, INC 2716
RNAse A ThermoFisher EN0531
Urea Research Products International U20200
SDS Research Products International L22010
glycerol Sigma Aldrich G5516
Tris-HCl Gibco 15506-017
bromophenol blue Amresco 449
Gibson Assembly Cloning Kit New England Biolabs E5510S Rapid assembly method for cloning of plasmids in section 2
NEBNext High-Fidelity 2x PCR Master Mix New England Biolabs M0541S Used for amplification of products for Gibson Assembly in Section 2.3 as well assample preparation for DEEPN deep sequencing in section 6.2.1
Ethidium Bromide Amresco 0492-5G
QIAquick PCR purification kit Qiagen 28104 Used for purification of pcr products in section 6.2.3
Qiaquick DNA Gel Extraction Kit Qiagen 28704 Used for purification of digested pTEF-GBD in section 2.1
KAPA Hyper Prep kit KAPA Biosystems KK8500 preparation kit for deep sequencing
Codon optimization http://www.jcat.de
Codon optimization https://www.idtdna.com/CodonOpt
gBlocks Integrated DNA Technologies DNA fragments used for cloning in Section 2.2
Strings Thermofisher DNA fragments used for cloning in Section 2.2
GenCatch Plasmid DNA mini-prep Kit EPOCH Life Sciences Used to prepare quantities of DNA in Section 2.3
Covaris E220 Covaris high performance ultra-sonicator in section 7
oligo nucelotide 5’- CGGTCTT
CAATTTCTCAAGTTTCAG -3’		 Integrated DNA Technologies or Thermofisher used for pcr amplification and sequencing 5' insert pTEF-GBD during plasmid construction
oligo nucelotide 5’-GAGTAACG
ACATTCCCAGTTGTTC-3’		 Integrated DNA Technologies or Thermofisher used for pcr amplification and sequencing 5' insert pTEF-GBD during plasmid construction
oligo nucelotide 5’-CACCGTAT
TTCTGCCACCTCTTCC-3’		 Integrated DNA Technologies or Thermofisher used for pcr amplification and sequencing 3' insert pTEF-GBD during plasmid construction
oligo nucelotide 5’-GCAACCGC
ACTATTTGGAGCGCTG-3’		 Integrated DNA Technologies or Thermofisher used for pcr amplification and sequencing 3' insert pTEF-GBD during plasmid construction
oligonucleotide 5’-GTTCCGATG
CCTCTGCGAGTG-3’		 Integrated DNA Technologies or Thermofisher 5' Pimer used for insert amplification of pGAL4AD
oligonucelotide 5’-GCACATGCT
AGCGTCAAATACC-3’		 Integrated DNA Technologies or Thermofisher 3' Pimer used for insert amplification of pGAL4AD
oligonucelotide 5’-ACCCAAGCA
GTGGTATCAACG-3’		 Integrated DNA Technologies or Thermofisher 5' Pimer used for insert amplification of pGADT7
oligonucelotide 5’- TATTTAGA
AGTGTCAACAACGTA -3’		 Integrated DNA Technologies or Thermofisher 3' Pimer used for insert amplification of pGADT7
PJ69-4A MatA yeast strain http://depts.washington.edu/yeastrc/ James P, Halladay J, Craig EA: Genomic Libraries and a host strain designed for highly efficient two-hybrid selection in yeast. GENETICS 1996 144:1425-1436 MATA leu2-3,112 ura3-52 trp1-901 his3-200 gal4D, gal80D, GAL-ADE2 lys2::GAL1-HIS3 met2::GAL7
pTEF-GBD Dr. Robert Piper Lab Gal4-DNA binding doimain expression plasmid
pGal4AD (pPL6343) Dr. Robert Piper Lab Gal4-activation domain expression plasmid
100 mm petri dishes Kord-Vallmark sold by VWR 2900
125 mL PYREX Erlenmeyer flask Fisher Scientific S63270
250 mL PYREX Erlenmeyer flask Fisher Scientific S63271
1,000 mL PYREX Erlenmeyer flask Fisher Scientific S63274
2,000 mL PYREX Erlenmeyer flask Fisher Scientific S63275
20 X 150 mm Disposable Culture Tube Thermofisher 14-961-33
pipet-aid Drummond 4-000-100
5 mL Serological Pipette Denville P7127
10 mL Serological Pipette Denville P7128
25 mL Serological Pipette Denville P7129
1,000 mL PYREX Griffin Beaker Fisher Scientific 02-540P
1,000 mL PYREX Reuasable Media Storage Bottle Fisher Scientific 06-414-1D
1,000 mL graduated cylinder Fisher Scientific 08-572-6G
SpectraMax 190 Molecular Devices used to measure the Optical Density of cells
NanoDrop 2000 Thermo Scientific ND-2000 Spectrophotometer used to quantify amount of DNA
Electronic UV transilluminator Ultra Lum MEB 20 used to visualize DNA in an Ethidium Bromide agarose gel
P1000 Gilson PIPETMAN Fisher Scientific F123602G
P200 Gilson PIPETMAN Fisher Scientific F123601G
P20 Gilson PIPETMAN Fisher Scientific F123600G
P10 Gilson PIPETMAN Fisher Scientific F144802G
1250 µL Low Retention Pipette Tips GeneMate P-1236-1250
200 µLLow Retention Pipette Tips VWR 10017-044
10 µL XL Low Retention Pipette Tips VWR 10017-042
50 mL conical tube VWR 490001-627
15 mL conical tube VWR 490001-621
cell scraper Denville Scientific TC9310
1.5 mL Microcentrifuge tubes USA Scientific 1615-5500
HCl Fluka Analytical 318949-1L
NaOH J.T. Baker 5674-02
Wooden applicators Solon Care 55900
Eppendorf microcentrifuge 5424 Fisher Scientific 05-400-005 microcentrifuge
Sorvall ST16R Thermo Fisher Scientific 75004381 benchtop centrifuge
Amersham ECL Rabbit IgG, HRP-linked whole Ab (from donkey) GE Healthcare NA934-1ML Secondary Antibody
Amersham ECL Mouse IgG, HRP-linked whole Ab (from sheep) GE Healthcare NA931-1ML Secondary Antibody
SuperSignal West Pico Chemiluminescent Substrate Thermo Fisher Scientific 34080 ECL detection solution
Isotemp Incubator Thermo Fisher Scientific Incubator
Mutitron 2 INFORS HT Shaking incubator
Isotemp Digital-Control Water Bath Model 205 Fisher Scientific water bath
Y2H mouse cDNA library in Y187 (pan tissue) Clontech 630482 commercially available cDNA Library
Y2H mouse cDNA library in Y187 (mouse brain) Clontech 630488 commercially available cDNA Library
pGADT7 AD Vector Clontech 630442 commercially available AD Vector housing many cDNA libraries
pGBKT7 DNA-BD Vector Clontech 630443 commercially available DNA-BD Vector
Biolase DNA Polymerase Bioline BIO-21042 DNA polymerase used for section 2.4
GeneMate GCL-60 Thermal Cycler BioExpress P-6050-60 pcr machine
TempAssure 0.5 mL PCR tubes USA Scientific 1405-8100

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References

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Biochimica emissione 136 interazione proteina Next Generation Sequencing analisi di sequenza del DNA 2-ibrido del lievito
Una schermata di 2-ibrido del lievito in Batch per confrontare interazioni proteina
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Peterson, T. A., Stamnes, M. A.,… More

Peterson, T. A., Stamnes, M. A., Piper, R. C. A Yeast 2-Hybrid Screen in Batch to Compare Protein Interactions. J. Vis. Exp. (136), e57801, doi:10.3791/57801 (2018).

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