Bestemmelse af Plasma membran partitionering for perifert forbundet proteiner

Summary

Vi præsenterer her, en protokol for at udføre en kvantitativ analyse af niveauet af plasma-membran association for fluorescently markeret perifert forbundet protein. Metoden er baseret på den beregningsmæssige nedbrydning af membranen og cytoplasmatisk komponent af signal observeret i celler mærket med plasma membran fluorescerende markør.

Abstract

Denne metode giver en hurtig metode til bestemmelse af plasma membran partitionering af enhver fluorescently markeret perifert forbundet protein ved hjælp af profiler af fluorescens intensitet over plasmamembran. Målte fluorescens profiler er monteret af en model for membran og cytoplasma fluorescens distribution langs en linje vinkelret påføres celle periferien. Denne model er konstrueret af fluorescens intensitetsværdierne i reference celler, der udtrykker en fluorescently markeret markør for cytoplasma og med FM 4-64-mærket plasma membran. Metoden kan anvendes til forskellige celletyper og organismer; dog kan kun plasma membraner af ikke-tilstødende celler evalueres. Denne hurtigt mikroskopi-baseret metode er egnet til eksperimenter, hvor der forventes subtile og dynamiske ændringer af plasma membran-associerede markører og skal kvantificeres, f.eks., i analysen af muterede versioner af proteiner, hæmmer behandlinger, og signal transduktion observationer. Metoden er implementeret i en multi-platform R pakke, der er kombineret med en ImageJ makro, der fungerer som en brugervenlig grænseflade.

Introduction

Perifert forbundet plasma-membran proteiner er de centrale komponenter i celle signalering veje. En af deres grundlæggende roller er deres forbigående plasmamembran association og dissociation, hvilket er vigtigt for signaltransduktion mellem plasma membran og cytoplasma. Perifert forbundet plasma Membranproteiner kan fastgøres på plasma membran af lipid ankre (N-myristoylation, S-acylation eller prenylation) eller af lipid bindende domæner (interagere med phosphatidylinositol fosfater, phosphatidic syre, etc.).

Plasma-membran bindende egenskaber af disse proteiner kan blive undersøgt i vivo, f.eks., når en fluorescently mærkede protein er ændret af en site-directed mutagenese af vigtige aminosyrer, eller når det er behandlet med forskellige hæmmere, der påvirker lipid signalering. Fordelinger af perifere plasma Membranproteiner er for det meste bliver vurderet kvalitativt, især i tilfælde, hvor protein omfordeling er indlysende. Metoden præsenteres er optimal for situationer, når protein omfordeling er kun delvis og kvantitativ evaluering er nødvendig. Et hyppigt anvendte tilgang af Hvornår plasmamembran association anslås fra Konfokal laser scanning mikroskopi billeder som et forhold af fluorescens intensiteter på plasma-membran og i cytoplasmaet^1,2, er enkle, men ikke nøjagtig. Fluorescens intensiteter på plasmamembran afspejler en superposition af plasma-membran og cytoplasma signalet på grund af lyset diffraction karakteristisk for særlig fluorescens mikroskopi teknik og optiske elementer bruges³. Derfor, den cytoplasmatisk signal indgår også i regionen membran. Af denne grund, kan ikke FM 4-64 farvning mønster bruges som en maske til en membran signal udvalg⁴. Desuden enkle målinger af membran signal på den position, defineret af FM 4-64 farvning maksimale altid systematisk overvurderer den virkelige plasmamembran signal perifert forbundet plasmamembran protein på grund af superposition af de membran og cytoplasmatisk sammensatte. Maksimalt observerede signaler for fluorescently markeret perifert forbundet proteiner også co lokalisere ikke med maksimalt antal plasmamembran markør (dvs., FM 4-64 styryl farvestof), men er flyttet til cytoplasma. En anden begrænsning er at FM 4-64 emission peak er bredere i forhold til emissionen toppene for grøn fluorescerende proteiner som normal god landbrugspraksis som følge af bølgelængde-afhængighed af lyset diffraction³.

I metoden beskrevet her, er mærket protein signal monteret af to empiriske funktioner beskriver en hypotetisk fordeling af plasma membran og cytoplasma signal, henholdsvis. Dette signal nedbrydning anvendes lineær fluorescens profiler, der anvendes på celleoverfladen vinkelret til plasmamembran i kildebilleder, som er regelmæssige, to-kanals Konfokal sektioner fluorescently markeret protein at udtrykke celler mærket med FM 4-64 farvestof.

Den første funktion anvendes til montering beskriver en diffraktion af en cytoplasma signal udkanten celle. Det er fremstillet af tidligere erhvervede fluorescens-profiler, der blev målt i celler, der udtrykker en cytoplasma protein markør mærket af den samme farvelegeme som plasma membran perifert forbundet protein af interesse. Den anden funktion, der beskriver en diffraktion af et plasma-membran signal er afledt af fluorescens af FM 4-64. Dette signal er for det første tilnærmelse af Gaussisk funktion, der bruges til en omtrentlig modellering af lys diffraktion af en punktkilde. For det andet, er denne model, gyldig til røde FM 4-64 emission, matematisk omdannet til den formular, der er relevante for en emission bølgelængde af farvelegeme anvendes til mærkning af perifert forbundet proteiner af interesse på plasmamembran. Begge funktioner er normaliseret ved maksimal intensitet og middelværdi fra 10% af de højeste værdier for FM 4-64 signal og cytoplasmatisk protein signal, henholdsvis. Af dette signal nedbrydning (ikke-lineære mindste firkantet montering metode), kan forholdet mellem plasma membran og cytoplasma brøkdel af de undersøgte protein vurderes nemt og præcist. Den reelle fysiske dimension af beregnede partitionering koefficient er i rækken af mikrometer, fordi cytoplasmatisk volumetriske koncentration er sammenlignet med overflade koncentration på plasmamembran. Det definerer afstanden fra plasma membran til cytoplasma, inden for hvilke den samme mængde proteiner er lokaliseret i den tilstødende område af plasmamembran. Denne værdi svarer at opdelingen koefficienten K₂ indført tidligere⁵. Metoden er meget hurtig, kræver kun enkelt Konfokal sektioner anskaffes ved hjælp af rutinemæssig Konfokal laser scanning mikroskop, og det beregningsmæssigt krævende ikke. Analyse core er blevet gennemført i en transportabel R pakke og en yderligere ImageJ makro var skrevet at give anskuelighed brugergrænseflade hen til opstille analysen fra de intuitive dialogbokse. Software og mere detaljeret beskrivelse af metoden (offentliggjort tidligere⁶) kan findes på http://kfrserver.natur.cuni.cz/lide/vosolsob/Peripheral/.

Metoden er velegnet til isolerede celler, protoplasts og væv, hvor plasma membran af individuelle celler er tydeligt kan skelnes, udtryk for en fluorescently markeret konstruktion af undersøgt perifert forbundet protein. En farvelegeme kompatibel med FM 4-64 farvning skal bruges. FM 4-64 udsender røde fluorescens; Derfor kan undersøgte protein være markeret af et fluorescens protein med blå, grøn eller gul udledning (f.eks.normal god landbrugspraksis, fælles fiskeripolitik, YFP). Stabil transformation af biologisk materiale anbefales, fordi det giver mulighed for mindre kunstige og mere reproducerbare observationer af protein fordeling. Det er nødvendigt, at den undersøgte protein har en forholdsvis homogen cytoplasmatisk distribution. Lokalisering af en protein i det endoplasmatiske reticulum eller en anden intracellulære membran rum kan producere kunstige resultater.

Derudover skal den samme biologiske materiale udtrykker et cytoplasmatisk markør bruges til sammenligning. Celler kan transformeres ved et gratis chomophore, (det samme som anvendes til perifere protein tagging, fxgratis normal god landbrugspraksis) eller mærket protein af interesse med afskaffet membran bindende kapacitet. Membran bindende kapacitet kan afskaffes, for eksempel ved trimning af membran-bindende domæne eller ved site-directed mutagenese af vigtige aminosyre residuum (fx, websteder for N-myristoylation, S-acylation, eller prenylation, osv.).

For scanning konfokalmikroskopi, skal celler være mærket af en membran markør som FM 4-64 farvestof. Hvis FM 4-64 farvning ikke er egnet til det undersøgte materiale (på grund af interfererende autofluorescence, dårlig farvestof penetration, etc.), kan plasma membran mærkes, for eksempel, af integreret plasma membran proteiner markeret til en passende chomophore ( mCherry, RFP, osv.). Det er vigtigt, at markøren har ubetydelig lokalisering i intracellulære membran rum (endomembranes).

Hvis arbejder med faste prøver og antistoffer, kan fixable analoge FM 4-64FX eller plasma membran mærkning af antistof mod et passende mål bruges. I dette tilfælde er det vigtigt at evaluere resultaterne meget omhyggeligt, fordi fiksering procedurer kan føre til selektiv tab af proteiner fra både cytoplasma og plasmamembran.

Protocol

1. forberedelse af biologisk materiale Forberede biologisk materiale udtrykker den fluorescently mærkede protein af interesse, samt et cytoplasmatisk markør. Følg de procedurer, der er nævnt i indledningen. 2. Konfokal Laser Scanning mikroskopi Pletten materiale udarbejdet i afsnit 1 med FM 4-64 farvestof7. Anvende en farvnings-protokol, der er relevante for den undersøgte materiale. For tobak BY-2 celler, pletten 200 μ…

Representative Results

DREPP10 er en plante-specifikke perifert forbundet plasmamembran protein, der er knyttet til plasma-membran via en N-myristoylation og elektrostatiske interaktion med phosphatidylinositol fosfater11, 12. DREPP blev beskrevet som en komponent af calcium-signalering maskiner i cellen fabrikken og også interagerer med cytoskeleton13,14. I præsentere…

Discussion

Metoden beskrevet her skaber en mere nøjagtig vurdering af plasma membran partitionering for perifert tilknyttede proteiner i forhold til andre metoder baseret på måling af fluorescens intensiteter⁵. Den store forbedring af denne metode er, at det tager hensyn til lys diffraktion og superposition af plasma-membran og cytoplasmatisk signaler. Selv om disse metode resultater er i sammenhæng med resultaterne af en simpel metode baseret på sammenligning af fluorescens intensitet på positionen me…

Materials

FM 4-64	ThermoFisher Scientific	T13320	Plasma membrane dye
Dimethyl sulfoxide	Sigma-Aldrich	D4540 Sigma	Dye solvent
Ordinary equipment (microscopic slides, pipettes, tips, tubes)			Equipment for cell labelling and microscopy
Confocal laser scanning microscope
Ordinary computer