Determinazione della membrana plasmatica di partizionamento per marginalmente-associated Proteins

Summary

Qui, presentiamo un protocollo per eseguire un’analisi quantitativa del livello di associazione di membrana plasmatica per etichetta fluorescente marginalmente-collegata della proteina. Il metodo si basa sulla decomposizione computazionale della membrana e citoplasmatico componente del segnale osservato in cellule identificate con marcatore fluorescente della membrana plasmatica.

Abstract

Questo metodo fornisce un approccio veloce per la determinazione della membrana plasmatica di partizionamento di qualsiasi proteina fluorescente contrassegnati perifericamente associata utilizzando i profili di intensità di fluorescenza attraverso la membrana plasmatica. Profili di fluorescenza misurata sono dotati di un modello per la distribuzione di fluorescenza di membrana e citoplasma lungo una linea applicata perpendicolarmente alla periferia delle cellule. Questo modello è costruito dai valori di intensità di fluorescenza in celle di riferimento che esprime un indicatore fluorescente contrassegnati per citoplasma e con FM 4-64-labeled membrana plasmatica. Il metodo può essere applicato a vari tipi di cellule e organismi; Tuttavia, solo il plasma membrane delle cellule vicine non possono essere valutate. Questo metodo veloce basata su microscopia è adatto per esperimenti, dove sono attesi cambiamenti sottili e dinamici dei marcatori di membrana-collegato e necessità di essere quantificati, per esempio, nell’analisi delle versioni mutanti delle proteine, trattamenti inibitore, e osservazioni di trasduzione del segnale. Il metodo viene implementato in un pacchetto di R multi-piattaforma che è accoppiato con una macro di ImageJ che funge da un’interfaccia user-friendly.

Introduction

Proteine di membrana plasmatica perifericamente associata sono i componenti chiave delle vie di segnalazione delle cellule. Uno dei loro ruoli fondamentali è la loro membrana plasmatica transitoria associazione e dissociazione, che è importante per la trasduzione del segnale tra membrana e citoplasma. Proteine della membrana di plasma perifericamente associata possono essere attaccati sulla membrana plasmatica dagli ancoraggi del lipido (N-miristoilazione, S-acilazione o prenilazione) o dai domini di legame dei lipidi (interagendo con fosfatidilinositolo fosfati, acido fosfatidico, ecc).

Associazione di membrana plasmatica le proprietà di queste proteine possono essere esaminati in vivo, per esempio, quando una proteina fluorescente-tag viene modificata da una mutagenesi sito-diretta di aminoacidi chiave, o quando è trattata con vari inibitori che interessano segnalazione del lipido. Le distribuzioni delle proteine di membrana plasmatica periferici vengono per lo più valutate qualitativamente, soprattutto nei casi, quando re-distribuzione della proteina è ovvio. Il metodo proposto è ottimo per situazioni quando re-distribuzione della proteina è solo parziale e valutazione quantitativa è necessario. Un approccio utilizzato con frequenza di quando associazione della membrana del plasma è stimato da confocale laser scansione immagini di microscopia, come un rapporto di intensità di fluorescenza alla membrana del plasma e nel citoplasma^1,2, è semplice, ma non accurata. Intensità di fluorescenza alla membrana del plasma riflettono una sovrapposizione del segnale al plasma-membrana e citoplasma dovuto la caratteristica di diffrazione della luce per la tecnica di microscopia di fluorescenza particolare ed elementi ottici utilizzati³. Di conseguenza, il segnale citoplasmatico è incluso anche nella regione della membrana. Per questo motivo, modello di macchiatura FM 4-64 non può essere utilizzato come maschera per una membrana segnale selezione⁴. Inoltre, semplici misurazioni del segnale di membrana nella posizione definita da FM 4-64 colorazione massima sempre sistematicamente sopravvalutano il segnale reale-membrana plasmatica della proteina di membrana plasmatica perifericamente associata a causa della sovrapposizione della membrana e citoplasmatico composto. Il numero massimo di segnali osservati per etichetta fluorescente proteine marginalmente associate anche non co-localizza con il massimo del marcatore di membrana plasmatica (cioè, FM 4-64 styryl tintura), ma è spostato verso il citoplasma. Un’altra limitazione è basata sul fatto che la FM 4-64 picco di emissione è più ampia in confronto con i picchi di emissione per proteine verdi fluorescenti come GFP a causa della lunghezza d’onda-dipendenza di diffrazione della luce³.

Nel metodo descritto qui, il segnale di proteine con tag viene montato con due funzioni empiriche che descrivono un’ipotetica distribuzione della membrana plasmatica e segnale di citoplasma, rispettivamente. Questa decomposizione del segnale viene applicata ai profili di fluorescenza lineare che vengono applicati alla superficie delle cellule perpendicolarmente alla membrana plasmatica in immagini sorgente, che sono regolari, due canali sezioni confocale di esprimere la proteina fluorescente-Tag cellule identificate con la tintura di FM 4-64.

La prima funzione di fissaggio descrive una diffrazione di un segnale di citoplasma sul bordo delle cellule. È ottenuto da profili di fluorescenza acquisiti in precedenza che sono stati misurati in cellule esprimenti un citoplasma proteina marker contrassegnati dal cromoforo stesso come la membrana plasmatica marginalmente-collegata della proteina di interesse. La seconda funzione che descrive una diffrazione di un segnale di membrana plasmatica è derivata dalla fluorescenza di FM 4-64. Questo segnale è in primo luogo approssimato di una funzione gaussiana che viene utilizzata per una modellazione approssimativa di diffrazione della luce di una sorgente puntiforme. In secondo luogo, questo modello, valido per l’emissione FM 4-64 rosso, matematicamente è trasformato la forma che è rilevante per una lunghezza d’onda di emissione del cromoforo utilizzato per la codifica delle proteine marginalmente-collegate di interesse alla membrana del plasma. Entrambe le funzioni sono normalizzate di intensità massima e dalla media dal 10% dei valori più alti per segnale FM 4-64 e segnale proteina citoplasmatica, rispettivamente. Da questa decomposizione del segnale (metodo di montaggio quadrato almeno non lineare), il rapporto della membrana plasmatica e la frazione di citoplasma della proteina esaminata può essere stimati con facilità e precisione. La dimensione fisica reale del coefficiente di partizionamento computata è nella gamma di micrometro, poiché concentrazione citoplasmatica volume viene confrontati con superficie concentrazione sulla membrana plasmatica. Definisce la distanza tra la membrana plasmatica e citoplasma, all’interno del quale la stessa quantità di proteine è localizzata come nella zona adiacente della membrana del plasma. Questo valore è equivalente alla divisione coefficiente K₂ introdotto precedentemente⁵. Il metodo è molto veloce, che richiede solo singole sezioni confocale acquisite utilizzando routine laser confocale scansione microscopio, e non è computazionalmente impegnativo. Il nucleo di analisi è stato implementato in un pacchetto portatile R e una macro aggiuntiva di ImageJ è stato scritto per fornire l’interfaccia utente grafica per eseguire l’analisi dalle finestre di dialogo intuitivi. Software e descrizione più dettagliata del metodo (precedentemente pubblicato⁶) può essere trovato alla http://kfrserver.natur.cuni.cz/lide/vosolsob/Peripheral/.

Il metodo è adatto a cellule isolate, protoplasti e tessuti, dove la membrana plasmatica delle cellule individuali è chiaramente distinguibile, esprimendo un costrutto etichetta fluorescente di esaminato proteina perifericamente associata. Un cromoforo compatibile con FM 4-64 colorazione deve essere utilizzato. FM 4-64 emette fluorescenza rossa; di conseguenza, proteina esaminata possa essere contrassegnata da una proteina di fluorescenza con emissione di blu, verde o giallo (ad es., GFP, PCP, YFP). Trasformazione stabile di materiale biologico è raccomandato perché consente osservazioni meno artificiale e più riproducibile della distribuzione della proteina. È necessario che la proteina esaminata ha una distribuzione relativamente omogenea citoplasmatica. La localizzazione di una proteina nel reticolo endoplasmatico o un altro compartimento intracellulare membrana può produrre risultati artificiali.

Inoltre, lo stesso materiale biologico esprimenti un marker citoplasmatico deve essere utilizzato per il confronto. Le cellule possono essere trasformate da un chomophore gratuito (lo stesso utilizzato per la proteina periferica tagging, per esempio, GFP gratuito) o da tagged proteina di interesse con capacità legante membrana abolita. Capacità di legame di membrana può essere abolita, ad esempio, dal taglio del dominio legante membrana o da mutagenesi sito-diretta di residui dell’aminoacido chiave (ad esempio, siti per N-miristoilazione, S-acilazione, o prenilazione, ecc.).

Per microscopia a scansione confocale, le cellule devono essere etichettate da un marcatore di membrana come tintura FM 4-64. Se FM 4-64 colorazione non è adatta al materiale studiato (a causa di autofluorescenza interferente, colorante scarsa penetrazione, ecc.), la membrana plasmatica può essere etichettata, ad esempio, dalla proteina integrale di membrana del plasma etichettata per un appropriato chomophore ( mCherry, RFP, ecc.). È essenziale che il marcatore è trascurabile localizzazione nei compartimenti intracellulari membrana (livello delle endomembrane).

Se si lavora con campioni fissati e gli anticorpi, risolvibile analogica FM 4-64FX o membrana plasmatica etichettatura di anticorpo contro una destinazione appropriata può essere utilizzato. In questo caso, è essenziale per valutare i risultati con molta attenzione perché le procedure di fissaggio possono condurre alla perdita selettiva delle proteine dal citoplasma e membrana plasmatica.

Protocol

1. preparazione del materiale biologico Preparare il materiale biologico che esprimono la proteina fluorescente contrassegnata di interesse, come pure un marker citoplasmatico. Seguire le procedure menzionate nell’introduzione. 2. confocale a scansione Laser Macchiare il materiale preparato in sezione 1 con FM 4-64 tintura7. Applicare un protocollo di colorazione che è appropriato per il materiale studiato. Per le celle di t…

Representative Results

DREPP10 è una proteina specifica pianta perifericamente associata-membrana plasmatica che è associata con la membrana plasmatica tramite un N-miristoilazione e un’interazione elettrostatica con fosfatidilinositolo fosfati11, 12. DREPP è stato descritto come un componente del macchinario di segnalazione del calcio nella cellula vegetale e interagisce anche con il citoscheletro13<s…

Discussion

Il metodo qui descritto genera una stima più accurata della membrana plasmatica di partizionamento per proteine marginalmente associate rispetto ad altri approcci basati sulla misura di intensità di fluorescenza⁵. Il miglioramento notevole di questo metodo è che prende in considerazione la diffrazione della luce e la sovrapposizione di membrana del plasma e i segnali citoplasmatici. Anche se questi risultati del metodo sono in correlazione con i risultati di un metodo semplice, basato sul confr…

Materials

FM 4-64	ThermoFisher Scientific	T13320	Plasma membrane dye
Dimethyl sulfoxide	Sigma-Aldrich	D4540 Sigma	Dye solvent
Ordinary equipment (microscopic slides, pipettes, tips, tubes)			Equipment for cell labelling and microscopy
Confocal laser scanning microscope
Ordinary computer