Fastsettelse av Plasma membranen partisjonering for perifert knyttet proteiner

Summary

Her presenterer vi en protokoll for å utføre en kvantitativ analyse av nivået av plasma-membran foreningen for fluorescently-merket perifert knyttet protein. Metoden er basert på beregningsorientert nedbryting av membran og cytoplasmatiske komponent signal i celler merket med plasma membranen fluorescerende markør.

Abstract

Denne metoden gir en rask tilnærming for fastsettelse av plasma membranen partisjonering av noen fluorescently-merket perifert knyttet protein hjelp profilene til fluorescens intensiteten i plasma membranen. Målt fluorescens profiler er utstyrt med en modell for membran og cytoplasma fluorescens distribusjon på en linje som er vinkelrett på cellen periferien. Denne modellen er konstruert av fluorescens intensitetsverdiene i Referanse celler uttrykke merketråd fluorescently merket for cytoplasma og med FM 4-64-merket plasma membran. Metoden kan brukes til ulike celletyper og organismer; Imidlertid kan bare plasma membraner av ikke-nærliggende celler evalueres. Denne rask mikroskopi-basert metode er egnet for eksperimenter, hvor subtil og dynamiske endringer i plasma membranen-assosiert markører er forventet og nødvendig å være kvantifisert, f.eksi analysen av mutant versjoner av proteiner, hemmer behandlinger, og signalet signaltransduksjon observasjoner. Metoden som er implementert i en multi-plattform R-pakke som er kombinert med en ImageJ makro som fungerer som et brukervennlig grensesnitt.

Introduction

Perifert knyttet plasma-membran proteiner er hovedkomponentene i cellen signalnettverk trasé. En av sine grunnleggende roller er deres forbigående plasma membranen tilknytning og dissosiasjon, som er viktig for signaltransduksjon mellom plasma membranen og cytoplasma. Perifert knyttet plasma membran proteiner kan festes på plasma membran av lipid ankere (N-myristoylation, S-acylation eller prenylation) eller lipid bindende domener (samspill med phosphatidylinositol fosfater, phosphatidic acid, etc.).

Plasma-membran bindende egenskaper av disse proteinene kan være undersøkt i vivo, f.eksnår en fluorescently merket protein er endret av en område-rettet mutagenese av viktige aminosyrer, eller når det behandles med ulike hemmere påvirker lipid signalering. Distribusjonen av eksterne plasma membran proteiner er hovedsakelig blir evaluert kvalitativt, spesielt i tilfeller når protein re-distribusjon er åpenbart. Presentert metoden er optimale i situasjoner når protein re-distribusjon er bare delvis og kvantitativ vurdering er nødvendig. En brukte tilnærming når plasma membranen association er beregnet fra AC confocal laser skanning mikroskopi bilder som forholdet fluorescens intensiteter plasma-membranen og i cytoplasma^1,2, er enkelt, men ikke nøyaktig. Fluorescens intensiteter i plasma membranen gjenspeiler en superposisjon av plasma-membran og cytoplasma signalet på grunn av lys Diffraksjon karakteristisk for bestemt fluorescens mikroskopi teknikk og optiske elementer brukt³. Følgelig inngår cytoplasmatiske signalet også i regionen membran. Derfor kan ikke FM 4-64 flekker mønster brukes som en maske for en membran signal utvalg⁴. Videre enkle målinger av membran signalet på plasseringen angitt av FM 4-64 flekker maksimal alltid systematisk overvurderer virkelige plasma-membran signalet perifert knyttet plasma-membran protein på grunn av superposisjon av den membran og cytoplasmatiske sammensatte. Maksimalt antall observert signaler for fluorescently-merket perifert knyttet proteiner også co Lokaliser ikke med maksimal plasma membranen markøren (dvs., FM 4-64 styryl farge), men er forskjøvet mot cytoplasma. En annen begrensning er basert på det faktum at FM 4-64 utslipp peak er større med utslipp toppene for grønne fluorescerende proteiner som GFP på grunn av bølgelengde-avhengighet av lys Diffraksjon³.

I metoden beskrevet her er merket protein signalet utstyrt med to empirisk funksjoner som beskriver en hypotetisk fordelingen av plasma membranen og cytoplasma signal, henholdsvis. Dette signalet nedbryting brukes lineær fluorescens profiler som brukes til celleoverflaten vinkelrett til plasma membranen i kildebilder, som er vanlig, tokanals AC confocal deler av fluorescently-merket protein uttrykke celler merket med FM 4-64 fargestoff.

Den første funksjonen brukes for montering beskriver en Diffraksjon en cytoplasma signal på cellen kanten. Det er innhentet fra tidligere anskaffet fluorescens profiler som ble målt i celler som uttrykker en cytoplasma protein markør merket av den samme chromophore som plasma membranen perifert knyttet protein av interesse. Den andre funksjonen som beskriver en Diffraksjon et plasma-membran signal er avledet fra fluorescens av FM 4-64. Dette signalet anslås først med en Gaussian funksjonen som brukes for en omtrentlig modellering av lys Diffraksjon av en kilde. For det andre, denne modellen, gyldig for rød FM 4-64 utslipp, matematisk forvandles til skjemaet som er relevant for et utslipp bølgelengde på chromophore brukes for merking av perifert knyttet proteiner av interesse på plasma membranen. Begge funksjonene er normalisert ved maksimal intensiteten og gjennomsnittet på 10% av de høyeste verdiene for FM 4-64 signal og cytoplasmatiske protein signal, henholdsvis. Av dette signalet nedbryting (ikke-lineære minst kvadrat passende metode), kan forholdet mellom plasma membranen og cytoplasma brøkdel av undersøkt protein estimeres enkelt og nøyaktig. Den virkelige fysiske dimensjonen av beregnede partisjonering koeffisient er i størrelsesorden mikrometer, fordi cytoplasmatiske volum konsentrasjon sammenlignes med overflaten konsentrasjon på plasma membranen. Den definerer avstanden fra plasma membranen til cytoplasma, som samme mengde proteiner er lokalisert i det nærliggende området i plasma membranen. Denne verdien tilsvarer partisjonering koeffisienten K₂ introdusert tidligere⁵. Metoden er rask, krever bare én AC confocal deler anskaffes ved hjelp av rutinemessig AC confocal laserskanning mikroskop, og det er ikke beregningsmessig krevende. Analyse kjernen er implementert i en flyttbar R-pakke og en ekstra ImageJ makro ble skrevet å gi grafisk brukergrensesnitt for å kjøre analyser intuitivt dialoger. Programvare og mer detaljert beskrivelse av metoden (publisert tidligere⁶) kan finnes på http://kfrserver.natur.cuni.cz/lide/vosolsob/Peripheral/.

Metoden er egnet for isolert celler, protoplasts og vev, der plasma membranen individuelle celler er klart kan skilles, uttrykke en fluorescently merket konstruksjon av undersøkt perifert knyttet protein. En chromophore kompatibel med FM 4-64 flekker må brukes. FM 4-64 avgir røde fluorescens; Derfor kan undersøkt protein være merket av et fluorescens protein med blå, grønn eller gul utslipp (f.eksGFP, CFP, YFP). Stabil transformasjon av biologisk materiale anbefales fordi mindre kunstige og mer reproduserbar observasjoner av protein distribusjon. Det er nødvendig at undersøkt protein har en relativt homogene cytoplasmatiske distribusjon. Lokalisering av et protein i det endoplasmatiske retikulum eller en annen intracellulær membran kupeen kan produsere kunstig resultater.

I tillegg må det samme biologisk materialet uttrykke merketråd cytoplasmatiske brukes for sammenligningen. Cellene kan bli forvandlet ved en gratis chomophore (samme som gjelder perifer protein merking, f.eksgratis GFP) eller merket protein rundt med avskaffet membran innbindingen behandlingskapasitet. Membran innbindingen behandlingskapasitet kan bli avskaffet, for eksempel beskjæring av membran-bindende domene eller området-rettet mutagenese av viktige aminosyren residua (f.eks, nettsteder for N-myristoylation, S-acylation, eller prenylation, etc.).

For AC confocal mikroskopi skanning, må cellene merkes av merketråd membran som FM 4-64 fargestoff. Hvis FM 4-64 flekker ikke er egnet for studerte materialet (på grunn av forstyrrende autofluorescence, dårlig fargestoff penetrasjon, etc.), kan plasma membranen merkes, for eksempel med integrert plasma membranen protein merket med en riktig chomophore ( mCherry, RFP, etc.). Det er viktig at markøren har ubetydelig lokalisering i intracellulær membran seksjonene (endomembranes).

Hvis arbeider med fast prøver og antistoffer, kan fixable analog FM 4-64FX eller plasma membranen merking av antistoff mot en passende mål brukes. I dette tilfellet er det viktig å vurdere resultatene nøye fordi fiksering prosedyrer kan føre til selektiv tap av proteiner fra både cytoplasma og plasma membranen.

Protocol

1. utarbeidelse av biologisk materiale Forberede biologisk materiale uttrykke fluorescently merket protein av interesse, samt en cytoplasmatiske markør. Følg fremgangsmåten nevnt i innledningen. 2. AC confocal mikroskopi for laserskanning Stain materialet forberedt i Seksjon 1 med FM 4-64 fargestoff7. Bruke en fargeprotokoll som passer for studerte materialet. For tobakk ved-2 celler, beis 200 μL av cellen suspensjon med …

Representative Results

DREPP10 er en plante-spesifikke perifert knyttet plasma-membran protein som er knyttet til plasma membranen via en N-myristoylation og en elektrostatisk samhandling med phosphatidylinositol fosfater11, 12. DREPP ble beskrevet som en komponent av kalsium-signalisering maskiner i anlegget celle og også kommuniserer med cytoskjelett13,14. I presenter…

Discussion

Metoden beskrevet her genererer et mer nøyaktig anslag for plasma membranen partisjonering av perifert tilhørende proteiner sammenlignet med andre tilnærminger basert på måler fluorescens intensiteter⁵. Stor forbedring av denne metoden er at det tar hensyn til lys Diffraksjon og superposisjon av plasma-membranen og cytoplasmatiske signaler. Selv om disse metoden resultatene er i sammenheng med resultatene av en enkel metode basert på sammenligning av fluorescens intensitet på membran posisj…

Materials

FM 4-64	ThermoFisher Scientific	T13320	Plasma membrane dye
Dimethyl sulfoxide	Sigma-Aldrich	D4540 Sigma	Dye solvent
Ordinary equipment (microscopic slides, pipettes, tips, tubes)			Equipment for cell labelling and microscopy
Confocal laser scanning microscope
Ordinary computer