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Biology

परिधीय रूप से जुड़े प्रोटीन के लिए प्लाज्मा झिल्ली विभाजन का निर्धारण

Published: June 15, 2018 doi: 10.3791/57837
Automatic Translation
1, 1, 1
1Department of Experimental Plant Biology, Faculty of Science, Charles University

ERRATUM NOTICE

Summary

यहां, हम एक के लिए प्लाज्मा-झिल्ली एसोसिएशन के स्तर की एक मात्रात्मक विश्लेषण करने के लिए प्रस्तुत फ्लोरोसेंट-बाह्य टैग के लिए-परिधीय जुड़े प्रोटीन । विधि झिल्ली और cytoplasmic घटक के संकेत की गणना अपघटन पर आधारित है प्लाज्मा झिल्ली फ्लोरोसेंट मार्कर के साथ लेबल कोशिकाओं में मनाया ।

Abstract

इस पद्धति प्लाज्मा झिल्ली के पार प्रतिदीप्ति तीव्रता की प्रोफाइल का उपयोग कर किसी भी फ्लोरोसेंट-टैग की गई बाह्य परिधीय-संबंधित प्रोटीन का निर्धारण के लिए एक तेजी से दृष्टिकोण प्रदान करता है । मापा प्रतिदीप्ति प्रोफाइल एक लाइन के साथ झिल्ली और कोशिका द्रव्य प्रतिदीप्ति वितरण के लिए एक मॉडल द्वारा सज्जित कर रहे है सीधा सेल परिधि के लिए लागू किया । इस मॉडल के संदर्भ कोशिकाओं में प्रतिदीप्ति तीव्रता मूल्यों से निर्मित है कोशिका द्रव्य के लिए एक फ्लोरोसेंट-टैग मार्कर और एफएम 4-64 के साथ-प्लाज्मा झिल्ली लेबल व्यक्त । विधि विभिंन प्रकार के सेल और जीवों के लिए लागू किया जा सकता है; हालांकि, गैर-पड़ोसी कोशिकाओं के केवल प्लाज्मा झिल्ली का मूल्यांकन किया जा सकता है । यह तेजी से माइक्रोस्कोपी आधारित विधि प्रयोगों के लिए उपयुक्त है, जहां प्लाज्मा झिल्ली के सूक्ष्म और गतिशील परिवर्तन-जुड़े मार्करों की उम्मीद है और quantified होने की जरूरत है, उदाहरणके लिए, प्रोटीन के उत्परिवर्ती संस्करणों के विश्लेषण में, अवरोध करनेवाला उपचार, आणि सिग्नल transduction प्रेक्षणे आहेत. विधि एक बहु-प्लेटफ़ॉर्म R पैकेज जो एक उपयोगकर्ता के अनुकूल इंटरफ़ेस के रूप में कार्य करता है एक ImageJ मैक्रो के साथ युग्मित है में लागू किया गया है ।

Introduction

परिधीय-संबंधित प्लाज्मा-झिल्ली प्रोटीन सेल संकेत मार्ग के प्रमुख घटक हैं । उनके मौलिक भूमिकाओं में से एक है उनके क्षणिक प्लाज्मा झिल्ली एसोसिएशन और पृथक्करण, जो प्लाज्मा झिल्ली और कोशिका द्रव्य के बीच संकेत transduction के लिए महत्वपूर्ण है. परिधीय-संबंधित प्लाज्मा झिल्ली प्रोटीन लिपिड लंगर द्वारा प्लाज्मा झिल्ली पर संलग्न किया जा सकता (एन-myristoylation, एस-acylation, या prenylation) या लिपिड बाध्यकारी डोमेन द्वारा (phosphatidylinositol फॉस्फेट, phosphatidic एसिड के साथ बातचीत, आदि) ।

इन प्रोटीन के प्लाज्मा झिल्ली बाध्यकारी गुण vivo मेंजांच की जा सकती है, उदाहरणके लिए, जब एक फ्लोरोसेंट-टैग प्रोटीन एक साइट द्वारा संशोधित किया गया है कुंजी अमीनो एसिड का निर्देश mutagenesis, या जब यह विभिंन अवरोधकों के साथ व्यवहार किया जाता है प्रभावित लिपिड सिग्नलिंग. परिधीय प्लाज्मा झिल्ली प्रोटीन के वितरण ज्यादातर गुणात्मक मूल्यांकन किया जा रहा है, विशेष रूप से मामलों में, जब प्रोटीन पुनः वितरण स्पष्ट है । प्रस्तुत विधि स्थितियों के लिए इष्टतम है जब प्रोटीन पुनः वितरण केवल आंशिक और मात्रात्मक मूल्यांकन आवश्यक है । के एक बार इस्तेमाल किया दृष्टिकोण जब प्लाज्मा झिल्ली एसोसिएशन से अनुमान है फोकल लेजर प्लाज्मा में प्रतिदीप्ति तीव्रता के अनुपात के रूप में माइक्रोस्कोपी छवियों स्कैनिंग-झिल्ली और कोशिका द्रव्य1,2में, सरल है, लेकिन नहीं सटीक. प्लाज्मा झिल्ली में प्रतिदीप्ति तीव्रता विशेष प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपिक तकनीक और ऑप्टिकल तत्वों के लिए प्रकाश विवर्तन विशेषता के कारण प्लाज्मा-झिल्ली और कोशिका द्रव्य संकेत के एक superposition को प्रतिबिंबित3। नतीजतन, cytoplasmic संकेत झिल्ली क्षेत्र में भी शामिल है । इस कारण से, एफएम 4-64 धुंधला पैटर्न एक झिल्ली संकेत चयन4के लिए एक मुखौटा के रूप में इस्तेमाल नहीं किया जा सकता । इसके अलावा, एफएम 4-64 धुंधला अधिकतम द्वारा परिभाषित स्थिति पर झिल्ली संकेत की सरल माप हमेशा व्यवस्थित रूप से से जुड़े प्लाज्मा-झिल्ली प्रोटीन के superposition के कारण की वास्तविक प्लाज्मा-झिल्ली संकेत का अनुमान लगाना झिल्ली और cytoplasmic यौगिक । के लिए देखा संकेतों की अधिकतम फ्लोरोसेंट-टैग की गईं बाह्य उपकरणों से जुड़े प्रोटीन भी सह नहीं करता है प्लाज्मा झिल्ली मार्कर (यानी, एफएम 4-64 styryl डाई) की अधिकतम के साथ, लेकिन कोशिका द्रव्य की ओर स्थानांतरित कर दिया है । एक और सीमा तथ्य यह है कि एफएम 4-64 उत्सर्जन चोटी इस तरह के रूप में हरी फ्लोरोसेंट प्रोटीन के लिए उत्सर्जन चोटियों के साथ तुलना में व्यापक है पर आधारित है GFP तरंग दैर्ध्य-प्रकाश विवर्तन3की निर्भरता के कारण ।

यहां वर्णित विधि में, चिह्नित प्रोटीन संकेत दो अनुभवजंय प्लाज्मा झिल्ली और कोशिका द्रव्य संकेत, क्रमशः के एक काल्पनिक वितरण का वर्णन कार्यों से सज्जित है । यह संकेत अपघटन रैखिक प्रतिदीप्ति प्रोफाइल है कि स्रोत छवियों, जो नियमित रूप से कर रहे है में प्लाज्मा झिल्ली को सीधा सेल सतह पर लागू कर रहे है करने के लिए लागू किया जाता है, दो चैनल के फोकल वर्गों फ्लोरोसेंट-टैग प्रोटीन व्यक्त एफएम 4-64 डाई के साथ लेबल कोशिकाओं ।

फिटिंग के लिए इस्तेमाल किया पहला समारोह सेल एज पर एक कोशिका द्रव्य संकेत के एक विवर्तन का वर्णन करता है । यह पहले से प्राप्त की है प्रतिदीप्ति प्रोफाइल है कि एक कोशिका द्रव्य प्रोटीन प्लाज्मा झिल्ली के रूप में एक ही chromophore द्वारा टैग मार्करों को व्यक्त की कोशिकाओं में मापा गया है परिधीय-ब्याज के जुड़े प्रोटीन । दूसरा समारोह एक प्लाज्मा-झिल्ली संकेत के एक विवर्तन का वर्णन एफएम 4-64 के प्रतिदीप्ति से ली गई है । यह संकेत सबसे पहले एक गाऊसी समारोह है कि एक बिंदु स्रोत के प्रकाश विवर्तन के एक अनुमानित मॉडलिंग के लिए इस्तेमाल किया जा रहा द्वारा अनुमानित है । दूसरे, इस मॉडल, लाल एफएम 4-64 उत्सर्जन के लिए मांय है, गणितीय रूप है कि chromophore के एक उत्सर्जन तरंग दैर्ध्य के लिए प्रासंगिक प्लाज्मा झिल्ली में रुचि के परिधीय-संबद्ध प्रोटीन की टैगिंग के लिए प्रयोग किया जाता है के लिए उपयुक्त है बदल गया है । दोनों कार्यों को अधिकतम तीव्रता से और एफएम 4-64 संकेत और cytoplasmic प्रोटीन संकेत, क्रमशः के लिए उच्चतम मूल्यों का 10% से मतलब द्वारा सामान्यीकृत हैं । इस संकेत अपघटन द्वारा (गैर रेखीय कम वर्ग फिटिंग विधि), प्लाज्मा झिल्ली के अनुपात और जांच प्रोटीन के कोशिका द्रव्य अंश आसानी से और सही अनुमान लगाया जा सकता है । गणना विभाजन गुणांक के वास्तविक भौतिक आयाम माइक्रोमीटर की श्रेणी में है, क्योंकि cytoplasmic मात्रा एकाग्रता प्लाज्मा झिल्ली पर सतह एकाग्रता के साथ तुलना में है । यह कोशिका द्रव्य के लिए प्लाज्मा झिल्ली से दूरी को परिभाषित करता है, जिसके भीतर प्रोटीन की एक ही राशि प्लाज्मा झिल्ली के आसन्न क्षेत्र में के रूप में स्थानीयकृत है । यह मान विभाजन गुणांक K2 पहले5पेश करने के लिए समतुल्य है । विधि बहुत जल्दी है, केवल एक ही फोकल वर्गों नियमित फोकल लेजर स्कैनिंग माइक्रोस्कोप का उपयोग कर अधिग्रहीत की आवश्यकता होती है, और यह गणना की मांग नहीं है । विश्लेषण कोर एक पोर्टेबल R पैकेज में लागू किया गया है और एक अतिरिक्त ImageJ मैक्रो विश्लेषण सहज ज्ञान युक्त संवाद से चलाने के लिए ग्राफ़िकल यूज़र इंटरफ़ेस प्रदान करने के लिए लिखा गया था । सॉफ्टवेयर और विधि का अधिक विस्तृत विवरण (पहले6प्रकाशित) http://kfrserver.natur.cuni.cz/lide/vosolsob/Peripheral/पर पाया जा सकता है ।

विधि पृथक कोशिकाओं के लिए उपयुक्त है, protoplasts, और ऊतकों, जहां व्यक्तिगत कोशिकाओं के प्लाज्मा झिल्ली स्पष्ट रूप से अलग है, एक फ्लोरोसेंट-टैग व्यक्त की जांच की परिधीय रूप से जुड़े प्रोटीन का निर्माण । एक एफएम 4-64 धुंधला के साथ संगत chromophore इस्तेमाल किया जाना चाहिए । एफएम 4-64 लाल प्रतिदीप्ति उत्सर्जन करता है; इसलिए, प्रोटीन की जांच की, नीले, हरे या पीले उत्सर्जन के साथ एक प्रतिदीप्ति प्रोटीन द्वारा टैग किया जा सकता है (जैसे, GFP,, YFP) । जैविक सामग्री के स्थिर परिवर्तन की सिफारिश की है क्योंकि यह प्रोटीन वितरण के कम कृत्रिम और अधिक reproducible टिप्पणियों को सक्षम बनाता है । यह आवश्यक है कि जांच प्रोटीन एक अपेक्षाकृत सजातीय cytoplasmic वितरण किया है । endoplasmic जालिका या अंय intracellular झिल्ली डिब्बे में एक प्रोटीन का स्थानीयकरण कृत्रिम परिणाम उत्पादन कर सकते हैं ।

इसके अतिरिक्त, एक ही जैविक सामग्री एक cytoplasmic मार्कर व्यक्त तुलना के लिए इस्तेमाल किया जाना चाहिए । कोशिकाओं को एक मुक्त chomophore द्वारा रूपांतरित किया जा सकता है (परिधीय प्रोटीन टैगिंग के लिए इस्तेमाल के रूप में ही, जैसे, मुक्त GFP) या द्वारा समाप्त झिल्ली बाध्यकारी क्षमता के साथ ब्याज की टैग प्रोटीन । झिल्ली बाध्यकारी क्षमता को समाप्त किया जा सकता है, उदाहरण के लिए, झिल्ली की छंटनी द्वारा-बाध्यकारी डोमेन या साइट द्वारा निर्देशित mutagenesis कुंजी एमिनो एसिड residua के (जैसे, एन के लिए साइटें-myristoylation, S-acylation, या prenylation, आदि) ।

फोकल स्कैनिंग माइक्रोस्कोपी के लिए, कोशिकाओं एफएम 4-64 डाई की तरह एक झिल्ली मार्कर से लेबल किया जाना चाहिए. यदि एफएम 4-64 धुंधला अध्ययन सामग्री के लिए उपयुक्त नहीं है (autofluorescence हस्तक्षेप, गरीब डाई प्रवेश, आदिके कारण), प्लाज्मा झिल्ली उदाहरण के लिए, लेबल किया जा सकता है, अभिंन प्लाज्मा झिल्ली प्रोटीन द्वारा एक उपयुक्त chomophore के लिए टैग ( mCherry, आरएफपी, आदि) । यह मार्कर intracellular झिल्ली डिब्बों (endomembranes) में नगण्य स्थानीयकरण है कि आवश्यक है.

यदि निश्चित नमूनों और एंटीबॉडी के साथ काम करना, fixable एनालॉग एफएम 4-64FX या प्लाज्मा झिल्ली लेबलिंग एंटीबॉडी द्वारा एक उचित लक्ष्य के खिलाफ इस्तेमाल किया जा सकता है । इस मामले में, यह बहुत सावधानी से परिणाम का मूल्यांकन करने के लिए आवश्यक है क्योंकि निर्धारण प्रक्रियाओं कोशिका द्रव्य और प्लाज्मा झिल्ली दोनों से प्रोटीन के चयनात्मक नुकसान के लिए नेतृत्व कर सकते हैं ।

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Protocol

1. जैविक सामग्री तैयार करना

  1. जैविक ब्याज की फ्लोरोसेंट टैग प्रोटीन, साथ ही एक cytoplasmic मार्कर व्यक्त सामग्री तैयार करते हैं । परिचय में उल्लिखित प्रक्रियाओं का पालन करें ।

2. फोकल लेजर स्कैनिंग माइक्रोस्कोपी

  1. धुंधला एफएम 4-64 डाई7के साथ 1 धारा में तैयार सामग्री ।
    1. एक दाग प्रोटोकॉल है कि अध्ययन सामग्री के लिए उपयुक्त है लागू करें । द्वारा तंबाकू के लिए-2 कोशिकाओं, दाग २०० μL सेल निलंबन के ०.२ μL के साथ 10 मिमी एफएम 4-64 dimethylsulfoxide में समाधान.
      नोट: एफएम 4-64 डाई के ठेठ धुंधला एकाग्रता के बारे में 10 माइक्रोन dimethylsulfoxide में 10 मिमी स्टॉक समाधान का उपयोग कर रहा है । उचित धुंधला के लिए एफएम 4-64 की सबसे कम संभव एकाग्रता का प्रयोग करें और बर्फ (एफएम 4-64 और कम तापमान प्लाज्मा झिल्ली गुणों को प्रभावित कर सकते हैं) पर कोशिकाओं गर्मी नहीं है । फोकल माइक्रोस्कोपी तुरंत का उपयोग अवलोकन के साथ जारी रखें । धुंधला और छवि अधिग्रहण के बीच अंतराल 10 मिनट से अधिक नहीं होना चाहिए; अंयथा, डाई के endocytosis एफएम 4-64 दाग को प्रभावित करेगा ।
    2. लगातार कई नमूनों की प्रक्रिया, और प्रयोग की शुरुआत में सभी नमूनों दाग नहीं है ।
  2. एक सेल प्रति एक इक्वेटोरियल फोकल खंड पर कब्जा ।
    1. एक अनुक्रमिक दो चैनल प्रोटीन टैग के रूप में इस्तेमाल किया chromophore के लिए स्कैनिंग सेट (पहले चैनल में होना चाहिए) और एफएम 4-64 (दूसरे चैनल में होना चाहिए) । एक उच्च ऑप्टिकल संकल्प सेट (10-20 पिक्सल/ एक उदाहरण सेट अप: 63X तेल विसर्जन उद्देश्य, एनए १.३, छवि आकार १,०२४ x १,०२४ पिक्सल । प्लाज्मा झिल्ली विमान अधिग्रहीत छवियों में फोकल-खंड विमान के लिए सीधा है कि यह सुनिश्चित करें ।
    2. आंकड़ा मूल्यांकन के लिए पर्याप्त डेटा है (प्रसंस्कृत सामग्री में संकेत परिवर्तनशीलता पर निर्भर करता है) के लिए नमूना प्रति कम से कम 20 कोशिकाओं पर कब्जा.

3. आवश्यक सॉफ्टवेयर स्थापना

  1. फिजी ImageJ वितरण8और आवश्यक मैक्रो पेरिफेरल स्थापित करें ।
    1. साइट https://fiji.sc/#download से सॉफ्टवेयर डाउनलोड करें, और उंहें unpacking द्वारा स्थापित करें ।
    2. फिजी "ImageJ (. exe)" फ़ाइल में unpacked "फिजी. app" निर्देशिका पर डबल-क्लिक करके प्रारंभ करें ।
    3. कोई मैक्रो "पेरिफेरल" को निंन साइट से डाउनलोड करें:
      http://kfrserver.natur.cuni.cz/lide/vosolsob/Peripheral/source/Peripheral_.ijm ।
    4. फिजी में, Plugins का चयन करें । मैक्रोज़ । स्थापित करें .. । मुख्य मेनू में और डाउनलोड की गई फ़ाइल के लिए पथ निर्दिष्ट करें "Peripheral_. ijm."
      नोट: स्थापित मैक्रो "परिधीय" के दो नए उपकरण फिजी टूलबार में दिखाई देंगे: "प्रोफाइल टूल ले लो" और "परिधीय प्रोटीन मेनू."
  2. आर परियोजना सॉफ्टवेयर9और आवश्यक संकुल स्थापित करें ।
    1. r-प्रोजेक्ट स्थापना के लिए साइट https://cloud.r-project.org/पर दिए गए निर्देशों का पालन करें ।
      नोट: समग्र विश्लेषण फिजी में किया जाएगा । आर सॉफ्टवेयर केवल आंतरिक फिजी स्थूल "परिधीय" द्वारा गणना के दौरान कहा जाएगा ।
    2. भागो आर जीयूआई, संकुल का चयन करें । पैकेज (s) स्थापित करें.. । मुख्य मेनू में, और स्थापना के लिए निकटतम भंडार और पैकेज "ggplot2" निर्दिष्ट करें ।
      नोट: वैकल्पिक रूप से, R आदेश-पंक्ति के लिए टाइप करें: install. पैकेजेज़ ("ggplot2") ।
    3. गंतव्य से एक आर पैकेज परिधीय डाउनलोड करें: http://kfrserver.natur.cuni.cz/lide/vosolsob/Peripheral/source/peripheral_latest.tar.gz । संकुल का चयन करके उंहें स्थापित करें । स्थानीय फ़ाइलों से पैकेज (s) स्थापित करें...।
      नोट: वैकल्पिक रूप से, R आदेश-पंक्ति इस आदेश को केवल टाइप करें:
      install. संकुल ("http://kfrserver.natur.cuni.cz/lide/vosolsob/Peripheral/source/peripheral_latest.tar.gz", रेपो = नल, प्रकार = "स्रोत") ।

4. फिजी में छवि विश्लेषण

  1. cytoplasmic मार्कर के फोकल छवियों की प्रक्रिया ।
    1. फिजी Plugins का उपयोग करने के लिए छवियां आयात करें । जैव प्रारूपों । डिफ़ॉल्ट सेटिंग्स के साथ फिजी मेनू से जैव प्रारूपों आयातक ।
    2. जांचें कि क्या जैव-स्वरूप आयातक ने छवि अंशांकन को ठीक से पहचाना है । ऊपरी बाएँ जानकारी फ़ील्ड छवि विंडो में दिखाए गए चित्र आयाम मूल चित्र आयाम के बराबर होना चाहिए ।
    3. गलत आयामों के साथ अनुचित तरीके से नपे छवियों का इलाज व्यक्तिगत रूप से, उदाहरणके लिए, संवाद विंडो विश्लेषण में सही मापदंडों की स्थापना । स्केल सेट करें.. । फिजी मेनू से: पिक्सल में पिक्सेल क्षेत्र में दूरी और ज्ञात दूरी क्षेत्र में उचित लंबाई इकाई में वास्तविक चौड़ाई में छवि चौड़ाई भरें) ।
      नोट: यदि Leica एलसी LEI फ़ाइलें गलत तरीके से तुले हुए हैं, तो चरण 4.2.1 का पालन करें ।
  2. किसी विश्लेषण सेट-अप के लिए आयात विकल्प मैक्रो चलाएं । मैक्रो को तीन भिंन तरीकों में से एक करके सक्रिय करें: चुनें प्लगइंस । मैक्रोज़ । आयात विकल्प [f1] मुख्य फिजी मेनू में, मेनू उपकरण परिधीय प्रोटीन मेनूपर क्लिक करने के बाद एक ही आइटम का चयन करें, या कुंजीपटल लघु कट f1 दबाएँ. लाया गया मैक्रो संवाद विंडो में पैरामीटर सेट करें ।
    1. Leica एलसी lei स्वरूप के मामले में, Leica. LEI छवियों को सक्रिय करके अनुचित अंशांकन का समाधान चेक बॉक्स । यह विकल्प ठीक से छवि आयाम फ़ाइल "lei" एक्सटेंशन के साथ आयात करता है ।
    2. क्षेत्र गाऊसी धुंधला त्रिज्या (पिक्सल)में उचित मूल्य निर्धारित करें । इस चित्र चिकनी और शोर में कमी को प्रभावित करता है । एक कम मूल्य (1 पिक्सल) पर्याप्त है और किसी भी छवि जानकारी हानि का कारण नहीं है ।
    3. फ़ील्ड प्रोफ़ाइल रेखा चौड़ाई (पिक्सेल)में कोई मान सेट करें । एक मोटा लाइन प्रोफ़ाइल curves के उच्च स्मूथिंग का कारण बनता है । एक डिफ़ॉल्ट मान 10 पिक्सेल अनुशंसित है ।
    4. एक छवि शीर्षक "नमूना सीमांकक" और "निर्यातित आइटम." की परिभाषा द्वारा पार्सिंग सेट करें
      नोट: एक छवि शीर्षक (विस्तार के बिना फ़ाइल नाम, उदा.: "experiment-1_line-02_cell-11") को " नमूना सीमांकक" (उदा.: "-_") में सूचीबद्ध सभी वर्णों को आइटम के एक सेट में विभाजित किया जाएगा ("प्रयोग", "1", " पंक्ति "," 02 "," कक्ष ", और" 11 ") जो निम्न विश्लेषण में कारक (नमूना, कक्ष, रेखा, या उपचार पहचान) समूहीकरण के रूप में उपयोग किया जा सकता है । निर्दिष्ट करें कि कौन-से आइटंस का उपयोग उनके अनुक्रम संख्या ("0" को पहले आइटम के लिए) में दायर "निर्यात किए गए आइटम" में लिख कर किया जाएगा । रिक्ति-सीमांकित स्वरूप का उपयोग करें, उदा., "३ ५." इस उदाहरण में, आइटंस "02" और "11" को "Fac_0" और "Fac_1" नामक समूहीकरण कारक के रूप में संदर्भित किया जाएगा । साथ ही, प्रत्येक माप की पहचान करने के लिए "i" कारक के रूप में संदर्भित किया जाएगा ।
    5. वैकल्पिक रूप से, नमूना सीमांकक को खाली रखें और पूर्ण छवि शीर्षक रखे जा सकते हैं, तो 0 निर्यात किए गए आइटम्स में दर्ज करें ।
    6. Windows कार्रवाई सिस्टम पर, जांचें कि आर सॉफ़्टवेयर का पथ सही रूप से स्वत:-पता लगाया जाएगा r. exe करने के लिए फ़ील्ड पथमें । अंयथा, सिस्टम में R. exe फ़ाइल का पूरा पथ निर्दिष्ट करें (उदा., "C:\Program Files\R\bin\R.exe") ।
    7. ठीकक्लिक करें । अगले संवाद विंडो में शीर्षक पार्सिंग की जांच करें और रीसेट करने के लिए ठीक या वापस क्लिक करे ।
      नोट: सभी तस्वीरें स्वचालित रूप से चिकनी और अंततः reतुले हो जाएगा । सभी निर्यात किए गए समूहीकरण कारकों की एक सूची परिणाम विंडो में प्रदर्शित किया जाएगा ।
  3. संसाधित छवियों में प्लाज्मा झिल्ली क्षेत्र भर में एक रैखिक चयन करते हैं और प्रतिदीप्ति प्रोफाइल को मापने.
    1. फिजी उपकरण पट् टी से फिजी टूल सीधी रेखा का चयन करें । छवि पर क्लिक करें और प्लाज्मा झिल्ली क्षेत्र भर में एक लाइन खींचें । लाइन extracellular अंतरिक्ष में शुरू करना चाहिए और प्लाज्मा झिल्ली को सीधा किया जाना चाहिए । cortical कोशिका द्रव्य की एक मोटी और अधिक सजातीय परत के साथ क्षेत्रों का चयन करें । रैखिक चयन की इष्टतम लंबाई 5-10 माइक्रोन है ।
    2. ले प्रोफ़ाइल मैक्रो द्वारा analogical विधि के रूप में चरण ४.२ (शॉर्टकट "x") या क्लिक करके चलाएं प्रोफ़ाइल उपकरण में फिजी उपकरण पट्टी । दोनों चैनलों में प्रतिदीप्ति प्रोफाइल का स्वत: माप किया जाएगा और डेटा परिणाम विंडो में प्रदर्शित किया जाएगा ।
    3. यदि "x" कुंजी का उपयोग उपयोगकर्ता-बेपरवाह माना जाता है, मैक्रो स्रोत फ़ाइल Peripheral_. ijm पाठ संपादक में, बदलें "x" प्रतीक पंक्ति ' मैक्रो में ' ले प्रोफ़ाइल [x] "{' एक अधिक अनुकूल प्रतीक (जो फिजी वातावरण में एक के रूप में उपयोग नहीं किया जाता है के साथ सक्रिय कुंजीपटल शॉर्ट-कट) और फ़ाइल सहेजें । मैक्रो (चरण 3.1.4) को पुनर्स्थापित करें और विश्लेषण छवि आयात से प्रारंभ करें ।
    4. व्यक्तिगत संकेत परिवर्तनशीलता के अनुसार, प्रत्येक सेल के लिए प्रोफाइल के प्रतिनिधि संख्या ले लो ।
    5. फ़ाइल के माध्यम से डेटा सहेजें । इस रूप में सहेजें...। हमेशा "csv" एक्सटेंशन का उपयोग करें; यह उचित डेटा स्वरूप के लिए आवश्यक है ।
  4. मापा प्रोफाइल के चित्रमय दृश्य के लिए भूखंड प्रोफ़ाइल डेटा मैक्रो (शॉर्ट-कट F5) चलाएँ. लाया गया मैक्रो संवाद विंडो में पैरामीटर सेट करें ।
    1. चेक-बॉक्स का उपयोग इनपुट डेटा के लिए फ़िल्टरिंग रखें? अचयनित ।
    2. निर्दिष्ट करें कि उचित रेडियो बटन पर क्लिक करके किसी एकल csv फ़ाइल से या निर्दिष्ट निर्देशिका में सभी csv फ़ाइलों से, परिणाम विंडो में हाल के डेटा से प्लॉट बनाया जाना चाहिए ।
      नोट: यदि प्लॉट हाल के परिणामों से बनाया गया है, तो डेटा पहले सहेजा जाएगा (इसरूप में सहेजें ... संवाद स्वचालित रूप से सक्रिय हो जाएगा).
    3. निर्दिष्ट करें कि उपयुक्त चेक-बॉक्स का चयन करके प्लॉटिंग के लिए कौन से समूहीकरण कारकों का उपयोग किया जाएगा । यदि सभी प्रोफ़ाइल्स को अद्वितीय प्लॉट में प्रदर्शित किया जाना चाहिए, तो "i." फ़ैक्टर का चयन करें । यदि सभी डेटा किसी एकल प्लॉट में प्लॉट कर देना चाहिए, तो चेक-बॉक्स अचयनित रखें ।
      चेतावनी: एक समूहीकरण फ़ैक्टर संसाधित परिणाम में मौजूद नहीं है जो का चयन करना प्लॉट निर्माण के दौरान त्रुटि होती है ।
    4. किसी प्लॉट को फ़ील्ड आउटपुट फ़ाइल उपसर्ग में सहेजते समय फ़ाइल का नाम निर्दिष्ट करें और प्लॉट छवि आयाम को फ़ाइलें प्लॉट उच्च और प्लॉट चौड़ाईमें परिभाषित करे ।
      नोट: परिणामी प्लॉट किसी स्रोत डेटा निर्देशिका में PNG फ़ाइल के रूप में सहेजा जाएगा ।
    5. pdf आउटपुट का चयन करें? यदि एक अतिरिक्त pdf आउटपुट उत्पादन किया जा सकता है चेक बॉक्स ।
    6. ठीकक्लिक करें । अगले संवाद विंडो में डेटा आयात के लिए परिणाम या अंतत: सहेजने का पथ निर्दिष्ट करें । संवाद windows प्रदर्शन R कोड दिखा रहा है में ठीक क्लिक करके विश्लेषण की पुष्टि करें ।
      नोट: प्लॉट एक नई छवि विंडो में खोला जाएगा और R विश्लेषण आउटपुट पाठ विंडो में सूचीबद्ध किया जाएगा ।
  5. यदि कुछ प्लॉट किए गए प्रोफ़ाइल में extracellular स्थान (टैग की गई प्रोटीन के लिए) या intracellular स्थान (एफएम 4-64 संकेत के लिए) में अत्यधिक संकेतों है, तो प्रोफ़ाइल फ़िल्टर सेटअप मैक्रो को चलाएं । इनवोक मैक्रो संवाद विंडो में पैरामीटर सेट कर का पालन करें ।
    नोट: फ़िल्टरिंग निर्दिष्ट x-निर्देशांकों पर अधिकतम अनुमत तीव्रता थ्रेशोल्ड के अनुसार खराब प्रोफ़ाइल को निकालने में सक्षम करता है ।
    1. प्रत्येक चैनल के लिए, फ़ाइल में उपयुक्त तीव्रता थ्रेशोल्ड एक अत्यधिक extracellular (intracellular) संकेत के साथ माप निकालेंसेट करें । वह क्षेत्र निर्दिष्ट करें जहां x-निर्देशांक निचले (अधिक से अधिक) परफ़ील्ड में तीव्रता थ्रेशोल्ड लागू किया जाएगा ।
    2. प्लॉट प्रोफ़ाइल डेटा मैक्रो (चरण ४.४) फिर से चलाएं चेक-बॉक्स इनपुट डेटा के लिए फ़िल्टरिंग का उपयोग करें? चयनित; सुनिश्चित करें कि सभी ंयायपालिका प्रोफ़ाइल सफलतापूर्वक निकाल दिए गए थे । अंयथा, फ़िल्टरिंग पैरामीटर (4.5.1 चरण) में सुधार होगा ।
  6. चलाएं मॉडल मैक्रो (शॉर्ट-कट F3) प्लाज्मा झिल्ली का एक मॉडल बनाने के लिए और कोशिका द्रव्य प्रतिदीप्ति वितरण अंशांकन डेटा पर आधारित है । इनवोक मैक्रो संवाद विंडो में पैरामीटर सेट कर का पालन करें ।
    1. निर्दिष्ट करें कि क्या इनपुट डेटा के लिए फ़िल्टरिंग का उपयोग कर (चरण ४.५) को फ़िल्टर किया जाना चाहिए? चेक-बॉक्स ।
    2. चरण 4.4.2 के रूप में स्रोत डेटा analogically निर्दिष्ट करें ।
    3. एक अंतराल है जिस पर मॉडल "प्रारंभ," "अंत," और माइक्रोन में "कदम" मूल्यों की परिभाषा द्वारा भविष्यवाणी की जाएगी निर्दिष्ट करें ।
      नोट: सभी प्रोफ़ाइल माप निर्दिष्ट अंतराल से अधिक होना चाहिए ।
    4. उपयुक्त क्षेत्रों में, प्रयुक्त chromophores के प्रतिदीप्ति उत्तेजना और उत्सर्जन maxima की तरंग दैर्ध्य निर्दिष्ट करें । GFP और एफएम 4-64 संयोजन के लिए डिफ़ॉल्ट सेट करें ।
      नोट: "GFP" chromophore प्रोटीन टैगिंग के लिए इस्तेमाल किया इंगित करता है (GFP,, YFP, आदि), और "FM4" एक प्लाज्मा झिल्ली धुंधला (आमतौर पर एफएम 4-64) के लिए इस्तेमाल chromophore इंगित करता है ।
    5. आउटपुट फ़ाइल उपसर्ग फ़ील्ड निर्दिष्ट करें । उपसर्ग का उपयोग किसी परिणामी मॉडल को RData फ़ाइल के रूप में किसी स्रोत डेटा निर्देशिका में सहेजने के लिए किया जाएगा ।
    6. चेक-बॉक्स प्लॉट मॉडल का चयन करें? यदि ग्राफ़िकल आउटपुट आवश्यक है । साजिश PNG के रूप में और pdf फ़ाइल के रूप में भी सहेजा जाएगा अगर पीडीएफ उत्पादन? चेक-बॉक्स चयनित है ।
    7. ठीकक्लिक करें । अगले संवाद विंडो में इनपुट या आउटपुट पथ निर्दिष्ट करें और प्रदर्शन किए गए R कोड दिखा रहा है संवाद खिड़की में ठीक क्लिक करके विश्लेषण की पुष्टि ।
      नोट: बाह्य-संबंधित प्रोटीन प्रतिदीप्ति के modeled cytoplasmic और झिल्ली यौगिक की साजिश नई छवि विंडो में दिखाया जाएगा, और R विश्लेषण आउटपुट पाठ विंडो में सूचीबद्ध किया जाएगा ।
  7. प्रक्रिया ब्याज की प्रोटीन व्यक्त कोशिकाओं की छवियों ।
    1. analogically छवियों के रूप में चरण ४.१ में आयात करें ।
    2. विश्लेषण analogically चरण ४.२ में के रूप में सेट करें । स्मूथिंग और लाइन की चौड़ाई समरूप होनी चाहिए ।
    3. चरण ४.३ में के रूप में analogically प्रोफ़ाइल को मापने ।
    4. प्लॉटिंग (चरण ४.४) द्वारा प्रोफाइल की सटीकता की जांच करें और यदि वांछित (चरण ४.५) फ़िल्टरिंग सेट ।
  8. प्लाज्मा झिल्ली और कोशिका द्रव्य के बीच एक प्रोटीन विभाजन की गणना के लिए वितरण की गणना मैक्रो (कम-कट F4) भागो । इनवोक मैक्रो संवाद विंडो में पैरामीटर सेटिंग का पालन करें ।
    1. पिछले चरण (चरण ४.४) के साथ Analogically, डेटा स्रोत, फ़िल्टरिंग, और फ़ाइल नाम उपसर्ग निर्दिष्ट करें ।
    2. निर्दिष्ट करें यदि प्रोटीन वितरण परिकलन के लिए मॉडल को पिछले मॉडल गणना से "पेरिफेरल" मैक्रो की हाल की आवृत्ति में फिजी पर लोड किया जाएगा (चेक-बॉक्स हाल ही के परिणामोंका चयन करें), या RData फ़ाइल से ( चेक-बॉक्स का चयन करें "से फ़ाइल") ।
    3. यदि कोई परिणाम फ़िल्टरिंग वांछित है, तो चेक-बॉक्स को सक्रिय से अधिक अवशिष्ट परिवर्तनशीलता के साथ परिणाम निकालें रखें । अधिकतम अनुमत अवशिष्ट परिवर्तनशीलता की सीमा निर्दिष्ट करें जिसे व्यक्तिगत प्रोफ़ाइल माप के संकेत अपघटन द्वारा अस्पष्टीकृत किया जा सकता है । उदाहरण के लिए: ०.२०० का एक मान इंगित करता है कि प्रोफ़ाइल में प्रतिदीप्ति तीव्रता की कुल परिवर्तनशीलता के 20% से अधिक अस्पष्टीकृत परिवर्तनशीलता के साथ सभी माप छोड़ दिया जाएगा ।
    4. नमूना समूहीकरण कारकोंका चयन करें, जिसका उपयोग बॉक्स-प्लॉट बनाने (चरण ४.४) के लिए किया जा सकता है.
    5. चेक-बॉक्स pdf आउटपुट को सक्रिय करें? pdf फ़ाइल के रूप में बॉक्स-प्लॉट को सहेजने के लिए ।
    6. ' ठीक' क्लिक करें, इनपुट या आउटपुट पथ निर्दिष्ट है, और संवाद विंडो में प्रदर्शन R कोड दिखा रहा है ठीक क्लिक करके विश्लेषण की पुष्टि ।
      नोट:---बाह्य प्लाज्मा झिल्ली और कोशिका द्रव्य के बीच से संबंधित प्रोटीन विभाजन के बॉक्स-प्लॉट एक नई छवि विंडो में दिखाया जाएगा, और R विश्लेषण आउटपुट पाठ विंडो में सूचीबद्ध किया जाएगा ।
    7. बाह्य प्रसंस्करण के लिए, परिणाम विंडो में प्रदर्शित परिणामों को बचाने के माध्यम से फ़ाइल । इस रूप में सहेजें .. । विंडो मेनू में ।

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Representative Results

10 DREPP एक संयंत्र है-विशिष्ट बाह्य प्लाज्मा-झिल्ली प्रोटीन है कि एक N-myristoylation और phosphatidylinositol फॉस्फेट11के साथ एक इलेक्ट्रोस्टैटिक बातचीत के माध्यम से प्लाज्मा झिल्ली के साथ जुड़ा हुआ है, 12. DREPP संयंत्र सेल में कैल्शियम संकेत मशीनरी के एक घटक के रूप में वर्णित किया गया था और यह भी cytoskeleton13,14के साथ बातचीत । प्रस्तुत प्रयोग में, जंगली प्रकार के तंबाकू DREPP2 और उसके गैर myristoylated उत्परिवर्ती संस्करण (Gly2 द्वारा प्रतिस्थापित ाला) थे GFP-6 टैग और द्वारा तंबाकू में व्यक्त-2 निलंबन कोशिकाओं15 CaMV 35S मोटर16के तहत । इन प्रोटीन की प्लाज्मा झिल्ली विभाजन 3 में मापा गया दिन पुराने (कमजोर पड़ने के बाद 3 दिन), एफएम 4-64-(8 µ एम) सेल संस्कृतियों6 के साथ (आंकड़ा 1a) और बिना (आंकड़ा1b) phosphoinositide के अलावा 3-कळेनासे अवरोध करनेवाला Wortmannin (10 µ मीटर)17, ऊपर वर्णित प्रोटोकॉल के अनुसार. छंटनी संस्करण DREPP2 (δ 1-23) प्लाज्मा झिल्ली बंधन डोमेन6 कमी प्रतिदीप्ति वितरण मॉडल निर्माण (चित्रा 1C) के लिए एक कोशिका द्रव्य मार्कर के रूप में इस्तेमाल किया गया था ।

परिकलित डेटा वर्ग रूट रूपांतरित किए गए थे (धनात्मक मान के संगत निंनतम ऋणात्मक मान केवल धनात्मक डेटा प्राप्त करने के लिए सभी डेटा में जोड़ा गया था), और डेटा दो-तरफ़ा ANOVA द्वारा R9में परीक्षण किए गए थे । उत्परिवर्तन और अवरोधक उपचार के प्रभाव अत्यधिक महत्वपूर्ण थे (p < 2.2 x 10-16 * * *) । सभी समूहों Tukey एचएसडी परीक्षण की तुलना में थे; सभी समूहों Wortmannin और गैर इलाज DREPP2 (G2A) (चित्रा 1 डी) द्वारा इलाज DREPP2 के अपवाद के साथ काफी मतभेद ।

इन परिणामों से स्पष्ट रूप से पता चलता है कि तंबाकू DREPP2 प्रोटीन के प्लाज्मा झिल्ली एसोसिएशन एक एन myristoylation और इलेक्ट्रोस्टैटिक बातचीत का परिणाम है, जो सहकारिता के काम कर रहे हैं । केवल एन myristoylation साइट उत्परिवर्तन और Wortmannin उपचार के पारस्परिक प्रभाव प्लाज्मा झिल्ली से DREPP2 प्रोटीन का एक पूर्ण पृथक्करण के कारण होता है । ये परिणाम पहले से प्रकाशित6डेटा के अनुसार होते हैं ।

Figure 1
चित्रा 1 : एन-myristoylation साइट में उत्परिवर्तन के प्रभाव और परिधीय-संबंधित प्लाज्मा-झिल्ली प्रोटीन DREPP, जो संयंत्र सेल में एक कैल्शियम संकेत मार्ग में शामिल है प्लाज्मा झिल्ली विभाजन पर Wortmannin उपचार । (A) तंबाकू के औसत दर्जे के फोकल वर्गों द्वारा-2 जंगली प्रकार के रूप में व्यक्त कोशिकाओं DREPP2-GFP और उत्परिवर्ती फार्म DREPP2 (Gly2Ala)-GFP (ग्रीन चैनल) । सेल एफएम 4-64 डाई (रानी चैनल), स्केल बार 10 µm के साथ लेबल थे । (ख) १० µ मीटर Wortmannin (एम डब्ल्यू पी) द्वारा इसी कोशिका रेखा का उपचार किया गया. (ग) cytoplasmic मार्कर DREPP2 (δ 1-23) व्यक्त करने वाली कोशिकाएँ. (घ) सभी नमूनों के लिए अनुमानित प्लाज्मा झिल्ली विभाजन । दोनों प्रभावों के महत्व दो तरह ANOVA द्वारा परीक्षण किया गया था (p < 2.2 x 10-16 * * * दोनों मामलों में; मूल डेटा वर्ग रूट रूपांतरित किया गया) । पत्र समूहों है कि Tukey एचएसडी परीक्षण द्वारा निर्धारित के रूप में एक दूसरे से काफी अलग नहीं है संकेत मिलता है । बॉक्स के मूंछों-भूखंडों ९५% विश्वास अंतराल संकेत मिलता है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

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Discussion

विधि यहां वर्णित प्रतिदीप्ति तीव्रता5मापने के आधार पर अन्य दृष्टिकोण की तुलना में परिधीय रूप से जुड़े प्रोटीन के लिए प्लाज्मा झिल्ली विभाजन का एक और अधिक सटीक आकलन उत्पन्न करता है. इस विधि का प्रमुख सुधार यह है कि यह प्लाज्मा-झिल्ली और cytoplasmic संकेतों के हल्के विवर्तन और superposition को ध्यान में रखता है । हालांकि इन विधि परिणाम एक साधारण औसत cytoplasmic संकेत के साथ झिल्ली की स्थिति पर प्रतिदीप्ति तीव्रता की तुलना पर आधारित विधि के परिणाम के साथ संबंध में है (जैसा कि पहले6दिखाया गया है), इस उपंयास विधि का प्रमुख लाभ अवशिष्ट परिवर्तनशीलता का निर्धारण (संकेत अपघटन द्वारा अस्पष्टीकृत) है कि परिणामों की प्रासंगिकता के आकलन की अनुमति देता है, विशेष रूप से जहां प्लाज्मा झिल्ली संकेत cytoplasmic संकेत से कम है । वर्णित विधि भी संकेत शोर करने के लिए और अधिक मजबूत है क्योंकि प्रोटीन विभाजन की गणना केवल एक बिंदु पर आधारित नहीं है ।

विश्लेषण केवल एक दो चैनल फोकल छवियों की आवश्यकता है । frap है दृष्टिकोण18 के विपरीत अब समय खिड़कियों में प्रोटीन प्रसार गतिशीलता की माप के आधार पर, वर्णित विधि अधिक vivo दृष्टिकोण में गतिशील के लिए लागू होता है, जब तेजी से छवि अधिग्रहण एक महत्वपूर्ण आवश्यकता है ( उदाहरणके लिए, सिग्नल transduction अन्वेषण, निरोधात्मक परख). विधि जल्दी से डेटा है कि सांख्यिकीय मूल्यांकन के लिए पर्याप्त है की बड़ी मात्रा में प्राप्त करने के लिए उपयुक्त है ।

विधि केवल एक ही झिल्ली तक सीमित है । पड़ोसी कोशिकाओं के दो निकट आसंन झिल्ली से संकेतों का विश्लेषण वर्तमान में समर्थित नहीं है । इस मामले में, संकेत फिटिंग कलाकृतियों के एक उच्च जोखिम के साथ और अधिक मांग है ।

हालांकि, विश्लेषण मूलतः संयंत्र निलंबन कोशिकाओं15के लिए डिजाइन किया गया था, और यह अंय प्रकार के सेल के विश्लेषण के लिए लागू किया जा सकता है के रूप में अच्छी तरह से । पराग ट्यूबों और रूट बाल संयंत्र जीव विज्ञान में इस पद्धति के संभावित बहुत अच्छा लक्ष्य का प्रतिनिधित्व करते हैं । संयंत्र एपिडर्मल कोशिकाओं के बाहरी झिल्ली पिछले सत्यापन के बाद विश्लेषण किया जा सकता है कि सेल दीवारों एफएम 4-64 द्वारा लेबल नहीं कर रहे है और autofluorescence हस्तक्षेप प्रदर्शित नहीं है । Protist कोशिकाओं है कि हस्तक्षेप autofluorescence के मुक्त कर रहे हैं, खमीर कोशिकाओं, कवक कोशिकाओं, साथ ही चिकनी प्लाज्मा झिल्ली के साथ पशु कोशिकाओं को वर्णित विधि का उपयोग कर विश्लेषण किया जा सकता है; हालांकि, पशु कोशिकाओं के लिए fibroblast कोशिकाओं के अग्रणी किनारे पर या उपकला कोशिकाओं के ब्रश सीमा पर प्रोटीन वितरण के विश्लेषण संभव नहीं हो सकता । लचीला विश्लेषण सेटिंग्स के कारण, एफएम 4-64 धुंधला अंय प्लाज्मा झिल्ली दृश्य दृष्टिकोण से प्रतिस्थापित किया जा सकता है, इस तरह के रूप में फ्लोरोसेंट प्रोटीन टैग । सावधानी के साथ, विधि तय कोशिकाओं के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है ।

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Disclosures

लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

इस परियोजना NPU मैं, LO1417 (शिक्षा, युवा और चेक गणराज्य के खेल मंत्रालय) द्वारा समर्थित किया गया था ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
FM 4-64 ThermoFisher Scientific T13320 Plasma membrane dye
Dimethyl sulfoxide Sigma-Aldrich D4540 Sigma Dye solvent
Ordinary equipment (microscopic slides, pipettes, tips, tubes) Equipment for cell labelling and microscopy
Confocal laser scanning microscope
Ordinary computer

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References

  1. Barbosa, I. C. R., Shikata, H., Zourelidou, M., Heilmann, M., Heilmann, I., Schwechheimer, C. Phospholipid composition and a polybasic motif determine D6 PROTEIN KINASE polar association with the plasma membrane and tropic responses. Development. 143 (24), 4687-4700 (2016).
  2. Kato, M., Aoyama, T., Maeshima, M. The Ca2+-binding protein PCaP2 located on the plasma membrane is involved in root hair development as a possible signal transducer. Plant J. 74 (4), 690-700 (2013).
  3. Kubitscheck, U. Fluorescence Microscopy: From Principles to Biological Applications. , John Wiley & Sons. (2013).
  4. Janecki, A. J., Janecki, M., Akhter, S., Donowitz, M. Quantitation of plasma membrane expression of a fusion protein of Na/H exchanger NHE3 and green fluorescence protein (GFP) in living PS120 fibroblasts. J Histochem Cytochem. 48 (11), 1479-1492 (2000).
  5. Peitzsch, R. M., McLaughlin, S. Binding of acylated peptides and fatty acids to phospholipid vesicles: pertinence to myristoylated proteins. Biochemistry. 32 (39), 10436-10443 (1993).
  6. Vosolsobě, S., Petrášek, J., Schwarzerová, K. Evolutionary plasticity of plasma membrane interaction in DREPP family proteins. Biochim Biophys Acta - Biomembr. 1859 (5), 686-697 (2017).
  7. Bolte, S., Talbot, C., Boutte, Y., Catrice, O., Read, N. D., Satiat-Jeunemaitre, B. FM-dyes as experimental probes for dissecting vesicle trafficking in living plant cells. J Microsc. 214 (2), 159-173 (2004).
  8. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nat Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  9. R Development Core Team. R: A language and environment for statistical computing. , R Foundation for Statistical Computing. Vienna, Austria. (2008).
  10. Logan, D. C., Domergue, O., Teyssendier de la Serve, B., Rossignol, M. A new family of plasma membrane polypeptides differentially regulated during plant development. Biochem Mol Biol Int. 43 (5), 1051-1062 (1997).
  11. Ide, Y., Nagasaki, N., Tomioka, R., Suito, M., Kamiya, T., Maeshima, M. Molecular properties of a novel, hydrophilic cation-binding protein associated with the plasma membrane. J Exp Bot. 58 (5), 1173-1183 (2007).
  12. Nagasaki-Takeuchi, N., Miyano, M., Maeshima, M. A plasma membrane-associated protein of Arabidopsis thaliana AtPCaP1 binds copper ions and changes its higher order structure. J Biochem. 144 (4), 487-497 (2008).
  13. Li, J., et al. MDP25, A Novel Calcium Regulatory Protein, Mediates Hypocotyl Cell Elongation by Destabilizing Cortical Microtubules in Arabidopsis. Plant Cell. 23 (12), 4411-4427 (2011).
  14. Qin, T., Liu, X., Li, J., Sun, J., Song, L., Mao, T. Arabidopsis microtubule-destabilizing protein 25 functions in pollen tube growth by severing actin filaments. Plant Cell. 26 (1), 325-339 (2014).
  15. Nagata, T., Nemoto, Y., Hasezawa, S. Tobacco BY-2 Cell Line as the "HeLa" Cell in the Cell Biology of Higher Plants. Int Rev Cytol. 132, 1-30 (1992).
  16. Hellens, R. P., Anne Edwards, E., Leyland, N. R., Bean, S., Mullineaux, P. M. pGreen: A versatile and flexible binary Ti vector for Agrobacterium-mediated plant transformation. Plant Mol Biol. 42 (6), 819-832 (2000).
  17. Vermeer, J. E. M., Thole, J. M., Goedhart, J., Nielsen, E., Munnik, T., Gadella, T. W. J. Jr Imaging phosphatidylinositol 4-phosphate dynamics in living plant cells. Plant J. 57 (2), 356-372 (2009).
  18. Laňková, M., et al. Determination of Dynamics of Plant Plasma Membrane Proteins with Fluorescence Recovery and Raster Image Correlation Spectroscopy. Microsc Microanal. 22 (2), 290-299 (2016).

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जीव विज्ञान समस्या १३६ बाह्य उपकरणों से जुड़े प्लाज्मा झिल्ली प्रोटीन झिल्ली संबध झिल्ली विभाजन फोकल माइक्रोस्कोपी ImageJ आर परियोजना एफएम 4-64 deconvolution

Erratum

Formal Correction: Erratum: Determination of Plasma Membrane Partitioning for Peripherally-associated Proteins
Posted by JoVE Editors on 11/02/2018. Citeable Link.

An erratum was issued for: Determination of Plasma Membrane Partitioning for Peripherally-associated Proteins. The Affiliations section was updated.

One of the affiliations was updated from:

Department of Experimental Plant Biology, University of Science, Charles University

to:

Department of Experimental Plant Biology, Faculty of Science, Charles University

परिधीय रूप से जुड़े प्रोटीन के लिए प्लाज्मा झिल्ली विभाजन का निर्धारण
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Vosolsobě, S.,… More

Vosolsobě, S., Schwarzerová, K., Petrášek, J. Determination of Plasma Membrane Partitioning for Peripherally-associated Proteins. J. Vis. Exp. (136), e57837, doi:10.3791/57837 (2018).

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