Summary
Dentre as mais adversas condições de stress que organismos encontram durante seu ciclo de vida envolve o acúmulo de oxidantes. Durante o estresse oxidativo, células dependem fortemente de chaperones moleculares. Aqui, apresentamos os métodos usados para investigar redox-regulado antiatividade agregação, bem como para acompanhar mudanças estruturais que regulam a função de acompanhante usando HDX-MS.
Abstract
Organismos vivos, regularmente, precisa lidar com ambientes de flutuação durante o seu ciclo de vida, incluindo mudanças de temperatura, pH, o acúmulo de espécies reativas de oxigênio e muito mais. Estas flutuações podem levar a uma proteína ampla desdobramento, agregação e morte de células. Portanto, as células desenvolveram uma rede dinâmica e stress específico de chaperones moleculares, que mantêm um proteome "saudável" durante condições de estresse. Independente de ATP acompanhantes constituem uma classe principal de chaperones moleculares, que servem como moléculas de defesa de primeira linha, protegendo contra a agregação da proteína em uma maneira dependente do stress. Uma característica que destes acompanhantes têm em comum é sua capacidade de utilizar a plasticidade estrutural para sua ativação específicas de stress, reconhecimento e liberação do cliente misfolded.
Neste trabalho, focalizamos a análise estrutural e funcional de um tal acompanhante intrinsecamente desordenado, a Hsp33 bacteriana redox-regulado, que protege as proteínas contra agregação durante o estresse oxidativo. Aqui, nós apresentamos uma caixa de ferramentas de diversas técnicas para estudar a atividade de acompanhante redox-regulada, bem como para mapear mudanças conformacionais do acompanhante, subjacente a sua actividade. Especificamente, podemos descrever um fluxo de trabalho que inclui a preparação de proteínas totalmente reduzidas e totalmente oxidadas, seguido por uma análise do acompanhante atividade antiagregação em vitro usando espalhamento de luz, incidindo sobre o grau da atividade antiagregação e sua cinética. Para superar valores atípicos frequentes acumulados durante os ensaios de agregação, descrevemos o uso de Kfits, uma nova ferramenta gráfica que permite fácil processamento das medições de cinéticas. Esta ferramenta pode ser facilmente aplicada a outros tipos de medições cinéticas para remoção de outliers e ajuste de parâmetros cinéticos. Para correlacionar a função com a estrutura da proteína, descrevemos a configuração e fluxo de trabalho de uma técnica de espectrometria de massa estrutural, hidrogênio-deutério troca espectrometria de massa, que permite o mapeamento de mudanças conformacionais sobre o acompanhante e substrato durante diferentes estágios de atividade Hsp33. A mesma metodologia pode ser aplicada a outras interações da proteína-proteína e proteína-ligante.
Introduction
Células frequentemente encontram um acúmulo de espécies reativas de oxigênio (ROS) produzidos como subprodutos da respiração1,2, proteínas e lipídios oxidação3,4e processos adicionais5, 6,7. Apesar de papel benéfico de ROS em diversos processos biológicos, tais como celular, sinalização8,9 e resposta imune10, um desequilíbrio entre a produção de ROS e sua desintoxicação pode ocorrer, líder de oxidativo estresse7. Os alvos biológicos de ROS são proteínas, lípidos e ácidos nucleicos, a oxidação do que afetam sua estrutura e função. Portanto, o acúmulo de oxidantes celulares está fortemente ligado a uma variada gama de patologias, incluindo câncer de9,11, inflamação12,13e envelhecimento14, 15e foram encontrados para ser envolvido no aparecimento e progressão das doenças neurodegenerativas, como Alzheimer, Parkinson e ALS doença16,17,18.
Proteínas recém sintetizadas e maduras são altamente sensíveis à oxidação devido as modificações potencialmente prejudiciais de suas cadeias laterais, que forma a proteína estrutura e função de19,20. Portanto, o estresse oxidativo geralmente leva a uma inativação da proteína generalizada, enrolamento e agregação, eventualmente levando a morte celular. Uma das estratégias para lidar com o dano potencial de oxidação da proteína celulares elegantes é utilizar a acompanhantes redox-dependente, que inibem a agregação da proteína generalizada, em vez de formar complexos estáveis com proteínas misfolded cliente21 ,22,23. Estes acompanhantes de primeira linha de defesa rapidamente são ativados por uma site-specific oxidação (normalmente em resíduos de cisteína) que converte-los em potente antiagregação de moléculas24. Desde que o estresse oxidativo resulta na inibição da respiração e em diminuições na ATP celular níveis25, canônicos acompanhantes ATP-dependente são menos eficazes durante estresse oxidativo condições25,26 ,27. Portanto, acompanhantes de ATP independente redox-ativado desempenham um papel vital na manutenção da homeostase de proteína sobre a acumulação de oxidantes em bactérias e eucariotas (por exemplo, Hsp3328 e RidA29 em bactérias, Get330 no fermento, peroxiredoxins31 em eucariontes). A atividade destes acompanhantes depende fortemente reversíveis mudanças conformacionais estruturais induzidas por uma site-specific oxidação que revela regiões hidrofóbicas envolvidos no reconhecimento de proteínas misfolded cliente.
Investigação do mecanismo de antie agregação os princípios que regem o reconhecimento das proteínas do cliente por acompanhantes não é fácil devido à natureza dinâmica e heterogêneo de acompanhante-substrato interações32,33, 34,35,36,37. No entanto, stress-regulado acompanhantes têm a oportunidade de avançar nossa compreensão da função de antidevido agregação à sua capacidade para: 1) obter de duas formas diferentes da dama de companhia, ativo (por exemplo, oxidado) e inativos (por exemplo, reduzido), com a introdução ou remoção de uma condição de estresse facilmente alternar entre eles (por exemplo, oxidante e agente redutor), 2) tem uma ampla gama de substratos, 3) formam complexos altamente estáveis com as proteínas de cliente que podem ser avaliadas por diferentes metodologias estruturais e 4) focar exclusivamente o reconhecimento do substrato e lançamento, mediada por mudanças conformacionais redox dependentes, como a maioria destes acompanhantes não tem a capacidade de dobramento.
Aqui, analisamos atividade antiagregação do acompanhante bacteriana redox-regulada do Hsp33, um componente vital do sistema de defesa bacteriana contra a proteína induzida por oxidação agregação28. Quando reduzida, Hsp33 é uma proteína ligadora de zinco firmemente dobrada com nenhuma atividade de acompanhante; no entanto, quando expostos a estresse oxidativo, Hsp33 sofre grandes mudanças conformacionais que expõem seu substrato vinculação regiões38,39. Após a oxidação, o íon de zinco que está fortemente ligado a quatro resíduos de cisteína altamente conservadas do domínio C-terminal é lançado40. Isso resulta na formação de ligações de bissulfeto dois, um desdobramento do domínio C-terminal e uma desestabilização do vinculador adjacente região41. Os C-terminal e vinculador regiões são altamente flexíveis e são definidas como intrinsecamente ou parcialmente desordenada. Após retornar às condições anti-stress, reduzidas as cisteínas e o acompanhante retorna ao seu estado nativo dobrado com nenhuma atividade antiagregação. O dobrar do acompanhante leva a um maior desdobramento e desestabilização da proteína do limite do cliente, que desencadeia a sua transferência para o sistema de acompanhante canônico, DnaK/J, por redobramento38. Análise de sites de interação do Hsp33 sugere que a Hsp33 usa ambos que sua carregada desordenada regiões, bem como as regiões hidrofóbicas no vinculador e domínio N-terminal para capturar misfolded proteínas do cliente e impede sua agregação38, 42. no estado dobrado, estas regiões estão escondidas pelo vinculador dobrado e domínio C-terminal. Curiosamente, a região de vinculador serve como um guardião dobrado e inativo do Hsp33 estado de, "sentindo" o status de dobramento de seu adjacente de domínio C-terminal34. Uma vez desestabilizado por mutagênese (seja por uma mutação de ponto ou de uma perturbação da sequência completa), Hsp33 é convertido para um acompanhante constitutivamente ativo independentemente o estado redox do seu redox sensíveis cisteínas43.
Os protocolos aqui apresentados permitem monitoramento de atividade de acompanhante redox dependentes do Hsp33, bem como mudanças conformacionais de mapeamento sobre a ativação e a ligação de proteínas do cliente. Esta metodologia pode ser adaptada para outros modelos de reconhecimento de acompanhante-cliente, bem como interações da proteína-proteína de não-acompanhante de investigação. Além disso, apresentamos os protocolos para a preparação de acompanhantes totalmente reduzidas e oxidadas que podem ser usados em estudos de outras proteínas redox-switch, para revelar as funções potenciais de oxidação de proteínas sobre a atividade da proteína.
Especificamente, nós descrevemos um procedimento para monitorar acompanhante atividade em vitro e definir sua especificidade de substrato sob diferentes tipos de agregação de proteínas (quimicamente ou termicamente induzido) usando espalhamento de luz (LS) medido por um fluorospectrometer44. Durante a agregação, luz espalhamento no 360 nm aumenta rapidamente devido a turbidez crescente. Assim, a agregação pode ser monitorada em uma maneira dependente do tempo neste comprimento de onda. LS é um método rápido e sensível para os testes de agregação de proteínas e, portanto, a atividade antiagregação de uma proteína de interesse usando nanomolar concentrações, permitindo a caracterização de parâmetros cinéticos relacionados a agregação da proteína sob diferentes condições. Além disso, o protocolo é descrito aqui não requer instrumentação cara e pode ser facilmente estabelecido em qualquer laboratório.
No entanto, é bastante desafiador para obter curvas cinéticas "limpo" e para derivar parâmetros cinéticos de uma proteína tal luz dispersando experiências, devido ao ruído e ao grande número de exceções geradas por bolhas de ar e grandes agregados. Para superar este obstáculo, apresentamos uma nova ferramenta gráfica, Kfits45, usado para reduzir os níveis de ruído em diferentes medidas cinéticas, especificamente equipados para dados cinéticos de agregação de proteínas. Este software fornece parâmetros cinéticos preliminares para uma avaliação inicial dos resultados e permite que o usuário para "limpar" grandes quantidades de dados rapidamente sem afetar suas propriedades cinéticas. Kfits é implementado em Python e disponível em open source em 45.
Uma das questões desafiadoras no campo diz respeito ao mapeamento de sites de interação entre acompanhantes e suas proteínas de cliente e compreensão como acompanhantes reconhecem uma ampla gama de substratos misfolded. Esta questão é ainda mais complicada quando estudar complexos de proteínas altamente dinâmico que envolvem intrinsecamente desordenado acompanhantes e substratos sujeitos a agregação. Felizmente, espectrometria de massa estrutural avançou dramaticamente na última década e forneceu com sucesso útil abordagens e ferramentas para analisar a plasticidade estrutural e mapear resíduos envolvidos no reconhecimento de proteínas46, 47 , 48 , 49. aqui, nós apresentamos uma tal técnica-hidrogênio-deutério troca espectrometria de massa (HDX-MS)-que permite o mapeamento das alterações no nível do resíduo em uma conformação estrutural sobre modificação de proteína ou proteína/ligante ligação35, 50,,51,52,53,54,55. HDX-MS usa o intercâmbio contínuo de hidrogênios espinha dorsal por deutério, a taxa que é afectada pelo ambiente químico, acessibilidade, e ligações covalentes e não-covalentes56. HDX-MS acompanha estes processos do exchange usando um solvente deuterado, comumente água pesada (D.2O) e permite a medição com base na mudança no peso molecular após o hidrogênio para troca de deutério. Taxas mais lentas de intercâmbio de hidrogênio-deutério podem resultar de hidrogênios participando de ligações de hidrogênio ou, simplesmente, de estérico, que indica alterações locais na estrutura57. Alterações em cima de uma ligação de ligante ou modificações borne-translational também podem levar a diferenças no ambiente de hidrogênio, com uma ligação, resultando em diferenças nas taxas de câmbio (HDX) o hidrogênio-deutério46,53.
Nós aplicamos esta tecnologia para as regiões 1) mapa Hsp33, que rapidamente se desdobrar em cima de oxidação, levando a ativação de Hsp33 e 2) definem a interface de ligação potencial de Hsp33 com seu substrato de misfolded completo, citrato sintase (CS)38.
Os métodos descritos neste manuscrito podem ser aplicados para estudar funções redox dependentes de proteínas em vitro, definindo atividade antiagregação e o papel das mudanças estruturais (se houver), em função da proteína. Essas metodologias podem ser facilmente adaptadas aos diversos sistemas biológicos e aplicadas no laboratório.
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Protocol
1. preparação de proteínas totalmente reduzidas e totalmente oxidadas
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Preparação de uma proteína totalmente reduzida
Nota: Aqui, descrevemos a redução de uma proteína que contêm zinco e uso um ZnCl2 solução para restaurar o estado de proteína Zn-incorporada, reduzida. A ZnCl2 solução pode ser substituída ou descartada. Observe que o tempo e a temperatura do processo de redução depende da estabilidade da proteína e função e assim é específicos por proteína.- Descongelar a amostra de proteína no gelo e girá-lo para baixo para remover agregados. Incubar a amostra pelo menos 1,5 h a 37 ° C, com 5 mM DTT e 20 µM ZnCl2 (até 70% de concentração de proteína).
Nota: A temperatura nesta etapa é dependente da proteína e deve ser ajustada para a estabilidade da proteína. - Remova TDT usando colunas do desalting.
Nota: Existem diferentes colunas disponíveis de dessalinização. O protocolo abaixo descreve o procedimento usando colunas do desalting específicas (ver Tabela de materiais). Antes de usar outras colunas do desalting, recomendamos examinar sua eficiência de recuperação de remoção e proteína de TDT, desde que algumas colunas do desalting podem absorver parcialmente a proteína de interesse.- Equilibrar a coluna com um tampão de fosfato (KPi) de potássio (40 mM, pH 7,5) completamente a encher a coluna com o buffer e deixando o buffer escorrer para fora. Repita esse processo 2 x.
- Remova o filtro de disco branco na coluna suavemente empurrando-o para baixo com uma pinça e removê-lo; é mais fácil de remover, enquanto que a coluna é preenchida com o buffer de KPi. Encher a coluna com buffer de KPi e centrifugá-la a 1.000 x g durante 3 minutos.
- Transferir a coluna em um tubo limpo, adicionar a amostra de proteína lentamente para o meio da coluna e centrifugue a 1.000 x g por 2 min. A proteína livre de TDT é agora o escoamento.
- Verifique suas concentrações (por exemplo, usar um espectrómetro de UV/Vis) e medir sua absorbância em 280 nm. Calcule a concentração de proteínas usando a lei de Beer.
- Distribua metade das amostras da proteína em alíquotas. Incube as alíquotas em condições anaeróbicas (por exemplo, utilizando uma câmara anaeróbica) por 20 min. para uma completa remoção de oxigênio. Selar os tubos com filme plástico e armazenar as amostras a-20 ° C ou -80 ° C, dependendo da proteína.
Nota: Em vez de usar a câmara anaeróbica, os tubos podem também ser um flash com gás argônio para remover o oxigênio.
- Descongelar a amostra de proteína no gelo e girá-lo para baixo para remover agregados. Incubar a amostra pelo menos 1,5 h a 37 ° C, com 5 mM DTT e 20 µM ZnCl2 (até 70% de concentração de proteína).
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Preparação de uma proteína totalmente oxidada
Nota: É aconselhável preparar amostras de proteína oxidada de proteínas totalmente reduzidas (descritas anteriormente). Isto irá reduzir a heterogeneidade em Estados de oxidação de cisteínas. É possível usar diferentes reagentes oxidantes; aqui, nos concentramos em peróxido de hidrogênio (H2O2).
Atenção: Evite sobre-oxidação pois pode levar a dissulfeto intramoleculares indesejáveis e irreversível oxidação de aminoácidos diferentes, incluindo a cisteína, metionina, tirosina e outros.- Para a amostra de proteína existente, adicione 5 mM H2O2 (fresco diluído) e incube-3 h a 40 ° C e agitando.
Nota: A temperatura nesta etapa é dependente da proteína e deve ser ajustada para a estabilidade da proteína. - Equilibrar a coluna com buffer de KPi (40 mM, pH 7,5) completamente a encher a coluna com o buffer e deixando o buffer escorrer para fora. Repita esse processo 2 x.
- Remova o filtro de disco branco na coluna suavemente empurrando-o para baixo com uma pinça e removê-lo; é mais fácil de remover, enquanto que a coluna é preenchida com o buffer de KPi.
- Encher a coluna com buffer de KPi e centrifugá-la a 1.000 x g durante 3 minutos.
- Transferir a coluna em um tubo limpo, adicionar a amostra de proteína oxidada lentamente para o meio da coluna e centrifugue a 1.000 x g por 2 min; a proteína oxidada é agora o escoamento.
- Verificar as concentrações de proteína como na etapa 1.2.5, divida as proteínas oxidadas em alíquotas e armazená-los em-20 ° C ou a-80 ° C, a proteína-dependente.
- Para a amostra de proteína existente, adicione 5 mM H2O2 (fresco diluído) e incube-3 h a 40 ° C e agitando.
2. luz espalhamento do ensaio de agregação
Nota: Todas as concentrações neste ensaio são específicas de acompanhante e de substrato e devem ser calibradas. Todos os buffers devem ser 0,22 µm-filtrada, como é extremamente importante que os buffers são livres de quaisquer partículas ou bolhas de ar e as cubetas são limpos e livre de poeira. É muito importante usar um misturador colocado na cubeta de quartzo. Verifique o agitador de diferentes tamanhos e formas para assegurar uma mistura eficiente de toda a solução sem produzir bolhas de ar indesejáveis. Além disso, há flouorospectrometers diferentes disponíveis em laboratórios e instalações. Aqui, um fluorospectrometer específico (ver Tabela de materiais) foi usado. Diferentes instrumentos têm uma sensibilidade diversificada, velocidade de medição e parâmetros do amostrador. Portanto, os parâmetros de medição exata (por exemplo, largura de banda de emissão e excitação, sensibilidade e outros) devem ser otimizados usando uma proteína conhecida propensas a agregação e suas respectivas condições. É recomendável utilizar citrato sintase (CS) e/ou luciferase como substratos iniciais em concentrações nanomolar.
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Ensaio de química de agregação
- Preparar o substrato desnaturado por incubação 12 µM CS durante a noite em 40 mM HEPES (pH 7,5) e 4,5 M de GdnCl. A fim de preservar o pH, dissolva o GdnCl no 40 mM HEPES (pH 7,5).
- Abra o software fluorospectrometer e ir para a medição do tempo de curso. Definir os parâmetros para: temperatura: 25 ° C; Λem: 360; Largura de banda em: 5 nm; Λ,ex: 360; Ex de largura de banda: 2,5 nm; e o intervalo de dados: 0,5 s.
- Prepare a amostra adicionando 1.600 µ l de 40 mM HEPES para uma cubeta de quartzo. Inserir a cubeta do porta-amostras e deixar a amostra atingir a temperatura desejada.
- Defina a agitação para 600 rpm e começa a medição até uma linha de base é estabelecida. Continue para a medição de toda a agitação.
- Para medir a agregação de CS na ausência de um acompanhante, em 120 s para a medição, adicione (delicadamente, mas rapidamente) 10 µ l de CS desnaturado (concentração final de 75 nM). Continuar a medição para 1.200 s.
- Para medir a agregação de CS na presença de Hsp33, em 60 s para a medição, adicionar Hsp33 (concentração final de 300 nM). Depois de um adicional de 60 s, adicionar 10 µ l de CS desnaturado (concentração final de 75 nM). Continuar a medição para 1.200 s.
Nota: Ao adicionar o substrato ou acompanhante, a fim de evitar a inserção de bolhas, use uma pipeta de 10 µ l.
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Ensaio de agregação térmica
Nota: A temperatura para o ensaio de agregação térmica depende da estabilidade da proteína e deve ser ajustada independentemente para cada proteína.- Abra o software fluorospectrometer e ir para a medição do tempo de curso. Defina os parâmetros da seguinte maneira: temperatura: 43 ° C; Λem: 360; Largura de banda de emissão: 5 nm; Λ,ex: 360; Largura de banda da excitação: 2,5 nm; e o intervalo de dados: 0,5 s.
- Prepare a amostra adicionando 1.600 µ l de pré-aquecido 40 mM HEPES para uma cubeta de quartzo. Inserir a cubeta do porta-amostras e deixar a amostra chegar a 43 ° C.
- Defina a agitação para 600 rpm e começa a medição até uma linha de base é estabelecida. Continue para a medição de toda a agitação.
- Para medir a agregação de CS na ausência de um acompanhante, em 120 s para a medição, suavemente adicionar CS (concentração final de 125 nM) e continuar a medição para 1.200 s.
- Para medir a agregação de CS na presença de Hsp33, em 60 s para a medição, adicionar Hsp33 (concentração final de 600 nM). Depois de um adicional de 60 s, adicionar CS (concentração final de 125 nM). Continuar a medição para 1.200 s.
Nota: Ao adicionar o substrato ou acompanhante, evite a inserção de bolhas.
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Remoção de ruído e análise de dados por Kfits
Nota: Kfits está disponível no uso de Kfits tem sido descrito anteriormente em JGD et al 45- Carregar o arquivo de dados.
Nota: A entrada é os resultados brutos de medições de espalhamento de luz em um formato separado por vírgulas ou tabulações textual. - Para remover qualquer ruído, escolha parâmetros de análise. Uso modelo melhor automático (recomendado), marca a bandeira de ruído está sempre acima do sinal .
- Remover manualmente as óbvias exceções usando a linha verde e vermelha ajustável; nesta etapa serão filtrar o ruído acima da linha verde e abaixo da linha vermelha.
- Defina a linha de base e a curva de ajuste. Depois de aplicar o limite de ruído, baixe os dados processados.
- Carregar o arquivo de dados.
3. hidrogênio-deutério Exchange espectrometria de massa
- Preparação de buffers e amostras da proteína (complexo Hsp33 e Hsp33-CS)
- Diluir as amostras da proteína para uma concentração final de 1 mg/mL em buffer de 25 mM Tris-HCl pH 7,5 e transferi-los para ampolas de 1,5 mL.
- Preparar amostras complexas de proteína-substrato incubando Hsp33 com CS na proporção de 1: 1,5 a 43 ° C.
- Adicione CS de forma faseada para evitar qualquer agregação rápida e assegurar uma ligação fecunda entre a Hsp33 e o CS termicamente desdobrada.
- Use pelo menos quatro etapas (isto é, cada vez que adicionar um quarto do volume final) e incubar as amostras durante 15 minutos após cada adição para permitir a proteção de CS por Hsp33.
- Remover quaisquer agregações usando uma centrifugação de 30 min a 16.000 x g a 4 ° C.
Nota: Novos complexos proteína-substrato devem ser preparados fresca. Adição de substrato deve ser feita gradualmente; caso contrário, agregação irá ocorrer. Concentrações de substrato, temperatura e substrato são proteínas específicas. - Prepare um buffer H (25 mM Tris-HCl, pH 7,5), que serve como controle de deuteration, e um buffer D (25 mM Tris-DCl, pH 7.09), que é a reserva de deuteration. Também prepare um buffer de têmpera fresco (TCEP, 3 M GdnCl, de 150 mM 0,1% ácido fórmico).
Nota: O buffer de têmpera deve ser otimizado para a proteína de interesse, a fim de obter sua cobertura máxima sequência após a digestão de pepsina. - Transferir todos os buffers e amostras em frascos e colocá-los em bandejas adequadas. Segure buffers H e D a 25 ° C (bandeja de 25 ° C); por outro lado, manter o buffer têmpera e amostras em 0 - 2 ° C (bandeja de 0 ° C). Colocar as amostras em pastilhas de vidro de 150 µ l (veja a Tabela de materiais) primeiro e depois transferi-los em frascos.
- Preparação do instrumento
Nota: O espectrômetro de massa vem com dois programas de software de acompanhamento: um controla as bombas, e o outro controla o espectrômetro de massa (consulte a Tabela de materiais). Os próximos passos serão descritos utilizando estes dois programas de software.- Ative manualmente todas as unidades de refrigeração. Uma vez que todos os sistemas de resfriamento alcancem suas temperaturas de alvo, alterne manualmente na cromatografia líquida de alto desempenho (HPLC) e bombas de carregamento.
Nota: No nosso caso, estes consistem em dois banhos de resfriamento e uma caixa de resfriamento (que contém a armadilha e colunas analíticas). Uma unidade de refrigeração resfria a bandeja a 0 ° C, enquanto o outro mantém a bandeja a 25 ° C; a temperatura da caixa de resfriamento é 1-2 ° C. - Abra o software que controla tanto as bombas, bem como o software que controla o espectrômetro de massa; Certifique-se de que a MS está em modo de espera.
- Desconecte a fonte MS a válvula de saída HPLC e lave o sistema primeiro com uma solução de "aspirador triplo" (1% de ácido fórmico, acetonitrilo de 33%, 33% de isopropanol, 33% de metanol) e, em seguida, com buffer B (80% acetonitrila, 0,1% de ácido fórmico) e finalmente com um (0,1% do buffer ácido fórmico, pH 2,25) e em seguida, insira a coluna de pepsina no sistema. Se mudar de amortecedores, certifique-se de limpar ambas as bombas antes de prosseguir.
- Certifique-se que a taxa de fluxo para bombas de ambos é de 0,1 mL/min e a pressão está estável.
- Depois de lavar o sistema com um fluxo constante e pressão firme, inserir a tomada HPLC na fonte de MS e ativar a MS.
- Ative manualmente todas as unidades de refrigeração. Uma vez que todos os sistemas de resfriamento alcancem suas temperaturas de alvo, alterne manualmente na cromatografia líquida de alto desempenho (HPLC) e bombas de carregamento.
- Parâmetros de espectrômetro de massa
- Definir a ionização de peptídeo de ionização electrospray (ESI), a 175 ° C, o fluxo de gás de bainha aos 17 anos, o brilho de gás aux no 2 e a tensão do pulverizador em 4.5 kV (complementar a Figura 1).
- Configure os parâmetros da seguinte forma para as amostras não-deuterado.
- Definir os parâmetros: intervalo de varredura m/z para 300-1500; Resolução para 70.000; Alvo de controle de ganho automático (AGC) para 106; e o tempo máximo de injeção (TI) em 100 ms.
Nota: Os 5 íons mais intensos com os Estados de carga entre + 2 e + 6 (sua intensidade superior a 1,3 x 104) e uma janela dinâmica de 30 será isolada. - Execute a fragmentação do íon por dissociação de colisão de alta energia (HCD) na célula múltiplo-colisão com energia de colisão normalizado (NCE) igual a 28. Detectar o fragmento íons em tandem MS em uma resolução de 35.000, alvo AGC de 105, máxima no ms 60 e uma janela de isolamento de 2,0 m/z.
- Definir os parâmetros: intervalo de varredura m/z para 300-1500; Resolução para 70.000; Alvo de controle de ganho automático (AGC) para 106; e o tempo máximo de injeção (TI) em 100 ms.
- Para as amostras deuteradas, empregam MS1 apenas com uma resolução mais alta de 140.000 e com parâmetros de outra forma semelhantes.
- Executando o experimento
- Defina as bandejas da seguinte maneira.
- Coloque o buffer H e D na bandeja 25 ° C e, em seguida, coloque as amostras e o buffer de têmpera na bandeja de 0 ° C.
- Lugar X esvaziar frascos, alinhado em ambos os tabuleiros, onde X = número de amostras x o número de pontos de tempo.
Nota: Na bandeja de 25 ° C, os frascos vazios servem como tubos de ensaio, e na bandeja de 0 ° C, eles servem como frascos de têmpera. - Cada um dos frascos vazios contém uma inserção de copo vazio; descartar e substituir disse inserir entre as experiências.
Nota: Para executar o experimento HDX da forma mais eficiente e menos demorado, um software que permite que as amostras para serem executados simultaneamente (complementar a Figura 2) foi usado. Os próximos passos serão descritos utilizando este software.
- Abra o software. Configure os parâmetros de programa para efectuar o seguinte procedimento.
- Incube cada amostra (5 µ l) com 45 µ l de tampão D durante vários minutos, dependendo dos pontos de tempo selecionados (por exemplo, 1, 3, 18, 40 e 100 min) a 25 ° C. Incube a amostra não-deuterado com 45 µ l de tampão H em vez disso.
- Imediatamente após a incubação, misture 50 µ l de proteína deuterada em 50 µ l de buffer de têmpera gelada e injetá-las em uma coluna de pepsina imobilizado (20 mm de comprimento, 2,0 mm de diâmetro).
- Eluir qualquer peptídeos da coluna pepsina na pré-coluna lavando-o com tampão A para 6 min a uma taxa de 50 µ l/min. Mantenha o tampão A na caixa de resfriamento a 0 ° C.
- Eluir os peptídeos da pré-coluna analítico coluna C18 (coluna C18, 130 Å, 1,7 µm, 2,1 mm x 50 mm, manteve a 0 ° C) e separá-los através da aplicação de um gradiente linear de acetonitrilo em 100 µ l/min. Run acetonitrilo gradiente usando acetonitrilo 100% como tampão B : min 7 a 2%, 7 min a 10-30%, 2,5 min em 30-90%, 1,5 min a 90%, gradiente rápida por 1 min a 90-8% e finalmente equilibrar a coluna por 4 min em 2%.
- Construir uma sequência de execução (consulte complementar a Figura 2): digite todos os pontos de tempo, nomes do amostra e locais em bandejas, bem como os nomes de tampão e locais.
Nota: O software permite o alinhamento de todos os tempos de execução diferentes em um programa que executa várias amostras ao mesmo tempo, de forma eficiente diminuindo tempos de corrida.
- Defina as bandejas da seguinte maneira.
- Análise de dados
Nota: Nós trabalhamos com vários programas de software no processo de análise de dados, incluindo Proteome descobridor e MaxQuant (software livre) para a identificação de peptídeo e a análise da cobertura de sequência, bem como a bancada HDX, um software gratuito que permite a análise da incorporação deutério em proteínas e uma comparação das taxas entre diferentes conjuntos de experiências HDX. Os próximos passos serão descritos utilizando esses programas.- Analise a cobertura de peptídeo da amostra executando as amostras de controle não-deuterado através do software (complementar a Figura 3). Configure o software usando os seguintes parâmetros.
- Uso o método Sequest HT com um não-enzimática (inespecíficos) cleave. Busca de péptidos de aminoácidos 4-144 com uma tolerância de massa de 7 ppm e 0,5 para do precursor íon e fragmento. Permitem uma oxidação de metionina dinâmico.
- Crie um banco de dados da proteína, através do qual o software pode determinar a cobertura do peptide. Exporte os peptídeos identificados em formato textual.
- Analise os resultados deuterados usando o HDX bancada software livre58.
- Abra o editor de proteína e definir a proteína inserindo o arquivo de cobertura de sequência e peptídeo de proteína.
- Em seguida, abra o editor de configuração experiência assistente e insira todas as entradas solicitadas.
Nota: O programa requer o número de amostras, o número de pontos de tempo, o número de repetições, o valor de pH de buffers e a temperatura. - Finalmente, os parâmetros sobre o espectrômetro de massa usado, depois que o programa gera uma lista de peptídeos detectados de entrada.
Nota: O software detecta os peptídeos "HDX" inspeciona clusters de isótopo e demonstra uma clara visualização de deuteration nas amostras.
- Analise a cobertura de peptídeo da amostra executando as amostras de controle não-deuterado através do software (complementar a Figura 3). Configure o software usando os seguintes parâmetros.
- Apresentação de dados
- Rotule as regiões com uma absorção de deferentes deuteration sobre a estrutura utilizando o software PyMol ou qualquer outro software de visualização.
- Apresente os níveis de absorção de deutério em vez dos valores de B-fator.
Nota: Um tutorial básico pode ser encontrado em https://pymolwiki.org/index.php/Practical_Pymol_for_Beginners.
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Representative Results
Os dois métodos apresentados possibilitam acompanhar a atividade cinética e dinâmica de interações da proteína entre acompanhante e seu substrato. Além disso, o protocolo de redução-oxidação permite a preparação de um acompanhante totalmente reduzida e totalmente oxidado, dando uma compreensão mais profunda do mecanismo de ativação de redox dependentes desordenadas acompanhantes.
Primeiro, usamos o espalhamento de luz para examinar a atividade redox dependentes do acompanhante. Espalhamento de luz foi realizado em uma proteína CS quimicamente e termicamente desnaturada na presença de um oxidado (ativo) ou reduzido (inativo) acompanhante (Figura 1). Desnaturação química leva a uma agregação de CS rápida induzida pelo dobrar de uma proteína totalmente denaturized em condições desfavoráveis de reserva. Por outro lado, a agregação induzida por térmica resulta de um desdobramento relativamente lento do substrato nativamente dobrado. Portanto, estes diferentes tipos de processos de agregação variam em seus parâmetros cinéticos. Além disso, diferentes acompanhantes podem variar em sua capacidade de prevenir a agregação do mesmo substrato em modos diferentes de agregação.
Em ambas as formas de desnaturação, a adição de oxidado Hsp33 em uma relação molar de 1:4 (CS: Hsp33) completamente abolido a agregação, abaixando as 360 leituras nm a valores insignificantes. A presença de um Hsp33 reduzido, por outro lado, não teve efeito sobre a estabilidade do CS e deu uma curva de agregação semelhante àquela detectada na ausência de um acompanhante (Figura 1). Os resultados foram analisados e limpo do ruído de fundo usando o Kfits, descrito como esquematicamente na Figura 2.
O contorno da técnica HDX-MS começa com a incubação do acompanhante com óxido de deutério, seguido de têmpera e digestão, e finalmente a análise de MS e hidrogênio-deutério troca de perfil (Figura 3). Durante HDX-MS, o acompanhante foi incubado na bandeja a 25 ° C, em um buffer de contendo O D2. Depois de um tempo de incubação específico controlado pelo sistema robótico de manipulação da amostra, a solução da proteína foi transferida para a solução de resfriamento, ácida e desnaturação, na bandeja a 0 ° C. O baixo pH e a temperatura baixa diminui a troca de hidrogênio e preserva os níveis de deuteration de todos os hidrogênios de Amida, enquanto o desnaturação química se desdobra a proteína, permitindo-lhe ser digerido corretamente. O sistema robótico transfere a amostra da bandeja a 0 ° C para a caixa de resfriamento onde desagua a coluna de digestão de pepsina on-line. Imediatamente após a digestão de proteínas, os peptídeos proceder à coluna C18-armadilha para a dessalinização e a remoção de rápido exchangeable D2O (localizado principalmente sobre os átomos da cadeia lateral) e em seguida são separados usando a coluna C18 e analisaram usando massa espectrometria. O fluxo da amostra é controlado por um sistema de duas válvulas, que 1) garante a separação da pepsina e buffers de coluna C18 para evitar a inativação da pepsina por solventes orgânicos e 2) permite a dessalinização curto dos peptides remover rápido Exchangeable moléculas de2O D e sais (Figura 4).
Após a análise computacional, nós recebemos um perfil deuteration para cada peptídeo, mostrando uma mudança em massa em função do tempo de incubação em D2O. O software HDX Workbench permite a comparação de repetições experimentais a fim de criar análises estatísticas de cada condição (por exemplo, uma acompanhante ativa em uma forma não-ligada). O próximo passo é uma comparação das curvas de deuteration entre amostras diferentes; por exemplo, um acompanhante acoplado e uma acompanhante não acoplada. Essas comparações de acompanhante de diferentes Estados-Membros podem revelar as perturbações estruturais que acompanham a ligação do substrato. Resíduos que apresentem uma troca mais lenta no estado ligado provavelmente interagindo com um parceiro de vinculação. É importante notar que a diminuição de hidrogênio-deutério taxas de câmbio também pode indicar um dobrar de uma região específica mediante ligação sem a real interação direta com o substrato (Figura 5A). O HDX Workbench software permite o exame dos resultados na exibição de "perturbação", mostrando o deuteration com um erro padrão sobre a cobertura da proteína inteira.
Neste caso, HDX-MS foi usado para comparar o padrão de deuteration entre o acompanhante acoplado e desacoplado Hsp33 para seu substrato CS. Os resultados revelam um site de interação com o cliente dentro do domínio de interruptor C-terminal redox do acompanhante (Figura 5B). Enquanto reduzido, Hsp33 tem uma estrutura completamente ordenada, onde os sites de interação estão enterrados. Hsp33 perde sua estrutura e torna-se funcional quando ela sentir o stress oxidativo; daí, nós comparamos a Hsp33 reduzido e oxidado sob condições acopladas e desacopladas (Figura 5-C). Os resultados mostram que, enquanto a Hsp33 reduzida, se vinculado ou desvinculado, produz curvas de peptídeo semelhante, a Hsp33 oxidado exibe uma diferença significativa. As amostras Hsp33 oxidadas mostram uma diferença de deuteration de 30% entre o acompanhante acoplado e desacoplado, com áreas específicas da proteína ligada indicando um impedimento alostérico. A análise de peptídeos adicionais do N-terminal e as regiões de vinculador thermobile são mostrados na Figura complementar 3.
Figura 1 . Análise de agregação por espalhamento de luz. a agregação de CS quimicamente e termicamente desnaturado foi monitorada na presença de Hsp33 oxidado (vermelho), reduzido a Hsp33 (azul), ou na ausência de acompanhante (preto). Um espalhamento de luz a 360 nm foi monitorado por 1.200 s. (A) durante a agregação de química, na ausência de um acompanhante ou na presença de uma reduzida Hsp33, CS agregados rapidamente, atingindo um platô de aproximadamente 300 s a medição. (B) durante a agregação térmica, o CS agregados gradualmente na ausência de um acompanhante ou na presença de um Hsp33 reduzido. Em ambos os ensaios, a presença de Hsp33 oxidado completamente abolido agregação, como foi demonstrado pelas leituras de 360 nm insignificantes. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2 . Remoção de ruído e análise de dados usando o Kfits. Este painel mostra uma esquema Resumindo a remoção de ruído e análise de dados pela ferramenta Kfits , conforme descrito no texto e em JGD et al 45. clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3 . Fluxo de trabalho da metodologia HDX-MS. HDX-MS emprega deuterados solventes para determinar o ambiente químico dos hidrogênios de Amida, uniformemente distribuídos ao longo da espinha dorsal da proteína. A proteína de interesse é incubada em um buffer de deuterating em sua forma nativa para períodos de tempo específicos e, em seguida, o intercâmbio de hidrogênio-deutério é saciado por condições ácidas em uma baixa temperatura. A proteína é digerida por um estábulo de enzima sob condições ácidas, como a pepsina. Depois, os peptídeos são postos e separados em um tempo curto para evitar uma troca de volta. Finalmente, os peptídeos são analisados por um espectrômetro de massa e a absorção de deutério é avaliada por um software de análise, por exemplo pelo HDX Workbench software livre58. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4. Componentes do sistema totalmente automatizado de HDX-MS. (A), este diagrama esquemático do HDX-MS representa todas as partes do sistema: a bomba de carga e o fluxo de buffer de controle de bomba HPLC e o exemplo de transferência dentro do sistema. O sistema robótico contém duas seringas e bandejas que são usadas para preparar a amostra deuterada e transferir as proteínas para a digestão on-line coluna através da válvula de entrada da caixa de resfriamento (compartimento de LC). Então, os peptídeos digeridos são direcionados para as colunas de armadilha e separação de C18, posteriormente separados e direcionados para o espectrômetro de massa. (B) este painel mostra a configuração do sistema HDX real como ele foi criado no laboratório. (C), este painel mostra uma apresentação esquemática do on-line-digestão e a configuração de fluídico de separação do peptide. Os sistemas de digestão e separação têm uma válvula a cada que pode ser alternada entre modos de carregar e injetar . A primeira válvula (à esquerda) é conectada à porta de injeção e é controlada pela bomba de carga, direcionando as amostras para a coluna de pepsina usando o buffer ácido sem qualquer solvente orgânico que pode danificar a resina de pepsina. A amostra é transferida para a válvula direita na coluna de armadilha para remover resíduos de deutério, bem como rápido trocados átomos deuterados (principalmente das cadeias de lado). Após uma breve lavagem de 1-2 min na coluna da armadilha, a válvula muda seu modo de carregar e a amostra é lavada na coluna C18 de separação usando a bomba HPLC com concentrações crescentes de acetonitrilo. A amostra é transferida para o espectrômetro de massa para uma análise em massa. O comprimento dos tubos é marcado. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5 . Resultados HDX-MS. (A) os resultados são apresentados como uma porcentagem de deuteration ao longo do tempo por fragmento de proteína, gerado pelo software HDX Workbench . Cada gráfico mostra um exemplo de proteína, ou oxidado ou reduzido e compara entre amostras acopladas e desacopladas. Os fragmentos de peptídeo mostrados aqui são o peptídeo que YVVITITPSEG encontrado na região de vinculador e o peptídeo que LQVMPAQNAQQDDFD encontrado no C-terminal. (B) os resultados finais, apresentados como a diferença de deuteration entre os complexos acoplados e desacoplados, mostraram a perturbação por aminoácidos. (C), um modelo estrutural de acompanhante a Hsp33 mostra as diferenças de absorção de deuteration em todo o vinculador e regiões instáveis do C-terminal. Este painel é criado utilizando o software PyMol . Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Complementar Figura 1. Interface do programa operacional de espectrômetro de massa. O programa é usado para otimizar e definir parâmetros de método de espectrômetro de massa usados para o experimento HDX. Os parâmetros de método (no painel da esquerda) podem ser salvos no método, que é reconhecido por outros programas. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Complementar a Figura 2. Esta figura mostra uma captura de tela do software que serve como uma plataforma de integração da amostragem robótica entrega o sistema e o sistema MS-LC. O software otimiza o tempo de execução, a programação do experimento HDX, seguindo o tempo de incubação definidos no buffer deuterado (setas azuis). Por exemplo, acima, é um diagrama de 17 corridas de duas análises replicative da variante Hsp33 STIL, incubadas em um buffer deuterado por vezes diferentes, variando de 0 - 100 min. clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Complementar a Figura 3. Esta figura mostra uma análise da absorção de deutério de diversos peptídeos Hsp33 de diferentes variantes Hsp33, chamado PGBD e REV34. As parcelas demonstram alterações na captação de deutério da região mesma em Hsp33 em desacoplado (vermelho) e Estados ligados (azul). Peptídeos da região N-terminal não mostram nenhuma diferença significativa nas taxas de HDX, enquanto fragmentos da região de vinculador mostram uma diminuição significativa das taxas de HDX mediante a interação com o substrato desdobrado, citrato sintase. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
Neste trabalho, nós fornecemos os protocolos para a análise da atividade de acompanhante redox-dependente e a caracterização das mudanças estruturais sobre a ligação de uma proteína do cliente. Estas são metodologias complementares para definir o potencial complexos de acompanhante-substrato e analisar possíveis sites de interação.
Aqui, nós aplicamos esses protocolos para a caracterização de um complexo entre o acompanhante regulamentadas redox Hsp33 com um substrato bem estudado acompanhante CS. Apresentamos dois tipos diferentes de análises de agregação da proteína, que diferem em seu estado inicial e cinético: durante uma desnaturação química, o substrato começa seu processo de desdobramento da forma desnaturada, enquanto durante uma agregação térmica, a desdobramento é iniciada de forma nativa do substrato.
Medidas de dispersão de luz são uma ferramenta útil para monitorar a quantidade relativa de agregação da proteína. Enquanto usamos este método para determinar o estado ativo do acompanhante, mais pode ser usado para estudar as condições de agregação geral, para comparar a estabilidade de uma proteína diferente, ou estudar mutações desestabilizadoras no substrato e acompanhante.
Apesar de sua simplicidade, o método de espalhamento de luz pode produzir dados ruidosos, com vários valores atípicos. Para superar este problema, desenvolvemos o software de Kfits descrito acima. O software Kfits torna possível simplesmente e rapidamente remover grandes quantidades de dados ruidosos, bem como calcular os parâmetros cinéticos da curva de espalhamento de luz. Kfits não está restrito a agregação da proteína e pode ser aplicado a qualquer tipo de medidas cinéticas.
Assim, as metodologias descritas aqui são simples, fácil de executar e não demorado. Eles podem ser aplicados para diferentes chaperones moleculares, permitindo a sua dependência de redox ser examinado dentro de um par de dias. Além disso, a atividade antiagregação de acompanhantes dependentes de outros, não-redox pode ser avaliada usando os protocolos descritos de espalhamento de luz e Kfits. É importante observar que diferentes parâmetros, tais como temperatura, concentração de proteínas e o tempo de medição tem que ser ajustado para cada sistema de proteína independentemente.
Para obter informações estruturais que regem uma acompanhante trabalhando o ciclo, apresentamos a metodologia HDX-MS. Em contraste com o procedimento de espalhamento de luz, é uma tecnologia mais complexa e requer instrumentação específica, incluindo um espectrômetro de massa e, de preferência, um sistema robótico para a preparação da amostra. No entanto, esta configuração pode ser estabelecida, mesmo sem o sistema robótico, em uma instalação existente. Uma vez que é estabelecida, o procedimento é relativamente simples e permite a análise de complexos de proteína desafiadoras que não podem ser alcançados por metodologias de alta resolução (por exemplo, raios-x e NMR).
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Disclosures
Os autores não têm nada para divulgar.
Acknowledgments
Os autores são gratos a Meytal Radzinski para suas discussões úteis e crítica de leitura do artigo e Patrick Griffin e seus membros de laboratório para sua assistência ilimitada ao estabelecer a plataforma de análise HDX. Os autores agradecem a Fundação alemã-Israel (I-2332-1149.9/2012), a Fundação científica Binacional (2015056), a concessão de integração de Marie-Curie (618806), a Israel Science Foundation (1765/13 e 2629/16) e a ciência humana de fronteira Programa (CDA00064/2014) pelo apoio financeiro.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Chemicals, Reagents | |||
| Acetonitrile HPLC plus | Sigma Aldrich | 34998-2.5L | solvent |
| Formic acid Optima LC/MS | Fisher Chemicals | A117-50 | solvent supplement |
| Isopropyl alcohol, HPLC grade | Fisher Chemicals | P750717 | solvent |
| Methanol | Fisher Chemicals | A456-212 | solvent |
| Tris(hydroxymethyl)aminomethane | Sigma Aldrich | 252859 | buffer |
| Trifluoroacetic acid | Sigma Aldrich | 76-05-1 | solvent |
| Water for HPLC | Sigma Aldrich | 270733-2.5L-M | solvent |
| ZnCl2, Zinc Chloride | Merck | B0755416 308 | reagent |
| DTT | goldbio | 27565-41-9 | reducing agent |
| PD mini trap G-25 columns GE healthcare | GE healthcare | 29-9180-07 | desalting column |
| Potassium Phosphate | United states Biochemical Corporation | 20274 | buffer |
| Hydrogen peroxide 30% | Merck | K46809910526 | oxidizing agent |
| citrate synthase | sigma aldrich | C3260 | substrate |
| HEPES acid free | sigma aldrich | 7365-45-9 | buffer |
| Gndcl | sigma aldrich | G3272-500G | denaturant |
| Deuterium Chloride Solution | sigma aldrich | 543047-10G | buffer |
| Deuterium Oxide 99% | sigma aldrich | 151882-100G | solvent |
| TCEP | bioworld | 42000058-2 | reducing agent |
| 150uL Micro-Insert with Mandrel Interior & Polymer Feet, 29*5mm | La-Pha-Pack -Thermo Fischer Scientific | ||
| 1.5mL Clear Short Thread Vial 9mm Thread, 11.6*32mm | La-Pha-Pack -Thermo Fischer Scientific | ||
| quartz cuvette | Hellma 101-QS | ||
| Instruments | |||
| Jasco FP-8500 Fluorospectrometer | Jasco | ||
| Thermomixer Comfort | Eppendorf | 13058/0 | |
| Heraeus Megafuge 16R, bench topCentrifuge | Thermo Scientific | ||
| pH meter , PB-11 sartorius | Sartorius | 13119/0 | |
| AffiPro Immobilized Pepsin column (20mm length, 2.0mm diameter). | AffiPro | ||
| Waters Pre-column (ACQUITY UPLC BEH C18 VanGuard 130 Å, 1.7um, 2.1mmx5mm) | Waters | ||
| C18 analytical column (ACQUITY UPLC Peptide BEH c18 Column, 130 Å, 1.7um, 2.1mmx50mm) | |||
| Vinyl Anaerobic chamber with Airlock door | COY | ||
| Q-exactive-orbitrap mass spectrometer | Thermo-Fischer Scientific | ||
| PAL system LHX - robotic system for handling HDX samples | PAL system | https://www.palsystem.com/index.php?id=840 | |
| Dionex Ultimate 3000, XRS pump | Thermo Scientific | ||
| Dionex AXP-MS auxiliary pump | Thermo Scientific | ||
| Software, Software Tools, Database search | |||
| Kfits: Fit aggregation Data | http://kfits.reichmannlab.com/fitter/ | ||
| Thermo Scientific Xcalibur software | https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/OPTON-30487 | ||
| Q Exactive MS Series Tune Interface (Tune) | https://tools.thermofisher.com/content/sfs/brochures/WS-MS-Q-Exactive-Calibration-Maintenance-iQuan2016-EN.pdf | ||
| Chronos software (Axel Semrau) | http://www.axel-semrau.de/en/Software/Software+Solutions/Chronos-p-966.html | ||
| Proteome Discoverer V1.4 software | https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/OPTON-30795 | ||
| HDX workbench software | http://hdx.florida.scripps.edu/hdx_workbench/Home.html |
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