Determinação da membrana plasmática de particionamento para proteínas associadas perifericamente

Summary

Aqui, apresentamos um protocolo para realizar uma análise quantitativa do nível de associação a membrana plasmática para fluorescente etiquetado proteína associada perifericamente. O método baseia-se na decomposição computacional da membrana e componente citoplasmático do sinal observado em células rotuladas com marcador fluorescente de membrana plasmática.

Abstract

Este método fornece uma abordagem rápida para a determinação da membrana plasmática de particionamento de qualquer marcados fluorescentemente perifericamente-proteína associada usando os perfis da intensidade de fluorescência através da membrana plasmática. Perfis de fluorescência medidos estão equipados por um modelo para distribuição de fluorescência de membrana e citoplasma ao longo de uma linha aplicada perpendicularmente para a periferia da célula. Este modelo é construído a partir dos valores de intensidade de fluorescência em referência a células expressando um marcador fluorescente-etiquetadas para o citoplasma e com FM 4-64-rotulado membrana plasmática. O método pode ser aplicado a vários tipos de células e organismos; no entanto, apenas plasma as membranas das células vizinhas não pode ser avaliadas. Este método rápido baseado em microscopia é apropriado para experiências, onde esperam-se mudanças sutis e dinâmicas de marcadores associados a membrana plasmática e necessidade de ser quantificado, por exemplo, na análise das versões mutantes de proteínas, tratamentos de inibidor, e observações de transdução de sinal. O método é implementado em um pacote de R multi-plataforma que é acoplado com uma macro ImageJ que serve como uma interface amigável.

Introduction

Perifericamente associados-a membrana plasmática proteínas são os principais componentes das vias de sinalização celular. Um de seus papéis fundamentais é sua associação transitória de membrana plasmática e dissociação, que é importante para a transdução de sinal entre a membrana plasmática e citoplasma. Proteínas de membrana de plasma perifericamente associados podem ser anexadas na membrana plasmática por âncoras lipídicas (N-miristoilação, S-acilação ou Prenilação) ou domínios de ligação de lipídios (interagindo com fosfatidilinositol fosfatos, ácido fosfatídico, etc.).

Vinculação de membrana plasmática Propriedades destas proteínas podem ser examinados na vivo, por exemplo, quando uma proteína fluorescente-tag é modificada por um mutagenesis local-dirigido de chave de aminoácidos, ou quando é tratada com vários inibidores que afectam sinalização de lipídios. As distribuições das proteínas de membrana de plasma periférico são principalmente sendo avaliadas qualitativamente, especialmente em casos, quando re-distribuição de proteína é óbvio. O método apresentado é ideal para situações quando re-distribuição de proteína é apenas parcial e avaliação quantitativa é necessária. Uma abordagem frequentemente usada de quando associação de membrana plasmática é estimada a partir confocal laser imagens de microscopia de varredura como uma relação entre as intensidades de fluorescência na membrana plasmática e no citoplasma^1,2, é simples, mas não Exato. As intensidades de fluorescência na membrana plasmática refletem uma superposição do sinal-a membrana plasmática e citoplasma devido a característica de difração de luz para a técnica de microscopia de fluorescência particular e elementos ópticos utilizados³. Por conseguinte, o sinal citoplasmático é incluído também na região da membrana. Por esse motivo, coloração padrão FM 4-64 não pode ser usado como uma máscara para um sinal de membrana seleção⁴. Além disso, medidas simples de membrana sinal na posição definida pelo FM 4-64 coloração máxima sempre sistematicamente superestimam o sinal real-a membrana plasmática da proteína perifericamente associados-a membrana plasmática, devido à sobreposição do membrana e citoplasma composto. O máximo de sinais observados para proteínas de fluorescente-etiquetadas perifericamente associados também não localizar co com o máximo do marcador de membrana plasmática (ou seja, tintura de styryl FM 4-64), mas é deslocado para o citoplasma. Outra limitação é baseada no fato de que a FM 4-64 pico de emissão é maior em comparação com os picos de emissão para proteínas fluorescentes verdes tais como GFP devido a dependência-comprimento de onda de difração de luz³.

O método descrito aqui, o sinal de etiquetado proteína é equipado por duas funções empíricas descrevendo uma distribuição hipotética da membrana plasmática e citoplasma sinal, respectivamente. Esta decomposição do sinal é aplicada a perfis de fluorescência lineares que são aplicados à superfície da célula perpendicularmente à membrana plasmática em imagens de origem, que são seções confocal regulares, dois canais de expressar a proteína fluorescente-tag células rotuladas com tintura de FM 4-64.

A primeira função usada para encaixe descreve uma difração de um sinal de citoplasma na borda de célula. É obtido a partir de perfis de fluorescência anteriormente adquiridos que foram medidos em células expressando um marcador de proteína do citoplasma marcado pelo cromóforo do mesmo como a membrana plasmática perifericamente associada a proteína de interesse. A segunda função descrevendo uma difração de um sinal de membrana plasmática é derivada de fluorescência do FM 4-64. Em primeiro lugar, este sinal é aproximado por uma função gaussiana que está sendo usada para uma modelagem aproximada de difração de luz de uma fonte pontual. Em segundo lugar, este modelo, válido para o vermelho de emissão FM 4-64, matematicamente é transformado para a forma que é relevante para um comprimento de onda de emissão do cromóforo do utilizado para a marcação de proteínas associadas perifericamente de interesse na membrana plasmática. Ambas as funções são normalizadas pela intensidade máxima e a média de 10% dos valores mais altos para sinal FM 4-64 e proteínas citoplasmáticas, respectivamente. Por esta decomposição do sinal (método não-linear de encaixe quadrado menos), a relação entre a membrana plasmática e a fração de citoplasma da proteína analisada podem ser estimados facilmente e com precisão. A dimensão física real de coeficiente de particionamento computada é na faixa de micrômetro, porque a concentração do volume citoplasmático é comparada com a concentração de superfície na membrana plasmática. Define a distância entre a membrana plasmática para o citoplasma, dentro do qual a mesma quantidade de proteínas está localizada em área adjacente da membrana plasmática. Esse valor é equivalente para o particionamento coeficiente K₂ introduzido previamente⁵. O método é muito rápido, exigindo apenas única seções confocal adquiridas usando rotineiro laser confocal microscópio, e não é exigente computacionalmente. O núcleo de análise foi implementado em um pacote de R portátil e uma macro ImageJ adicional foi escrita para fornecer a interface gráfica do usuário para executar a análise de diálogos de intuitivo. Software e uma descrição mais detalhada do método (publicado anteriormente⁶) pode ser encontrada em http://kfrserver.natur.cuni.cz/lide/vosolsob/Peripheral/.

O método é adequado para células isoladas, protoplastas e tecidos, onde a membrana plasmática das células individuais é claramente distinguível, expressar uma construção fluorescente-etiquetadas do examinado perifericamente associados a proteína. Um cromóforo compatível com FM 4-64 a coloração deve ser usada. FM 4-64 emite fluorescência vermelha; Portanto, examinada proteína pode ser marcada por uma proteína de fluorescência com emissão de azul, verde ou amarelo (por exemplo, GFP, PCP, YFP). Transformação estável de material biológico é recomendada porque permite observações menos artificiais e mais reprodutíveis de distribuição de proteína. É necessário que a proteína examinada tem uma distribuição relativamente homogênea citoplasmática. A localização de uma proteína no retículo endoplasmático ou outro compartimento intracelular de membrana pode produzir resultados artificiais.

Além disso, o mesmo material biológico expressando um marcador citoplasmático deve ser usado para a comparação. Células podem ser transformadas por um chomophore gratuito (o mesmo que usado para proteína periférica de marcação, por exemplo, enciclopédia GFP) ou etiquetada proteína de interesse com capacidade de ligação de membrana abolido. Capacidade de ligação de membrana pode ser abolida, por exemplo, por aparamento do domínio de ligação de membrana ou mutagenesis local-dirigido de resíduos de aminoácido chave (por exemplo, sites para N-miristoilação, S-acilação, ou Prenilação, etc.).

Para microscopia confocal, as células devem ser etiquetadas por um marcador de membrana como corante FM 4-64. Se FM 4-64 coloração não é adequado para o material estudado (devido a interferente autofluorescência, penetração do corante pobre, etc.), a membrana plasmática pode ser rotulada, por exemplo, pela proteína integral de membrana de plasma marcada para um chomophore apropriado ( mCherry, RFP, etc.). É essencial que o marcador tem localização insignificante nos compartimentos intracelular de membrana (endomembranes).

Se trabalhar com amostras fixas e anticorpos, fixável analógica FM 4-64FX ou membrana plasmática rotulagem pelo anticorpo contra um destino apropriado pode ser usado. Neste caso, é essencial para avaliar resultados com muito cuidado porque os procedimentos de fixação podem levar à perda seletiva de proteínas do citoplasma e a membrana plasmática.

Protocol

1. preparação de Material biológico

1. Prepare material biológico, expressando a proteína fluorescente etiquetada de interesse, bem como um marcador citoplasmático. Siga os procedimentos mencionados na introdução.

2. confocal Laser, microscopia eletrônica de varredura

1. Manchar o material preparado na secção 1 com FM 4-64 tintura⁷.
   1. Aplica um protocolo de coloração que é apropriado para o material estudado. Para células de tabaco por-2, mancha 200 µ l de suspensão de células com 0,2 µ l de 10mm FM 4-64 solução em dimetilsulfóxido.
      Nota: A concentração de coloração típica de FM 4-64 tintura é sobre 10 μM usando solução de reserva 10 mM em dimetilsulfóxido. Use a menor concentração possível de FM 4-64 para coloração adequada e não incubar as células no gelo (FM 4-64 e baixa temperatura pode afetar as propriedades da membrana plasmática). Continue com observação usando microscopia confocal imediatamente. O intervalo entre a coloração e a aquisição de imagem não deve ter mais de 10 min; caso contrário, endocitose da tintura afetará o FM 4-64 coloração.
   2. Processar amostras múltiplas consecutivamente e não mancham todas as amostras no início do experimento.
2. Capture uma seção confocal equatorial por uma célula.
   1. Defina uma digitalização de dois canais sequenciais para o cromóforo usado como a marca de proteína (deve estar no primeiro canal) e FM 4-64 (deve ser no segundo canal). Defina uma maior resolução óptica (10 – 20 px/μm). Uma configuração de exemplo: 63 X óleo de imersão objetivo, at 1.3, imagem tamanho 1.024 x 1.024 px. Certifique-se de que o avião de membrana plasmática é perpendicular ao plano confocal-seção nas imagens adquiridas.
   2. Capturar pelo menos 20 células por exemplo tenham dados suficientes para a avaliação estatística (depende da variabilidade do sinal no material processado).

3. necessário Software instalação

1. Instalação de distribuição de Fiji ImageJ⁸e a macro necessária periférica.
   1. Download de software de https://fiji.sc/#download o site e instalá-los por descompactar.
   2. Comece Fiji clicando duas vezes sobre o arquivo "ImageJ(.exe)" no diretório descompactado "Fiji.app".
   3. Baixe uma macro "periférica" a partir do seguinte site:
      http://kfrserver.Natur.cuni.cz/lide/vosolsob/Peripheral/Source/Peripheral_.IJM.
   4. Em Fiji, selecione Plugins | As macros | Instalar... no menu principal e especifique o caminho para o arquivo baixado "Peripheral_.ijm."
      Nota: Duas novas ferramentas da macro instalada "periférico" aparecerá na barra de Fiji: "Take perfil ferramenta" e "Menu de proteína periférica".
2. Instale o software de projeto R⁹e pacotes necessários.
   1. Siga as instruções sobre o local https://cloud.r-project.org/ para instalação do R-project.
      Nota: A análise global será realizada em Fiji. O software R será chamado apenas internamente pela macro Fiji "periférica" durante o cálculo.
   2. Executar R GUI, selecione pacotes de | Instalar o pacote (s)... no menu principal e especificar o repositório mais próximo e o pacote "ggplot2" para a instalação.
      Nota: Como alternativa, para o R de linha de comando, digite: install.packages("ggplot2").
   3. Baixe um pacote de R periférico do destino: http://kfrserver.natur.cuni.cz/lide/vosolsob/Peripheral/source/peripheral_latest.tar.gz. Instalá-los, selecionando pacotes de | Instalar o pacote (s) de arquivos locais....
      Nota: Como alternativa, digite ao r de linha de comando apenas este comando:
      install.Packages ("http://kfrserver.natur.cuni.cz/lide/vosolsob/Peripheral/source/peripheral_latest.tar.gz", repo = NULL, tipo = "fonte").

4. imagem análise em Fiji

1. Processe as imagens confocal do marcador citoplasmático.
   1. Importar as imagens para Fiji usando Plugins | Bio-formatos | Bio-formatos importador do menu Fiji com as configurações padrão.
   2. Verifica se o importador de Bio-formatos reconhecidos corretamente a calibração de imagem. A dimensão da imagem mostrada na janela de imagem de campo superior esquerdo informações deve ser igual para as dimensões de imagem original.
   3. Tratar incorretamente calibrados imagens com o incorreto dimensões individualmente, por exemplo, definindo os parâmetros corretos na janela de diálogo Analyze | Definir escala... no menu de Fiji: preencher a largura da imagem em pixels no campo distância em pixels e a largura real da unidade de comprimento apropriado no campo conhecido de distância ).
      Nota: Se os arquivos de Leica LCS LEI impropriamente são calibrados, siga o passo 4.2.1.
2. Execute a macro de opções de importação para uma configuração de análise. Para activar a macro de uma das três maneiras diferentes: selecione Plugins | As macros | Importar as opções [f1] no menu principal de Fiji, selecione o mesmo artigo depois de clicar a ferramenta menu Menu de proteína periférica, ou pressione o teclado atalho F1. Defina o parâmetro na janela de diálogo macro chamada.
   1. No caso do formato Leica LCS leus, resolva calibragem inadequada , ativando a caixa de seleção de imagens Leica.lei . Esta opção importa corretamente as dimensões da imagem do arquivo com a extensão de "lei".
   2. Defina o valor apropriado no campo Gaussian blur raio (px). Isso influencia imagens de suavização e redução de ruído. Um valor baixo (1 px) é suficiente e não causa qualquer perda de informações de imagem.
   3. Defina um valor no campo largura da linha de perfil (px). Uma linha mais grossa provoca maior suavização das curvas de perfil. Recomenda-se um valor padrão de 10 px.
   4. Definir um título de imagem, análise da definição de "Delimitadores de amostra" e "Itens exportados."
      Nota: Imagem título (nome do arquivo sem extensão, por exemplo: "Experimento-1_line-02_cell-11") será dividido em torno de todos os personagens listados no campo "Delimitadores de amostra" (por exemplo: "-_") em um conjunto de itens ("Experimento", "1"," linha","02","célula"e"11") que podem ser usados como fatores de agrupamento (identidade de amostra, célula, linha ou tratamento) na seguinte análise. Definir quais itens serão usados digitando seu número de sequência ("0" para o primeiro item) para o arquivado "Exportar itens." Use o formato delimitado por espaço, por exemplo, "3-5". Neste exemplo, itens "02" e "11" serão referidos como agrupamento de fatores denominados "Fac_0" e "Fac_1." Além disso, a identidade de cada medição será referida como "eu" do fator.
   5. Como alternativa, mantenha os delimitadores de amostra vazio e insira 0 para os itens exportados se o título completo de imagem pode ser mantido.
   6. No sistema de operação Windows, verifique se o caminho para o software R vai ser corretamente detectado automaticamente no campo caminho para R.exe. Caso contrário, especifique o caminho completo para o arquivo de R.exe no sistema (por exemplo, "C:\Program Files\R\bin\R.exe").
   7. Clique Okey. Verifique o título análise na próxima janela de diálogo e clique Okey ou volta para redefinir.
      Nota: Todas as imagens serão automaticamente suavizadas e eventualmente recalibradas. Uma lista de fatores de agrupamento tudo exportado será exibida na janela de resultados.
3. Realizar uma seleção linear em toda a região da membrana plasmática nas imagens processadas e medir os perfis de fluorescência.
   1. Selecione a ferramenta de Fiji linha reta na barra de ferramentas de Fiji. Clique na imagem e arraste uma linha em toda a região da membrana plasmática. A linha deve começar no espaço extracelular e deve ser perpendicular à membrana plasmática. Escolha as regiões com uma camada mais espessa e mais homogênea do citoplasma cortical. O comprimento ideal da seleção linear é 5-10 μm.
   2. Execute a macro perfil de tomar método analógico como na etapa 4.2 (atalho "x") ou clicando em tomar perfil ferramenta na barra de Fiji. Será realizada a medição automática de perfis de fluorescência em ambos os canais e os dados serão exibidos na janela de resultados.
   3. Se usar a tecla "x" é considerado user-unfriendly, abra o arquivo de origem de macro Peripheral_.ijm no editor de texto, substituir o símbolo "x" na linha de ' macro "Take perfil [x]" {' com um símbolo mais favorável (que não é usado no ambiente de Fiji como um atalho de teclado ativo) e salve o arquivo. Reinstalar a macro (passo 3.1.4) e iniciar a análise a partir da importação de imagem.
   4. De acordo com a variabilidade individual sinal, tirar números representativos dos perfis para cada célula.
   5. Salvar os dados via arquivo | Salvar como.... Sempre usar a extensão "csv"; é necessário que o formato de dados apropriados.
4. Execute a macro de dados de perfil de plotagem (atalho F5) para visualização gráfica dos perfis medidos. Defina o parâmetro na janela de diálogo macro chamada.
   1. Manter a caixa de seleção usar filtragem de dados de entrada? desmarcado.
   2. Especifica se o enredo deve ser criado a partir dados recentes na janela de resultado, de um único arquivo CSV ou de todos os arquivos CSV em um diretório especificado clicando no botão apropriado.
      Nota: Se a trama é criada a partir de resultados recentes, dados serão salvos primeiro (caixa de diálogosalvar como... será automaticamente ativada).
   3. Especifica quais fatores de agrupamento será usado para a plotagem, selecionando as caixas de seleção apropriadas. Selecione o fator "i." se todos os perfis devem ser exibidos em parcelas únicas. Manter as caixas de seleção desmarcadas, se todos os dados devem por plotados em um único lote.
      Atenção: A seleção de um fator de agrupamento que não consta o erro de causas de resultados processados durante a criação do enredo.
   4. Especifique o nome do arquivo ao salvar um lote no campo prefixo do arquivo de saída e definir o enredo dimensões da imagem em arquivos de lote alto e largura de trama.
      Nota: O enredo resultante será salvo em um diretório de fonte de dados como um arquivo PNG.
   5. Selecione o saída Pdf? -caixa de seleção se um PDF adicional de saída pode ser produzido.
   6. Clique Okey. Especificar o caminho para salvar os resultados ou eventualmente para dados importação na próxima janela de diálogo. Confirme a análise clicando Okey nas janelas de diálogo mostrando o código R realizado.
      Nota: O enredo será aberto em uma nova janela de imagem e a saída de análise R será listada na janela de texto.
5. Execute a macro de instalação de filtragem de perfil (atalho F2) se alguns perfis plotados tem sinais excessivos no espaço extracelular (para a proteína etiquetado) ou no espaço intracelular (para o sinal de FM 4-64). Siga, definindo os parâmetros na janela de diálogo macro chamada.
   Nota: Filtragem permite a remoção de perfis de pobres, de acordo com o limiar de intensidade máxima permitida no x-coordenadas especificadas.
   1. Para cada canal, defina o limiar de intensidade apropriada no arquivo remover medições com um sinal (intracelular) extracelular excessiva. Especifica a região onde será aplicado o limiar de intensidade no campo x - coordenadas inferior (superior).
   2. Executar a macro de dados de perfil de plotagem (etapa 4.4) novamente com a caixa de seleção usar filtragem de dados de entrada? selecionado; Certifique-se de que todos os perfis aberrantes foram removidos com êxito. Caso contrário, melhore os parâmetros de filtragem (etapa 4.5.1).
6. Execute a macro do modelo criar (atalho F3) para criar um modelo de membrana plasmática e a distribuição de fluorescência do citoplasma baseado nos dados de calibração. Siga, definindo os parâmetros na janela de diálogo macro chamada.
   1. Especificar se os dados de entrada devem ser filtrada (etapa 4.5) selecionando o usar filtragem de dados de entrada? caixa de seleção.
   2. Especifica a fonte de dados , analogicamente, como na etapa 4.4.2.
   3. Especifique um intervalo no qual o modelo irá ser previsto pela definição de "Iniciar", "fim", e "passo" valores em μm.
      Nota: Todas as medições de perfil devem ser mais que o intervalo especificado.
   4. Especifica o maxima de excitação e emissão de comprimentos de onda de fluorescência dos cromóforos usados, nos campos apropriados. Defina os padrões para as boas práticas agrícolas e FM combinação 4-64.
      Nota: O "GFP" indica o cromóforo usado para a proteína de marcação (GFP, PCP, YFP, etc), e "FM4" indica o cromóforo usado para uma membrana de plasma mancha (tipicamente FM 4-64).
   5. Especifique o campo prefixo do arquivo de saída . O prefixo será usado para salvar um modelo resultante do arquivo RData para um diretório de dados de origem.
   6. Marque a caixa de seleção modelo de plotagem? Se a saída gráfica é necessária. O enredo será salvo como o PNG e também o arquivo PDF se o saída Pdf? caixa de seleção está selecionada.
   7. Clique Okey. Especificar a entrada ou saída caminhos nas janelas de diálogo próximo e confirmar a análise clicando Okey na janela de diálogo mostrando o código R realizado.
      Nota: O enredo do modelado citoplasmático e composto de membrana da fluorescência perifericamente associados a proteína serão mostrados na janela de imagem nova, e a saída de análise R será listada na janela de texto.
7. Processe as imagens das células expressando a proteína de interesse.
   1. Importe as imagens analogicamente como na etapa 4.1.
   2. Configure a análise analogicamente como na etapa 4.2. A largura de suavização e a linha deve ser idêntica.
   3. Medir os perfis analogicamente como no passo 4.3.
   4. Verificar a precisão dos perfis plotando (etapa 4.4) e definir a filtragem se desejado (etapa 4.5).
8. Execute a macro de distribuição Calculate (atalho F4) para o cálculo de um particionamento de proteína entre a membrana plasmática e no citoplasma. Siga a configuração de parâmetro na janela de diálogo macro chamada.
   1. Analogicamente com a etapa anterior (etapa 4.4), especifica a fonte de dados, filtragem e prefixo de nome de arquivo.
   2. Especificar se o modelo para cálculo de distribuição de proteína será carregado partir o último cálculo do modelo na instância recente da macro "Periférica" em Fiji (selecionar caixa de seleção recentes resultados) ou o arquivo RData ( Marque a caixa de seleção "do arquivo").
   3. Manter a caixa de seleção remover resultados com variabilidade residual maior que ativado se um resultado de filtração é desejado. Especifica o limiar da máxima variabilidade residual permitido que pode ser inexplicáveis pela decomposição sinal de medição do perfil individual. Por exemplo: um valor de 0.200 indica que toda a medida com inexplicada variabilidade maior que 20% da variabilidade total da intensidade da fluorescência no perfil será descartada.
   4. Selecione os fatores de agrupamento de amostra, que pode ser usado para caixa-trama criando (etapa 4.4).
   5. Ativar a caixa de seleção saída Pdf? para salvar o caixa-enredo como arquivo PDF.
   6. Clique Okey, especificar a entrada ou saída de caminhos e confirmar a análise clicando Okey na janela de diálogo mostrando o código R realizado.
      Nota: A caixa-trama de proteína associada perifericamente particionamento entre a membrana plasmática e citoplasma será mostrada em uma nova janela de imagem, e a saída de análise R será listada na janela de texto.
   7. Para processamento externo, salvar os resultados exibidos na janela de resultados através de arquivo | Salvar como... no menu janela.

Representative Results

DREPP¹⁰ é uma proteína de planta específica perifericamente associados-membrana plasmática que está associada com a membrana plasmática através de um N-miristoilação e uma interação eletrostática com fosfatidilinositol fosfatos^{11, 12}. DREPP foi descrito como um componente de uma máquina de sinalização de cálcio na célula da planta e também interage com o citoesqueleto^13,14. No experimento apresentado, o tabaco selvagem-tipo DREPP2 e sua versão mutante não-myristoylated (Gly2, substituído por Ala) eram GFP-etiquetado⁶ em expressaram em tabaco BY-2 suspensão de células¹⁵ sob o CaMV 35S promotor¹⁶. O particionamento de membrana plasmática destas proteínas foram medidos em 3 dias de idade (3 dias após diluição), FM 4-64-rotulado (8 µM) célula culturas⁶ com (figura 1A) e sem (figura 1B), a adição do phosphoinositide 3-quinase inibidor (10 µM) Wortmannin¹⁷, de acordo com o protocolo descrito acima. A versão aparada DREPP2(Δ1-23) falta a membrana plasmática vinculação domínio⁶ foi usada como um marcador do citoplasma para a construção de modelo de distribuição de fluorescência (Figura 1).

Computados os dados foram transformado de raiz quadrada (o valor positivo correspondente ao menor valor negativo foi adicionado a todos os dados para recuperar somente dados positivos), e dados foram testados pela ANOVA de duas vias em R⁹. Os efeitos do tratamento mutação e inibidor foram altamente significativos (p < 2,2 x 10^-16 * * *). Todos os grupos foram comparados pelo teste de Tukey HSD; todos os grupos diferiam significativamente com excepção DREPP2 tratados por Wortmannin e DREPP2(G2A) não tratados (Figura 1).

Esses resultados mostram claramente que a associação de tabaco DREPP2 proteína de membrana plasmática é o resultado de um N-miristoilação e a interação eletrostática, que estão funcionando cooperativamente. Somente o efeito recíproco da mutação do site N-miristoilação e Wortmannin tratamento causou uma dissociação completa da proteína DREPP2 da membrana plasmática. Estes resultados estão de acordo com dados publicados anteriormente⁶.

Figura 1 : Efeito da mutação no site N-miristoilação e tratamento de Wortmannin sobre o particionamento de membrana plasmática da proteína perifericamente associados-a membrana plasmática DREPP, que está envolvida em um percurso na célula da planta de sinalização de cálcio. (A) Medial confocal seções de células de tabaco por-2, expressando a forma selvagem tipo DREPP2-GFP e o mutante formam DREPP2 (Gly2Ala)-GFP (canal verde). As células foram rotuladas com FM 4-64 tintura (canal magenta), escala bar 10 µm. (B) a mesma linha de celular foi tratada por 10 µM Wortmannin (WM). (C) células expressando o marcador citoplasmático DREPP2(Δ1-23). (D) o estimado de membrana plasmática de particionamento para todas as amostras. O significado de ambos os efeitos foi testado pela ANOVA de duas vias (p < 2,2 x 10^-16 * * * em ambos os casos; os dados originais foram transformados por raiz quadrada). Letras indicam grupos que não são significativamente diferentes entre si, conforme determinado pelo teste de Tukey HSD. Bigodes de caixa-parcelas indicam o intervalo de confiança de 95%. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Discussion

O método descrito aqui gera uma estimação mais acurada de membrana plasmática de particionamento para proteínas perifericamente associadas em comparação com outras abordagens baseadas em medir intensidades de fluorescência⁵. O grande avanço desse método é que leva em conta a difração de luz e superposição de membrana plasmática e os sinais citoplasmáticos. Embora estes resultados do método estão em correlação com os resultados de um método simples, baseado na comparação da intensidade de fluorescência na posição de membrana citoplasmática à média sinal (conforme mostrado anteriormente⁶), a principal vantagem deste método de romance é a determinação da variabilidade residual (inexplicada pela decomposição de sinal) que permite a estimativa da relevância dos resultados, especialmente onde o sinal de membrana plasmática é menor do que o sinal citoplasmático. O método descrito é também mais robusto para o sinal de ruído, porque o cálculo de proteína particionamento não se baseia em apenas um ponto.

A análise requer apenas imagens confocal única dois canais. Em contraste com o FRAP abordagens¹⁸ com base em medições de dinâmica de difusão da proteína em janelas de tempo mais longos, o método descrito é mais aplicável para métodos dinâmicos na vivo , quando a aquisição de imagem rápida é um requisito crítico ( por exemplo,, sinal explorações de transdução, ensaios inibitórios). O método é adequado para obter rapidamente grandes quantidades de dados que são suficientes para a avaliação estatística.

O método é limitado a apenas uma membrana única. A análise dos sinais de duas membranas pròxima adjacentes de células vizinhas não é suportada atualmente. Neste caso, a instalação de sinal é mais exigente com um risco maior de artefatos.

No entanto, a análise foi projetada originalmente para planta suspensão células¹⁵, e pode ser aplicado para as análises, bem como outros tipos de células. Tubos de pólen e pelos radiculares representam alvos potencialmente muito boas desse método em biologia vegetal. As membranas externas das células epidérmicas de planta podem ser analisadas após verificação anterior que as paredes celulares não são rotuladas por FM 4-64 e não exibem interferente autofluorescência. Células de Protista que estão livres de interferente autofluorescência, células de levedura, células fúngicas, bem como as células animais com a membrana plasmática Lisa podem ser analisadas usando o método descrito; no entanto, para as células animais não é possível a análise da distribuição de proteína na borda principal de células de fibroblastos ou na fronteira escova das células epiteliais. Devido às configurações de análise flexível, FM 4-64 coloração pode ser substituídas por outras abordagens de visualização da membrana plasmática, tais como fluorescente etiquetado proteínas. Com cuidado, o método pode ser usado para células fixas.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
FM 4-64	ThermoFisher Scientific	T13320	Plasma membrane dye
Dimethyl sulfoxide	Sigma-Aldrich	D4540 Sigma	Dye solvent
Ordinary equipment (microscopic slides, pipettes, tips, tubes)			Equipment for cell labelling and microscopy
Confocal laser scanning microscope
Ordinary computer