Una schermata di 2-ibrido del lievito in Batch per confrontare interazioni proteina

Questo metodo utilizza il principio del sistema 2-ibrido di lievito in entrambe le popolazioni per identificare le interazioni proteina-proteina che rispondono a domande chiave su una varietà di processi molecolari e cellulari. Questa tecnica sfrutta il sequenziamento profondo per vedere le interazioni di una proteina rispetto a un'altra. Poiché questo approccio è orientato a fare confronti paralleli, può identificare insiemi di proteine che interagiscono con una proteina rispetto a un'altra o diverse conferme della stessa proteina o durante la tipizzazione di una versione mutante che causa la malattia, per rivelare interattomi differenziali.

Per questa procedura è stato costruito un nuovo plasmide esca 2-ibrido di lievito pTEF-GBD come descritto nel protocollo di testo. Questo plasmide produce proteine di fusione del dominio di legame del DNA Gal4 all'interno di un plasmide a bassa copia basato sul centromero TRP1 che trasporta il gene di resistenza alla kanamicina che consente anche il clonaggio di frammenti di esca sia a monte che a valle del dominio di legame del DNA Gal4. Questo plasmide esca è stato utilizzato per trasformare il lievito MATa e l'espressione delle proteine di fusione dell'esca Gal4 è stata verificata mediante immunoblotting con anticorpi anti-MIC.

Inoltre, è stata creata una nuova libreria di lievito 2-ibrido nel vettore plasmidico preda semplificato PGAL4 AD. Il DNA genomico è stato frammentato mediante taglio, le dimensioni selezionate, modificate con adattatori e inserite in PGAL4-AD per creare la libreria 2-ibrida di lievito saxairtab. Per iniziare la procedura per la creazione di popolazioni di lievito con librerie di esche e prede, inoculare colture di tre millilitri di ciascuno dei trasformanti di lievito MATa che trasportano i vari trip uno contenente plasmidi esca e CSM meno trip medium.

Includere due colture separate, contenenti solo il plasmide vettore, per fungere da controlli procedurali. Incubare le colture a 30 gradi Celsius e 200 giri/min per sei ore. Quindi diluire ogni coltura in una coltura da 25 millilitri in un pallone di Erlenmeyer sterile e incubare per una notte.

Scongelare a temperatura ambiente una fiala congelata di cellule alfa MAT contenenti la libreria di prede che trasportano lu2. Utilizzare l'intera vile di cellule scongelate per inoculare 125 millilitri di CSM meno lu minus met in un pallone di Erlenmeyer sterile. Coltiva la coltura a 30 gradi Celsius e 200 giri/min durante la notte.

Il giorno seguente, dopo aver confermato che l'OD600 delle colture trasformanti del tappetino notturno è compreso tra 1,0 e 1,5, trasferire le colture in provette coniche da 50 millilitri e centrifugare 21 equivalenti OD 600 di ciascuna coltura a 4.696 volte g a temperatura ambiente per cinque minuti. Risospendere ogni pellet di cellule mat a in 10 millilitri di acqua sterile, trasferire la sospensione in una nuova provetta conica da 50 millilitri e centrifugare a 4.696 volte g a temperatura ambiente per cinque minuti. Utilizzando una pipetta, rimuovere delicatamente il surnatante, senza interrompere le cellule pellettate, e risospendere il pellet in quattro millilitri di terreno YPDA tamponato a pH 3,7.

Per ogni 10 reazioni di accoppiamento desiderate, pellettare 39 OD 600 equivalenti del ceppo alfa mat che trasporta i plasmidi della libreria in un tubo conico da 50 millilitri. Risospendere le cellule alfa mat in 10 millilitri di acqua sterile e ripellettare in una nuova provetta conica da 50 millilitri a 4.696 volte g a temperatura ambiente per cinque minuti. Utilizzando una pipetta, rimuovere delicatamente il surnatante, senza interrompere le cellule pellettate, e risospendere il pellet in 10 millilitri di terreno YPDA tamponato a pH 3,7.

Per impostare ogni reazione di accoppiamento, aggiungere quanto segue a una nuova provetta conica da 50 millilitri: un millilitro di cellule trasformate MAT-A, un millilitro di libreria MAT-alfa contenente cellule e un millilitro di YPDA tamponato a pH 3,7. Incubare a 30 gradi Celsius con una leggera agitazione orbitale per 90 minuti. Dopo 90 minuti, centrifugare le celle a 4,696 volte g a temperatura ambiente per cinque minuti.

Rimuovere il surnatante e risospendere il pellet in due millilitri di YPDA-YPD tamponato uno a uno. Placcare tutti e due i millilitri di cellule su una piastra YPD da 100 millilitri e incubare a 30 gradi Celsius per circa 20 ore. Per raccogliere le cellule, pipettare da due a tre millilitri di CSM meno lu minus trip medium su ciascuna piastra YPD e utilizzare un raschietto cellulare per rimuovere le cellule.

Pipettare le cellule rimosse in una provetta conica da 50 millilitri. Sciacquare la piastra quattro o cinque volte con due o tre millilitri di CSM meno lu minus trip medium utilizzando una pipetta da 1.000 microlitri per pipettare il terreno ed espellendolo delicatamente sulla superficie della piastra YPD. Centrifugare le celle a 4, 696 volte g a temperatura ambiente per cinque minuti.

Scartare il surnatante da ciascuna provetta conica e risospendere le cellule in 40 millilitri di CSM meno lu meno mezzo di viaggio pipettando su e giù. Per stimare il numero di cellule diploidi formate, diluire quattro microlitri della miscela diploide in 200 microlitri e 2.000 microlitri di CSM meno lu meno mezzo di viaggio, rispettivamente. Piastra 200 microlitri di ciascuna diluizione su una piastra CSM meno lu meno trip per rappresentare una diluizione completa da uno a 10.000 e da uno a 100.000 dello stock di diploidi raccolti.

Incubare le piastre a 30 gradi Celsius per 36-40 ore. Utilizzare immediatamente il resto di ogni 40 millilitri di risospensione cellulare per inoculare 500 millilitri di CSM meno lu meno trip medium in un pallone di Erlenmeyer da un litro. Misurare il diametro esterno 600 di ogni lingua.

Incubare queste fiasche a 30 gradi Celsius, agitando a 180 giri/min, fino a raggiungere la saturazione, che in genere richiede dalle 36 alle 40 ore. Monitora la crescita cellulare a 24 e 36 ore misurando l'OD 600. Prima di continuare con la procedura, confermare l'efficienza di accoppiamento dei due ceppi di lievito.

È richiesto un numero minimo di 200 colonie su una piastra di diluizione da una a 10.000. Una volta che le colture hanno raggiunto la saturazione, utilizzare una pipetta per rimuovere un alloquade da 20 millilitri da ciascuna coltura e inoculare fiasche di Erlenmeyer da due litri. Un pallone contenente 750 millilitri di CSM meno lu minus trip medium e un secondo pallone contenente 750 ml di CSM meno lu minus trip meno il suo medium.

Con il livello più basso di tre ammino 124 triasol che elimina lo sfondo, determinato in precedenza come descritto nel protocollo di testo. Mescola bene le nuove culture turbinando. Dopo aver misurato l'OD 600 iniziale, incubare le colture a 30 gradi Celsius, agitando a 180 giri/min, fino alla saturazione, che in genere si verifica entro 24 ore per la coltura di viaggio CSM meno lu meno non selezionata, ma può richiedere oltre 70 ore per le colture in selezione per le interazioni lievito 2-ibrido.

Una volta che le colture hanno raggiunto la saturazione, rimuovere 11 millilitri di ciascuna coltura con una pipetta e sedimentare le cellule con una centrifuga di cinque minuti a 4.696 volte g a temperatura ambiente. Scartare il surnatante e procedere con l'estrazione del DNA come dimostrato nella sezione successiva. Per iniziare la procedura di estrazione del DNA, utilizzare una pipetta per risospendere ogni pellet cellulare preparato in precedenza in 500 microlitri di tampone TE forte.

Trasferire in una provetta da microcentrifuga da 1,5 millilitri e aggiungere 10 microlitri di brodo zimolay a ciascuna provetta. In una cappa aspirante, aggiungere tre microlitri di beta marketol etanolo a ciascun tubo e mescolare bene. Incubare nell'incubatore a 37 gradi Celsius per 24-36 ore.

Quindi, estrarre i campioni due volte con 500 microlitri di alcol isolaymal fenol cloroformio come descritto nel protocollo di testo. Aggiungere sette microlitri di cloruro di sodio a quattro molari e 900 microlitri di etanolo ghiacciato al 100% e mescolare per inversione. Sedimentare il DNA facendolo girare in una microcentrifuga a 21, 130 volte g per 10 minuti a temperatura ambiente.

Scartare il surnatante pipettando e lavare ogni pellet tre volte con 900 microlitri di etanolo al 70%. Sedimentare il DNA centrifugando a 21, 130 volte g per due minuti. Dopo aver rimosso l'etanolo residuo, asciugare il pellet a 42 gradi Celsius per sette minuti.

Risospendere ogni pellet in 120 microlitri di TE forte 0,1x in un bagno d'acqua a 37 gradi Celsius per 90 minuti. Pipettare 60 microlitri del DNA estratto in una provetta sterile da microcentrifuga da 1,5 millilitri. Aggiungere 120 microlitri di TE forte e 3,5 microlitri di brodo RN ace A, frullare per mescolare e incubare a 37 gradi Celsius per un'ora.

Aggiungere sette microlitri di acitato di ammonio a cinque molari e 900 microlitri di etanolo ghiacciato al 100% in ogni tubo. Mescolare per inversione e sedimentare il DNA, come dimostrato in precedenza. Risospendere il DNA trattato con RNace-A in 55 microlitri di TE forte 0,1x in un bagno d'acqua a 37 gradi Celsius per 90 minuti.

Quantificare il DNA mediante assorbanza a 260 nanometri. Il passo successivo consiste nell'eseguire la PCR sugli inserti CDNA. Eseguire due reazioni di PCR da 50 microlitri per campione di DNA.

Ad ogni reazione aggiungere acqua, cinque microgrammi di campione di DNA, 25 picamoli di ciascun primer diretto e inverso corrispondente al plasmide della libreria delle prede e 25 microlitri di master mix PCR 2x ad alta fedeltà. Amplifica le reazioni con questo programma. Una denaturazione di 30 secondi a 98 gradi Celsius, 25 cicli di D-natrina a 98 gradi Celsius per 10 secondi, anealing a 55 gradi Celsius per 30 secondi e tempi di estensione di tre minuti a 72 gradi Celsius, seguiti da un'incubazione di cinque minuti a 72 gradi Celsius.

Analizza ogni reazione PCR mediante elettroforesi a freddo con agrose all'1% di DNA con un gel contenente atidiobromina e visualizza il gel mediante transilluminazione UV. I campioni senza selezione mostrano uno striscio generalizzato di DNA, ma dopo la selezione si possono distinguere le singole bande. Combinare i campioni di PCR duplicati e purificare utilizzando un kit seguendo le istruzioni del produttore.

Quantificare il DNA mediante assorbanza a 260 nanometri su uno spettrofotometro. Successivamente, eseguire il sequenziamento profondo, seguito dall'elaborazione e dalla verifica bioinformatica come descritto nel protocollo di testo. Nella procedura dimostrata è stata utilizzata la nuova libreria di 2-ibridi di lievito frammentato casuale e gli inserti plasmidici amplificati mediante PCR sono stati analizzati mediante sequenziamento DEEP e l'elaborazione bioinformatica utilizzando il software DEEPN e confrontati con una libreria precedentemente pubblicata.

Questo grafico mostra l'ordine di rango delle ance per ciascun gene nelle librerie diviso per le ance per gene trovato sequenziando il genoma del lievito. Questo istogramma mostra il numero di plasmidi unici per gene che codifica un frammento che si trova sia nella regione codificante la proteina che nel corretto frame di lettura traduzionale. Viene mostrato un confronto tra il numero di plasmidi diversi in ciascuna libreria che codificano geni di lievito e la proporzione che sono e non sono nel corretto frame di lettura traduzionale o sono inseriti all'indietro.

Nel complesso, la nuova libreria ha molti più plasmidi diversi. Questi metodi assicurano che la libreria possa essere trasferita in modo riproducibile a cellule contenenti diverse proteine esca e che la procedura di selezione possa produrre insiemi riproducibili di geni che vengono arricchiti, distinguendoli come specifiche proteine candidate interagenti. Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita in circa una settimana se eseguita correttamente.

La maggior parte di questo lavoro consiste nell'incubare colture di cellule e il tempo di utilizzo effettivo è di poche ore. Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare di creare popolazioni di un gran numero di singole cellule diploidi in modo che la libreria possa essere trasferita in modo riproducibile alle cellule contenenti le diverse proteine esca. È anche importante prestare molta attenzione alle condizioni di diluizione e al tasso di crescita delle cellule per quelle popolazioni sottoposte a selezione per condizioni positive di lievito 2-ibrido.

Seguendo questa procedura, i metodi computazionali spiegati nel lavoro di accompagnamento identificheranno le proteine interagenti candidate e forniranno un percorso per convalidare queste interazioni utilizzando un saggio tradizionale di lievito 2-ibrido o altri metodi biochimici. Dopo aver visto questo video, dovresti avere un'idea molto buona su come creare in modo riproducibile popolazioni di lievito diploidi che contengono la libreria di plasmidi di prede e farle crescere in batch per selezionare interazioni positive con lievito 2-ibrido. Non dimenticare che lavorare con solventi organici, durante il protocollo di purificazione del DNA, può essere pericoloso e dovrebbe essere fatto nella cappa aspirante indossando guanti e camice da laboratorio.