Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

Definiera Hsp33's Redox-reglerade förkläde aktivitet och mappning konfirmerande ändringar på Hsp33 med hjälp av väte-deuterium Exchange masspektrometri

Published: June 7, 2018 doi: 10.3791/57806
Automatic Translation
*1, *1, 1, 1
1Department of Biological Chemistry, The Alexander Silberman Institute of Life Sciences, Safra Campus Givat Ram, The Hebrew University of Jerusalem
* These authors contributed equally

Summary

En av de mest utmanande stress villkor som organismer stöta på under sin livstid innebär ansamling av oxidanter. Under oxidativ stress, celler förlita sig tungt på molekylär chaperones. Här presenterar vi metoder som används för att undersöka redox-reglerade anti aggregering aktiviteten, samt för att övervaka strukturförändringar som styr funktionen förkläde med HDX-MS.

Abstract

Levande organismer behöver regelbundet klara varierande miljöer under deras livscykel, inklusive ändringar i temperatur, pH, ansamling av reaktiva syreradikaler och mer. Dessa svängningar kan leda till en utbredd protein utspelas, aggregering, och celldöd. Celler har därför utvecklats en dynamisk och stress-specifika nätverk av molekylär chaperones, som upprätthåller en ”frisk” proteomet under stress villkor. ATP-oberoende chaperones utgör en stor klass av molekylär chaperones, som tjänar som första linjens försvar molekyler, skydda mot protein aggregation på ett sätt som stress-beroende. En funktion dessa chaperones har gemensamt är deras förmåga att använda strukturell plasticitet för deras stress-specifik aktivering, erkännande och versionen av felveckning klienten.

I detta papper fokuserar vi på funktionella och strukturella analysen av en sådan inneboende oordnade förkläde, den bakteriella redox-reglerade Hsp33, som skyddar proteiner mot sammanläggning under oxidativ stress. Här presenterar vi en verktygslåda med olika tekniker för att studera redox-reglerade förkläde verksamhet, liksom för mappning konfirmerande förändringar av förkläde, underliggande verksamheten. Specifikt, beskriver vi ett arbetsflöde som omfattar utarbetande av fullt reducerat och fullt oxiderat proteiner, följt av en analys av förkläde anti aggregering aktivitet in vitro- med hjälp av ljus-spridning, med fokus på graden av den anti aggregering aktivitet och dess kinetik. För att övervinna frekventa extremvärden som ackumulerats under aggregering analyser, beskriver vi användningen av Kfits, en roman grafiska verktyg som tillåter enkel bearbetning av kinetiska mätningar. Detta verktyg kan enkelt tillämpas på andra typer av kinetiska mätningar för att ta bort outliers och passande kinetiska parametrar. För att korrelera funktionen med proteinstruktur, vi beskriver setup och arbetsflödet för en strukturell masspektrometri teknik, väte-deuterium exchange-masspektrometri, som tillåter kartläggning av konfirmerande förändringar på förkläde och substratet under olika skeden av Hsp33 aktivitet. Samma metod kan tillämpas på andra protein-protein och protein-ligand interaktioner.

Introduction

Celler möter ofta en ansamling av reaktiva syreradikaler (ROS) produceras som biprodukter av respiration1,2, protein och lipid oxidation3,4och ytterligare processer5, 6,7. Trots ROS' positiva roll i olika biologiska processer såsom cellulär signalering8,9 och immunsvar10, uppstå en obalans mellan ROS produktion och dess avgiftning, ledande till oxidativ betona7. De biologiska målen för ROS är proteiner, lipider och nukleinsyror, oxidation av som påverkar deras struktur och funktion. Därför, ansamling av cellulära oxidanter är starkt kopplad till en rad olika sjukdomar inklusive cancer9,11, inflammation12,13och åldrande14, 15, och har befunnits vara inblandade i uppkomsten och utvecklingen av neurodegenerativa sjukdomar som Alzheimers, Parkinsons och ALS sjukdom16,17,18.

Både nyligen syntetiserade och mogen proteiner är mycket känsliga för oxidation på grund av de potentiellt skadliga ändringarna av deras sida kedjor, som forma protein struktur och funktion19,20. Därför leder oxidativ stress vanligtvis till en utbredd protein inaktivering, Skellefteåsjukan och aggregering, så småningom leder till celldöd. En av de eleganta cellulära strategierna att klara av den potentiella skadan av protein oxidation är att utnyttja redox-beroende chaperones, som hämmar den utbredda protein aggregeringen, i stället för bildar stabila komplex med felveckning klienten proteiner21 ,22,23. Dessa första linjens försvar chaperones aktiveras snabbt genom en platsspecifik oxidation (vanligtvis på cystein rester) som omvandlar dem till potenta anti aggregering molekyler24. Eftersom oxidativ stress resulterar i hämning av respiration och minskningar i cellulär ATP nivåerna25, är kanoniska ATP-beroende chaperones mindre effektiva under oxidativ stress villkor25,26 ,27. Därför, redox-aktiverat ATP-oberoende chaperones spelar en viktig roll i att upprätthålla protein homeostas vid ansamling av oxidanter i bakterier och Eukaryoter (t.ex., Hsp3328 och RidA29 i bakterier, Get330 i jäst, peroxiredoxins31 i Eukaryoter). Aktiviteten av dessa följeslagare är starkt beroende av reversibel konfirmerande strukturförändringar induceras av en platsspecifik oxidation som avslöjar hydrofoba regioner involverade i erkännandet av felveckning klienten proteiner.

Forskning av mekanismen för anti aggregering och principerna för erkännande av klienten proteinerna av chaperones är inte lätt på grund av förkläde-substrat interaktioner32,33, dynamisk och heterogen 34,35,36,37. Stress-reglerade chaperones har dock en möjlighet att avancera vår förståelse av den anti aggregeringsfunktionen tack vare sin förmåga att: 1) få två olika former av förkläde, aktiv (t.ex., oxideras) och inaktiva (t.ex. sänkt), med ett införande eller borttagning av en belastning som enkelt växla mellan dem (t.ex., antioxidant och reduktionsmedel), 2) har ett brett utbud av substrat, 3) bildar mycket stabila komplex med de klient-proteiner som kan utvärderas av olika strukturella metoder, och 4) fokuserar enbart på substrat erkännande och release, medieras av redox-beroende konfirmerande förändringar, som flesta av dessa chaperones saknar den fällbara anlagen.

Här analyserar vi bakteriell redox-reglerade förkläde Hsp33's anti aggregering, en viktig del av det bakteriella försvarssystemet mot oxidation-inducerad protein aggregering28. När minskar, är Hsp33 ett tätt veckade zink-bindande protein utan förkläde aktivitet; dock när den utsätts för oxidativ stress, genomgår Hsp33 omfattande konfirmerande förändringar som exponerar dess substrat bindande regioner38,39. Vid oxidation är zink jonen som är starkt bunden till fyra mycket cystein rester av C-terminala domänen släppt40. Detta resulterar i bildandet av två disulfide obligationer, en unfoldingen av domänen C-terminal och en destabilization av de intilliggande linker region41. C-terminal och linker regionerna är mycket flexibla och definieras som inneboende eller delvis störda. Vid återkomst till icke-stress villkor, cysteines bli minskas och förkläde återgår till dess infödda vikta tillstånd utan anti aggregering aktivitet. Vika av förkläde leder till en ytterligare utspelas och destabilization av proteinet bundna klient, som utlöser dess överföring till kanoniska förkläde systemet, DnaK/J, för vika38. Analys av Hsp33's interaktion platser tyder på att Hsp33 använder båda dess laddade andningsstörningar regioner samt de hydrofoba regionerna på länkare och N-terminala domänen att fånga felveckning klienten proteiner och förhindra deras aggregering38, 42. i hopvikt skick, döljs dessa regioner av den vikta länkare och C-terminal domän. Intressant, fungerar regionen linker som en grindvakt av Hsp33's vikta och inaktiva tillstånd, ”sensing” fällbara status för dess intilliggande C-terminal domän34. När destabiliserat av mutagenes (antingen genom en punktmutation eller ett kontosystem störning), omvandlas Hsp33 till en konstitutivt aktiv förkläde oavsett redox staten i dess redox-känsliga cysteines43.

De protokoll som presenteras här tillåter övervakning av Hsp33's redox-beroende förkläde aktivitet, samt mappning konfirmerande förändringar vid aktiveringen och bindning av klienten proteiner. Denna metod kan anpassas till forskning andra förkläde-klienten erkännande modeller samt icke-förkläde protein-protein interaktioner. Dessutom presenterar vi protokoll för beredning av helt nedsatt och oxiderade chaperones som kan användas i studier av andra redox-switch proteiner, för att avslöja potentiella roller av protein oxidation på proteinaktiviteten.

Specifikt, vi beskriver en procedur för att övervaka förkläde aktivitet in vitro- och definiera dess substrat specificitet under olika typer av protein aggregation (kemiskt eller termiskt inducerad) använder ljusspridning (LS) mätt med en fluorospectrometer44. Under aggregering, ljus spridning på 360 nm ökar snabbt på grund av den ökande grumligheten. Aggregation kan således övervakas på ett tidsberoende sätt vid denna våglängd. LS är en snabb och känslig metod för att testa protein aggregering och därmed aktiviteten anti aggregering av ett protein av intresse med hjälp av nanomolar koncentrationer, aktivera karakterisering av protein aggregation-relaterade kinetiska parametrar under olika villkor. Dessutom det LS-protokollet som beskrivs här kräver inte dyra instrumentering och lätt kan fastställas i ett laboratorium.

Det är dock ganska utmanande att få ”rena” kinetic kurvor och att härleda en proteinets kinetiska parametrar från sådant ljus spridning experiment, på grund av buller och det stora antalet avvikare som genereras av luftbubblor och stora aggregat. För att övervinna detta hinder, presenterar vi ett nytt grafiskt verktyg, Kfits45, används för att minska bullernivåerna i olika kinetiska mätningar, specifikt utrustade för protein aggregering kinetiska data. Denna programvara ger preliminära kinetiska parametrar för en tidig utvärdering av resultaten och tillåter användaren att ”rena” stora mängder data snabbt utan att påverka dess kinetiska egenskaper. Kfits är genomförda i Python och finns i öppen källkod på 45.

En av de utmanande frågorna i fältet avser kartläggning interaktion platser mellan följeslagare och deras klient proteiner och förstå hur chaperones igen ett brett utbud av felveckning substrat. Denna fråga är ytterligare komplicerat när studera högdynamiska proteinkomplex som inbegriper egensäkra andningsstörningar chaperones och aggregation-benägen substrat. Lyckligtvis, strukturella masspektrometri dramatiskt har avancerat under det senaste decenniet och har framgångsrikt levererat bra metoder och verktyg för att analysera strukturell plasticitet och karta rester inblandade i protein erkännande46, 47 , 48 , 49. Här presenterar vi en sådan teknik-väte-deuterium exchange masspektrometri (HDX-MS)-som tillåter kartläggning av resthalter ändringar i en strukturell konformation vid protein modifiering eller protein/Ligand bindande35, 50,51,52,53,54,55. HDX-MS använder fortlöpande utbyte av ryggraden hydrogens av deuterium, som påverkas av den kemiska miljön, tillgängligheten, och kovalenta och icke-kovalent56. HDX-MS spårar dessa exchange processer med ett deutererade lösningsmedel, vanligen tungt vatten (D2O), och tillåter mätning baserat på förändringen i molekylvikt efter väte till deuterium exchange. Långsammare andelen väte-deuterium exchange kan resultera från hydrogens deltar i vätebindningar eller helt enkelt, från sterisk hinder, som visar lokala förändringar i struktur57. Förändringar vid en ligand bindning eller post-translationella modifieringar kan också leda till skillnader i väte-miljön med en bindning som resulterar i skillnader i väte-deuterium exchange (HDX) priser46,53.

Vi tillämpat denna teknik 1) karta Hsp33 regioner som snabbt utvecklas vid oxidation, vilket leder till aktivering av Hsp33, och 2) definiera potentiella bindande gränssnittet för Hsp33 med dess hellångt felveckning substrat, citrat synthase (CS)38.

De metoder som beskrivs i detta manuskript kan användas för att studera redox-beroende funktioner av proteiner i vitro, definiera anti aggregering aktivitet och rollen av strukturella förändringar (om någon) i proteinfunktion. Dessa metoder kan enkelt anpassas till olika biologiska system och tillämpas i laboratoriet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. beredning av fullt reducerat och fullt oxiderat proteiner

  1. Beredning av ett fullt reducerat protein
    Obs: Här, vi beskriver minskningen av en zink-innehållande protein och använda en ZnCl2 lösningen att återställa Zn-införlivas, minskad protein. ZnCl2 lösningen kan bytas ut eller kasseras. Observera att tid och temperatur minskning processen beror på protein stabilitet och funktion, och är således specifikt per protein.
    1. Tina protein provet på is och snurra den ner till ta bort aggregat. Inkubera provet för i minst 1,5 timmar vid 37 ° C med 5 mM DTT och 20 µM ZnCl2 (upp till 70% av proteinkoncentration).
      Obs: Temperaturen vid detta steg är protein-beroende och bör anpassas till protein stabilitet.
    2. Ta bort DTT hjälp avsaltning kolumner.
      Obs: Det finns olika avsaltning kolumner som är tillgängliga. Protokollet nedan beskriver proceduren med specifika avsaltning kolumner (se Tabell för material). Innan du använder andra avsaltning kolumner, rekommenderar vi att undersöka deras effektivitet av DTT borttagning och protein återhämtning, eftersom vissa avsaltning kolumner kan delvis absorbera proteinet av intresse.
      1. Jämvikta kolonnen med en kalium (KPi) fosfatbuffert (40 mM, pH 7.5) genom påfyllning av kolonnen helt med bufferten och låta bufferten rinna ut. Upprepa processen 2 x.
      2. Ta bort vit disk filtret i kolumnen genom att försiktigt trycka det med pincett och ta bort det; Det är enklast att ta bort medan kolumnen är fylld med KPI-bufferten. Fyll kolonnen med KPI-buffert och centrifugera det 1 000 x g i 3 min.
      3. Flytta kolumnen till en ren rör, tillsätt protein provet långsamt till mitten av kolumnen och centrifugera det 1 000 x g i 2 min. Proteinet DTT-gratis är nu i genomströmmande.
    3. Kontrollera dess koncentrationer (t.ex., använda en UV/Vis-spektrometer) och mäta dess absorbansen vid 280 nm. Beräkna protein koncentrationen med hjälp av Beers lag.
    4. Fördela hälften av proteinet proverna i alikvoter. Inkubera i alikvoter i anaeroba förhållanden (t.ex., med hjälp av en anaerob) i 20 min för en fullständig borttagning av syre. Täta rören med plastfilm och lagra proverna vid-20 ° C eller -80 ° C, beroende på proteinet.
      Obs: I stället för anaerob kammaren, rören kan också flashad med argongas att avlägsna syre.
  2. Beredning av ett fullt oxiderat protein
    Obs: Det rekommenderas att förbereda oxiderat protein prover från fullt reducerat proteiner (beskrivs ovan). Detta kommer att minska heterogenitet i oxidation påstår av cysteines. Det är möjligt att använda olika oxiderande reagenser. här fokuserar vi på väteperoxid (H2O2).
    Undvik alltför oxidation eftersom det kan leda till oönskade intramolekylära disulfide obligationer och oåterkalleliga oxidation av olika aminosyror, inklusive cystein, metionin, tyrosin och andra.
    1. Till resterande protein provet, tillsätt 5 mM H2O2 (nymalen utspätt) och inkubera det för 3 h vid 40 ° C under omskakning.
      Obs: Temperaturen vid detta steg är protein-beroende och bör anpassas till protein stabilitet.
    2. Jämvikta kolonnen med KPI-buffert (40 mM, pH 7.5) genom påfyllning av kolonnen helt med bufferten och låta bufferten rinna ut. Upprepa processen 2 x.
    3. Ta bort vit disk filtret i kolumnen genom att försiktigt trycka det med pincett och ta bort det; Det är enklast att ta bort medan kolumnen är fylld med KPI-bufferten.
    4. Fyll kolonnen med KPI-buffert och centrifugera det 1 000 x g i 3 min.
    5. Flytta kolumnen till en ren rör, tillsätt oxiderat protein provet långsamt till mitten av kolumnen och centrifugera det 1 000 x g i 2 min; det oxiderade proteinet är nu i genomströmmande.
    6. Kontrollera de protein koncentrationerna som i steg 1.2.5, dela de oxiderade proteinerna i alikvoter och lagra dem vid-20 ° C eller -80 ° C, protein-beroende.

2. ljus spridning Aggregation Assay

Obs: Alla koncentrationer i denna analys är förkläde - och substrat-specifika, och bör kalibreras. Alla buffertar bör 0,22 µm-filtrerad, eftersom det är extremt viktigt att buffertarna är fri från partiklar eller luftbubblor och kyvetter är ren och dammfri. Det är mycket viktigt att använda en omrörare som placeras i kvarts kyvetten. Kontrollera olika omrörare storlekar och former för att säkerställa en effektiv blandning av hela lösningen utan att producera oönskade luftbubblor. Dessutom finns olika flouorospectrometers tillgängliga i laboratorier och faciliteter. Här, användes en specifik fluorospectrometer (se Tabell för material). Olika instrument har en varierande känslighet, mätning hastighet och sampler parametrar. Därför bör de exakta mätning parametrarna (t.ex., utsläpp och excitation bandbredd, känslighet och andra) optimeras med hjälp av en känd aggregation-benägen protein och dess motsvarande villkor. Använda citrat synthase (CS) och/eller luciferas som inledande substrat i nanomolar koncentrationer rekommenderas.

  1. Kemiska aggregering assay
    1. Förbereda denaturerat underlaget av ruvande 12 µM CS övernattning i 40 mM HEPES (pH 7,5) och 4,5 M GdnCl. För att bevara pH, lös GdnCl i 40 mM HEPES (pH 7,5).
    2. Öppna programvaran fluorospectrometer och gå till kursen tidmätning. Ställa in parametrar: temperatur: 25 ° C; Λem: 360; EM bandbredd: 5 nm. Λex: 360; Ex bandbredd: 2.5 nm. och Data intervall: 0,5 s.
    3. Förbereda provet genom att lägga till 1 600 µL av 40 mM HEPES en kvarts kyvetten. Infoga kyvetten i provhållaren och låt provet nå önskad temperatur.
    4. Satt omrörningen till 600 rpm och påbörja mätningen tills en originalplan är etablerad. Håll omrörningen på för hela värderingen.
    5. Att mäta CS aggregering i avsaknad av ett förkläde, vid 120 s in i mätningen, lägga till (försiktigt, men snabbt) 10 µL av denaturerat CS (slutlig koncentration 75 nM). Fortsätta mätningen för 1,200 s.
    6. Att mäta CS aggregering i närvaro av Hsp33, på 60 s in i mätningen, lägga till Hsp33 (slutlig koncentration av 300 nM). Efter en ytterligare 60 s, tillsätt 10 µL av denaturerat CS (slutlig koncentration 75 nM). Fortsätta mätningen för 1,200 s.
      Obs: När du lägger den substrat eller förkläde, för att undvika införandet av bubblor, använda 10-µL pipett.
  2. Termiska aggregering assay
    Obs: Temperaturen för termisk aggregering analysen beror på protein stabilitet och bör anpassas till varje protein självständigt.
    1. Öppna programvaran fluorospectrometer och gå till kursen tidmätning. Ställa in parametrar som följer: temperatur: 43 ° C; Λem: 360; Utsläpp bandbredd: 5 nm. Λex: 360; Magnetiseringen bandbredd: 2.5 nm. och Data intervall: 0,5 s.
    2. Förbereda provet genom att lägga till 1 600 µL av pre värmde 40 mM HEPES en kvarts kyvetten. Infoga kyvetten i provhållaren och låt provet nå 43 ° C.
    3. Satt omrörningen till 600 rpm och påbörja mätningen tills en originalplan är etablerad. Håll omrörningen på för hela värderingen.
    4. Att mäta CS aggregering i avsaknad av ett förkläde, vid 120 s in i mätningen, försiktigt lägga till CS (slutlig koncentration av 125 nM) och fortsätta mäta för 1,200 s.
    5. Att mäta CS aggregering i närvaro av Hsp33, på 60 s in i mätningen, lägga till Hsp33 (slutlig koncentration på 600 nM). Efter en ytterligare 60 s, lägga till CS (slutlig koncentration av 125 nM). Fortsätta mätningen för 1,200 s.
      Obs: När du lägger den substrat eller förkläde, undvika införandet av bubblor.
  3. Data analys och buller borttagning av Kfits
    Obs: Kfits är tillgängliga vid användning av Kfits har tidigare beskrivits i Jeanette o.a. 45
    1. Ladda upp filen.
      Obs: Insignalen är rå resultaten från ljusspridning mätningar i en komma- eller tabbavgränsat textformat.
    2. Ta bort buller, välja analysparametrar. Använd Automatisk bästa modell (rekommenderas), markera flaggan buller är alltid över signalen .
    3. Ta manuellt bort uppenbara avskilda med hjälp av de gröna och röda justerbar linjerna; Detta steg kommer att filtrera bruset över gröna linjen och under den röda linjen.
    4. Ställ in baslinjen och fit kurvan. Ladda ner bearbetade data efter tillämpa tröskelvärdet buller.

3. väte-deuterium Exchange masspektrometri

  1. Beredning av buffertar och protein prover (Hsp33 och Hsp33-CS complex)
    1. Späd de protein proverna till en slutlig koncentration av 1 mg/mL i 25 mM Tris-HCl buffert med pH 7,5 och överföra dem till 1,5 mL injektionsflaskor.
    2. Förbereda protein-substrat komplexa prover genom ruvning Hsp33 med CS i förhållandet av 1:1.5 på 43 ° C.
      1. Lägga till CS i en stegvis sätt att undvika någon snabb aggregering och säkerställa en givande bindning mellan Hsp33 och termiskt Övik CS.
      2. Använd minst fyra steg (dvs, varje gång lägger till en fjärdedel av den slutliga volymen) och inkubera proverna för 15 min efter varje tillsats tillåta CS skydd av Hsp33.
    3. Ta bort alla aggregat med en 30-min centrifugering vid 16 000 x g vid 4 ° C.
      Obs: Nya protein-substrat komplex måste vara beredda färska. Substratet tillägg bör göras stegvis. Annars, aggregering uppstår. Temperatur, substrat och substrat koncentrationer är protein-specifika.
    4. Förbered en buffert H (25 mM Tris-HCl, pH 7.5), som fungerar som deuteration kontroll, och en buffert D (25 mM Tris-DCl, pH 7,09), vilket är deuteration bufferten. Förbered också en färsk släcka buffert (150 mM TCEP, 3 M GdnCl, 0,1% myrsyra).
      Obs: Släcka bufferten bör optimeras för proteinet av intresse för att erhålla dess maximal sekvens täckning efter pepsin matsmältningen.
    5. Överföra alla buffertar och prover i injektionsflaskor, och placera dem i rätt fack. Håll buffertar H och D vid 25 ° C (bricka 25 ° C); å andra håll prover och släcka buffert vid 0 - 2 ° C (bricka 0 ° C). Placera proverna i 150-µL glasinsatserna (se Tabell för material) först, och sedan överföra dem till injektionsflaskor.
  2. Beredning av instrumentet
    Obs: Masspektrometer levereras med två medföljande program: en styr pumpar, och den andra masspektrometer (se Tabell för material). Nästa steg kommer att beskrivas med dessa två program.
    1. Aktivera manuellt alla kylaggregat. När alla kylsystem når sina mål temperaturer, växla manuellt på både högpresterande vätskekromatografi (HPLC) och lastning pumpar.
      Obs: I vårt fall, dessa består av två svalkande bad och en kylbox (som innehåller fällan och analytiska kolumner). En kylmaskin kyler facket vid 0 ° C, medan den andra håller facket vid 25 ° C; temperaturen i rutan kyla är 1-2 ° C.
    2. Öppna programvaran som styr både pumpar, liksom den programvara som styr masspektrometer; Kontrollera att MS är på Standby.
    3. Koppla HPLC utloppsventilen från MS källan och tvätta systemet först med en ”triple cleaner”-lösning (1% myrsyra, 33% acetonitril, 33% isopropanol, 33% metanol), sedan med buffert B (80% acetonitril, 0,1% myrsyra) och slutligen med buffert en (0,1% myrsyra, pH 2,25), och sedan infoga kolumnen pepsin i systemet. Om ändra buffertar, se till att rensa både pumpar innan du fortsätter.
    4. Se till att flödet för båda pumpar är 0,1 mL/min och trycket är stabil.
    5. Efter tvättning av systemet med ett jämnt flöde och stadigt tryck, infoga HPLC utlopp i MS källan och aktivera MS.
  3. Masspektrometer parametrar
    1. Ange peptid joniseringen elektrospray jonisering (ESI) vid 175 ° C, slida gasflödet 17, aux gas glöden på 2 och spray spänningen vid 4,5 kV (kompletterande Figur1).
    2. Ställa in parametrar som följer för icke-deutererat prover.
      1. Ställa in parametrar: skanningsområde m/z till 300-1500; Resolution till 70.000; Automatisk gain kontroll mål (AGC) till 106; och den maximala injektion tid (IT) på 100 ms.
        Obs: De 5 mest intensiva jonerna med laddningstillstånd mellan + 2 och + 6 (deras intensitet som är högre än 1,3 x 104) och en dynamisk fönster 30 i kommer att isoleras.
      2. Utföra den ion fragmenteringen av högre energi lett dissociation (HCD) i cellen flera-kollision med normaliserade kollision energi (NCE) lika med 28. Upptäcka fragment joner av tandem MS med en upplösning på 35.000, AGC målet på 105, maximal den på 60 ms och ett isolerat fönster av 2,0 m/z.
    3. För de deutererade proverna, anställa MS1 endast med en högre upplösning på 140 000 och med annars liknande parametrar.
  4. Kör experimentet
    1. Ställ in facken på följande sätt.
      1. Placera buffert H och D i fack 25 ° C och placera prover och släcka buffert i 0 ° C magasinet.
      2. Plats X tomma flaskor, linje i både fack, där X = antalet prov x antalet tidpunkter.
        Obs: I 25 ° C facket, de tomma flaskorna fungera som reaktionskärlen, och fackets 0 ° C, de fungerar som kylning injektionsflaskor.
      3. Var och en av de tomma flaskorna innehåller ett tomt glas skär; Kassera och ersätt sade infoga mellan experiment.
        Obs: För att köra HDX experimentet i det mest effektiva och minst tidskrävande sättet, en programvara som gör prover ska köras samtidigt användes (kompletterande figur 2). Nästa steg kommer att beskrivas med hjälp av denna programvara.
    2. Öppna programvaran. Ställ in programparametrarna att utföra följande.
      1. Inkubera varje prov (5 µL) med 45 µL buffert D i flera minuter, beroende på de tidpunkter som valts (t.ex., 1, 3, 18, 40 och 100 min) vid 25 ° C. Inkubera provet i icke-deutererat 45 µL buffert H istället.
      2. Omedelbart efter inkubering, blanda 50 µL deutererade protein i 50 µL av iskall släcka buffert och injicera dem i en orörlig pepsin kolumn (20 mm i längd, 2,0 mm i diameter).
      3. Eluera någon peptider från kolumnen pepsin i kolumnen före genom tvättning med buffert A 6 min med en hastighet av 50 µL/min. Håll buffert A i rutan kylning vid 0 ° C.
      4. Eluera peptiderna ur kolumnen före in C18 analyskolonnen (C18 kolonnen, 130 Å, 1,7 µm, 2,1 mm x 50 mm, höll vid 0 ° C) och avgränsa dem genom att tillämpa en linjär övertoning acetonitril på 100 µL/min. kör den acetonitril gradient med acetonitril 100% som buffert B : 7 min på 2%, 7 min på 10-30%, 2,5 min vid 30-90%, 1,5 min till 90%, snabb gradient i 1 min 90-8%, och slutligen jämvikta kolonnen för 4 min med 2%.
    3. Bygga en kör sekvens (se kompletterande figur 2): Ange alla tidpunkter, prov namn, och platser i magasinen, samt buffert namn och platser.
      Obs: Programvaran tillåter anpassning av alla de olika rinnande tiderna in i ett program som körs flera prover på en gång, effektivt minskar rinnande tider.
  5. Analys av data
    Obs: Vi arbetar med flera program i processen för analys av data, inklusive Proteomet Discoverer och MaxQuant (fri programvara) för peptid identifiering och analys av sekvens täckning, liksom HDX workbench, en gratis programvara som gör analysen av deuterium inkorporering proteiner och en jämförelse av de HDX mellan olika uppsättningar av experiment. Nästa steg kommer att beskrivas med dessa program.
    1. Analysera peptid täckningen av provet genom att köra de icke-deutererat kontrollproverna via programvaran (kompletterande diagram 3). Ställa in programvaran med följande parametrar.
      1. Använd metoden Sequest HT med en No-enzym (ospecifikt) klyva. Sök efter peptider av 4-144 aminosyror med en massa tolerans på 7 ppm och 0,5 Da för föregångarens ion och fragment. Möjliggöra en dynamisk metionin oxidation.
      2. Skapa en databas för protein, genom vilken programvaran kan avgöra peptid täckningen. Exportera de identifiera peptiderna i textformat.
    2. Analysera deutererade resultaten med de HDX workbench fri programvara58.
      1. Öppna redigeraren för protein och definiera proteinet genom att infoga filen protein sequence och peptid täckning.
      2. Nästa, öppna redigeraren Setup experimentera guiden och ange alla ingångar efterfrågades.
        Obs: Programmet kräver att antalet prover, antalet tidpunkter, antalet replikat, pH av buffertar, och temperaturen.
      3. Slutligen, input parametrar angående den masspektrometer som används, varefter programmet genererar en lista över upptäckta peptider.
        Obs: Programvaran upptäcker ”HDX” peptiderna, inspekterar isotopen kluster och visar en tydlig visualisering av deuteration i proven.
  6. Presentation av data
    1. Etikett regionerna med en vördnad deuteration upptag på struktur med PyMol programvaran eller någon annan visualisering programvara.
    2. Införa deuterium upptag nivåer i stället för värdena som B-faktor.
      Obs: En grundläggande handledning kan hittas på https://pymolwiki.org/index.php/Practical_Pymol_for_Beginners.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

De två metoder som presenteras gör det möjligt att följa den kinetiska aktivitet och dynamiken av proteininteraktioner mellan ett förkläde och dess substrat. Dessutom tillåter protokollet minskning-oxidation utarbetandet av ett fullt reducerat och fullt oxiderat förkläde, ger en mer djupgående förståelse för aktivering mekanism av redox-beroende oordnade chaperones.

Vi använde först, ljusspridning för att undersöka aktiviteten redox-beroende av förkläde. Ljusspridning utfördes på ett kemiskt och termiskt denaturerat CS protein i närvaro av en oxiderad (aktiv) eller nedsatt (inaktiv) förkläde (figur 1). Kemiska denaturering leder till en snabb CS aggregering som induceras av vika av en fullt denaturized protein i unfavorable buffert villkor. Däremot, resultat thermal-inducerad sammanläggning från en relativt långsam unfoldingen av inföding vikta substratet. Därför varierar dessa olika typer av aggregering processer i deras kinetiska parametrar. Dessutom kan olika chaperones varierar i deras förmåga att förhindra aggregering av samma substratet i olika aggregering lägen.

I båda formerna av denaturering, tillägg av oxiderat Hsp33 i en molar förhållandet 1:4 (CS: Hsp33) helt avskaffat aggregering, sänka de 360 nm avläsningarna till försumbar värden. Förekomsten av en reducerad Hsp33, däremot, hade ingen effekt på CS stabilitet och gav en aggregering kurva liknande den som upptäckts i avsaknad av ett förkläde (figur 1). Resultaten analyseras och rengöras från bakgrundsljud som använder Kfits, som schematiskt beskrivs i figur 2.

Skissera av HDX-MS tekniken börjar med inkubering av förkläde med deuteriumoxid, följt av kylning och matsmältningen, och slutligen MS analys och väte-deuterium utbyta profilering (figur 3). Under HDX-MS, var förkläde inkuberas i facket vid 25 ° C i en O-innehållande D2-buffert. Efter en specifik inkubationstid kontrolleras av provet hantering robotsystem, protein lösningen överfördes till släcka lösningen, sura och denatureringen, i facket vid 0 ° C. Lågt pH och låg temperatur saktar väte utbyte och bevarar deuteration nivåerna av alla amide hydrogens, medan denatureringen kemikalien utspelar sig proteinet, gör det möjligt att vara ordentligt rötas. Robotsystem överför provet från facket vid 0 ° C till rutan kylning där det rinner ut i kolumnen online pepsin matsmältningen. Omedelbart efter protein matsmältningen, peptiderna vidare till kolumnen C18-fällan för avsaltning och borttagning snabbt utbytbara D2O (huvudsakligen belägna på side chain atomerna) och separeras då med C18 kolonnen och analyseras med massa spektrometri. Provtagningsflödet styrs av ett två-ventil system, som 1) säkerställer separation av pepsin och C18 kolumn buffertar för att undvika inaktivering av pepsin av organiska lösningsmedel, och 2) gör den kort avsaltning av peptiderna att ta bort fort utbytbara D2O molekyler och salter (figur 4).

Efter den computational analysen får vi en deuteration profil för varje peptid, visar en förändring i massa som funktion av inkubationstiden i D2O. HDX Workbench programvaran tillåter jämförelse av experimentella replikat för att skapa statistiska analyser av varje villkor (t.ex., en aktiv förkläde i ett obundet formulär). Nästa steg är en jämförelse av deuteration kurvor mellan olika prover. exempelvis en bunden förkläde och en obunden förkläde. Dessa jämförelser av olika förkläde stater kan avslöja de strukturella störningar som åtföljer substrat bindande. Rester som uppvisar en långsammare utbyte i bundna tillstånd sannolikt interagerar med en bindande partner. Det är viktigt att notera att minskad väte-deuterium valutakurser kan också indikera en vika i en specifik region vid bindning utan den faktiska direkt interaktionen med substratet (figur 5A). HDX Workbench programvaran tillåter granskning av resultaten i vyn ”störning” genom att Visa deuteration med ett standardfel över täckningen av hela proteinet.

I det här fallet användes HDX-MS att jämföra deuteration mönstret mellan bundna och obundna förkläde Hsp33 till dess substrat CS. Resultaten visar en klient-interaktion webbplats inom domänen C-terminal redox switch av förkläde (figur 5B). Samtidigt reduceras, har Hsp33 en helt beställda struktur, där interaktion webbplatser är begravda. Hsp33 förlorar sin struktur och blir funktionell när den känner av oxidativ stress; Därför jämfört vi de oxiderade och lägre Hsp33 på både bundna och obundna villkor (bild 5C). Resultaten visar att medan den reducerade Hsp33, huruvida bundet eller obundet, producerar liknande peptid kurvor, den oxiderade Hsp33 visar en signifikant skillnad. Oxiderat Hsp33 proverna Visa en 30% deuteration skillnaden mellan bundna och obundna förkläde, med specifika områden av proteinet bundna som anger ett Alloster hinder. Analys av ytterligare peptider från N-terminalen och thermobile linker regionerna visas i kompletterande figur 3.

Figure 1
Figur 1 . Aggregation analys av ljusspridning. Sammanläggning av kemiskt och termiskt denaturerat CS övervakades i närvaro av oxiderat Hsp33 (röd), minskad Hsp33 (blått), eller i avsaknad av förkläde (svart). En ljusspridning på 360 nm övervakades för 1,200 s. (A) under den kemiska aggregeringen, i avsaknad av ett förkläde eller i närvaro av en reducerad Hsp33, CS aggregerade snabbt, når en platå cirka 300 s in mätningen. (B) under den termiska aggregeringen, CS aggregeras successivt i avsaknad av ett förkläde eller i närvaro av en reducerad Hsp33. I båda analyser avskaffas förekomsten av oxiderat Hsp33 helt aggregation, vilket framgick av försumbar 360-nm avläsningar. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 2
Figur 2 . Borttagning av brus och data analys med hjälp av Kfits. I denna panel visas ett schema som sammanfattar data analys och buller avlägsnande av verktyget Kfits , som beskrivs i texten och Jeanette o.a. 45. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.

Figure 3
Figur 3 . Arbetsflödet för den HDX-MS metoden. HDX-MS sysselsätter deutererade lösningsmedel att avgöra den kemiska miljön i amide hydrogens, jämnt fördelade längs ryggraden i proteinet. Proteinet av intresse inkuberas i en deuterating buffert i sin ursprungliga form för specifika tidsperioder, då väte-deuterium utbyte är kylda av sura förhållanden vid en låg temperatur. Proteinet är spjälkas av ett enzym stabil under sura förhållanden, såsom pepsin. Peptiderna är efteråt, avsaltat och separeras i en kort tid för att undvika en tillbaka exchange. Slutligen peptiderna som analyseras av en masspektrometer och deuterium upptaget utvärderas av en analys programvara, till exempel genom de HDX Workbench fri programvara58. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 4
Figur 4. Komponenter i helautomatiska HDX-MS-systemet. (A) Detta Schematisk bild av HDX-MS representerar alla delar av systemet: lastning pumpen och HPLC pumpflödet kontroll buffert och provet överföra inom systemet. Robotsystem innehåller två sprutor och brickor som används för att förbereda deutererade provet och överföra proteinerna till den on-line matsmältning kolumn via den ingående ventilen i rutan kylning (LC fack). Sedan är smält peptiderna riktad till kolumnerna C18 fällan och separation därefter separeras och riktad till masspektrometer. (B) i denna panel visas faktiska HDX systeminställningarna visas som den skapades i labbet. (C), denna panel visar en schematisk presentation av online-matsmältningen och peptid separation fluidic konfigurationen. Matsmältningen och separation systemen har en ventil varje som kan växlas mellan belastning och injicera lägen. Den första ventilen (till vänster) är ansluten till injektionsporten och styrs av pumpen lastning, rikta prover in i kolumnen pepsin använder sura bufferten utan något organiskt lösningsmedel som kan skada pepsin kådan. Provet överförs till rätt ventilen in i kolumnen fällan för att ta bort rester av deuterium samt utbytt snabbt deutererade atomer (främst av de side kedjorna). Efter en kort tvätt för 1-2 min i kolumnen fällan, ventilen ändras dess läge till lasta och provet tvättas i kolumnen C18 separation med hjälp av HPLC-pumpen med ökande koncentrationer av acetonitril. Provet överförs till masspektrometer för en massa analys. Längden på rören är märkta. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 5
Figur 5 . HDX-MS resultat. (A) Resultaten presenteras i deuteration procent över tid per proteinfragment, genereras av programvaran HDX Workbench . Varje diagram visar ett protein prov, antingen oxideras eller minskas och jämför mellan bundna och obundna prover. De peptidfragment som visas här är peptiden YVVITITPSEG hittade i regionen länkare och peptiden LQVMPAQNAQQDDFD hittade i C-terminus. (B) de slutliga resultaten, som presenteras som deuteration skillnaden mellan bundna och obundna komplexen, visar störning per aminosyra. (C), en strukturell modell av Hsp33 förkläde visar deuteration upptag skillnaderna i hela länkare och C-terminal instabila regioner. Denna panel är skapad med programvaran PyMol . Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Supplementary Figure 1
Kompletterande figur 1. Gränssnittet för programmet löpande masspektrometer. Programmet används för att optimera och definiera masspektrometer metodparametrar används för HDX experimentet. Metodparametrarna (i den vänstra panelen) kan sparas i metoden, som är erkänd av andra program. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Supplementary Figure 2
Kompletterande bild 2. Denna figur visar en skärmdump av den programvara som fungerar som en integrationsplattform för robotic provtagningen lämna systemet och systemet för MS-LC. Programvaran optimerar den rinnande tiden av schemaläggningen av HDX experimentet, efter definierade inkubationstiden i deutererade bufferten (blå pilar). Till exempel ovan är ett diagram över 17 körningar av två replikationsförmåga analyser av den Hsp33 varianten STIL, inkuberas i en deutererade buffert i olika tider, från 0 - 100 min. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.

Supplementary Figure 3
Kompletterande bild 3. Denna bild visar en analys av deuterium upptaget av flera Hsp33 peptider från olika Hsp33 varianter, heter PGBD och REV34. Tomterna påvisa förändringar i deuterium upptaget av samma region i Hsp33 i obundna (röd) och bundna (blå) staterna. Peptider från regionen N-terminal visar ingen signifikant skillnad i HDX priset, och fragment från regionen linker visar en signifikant minskning i HDX priser vid samspelet med Övik substratet, citrat-syntas. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

I detta papper föreskrivs vi protokoll analys av redox-beroende förkläde aktivitet och karakterisering av strukturella förändringar vid bindningen av ett protein som klienten. Dessa är kompletterande metoder för att definiera potentiella förkläde-substrat komplex och analysera potentiella interaktion webbplatser.

Här, tillämpat vi dessa protokoll för karakterisering av ett komplex mellan redox-reglerade förkläde Hsp33 med ett väl studerat förkläde substrat CS. Vi presenterade två olika sorters protein aggregering analyser, som skiljer sig i deras kinetiska och inledande tillstånd: under en kemisk denaturering, substratet startar sin pågående process från formuläret denaturerat, medan under en termisk aggregering, den unfolding initieras från native form av substratet.

Ljus-scattering mätningar är ett användbart verktyg för att övervaka den relativa mängden protein aggregering. Medan vi använder den här metoden för att bestämma det aktiva tillståndet av förkläde användas det vidare att studera allmän aggregering villkor, att jämföra stabiliteten i ett annat protein, eller att studera destabiliserande mutationer både i substrat och förkläde.

Trots sin enkelhet, kan metoden ljusspridning producerar bullriga uppgifter, med flera extremvärden. För att lösa problemet, utvecklat vi programvaran Kfits som beskrivs ovan. Kfits programvaran gör det möjligt att enkelt och snabbt ta bort stora mängder bullriga data, samt beräkna kinetiska parametrar från kurvan ljusspridning. Kfits är inte begränsad till protein aggregering och kan tillämpas på någon typ av kinetiska mätningar.

Således, de metoder som beskrivs här är enkel, lätt att utföra och inte tidskrävande. De kan tillämpas på olika molekylära chaperones, aktivera deras redox beroende undersökas inom ett par dagar. Dessutom kan aktiviteten anti aggregering av andra, icke-redox beroende chaperones utvärderas med protokollen beskrivs av ljusspridning och Kfits. Det är viktigt att notera att olika parametrar, såsom temperatur, proteinkoncentration och mättid måste kunna anpassas till varje protein system självständigt.

För att få strukturell information styr ett förkläde som arbetar cykel, presenterade vi den HDX-MS metoden. Till skillnad från förfarandet för ljusspridning, det är en mer komplex teknik och kräver särskilda instrumentering, inklusive en masspektrometer och helst ett robotsystem för provpreparering. Men kan denna inställning fastställas, även utan robotsystem, i en befintlig anläggning. När det är etablerad, förfarandet är relativt enkel och tillåter analys av utmanande proteinkomplex som skulle vara unreached av högupplösta metoder (t.ex., röntgen och NMR).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna har något att avslöja.

Acknowledgments

Författarna är tacksam till Meytal Radzinski för hennes bra diskussioner och kritisk läsning av artikeln och Patrick Griffin och hans lab medlemmar för deras obegränsade hjälp samtidigt fastställa HDX analys plattformen. Författarna är tacksamma att stiftelsen tyska-Israel (I-2332-1149.9/2012), den binationella Science Foundation (2015056), Marie-Curie-integration bidraget (618806), Stiftelsen Israel vetenskap (1765/13 och 2629/16), och Human Frontier Science Program (CDA00064 2014) för sitt finansiella stöd.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Chemicals, Reagents
Acetonitrile HPLC plus Sigma Aldrich 34998-2.5L solvent
Formic acid Optima LC/MS Fisher Chemicals A117-50 solvent supplement
Isopropyl alcohol, HPLC grade Fisher Chemicals P750717 solvent
Methanol Fisher Chemicals A456-212 solvent
Tris(hydroxymethyl)aminomethane Sigma Aldrich 252859 buffer
Trifluoroacetic acid Sigma Aldrich 76-05-1 solvent
Water for HPLC Sigma Aldrich 270733-2.5L-M solvent
ZnCl2, Zinc Chloride Merck B0755416 308 reagent
DTT goldbio 27565-41-9 reducing agent
PD mini trap G-25 columns GE healthcare GE healthcare 29-9180-07 desalting column
Potassium Phosphate United states Biochemical Corporation 20274 buffer
Hydrogen peroxide 30% Merck K46809910526 oxidizing agent
citrate synthase sigma aldrich C3260 substrate
HEPES acid free sigma aldrich 7365-45-9 buffer
Gndcl sigma aldrich G3272-500G denaturant
Deuterium Chloride Solution sigma aldrich 543047-10G buffer
Deuterium Oxide 99% sigma aldrich 151882-100G solvent
TCEP bioworld 42000058-2 reducing agent
150uL Micro-Insert with Mandrel Interior & Polymer Feet, 29*5mm La-Pha-Pack -Thermo Fischer Scientific
1.5mL Clear Short Thread Vial 9mm Thread, 11.6*32mm La-Pha-Pack -Thermo Fischer Scientific
quartz cuvette Hellma 101-QS
Instruments
Jasco FP-8500 Fluorospectrometer Jasco
Thermomixer Comfort Eppendorf 13058/0
Heraeus Megafuge 16R, bench topCentrifuge Thermo Scientific
pH meter , PB-11 sartorius Sartorius 13119/0
AffiPro Immobilized Pepsin column (20mm length, 2.0mm diameter). AffiPro
Waters Pre-column (ACQUITY UPLC BEH C18 VanGuard 130 Å, 1.7um, 2.1mmx5mm) Waters
C18 analytical column (ACQUITY UPLC Peptide BEH c18 Column, 130 Å, 1.7um, 2.1mmx50mm)
Vinyl Anaerobic chamber with Airlock door COY
Q-exactive-orbitrap mass spectrometer Thermo-Fischer Scientific
PAL system LHX - robotic system for handling HDX samples PAL system https://www.palsystem.com/index.php?id=840
Dionex Ultimate 3000, XRS pump Thermo Scientific
Dionex AXP-MS auxiliary pump Thermo Scientific
Software, Software Tools, Database search
Kfits: Fit aggregation Data http://kfits.reichmannlab.com/fitter/
Thermo Scientific Xcalibur software https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/OPTON-30487
Q Exactive MS Series Tune Interface (Tune) https://tools.thermofisher.com/content/sfs/brochures/WS-MS-Q-Exactive-Calibration-Maintenance-iQuan2016-EN.pdf
Chronos software (Axel Semrau) http://www.axel-semrau.de/en/Software/Software+Solutions/Chronos-p-966.html
Proteome Discoverer V1.4 software https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/OPTON-30795
HDX workbench software http://hdx.florida.scripps.edu/hdx_workbench/Home.html

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Wong, H. S., Dighe, P. A., Mezera, V., Monternier, P. A., Brand, M. D. Production of superoxide and hydrogen peroxide from specific mitochondrial sites under different bioenergetic conditions. Journal of Biological Chemistry. 292 (41), 16804-16809 (2017).
  2. Murphy, M. P. How mitochondria produce reactive oxygen species. Biochemical Journal. 417 (1), 1-13 (2009).
  3. Walker, C. L., Pomatto, L. C. D., Tripathi, D. N., Davies, K. J. A. Redox regulation of homeostasis and proteostasis in peroxisomes. Physiological Reviews. 98 (1), 89-115 (2018).
  4. Hohn, A., Konig, J., Jung, T. Metabolic syndrome, redox state, and the proteasomal system. Antioxidants & Redox Signaling. 25 (16), 902-917 (2016).
  5. Holmstrom, K. M., Finkel, T. Cellular mechanisms and physiological consequences of redox-dependent signalling. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 15 (6), 411-421 (2014).
  6. Halliwell, B., Gutteridge, J. M. C. Free radicals in biology and medicine. , Oxford University Press. Oxford, UK. (2007).
  7. He, L., et al. Antioxidants maintain cellular redox homeostasis by elimination of reactive oxygen species. Cellular Physiology and Biochemistry: International Journal of Experimental Cellular Physiology, Biochemistry, and Pharmacology. 44 (2), 532-553 (2017).
  8. Bae, Y. S., Oh, H., Rhee, S. G., Yoo, Y. D. Regulation of reactive oxygen species generation in cell signaling. Molecules and Cells. 32 (6), 491-509 (2011).
  9. Giles, G. I. The redox regulation of thiol dependent signaling pathways in cancer. Current Pharmaceutical Design. 12 (34), 4427-4443 (2006).
  10. Qiao, J., et al. Regulation of platelet activation and thrombus formation by reactive oxygen species. Redox Biology. 14, 126-130 (2018).
  11. Milkovic, L., Siems, W., Siems, R., Zarkovic, N. Oxidative stress and antioxidants in carcinogenesis and integrative therapy of cancer. Current Pharmaceutical Design. 20 (42), 6529-6542 (2014).
  12. Duecker, R., et al. Oxidative stress-driven pulmonary inflammation and fibrosis in a mouse model of human ataxia-telangiectasia. Redox Biology. 14, 645-655 (2018).
  13. Winterbourn, C. C., Kettle, A. J. Redox reactions and microbial killing in the neutrophil phagosome. Antioxidants & Redox Signaling. 18 (6), 642-660 (2013).
  14. Jones, D. P. Redox theory of aging. Redox Biology. 5, 71-79 (2015).
  15. Labunskyy, V. M., Gladyshev, V. N. Role of reactive oxygen species-mediated signaling in aging. Antioxidants & Redox Signaling. 19 (12), 1362-1372 (2013).
  16. Kurian, P., Obisesan, T. O., Craddock, T. J. A. Oxidative species-induced excitonic transport in tubulin aromatic networks: potential implications for neurodegenerative disease. Journal of Photochemistry and Photobiology B: Biology. 175, 109-124 (2017).
  17. Marinelli, P., et al. A single cysteine post-translational oxidation suffices to compromise globular proteins kinetic stability and promote amyloid formation. Redox Biology. 14, 566-575 (2018).
  18. Bozzo, F., Mirra, A., Carrì, M. T. Oxidative stress and mitochondrial damage in the pathogenesis of ALS: new perspectives. Neuroscience Letters. 636, 3-8 (2017).
  19. Lo Conte, M., Carroll, K. S. The redox biochemistry of protein sulfenylation and sulfinylation. Journal of Biological Chemistry. 288 (37), 26480-26488 (2013).
  20. Reichmann, D., Jakob, U. The roles of conditional disorder in redox proteins. Current Opinion in Structural Biology. 23 (3), 436-442 (2013).
  21. Suss, O., Reichmann, D. Protein plasticity underlines activation and function of ATP-independent chaperones. Frontiers in Molecular Biosciences. 2, 43 (2015).
  22. Voth, W., Jakob, U. Stress-activated chaperones: a first line of defense. Trends in Biochemical Sciences. 42 (11), 899-913 (2017).
  23. Segal, N., Shapira, M. HSP33 in eukaryotes - an evolutionary tale of a chaperone adapted to photosynthetic organisms. The Plant Journal. 82 (5), 850-860 (2015).
  24. Dahl, J. U., Gray, M. J., Jakob, U. Protein quality control under oxidative stress conditions. Journal of Molecular Biology. 427 (7), 1549-1563 (2015).
  25. Winter, J., Linke, K., Jatzek, A., Jakob, U. Severe oxidative stress causes inactivation of DnaK and activation of the redox-regulated chaperone Hsp33. Molecular Cell. 17 (3), 381-392 (2005).
  26. Wang, J., Sevier, C. S. Formation and reversibility of BiP protein cysteine oxidation facilitate cell survival during and post oxidative stress. Journal of Biological Chemistry. 291 (14), 7541-7557 (2016).
  27. Zhang, H., et al. Glutathionylation of the bacterial Hsp70 chaperone DnaK provides a link between oxidative stress and the heat shock response. Journal of Biological Chemistry. 291 (13), 6967-6981 (2016).
  28. Jakob, U., Muse, W., Eser, M., Bardwell, J. C. Chaperone activity with a redox switch. Cell. 96 (3), 341-352 (1999).
  29. Muller, A., et al. Activation of RidA chaperone function by N-chlorination. Nature Communications. 5, 5804 (2014).
  30. Voth, W., et al. The protein targeting factor Get3 functions as ATP-independent chaperone under oxidative stress conditions. Molecular Cell. 56 (1), 116-127 (2014).
  31. Moon, J. C., et al. Oxidative stress-dependent structural and functional switching of a human 2-Cys peroxiredoxin isotype II that enhances HeLa cell resistance to H2O2-induced cell death. Journal of Biological Chemistry. 280 (31), 28775-28784 (2005).
  32. Wright, M. A., et al. Biophysical approaches for the study of interactions between molecular chaperones and protein aggregates. Chemical Communications. 51 (51), 14425-14434 (2015).
  33. Haslbeck, M., Vierling, E. A first line of stress defense: small heat shock proteins and their function in protein homeostasis. Journal of Molecular BIology. 427 (7), 1537-1548 (2015).
  34. Rimon, O., et al. A role of metastable regions and their connectivity in the inactivation of a redox-regulated chaperone and its inter-chaperone crosstalk. Antioxidants & Redox Signaling. 27 (15), 1252-1267 (2017).
  35. Daturpalli, S., Kniess, R. A., Lee, C. T., Mayer, M. P. Large rotation of the N-terminal domain of Hsp90 is important for interaction with some but not all client proteins. Journal of Molecular Biology. 429 (9), 1406-1423 (2017).
  36. Rist, W., Graf, C., Bukau, B., Mayer, M. P. Amide hydrogen exchange reveals conformational changes in hsp70 chaperones important for allosteric regulation. Journal of Biological Chemistry. 281 (24), 16493-16501 (2006).
  37. Koldewey, P., Horowitz, S., Bardwell, J. C. A. Chaperone-client interactions: non-specificity engenders multifunctionality. Journal of Biological Chemistry. 292 (29), 12010-12017 (2017).
  38. Reichmann, D., et al. Order out of disorder: working cycle of an intrinsically unfolded chaperone. Cell. 148 (5), 947-957 (2012).
  39. Winter, J., Ilbert, M., Graf, P. C., Ozcelik, D., Jakob, U. Bleach activates a redox-regulated chaperone by oxidative protein unfolding. Cell. 135 (4), 691-701 (2008).
  40. Jakob, U., Eser, M., Bardwell, J. C. Redox switch of Hsp33 has a novel zinc-binding motif. Journal of Biological Chemistry. 275 (49), 38302-38310 (2000).
  41. Ilbert, M., et al. The redox-switch domain of Hsp33 functions as dual stress sensor. Nature Structural & Molecular Biology. 14 (6), 556-563 (2007).
  42. Groitl, B., et al. Protein unfolding as a switch from self-recognition to high-affinity client binding. Nature Communications. 7, 10357 (2016).
  43. Cremers, C. M., Reichmann, D., Hausmann, J., Ilbert, M., Jakob, U. Unfolding of metastable linker region is at the core of Hsp33 activation as a redox-regulated chaperone. Journal of Biological Chemistry. 285 (15), 11243-11251 (2010).
  44. Kumar, A., Mishra, S., Khan, E. Emerging methods for structural analysis of protein aggregation. Protein & Peptide Letters. 24 (4), 331-339 (2017).
  45. Rimon, O., Reichmann, D. Kfits: a software framework for fitting and cleaning outliers in kinetic measurements. Bioinformatics. 34 (1), 129-130 (2018).
  46. Percy, A. J., Rey, M., Burns, K. M., Schriemer, D. C. Probing protein interactions with hydrogen/deuterium exchange and mass spectrometry - a review. Analytica Chimica Acta. 721, 7-21 (2012).
  47. Sinz, A. Divide and conquer: cleavable cross-linkers to study protein conformation and protein-protein interactions. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 409 (1), 33-44 (2017).
  48. Sinz, A., Arlt, C., Chorev, D., Sharon, M. Chemical cross-linking and native mass spectrometry: a fruitful combination for structural biology. Protein Science. 24 (8), 1193-1209 (2015).
  49. Schmidt, C., Beilsten-Edmands, V., Robinson, C. V. Insights into eukaryotic translation initiation from mass spectrometry of macromolecular protein assemblies. Journal of Molecular Biology. 428, 2 Pt A 344-356 (2016).
  50. Marciano, D. P., Dharmarajan, V., Griffin, P. R. HDX-MS guided drug discovery: small molecules and biopharmaceuticals. Current Opinion in Structural Biology. 28, 105-111 (2014).
  51. Mistarz, U. H., Brown, J. M., Haselmann, K. F., Rand, K. D. Probing the binding interfaces of protein complexes using gas-phase H/D exchange mass spectrometry. Structure. 24 (2), 310-318 (2016).
  52. Harrison, R. A., Engen, J. R. Conformational insight into multi-protein signaling assemblies by hydrogen-deuterium exchange mass spectrometry. Current Opinion in Structural Biology. 41, 187-193 (2016).
  53. Brown, K. A., Wilson, D. J. Bottom-up hydrogen deuterium exchange mass spectrometry: data analysis and interpretation. Analyst. 142 (16), 2874-2886 (2017).
  54. Vadas, O., Jenkins, M. L., Dornan, G. L., Burke, J. E. Using hydrogen-deuterium exchange mass spectrometry to examine protein-membrane interactions. Methods in Enzymology. 583, 143-172 (2017).
  55. Zanphorlin, L. M., et al. Heat shock protein 90 kDa (Hsp90) has a second functional interaction site with the mitochondrial import receptor Tom70. Journal of Biological Chemistry. 291 (36), 18620-18631 (2016).
  56. Hvidt, A., Nielsen, S. O. Hydrogen exchange in proteins. Advances in Protein Chemistry. 21, 287-386 (1966).
  57. Roberts, V. A., Pique, M. E., Hsu, S., Li, S. Combining H/D exchange mass spectrometry and computational docking to derive the structure of protein-protein complexes. Biochemistry. 56 (48), 6329-6342 (2017).
  58. Pascal, B. D., et al. HDX Workbench: software for the analysis of H/D exchange MS data. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 23 (9), 1512-1521 (2012).

Tags

Biokemi fråga 136 Chaperones redox-reglerade förkläde Hsp33 ATP-oberoende förkläde protein aggregering väte-deuterium exchange HDX-MS protein aggregation kinetics och analys protein oxidation och reduktion.
Definiera Hsp33's Redox-reglerade förkläde aktivitet och mappning konfirmerande ändringar på Hsp33 med hjälp av väte-deuterium Exchange masspektrometri
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Fassler, R., Edinger, N., Rimon, O., … More

Fassler, R., Edinger, N., Rimon, O., Reichmann, D. Defining Hsp33's Redox-regulated Chaperone Activity and Mapping Conformational Changes on Hsp33 Using Hydrogen-deuterium Exchange Mass Spectrometry. J. Vis. Exp. (136), e57806, doi:10.3791/57806 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter