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Immunology and Infection

Caracterización de las respuestas de isotipo de inmunoglobulina dependiente del timo y timo-independiente en ratones usando el análisis enzima-ligado del inmunosorbente

Published: September 7, 2018 doi: 10.3791/57843
Automatic Translation
1, 1, 2,3
1Department of Cell Biology and Neuroscience and Graduate Program in Cellular and Molecular Pharmacology, Rutgers University, 2Department of Cell Biology and Neuroscience, Rutgers University, 3Rutgers Cancer Institute of New Jersey

Summary

En este artículo se describe un protocolo para caracterizar las respuestas de isotipo de inmunoglobulina (Ig) T dependientes y T independientes en ratones usando ELISA. Este método se usa solo o en combinación con el flujo cytometry permitirá a los investigadores identificar las diferencias en las respuestas de isotipo de Ig mediada por células B en ratones después de la inmunización de antígenos T dependientes y T independientes.

Abstract

Anticuerpos, también llamados como distinguen de inmunoglobulinas (Ig), secretadas por los linfocitos B, células de plasma plasmablasts, en la inmunidad humoral proporcionan una formidable defensa contra la invasión de patógenos a través de diversos mecanismos. Un objetivo importante de la vacunación es inducir anticuerpos protectores específicos de antígeno para prevenir las infecciones mortales. Tanto timo dependiente (TD) y antígenos de timo-independientes (TI) pueden provocar respuestas de IgM específica de antígeno sólidas y también pueden inducir la producción de anticuerpos de isotipo-switched (IgG, IgA e IgE) así como la generación de células de memoria B con la ayuda proporcionado por el antígeno que presenta las células (APCs). Aquí, describimos un protocolo para caracterizar las respuestas del TD y TI Ig isotipo en ratones usando el análisis enzima-ligado del inmunosorbente (ELISA). En este protocolo, TD y TI Ig respuestas son sacadas en ratones por inmunización intraperitoneal (i.p.) con antígenos conjugado hapteno-modelo PNT-KLH (en alumbre) y PNT-polisacárido (PBS), respectivamente. Para inducir la respuesta de memoria TD, una inmunización de refuerzo de PNT-KLH en alumbre se da en 3 semanas después de la primera vacunación con el mismo antígeno/adyuvante. Suero de ratón es cosechada en diferentes puntos temporales antes y después de la inmunización. Total niveles de Ig y anticuerpos específicos a la PNT posteriormente se cuantifican utilizando Ig isotipo específica Sandwich y ELISA indirecto, respectivamente. Para cuantificar correctamente la concentración de suero de cada isotipo de Ig, las muestras deben diluirse adecuadamente para encajar dentro de la gama linear de las curvas estándar. Usando este protocolo, siempre hemos obtenido resultados confiables con sensibilidad y alta especificidad. Cuando se utiliza en combinación con otros métodos complementarios como la citometría de flujo, en vitro cultura de esplénico de células B e immunohistochemical tinción (IHC), este protocolo permitirá a los investigadores obtener una comprensión completa del anticuerpo respuestas en un entorno experimental dado.

Introduction

Los linfocitos B son el jugador principal en la inmunidad humoral y el único tipo de célula en mamíferos que son capaces de producir anticuerpos, denominados también como inmunoglobulinas (Ig)1,2. Anticuerpos secretados por las células de B proporcionan una defensa formidable contra los invasores patógenos a través de diversos mecanismos incluyendo la opsonización, neutralización y activación del complemento, conduciendo a inmunidad protectora3. Secreción de anticuerpos por las células B se logra después de la completa activación de células B específicas, que normalmente requiere que dos distintas señales3. Señal 1 es retransmitida por atascamiento directo del antígeno (Ag) al receptor de células B (BCR) expresado en la superficie de ingenuo específico B células3. Dependiendo de la fuente de señal 2, activación de la célula de B puede dividirse en timo dependiente (TD) o timo-independientes (TI)3,4. En una respuesta de antígeno TD, 2 señal es proporcionada por cognado T CD4 helper (TH) las células activadas, que expresan CD154, el ligando para el receptor coestimuladoras CD40 expresado en las células de B1,2,3. En una respuesta antígeno TI señal 2 viene de cualquier participación de receptores Toll-like (TLRs en el caso del tipo 1 TI Ag) o Cross-linking extenso de las BCRs (en el caso del tipo 2 TI Ag) en la B células3,4. Antígenos de TI (TI-1) de tipo 1 son ligandos microbianos de TLRs, incluyendo lipopolisacáridos bacterianos (LPS), RNAs virales y CpG de ADN microbiano4,5. Tipo 2 TI (TI-2) antígenos tienen estructura altamente repetitiva y son capaces de entregar prolongada y persistente de señalización a la célula de B por varios Cross-linking de la BCRs4,6. Típicos los antígenos TI-2 ejemplos de polisacáridos de neumococos y polisacárido conjugado hapteno-6,7. Antígenos de TD y TI pueden provocar respuestas de IgM específica de antígeno sólidas y también pueden inducir la producción de anticuerpos de isotipo-switched (IgG, IgA e IgE) con la ayuda brindada por el antígeno que presenta las células (APCs), como las células dendríticas (DCs)1 ,2,3. Además, TD y TI antígenos son capaces de inducir respuestas de memoria con la ayuda de APC, pero TD antígenos son más eficientes en la inducción de memoria células B generación3,8.

En este protocolo, TD y TI Ig respuestas son sacadas en ratones por la inmunización intraperitoneal (i.p.) con hemocianina de Lapa 2,4,6-trinitrophenyl-cerradura modelo hapteno conjugado antígenos (PNT-KLH) y PNT-polisacárido (neutro, muy ramificado y la Misa), respectivamente9,10,11. Antígenos de TD se utilizan generalmente con un adyuvante para mejorar la producción de anticuerpos12. Aquí en nuestro protocolo, PNT-KLH se inyecta con el alumbre, un coadyuvante utilizado en estudios de inmunización12. Otros ejemplos de aditivos que pueden utilizarse son completo o incompleto adyuvante de Freund (CFA o IFA), monophosphoryl-lípido A / dicorynomycolate de trehalosa (adyuvante de "Ribi del") y oligodeoxynucleotides de CpG, etc.13, 14. después de la inmunización, sueros de ratón son cosechados en diferentes puntos temporales y anticuerpos de PNT específicos en el suero se cuantifican utilizando Ig isotipo específica enzima-ligado del inmunosorbente (ELISA) de ensayo9,10, 11.

ELISA es un ensayo basado en la placa que es ampliamente utilizado como una herramienta de diagnóstico en medicina y también como una herramienta de análisis en investigación biomédica15,16. Se utiliza para detectar y cuantificar analitos como anticuerpos, hormonas, citoquinas, quimiocinas y varios antígenos, etcetera. ELISA se puede realizar en varios formatos diferentes, incluyendo directo, indirecto, sandwich y competitivo ELISA15,16. En general, implica la inmovilización del antígeno en una superficie sólida, generalmente una placa de microtitulación de 96 pocillos, que se incuba con un anticuerpo primario. Después de la incubación, el anticuerpo no Unido se lava lejos. En un ELISA directo, el anticuerpo primario directamente se conjuga a una enzima (generalmente la peroxidasa de rábano o fosfatasa alcalina), que puede unirse un sustrato cromogénico para producir un cambio de color visible detectado por un instrumento de detección de señal como un Espectrofotómetro15,16. Por el contrario, si un anticuerpo enzima-ligado del secundario se utiliza para enlazar el anticuerpo primario, entonces esto se considera como un indirecto ELISA15,16. ELISA directo es más rápido mientras que ELISA indirecta es más sensible15,16. En un sandwich ELISA, las placas están recubiertas con un anticuerpo de la «captura» utilizado para inmovilizar el antígeno de interés en las muestras, y luego puede detectarse el antígeno capturado por otro anticuerpo de la "detección" de una manera directa o indirecta15, 16. ELISA Sandwich ofrece alta especificidad ya que el antígeno es detectado por dos diversos anticuerpos del antígeno. En un ELISA competitivo, la competencia se establece entre el antígeno de la muestra y el antígeno de limite de placa de unión del anticuerpo primario, y entonces la concentración de antígeno en la muestra se cuantifica midiendo la reducción de señal del substrato 15 , 16. ELISA competitivo puede realizarse utilizando el formato mencionado directo o indirecto y es útil para la detección de antígenos pequeños con un único epitopo15,16.

Técnicas alternativas para la medición de anticuerpos incluyen radio-inmunoanálisis (RIA), electrochemiluminescence (ECL) ensayo y superficie de resonancia de plasmon (SPR) ensayo17. RIA fue el primer inmunoensayo desarrollado que medidas la presencia de un antígeno (o anticuerpos) de alta especificidad y sensibilidad usando reactivos radiactivos18,19. Sin embargo, debido a las preocupaciones de toxicidad radioactiva, sus costes de eliminación, vida útil y licencias especiales para trabajar con materiales radioactivos, ELISA es la mejor y más conveniente técnica común utiliza20,21. ECL es un ensayo altamente sensible que reacciones de quimioluminiscencia se inician usando electricidad para generar especies altamente reactivas a partir de precursores estables en la superficie de un electrodo y pueden ser utilizadas para medir la cantidad de analitos (como antígenos o anticuerpos)22. Sin embargo, ECL requiere un instrumento especial y por lo tanto no es tan ampliamente usado como ELISA23. SPR es un ensayo directo que puede utilizarse para medir la Unión de ligandos (por ej., anticuerpos) para inmovilizar moléculas (e.g., antígenos) en un sensor chip superficial24. SPR detecta las interacciones en tiempo real muy concreto y no requiere el uso de reactivos etiquetados como ELISA. Sin embargo, el SPR también requiere un equipo especial y tiene menor sensibilidad que el ELISA17. Dadas las limitaciones de los métodos alternativos, ELISA es la técnica más adecuada y conveniente para nuestro propósito en este protocolo. Aquí, describimos el uso de sandwich ELISA para el análisis de los niveles totales de isotipo de Ig y los procedimientos de ELISA indirecto para el análisis de los isotipos de Ig específica de antígeno.

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Protocol

Este protocolo sigue las directrices del Comité de ética institucional de investigación animal de la Universidad de Rutgers. Todos los ratones se utilizan con arreglo a las directrices de los NIH y bajo un protocolo animal aprobado por la institucional Animal cuidado y uso.

1. preparación de ratones y recogida de sueros de ingenuo ratón

  1. Mantenga todos los ratones para los experimentos de inmunización en un específico Animalario libre de patógenos.
  2. Nocaut de sexo-emparejado, joven adulto (8-12 semanas) de uso y littermate control de ratones que comparten los mismos padres y jaulas para los estudios de inmunización.
  3. Plan de vacunación los horarios de recogida de suero como se muestra en la figura 1.
  4. La cosecha ingenuo suero de cada ratón en 7 días (-7 días) antes de la vacunación. Seguir los retro-orbitales sangrado suero preparación procedimientos y como se detalla a continuación en el paso 4.

2. elaboración de PNT-polisacárido (un antígeno de TI) y PNT-KLH (un antígeno de TD)

  1. Disolver los polvos de antígeno en PBS estéril (pH 7,4) a hacer 0,5 mg/mL 1 mg/mL de las soluciones madre PNT-KLH y PNT-polisacárido. Alícuota cada antígeno común solución en tubos estériles de microcentrífuga a 0,5 mL/tubo y mantener las alícuotas a-80 ° C para almacenamiento a largo plazo. Evitar congelar y descongelar las alícuotas de antígeno múltiples.
  2. En el día de la inyección, calcular el volumen de PNT-polisacárido (50 μg/100 μl/ratón) o PNT-KLH (100 μg/100 μl/ratón) necesarios según el número de ratones que se inyecta. Descongelar el número apropiado de PNT-polisacárido o PNT-KLH alícuotas a temperatura ambiente (RT).
  3. Para la inyección de PNT-KLH, primero diluir el coadyuvante de alumbre (40 mg/mL) y 3 volúmenes de PBS estéril a una concentración final de 10 mg/mL. Asegúrese de que la mezcla de coadyuvante de alumbre es bien suspendida antes de la dilución.
  4. Combinar un volumen igual de 10 mg/mL alumbre coadyuvante de la mezcla del paso 2.3 y la solución de PNT-KLH descongelada (1 mg/mL) en un tubo de polipropileno de 5 mL y mezclar bien, incubar a 37 ° C durante 30 minutos preparar este PNT-KLH/alumbre la mezcla recién antes de la inyección.

3. inmunización de ratones

  1. Realizar la inyección intraperitoneal (i.p.) de PNT-polisacárido o PNT-KLH/alumbre para inmunizar los ratones con jeringas de insulina de 1 mL en un gabinete de bioseguridad. Inserte la aguja en ángulo de aproximadamente 30° preferentemente en el cuadrante inferior derecho de cada ratón para evitar la inyección en los órganos internos.
  2. Inyección i.p. 100 μl de PNT-polisacárido por ratón en el día 0 para la inmunización de TI Ag (figura 1A).
  3. En el día 0 para la vacunación de TD Ag inyectar la i.p. 200 μL de la mezcla de PNT-KLH/alumbre (recién preparada en el paso 2.4) por ratón. Repita la misma inyección el día 21 como una vacunación de refuerzo para estudios de memoria (figura 1B).
  4. Después de la inyección, retomar cada ratón de su jaula y mantener todos los ratones inyectados en condiciones libres de patógenos específicos.

4. retro-orbital sangrado y preparación de suero

  1. Suero de ratón en diferentes momentos de la cosecha: para la inmunización de PNT-polisacárido, recoger suero de ratón en el día -7 y 7 (figura 1A); para la inmunización de PNT-KLH/alum, recoger suero de ratón día -7, 7, 14 y 28 (figura 1B).
  2. Para retro-orbital sangrado, anestesiar cada ratón con isoflurano 5% 1-2 min en un gabinete de bioseguridad25. Realizar el reflejo pedal para asegurar adecuada anestesia de cada ratón.
  3. Sostenga el ratón anestesiado en una mano con el índice y el pulgar tirando la piel que rodea el globo ocular para que el globo ocular sobresale de la toma25. Inserte un tubo capilar o pipeta Pasteur no heparinizada en un ángulo de 45° en el ángulo interno de la cavidad del ojo debajo del globo ocular25.
  4. Aplique presión suave hacia abajo y gire el tubo suavemente para romper en la vena y recoge 150 – 200 μL de sangre en la pipeta o tubo o pipeta. Inmediatamente transferir la sangre a un tubo de microcentrífuga de 1,5 mL estéril y retomar el ratón de su jaula para recuperar.
  5. Deje que la sangre muestras sentarse a temperatura ambiente durante 1-2 h para coagular.
  6. Centrifugar las muestras de sangre coagulada a 13.000 x g por 10 min a 4 ° C. Transferir el suero claro sobre el coágulo de sangre a un tubo nuevo de microcentrífuga de 1,5 mL estéril.
  7. Repita el paso 4.6 una vez más para eliminar el coágulo de sangre residual y recoger el suero claro.
  8. Alícuota del suero en tubos de microcentrífuga de 1,5 mL estéril en 50 μl/tubo y almacenar los sueros a-80 ° C.
  9. Alternan el ojo para el sangrado en diferentes puntos temporales para que cada ojo es purgar a lo más dos veces para el experimento entero. En la terminal del sangrado, recoger a 1 mL de sangre de cada ratón antes de eutanasia. Eutanasia el ratón con 5% CO2 seguido por dislocación cervical.
    Nota: Las células de B esplénico pueden ser cosechadas en vitro cultura estudios y análisis de citometría de flujo. También preparamos el ADN genómico de esplenocitos verificar el genotipo de cada ratón.

5. ratón Ig isotipo específica ELISA

  1. Preparar los buffers y soluciones antes de ELISA.
    1. Preparar 500 mL de tampón de acoplamiento (PBS, pH 7,4).
    2. Preparar 500 mL de solución de lavado (PBS-T (0,05% Tween 20), pH 7,4).
    3. Preparar 100 mL de tampón de bloqueo (1% de BSA en PBS, pH 7,4, almacenado a 4 ° C).
    4. Preparar 1 L de tampón de sustrato (dietanolamina de 1 M, pH 9.8 (97 mL de dietanolamina en 1 L de H2O, pH ajustado con 10 M de HCl) y 0,5 mM de MgCl2). Proteger el tampón de sustrato de luz envolviendo la botella con papel de aluminio. Almacenar a 4 ° C.
    5. Preparar 100 mL de solución de parada (3 M NaOH).
  2. Cubrir las placas de ELISA:
    1. Para el isotipo de Ig del suero total ELISA, capa de placas de 96 pocillos inmuno con 10 μg/mL de isotipo-específicos de captura del anti-ratón policlonal de cabra Ig (M, G1, G2a, G2b, G3, A o E) Abs en acoplamiento Buffer (PBS) a 100 μL/pocillo.
    2. Para PNT específicos Ig isotipo ELISA, capa de placas de 96 pocillos inmuno con 10 μg/mL de PNT(38)-BSA en PBS en 100 μL/pocillo.
    3. Para el isotipo de Ig PNT específicos de alta afinidad ELISA, capa de placas de 96 pocillos inmuno con 10 μg/mL de PNT(3)-BSA en PBS con 100 μL/pocillo26. Incubar las placas a 4 ° C durante la noche.
  3. Después de la incubación de la capa, lavar los platos 2 veces con 200 μL/pocillo de PBS-T. Desechar el tampón de lavado y la mancha blanca /negra seco las placas (pulse cada plato boca abajo sobre una pila de toallas de papel) después de cada lavado.
  4. Bloquear las placas: agregar 200 μL/pocillo de bloqueo (1% de BSA en PBS) en las placas de recubrimientos e incubar las placas durante 1 h a TA.
  5. Mientras que las placas están bloqueando, preparar las diluciones de Ig isotipo estándares y las muestras de suero en Buffer de bloqueo en una placa de 96 pocillos separada, no tratada en 150 μL/pocillo.
    1. Preparar 250 estándares de isotipo de Ig ng/mL la concentración estándar inicial (St01) y hacer de 7 a 10 de diluciones seriadas 1:2 de las normas de Ig (St02 St07 o St10, figura 2A).
    2. Preparar suero de ratón muestras a una dilución 1: 100 o 1: 500 del factor como la dilución partida y hacen 3 o 4 de 1:10 diluciones seriadas para el isotipo de Ig total o diluciones seriadas de 1:5 para el isotipo de Ig PNT específico de cada muestra de suero (figura 2A). Para IgE ELISA, preparar las muestras de suero de ratón en un factor de dilución 1:2 como la dilución partida y hacer 3 de diluciones seriadas de 1:5 de cada muestra de suero.
  6. Después de bloquear, lavar los platos en el paso 5.4 tres veces con 200 μL/pocillo de PBS-T y blot seque las placas después de cada lavado.
  7. Transferir 100 μL/pocillo de diluido normas de isotipo de Ig (apropiadas para la captura y detección Abs) y las muestras de suero diluido de paso 5.5 a los platos preparados en el paso 5.6. Incubar las placas con los estándares y las muestras a 4 ° C durante la noche.
  8. Lavar los platos 3 veces con 200 μL/pocillo de PBS-T y la mancha blanca /negra seco las placas después de cada lavado.
  9. En cada plato, añadir 100 μL/pocillo de 10 μg/mL de una apropiado fosfatasa alcalina (AP)-conjugados de isotipo-específicos de cabra anti-ratón Ig (M, G1, G2a, G2b, G3, A o E) Abs diluido en Buffer de bloqueo.
  10. Incubar las placas con Abs AP conjugado para el 1-2 h a TA. Para la detección de IgE, incubar las placas durante 1 – 2 h a 37 ° C.
  11. Preparar 1 mg/mL de solución de sustrato mediante la disolución de dos tabletas de sustrato de la fosfatasa de 5 mg en 10 mL de Buffer sustrato.
  12. Lavar la placa 5 veces con 200 μL/pocillo de PBS-T y la mancha blanca /negra seco las placas después de cada lavado.
  13. Añadir 100 μL/pocillo de solución sustrato a cada plato. Permite la reacción a desarrollar en el RT, que generalmente toma sólo unos minutos.
  14. Leer cada placa a 405 nm usando un lector de microplacas con su software asociado.
    1. Haga clic en "configuración" para establecer las longitudes de onda "Lm1" en "405 nm" y haga clic en "OK".
    2. Haga clic en "plantilla" para asignar wells "en blanco", "normas" pozos y pozos "desconocida" según la configuración de la placa de 96 pocillos.
    3. Para los pozos de "normas", haga clic en "serie" para establecer la "Primera muestra"como"St01", seleccione "Comenzar desde" en el "Top" y establecer "Replica" como "2". Compruebe"Muestra Descriptor" y "Valor estándar": seleccione "unidades"como"ng/mL", "valor inicial" como "250", sistema "paso a" como "2". Haga clic en "OK".
    4. Haga clic en "Leer" para leer la placa cuando más concentraron estándar alcanza una densidad óptica (OD) de ~ 1.
    5. Haga clic en el menú "archivo" y haga clic en "Guardar" para guardar el archivo.
    6. Haga clic en "leer" para leer la placa otra vez cuando el estándar de mayor concentración acerca a OD405 de ~ 1,5, 2 y 2.5, respectivamente.
  15. Detener la reacción añadiendo 25 μL/pocillo de 3 M NaOH. Realice los pasos 5.12 a 5.15 para una placa a la vez.
  16. Analizar los datos de ELISA utilizando el software asociado con el lector de microplaca:
    1. Compruebe los valores de OD405 de las normas de isotipo de Ig de leerlas archivos y seleccione una lectura apropiada con buen alcance lineal de las normas para el análisis de datos detallados.
    2. Seleccione el programa de instalación de 4 parámetros para trazar curvas estándar. Compruebe el coeficiente de la curva estándar (R2), que se necesitan para ser > 0.98 para asegurar datos buena calidad.
    3. Compruebe si los valores de OD405 de cada muestra de disminuyen con el aumento de factores de dilución. Clic en "Desconocidos" para recuperar la concentración de todos los pozos de muestra diluida.
    4. Seleccione un bien apropiado de cada muestra con OD405 en el rango lineal de la curva estándar del isotipo de Ig para el cálculo de la concentración.
    5. Calcular el suero la concentración de isotipo Ig de cada muestra utilizando la fórmula: suero la concentración de Ig = concentración bien seleccionado x factor de dilución.
  17. Trazar gráficos y realizar análisis estadísticos utilizando un software apropiado9,10,11. Hacer diagramas de dispersión vertical de suero niveles de isotipo de Ig para comparar las respuestas de Ig en el mismo punto de tiempo. Estudios de respuesta de memoria TD, hacer las curvas de respuesta del curso del tiempo a examinar las respuestas de isotipo de Ig antes y después de la vacunación del aumentador de presión. Usar barras de error para mostrar la desviación estándar (SD) de cada grupo de muestras. Para comparar las respuestas de isotipo de Ig entre los dos genotipos de ratones, use la prueba t para dos colas de datos para determinar la significación estadística. Establezca el valor de p < 0.05 como significativamente diferentes.

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Representative Results

Hemos utilizado este protocolo para investigar las funciones de un regulador crítico del sistema inmune, TRAF3, TI y TD Ig isotipo respuestas9,10,11. TRAF3 directa o indirectamente regula la transducción de la señal de un número de receptores inmunes innatos y adaptativos, incluyendo la superfamilia de receptores TNF, receptores Toll-like y T de la célula del receptor/CD28, entre otros27,28. Presumimos que TRAF3 desempeña diferentes roles en subconjuntos diferentes de la célula inmune para regular respuestas de anticuerpos. Para probar esta hipótesis, se determinan a TI y TD Ig isotipo respuestas usando condicional TRAF3 el ratones knockout que tienen el gen Traf3 eliminado específicamente en las células B, células T o células mieloides, respectivamente9,10, 11. Representante de inmunización y sueros horarios de colección para TI y TD Ig son representados en la figura 1. Representante de IgG1 e IgG2b ELISA resultados se muestran en la figura 2 y figura 3 para ilustrar cómo funciona la ELISA. Estos incluyen la configuración de la placa de normas diluidas y muestras (figura 2A), una imagen de la placa después de la adición del sustrato AP (figura 2B), los resultados de lectura de OD405 (figura 2C, 2D), los valores de las diluciones estándar (figura 2E, 2F), las curvas estándar (figura 3A, 3B), los valores de las muestras diluidas (figura 3C, 3D) y el cálculo de suero IgG1 e IgG2b concentraciones en las muestras (figura 3E, 3F). La figura 4 muestra resultados representativos del total isotipos de Ig en suero de ratones ingenuos. Hemos demostrado estadísticamente basal niveles crecientes del suero de IgM, IgG2a, IgG2b, IgG3 e IgA en células B específicas TRAF3- / - (TRAF3 B- / -) ratones, en comparación con género y edad-emparejaron TRAF3 suficiente littermate control ratones (LMC). Este hiperglobulinemia de ratones- / - B-TRAF3 es causada por el compartimiento expandido de células B en los órganos linfoides periféricos debido a la prolongada supervivencia de maduro TRAF3- / - B células9. La figura 5 muestra los resultados representativos de TI y TD Ig isotipo respuestas de ratones a la inmunización con PNT-polisacárido y PNT-KLH, respectivamente. Estos resultados revelaron a TI significativamente mayor, IgG3 PNT específico nivel y también elevada TD, IgG2b PNT específicos niveles en mieloide célula-específica TRAF3- / - (TRAF3 M- / -) ratones que en la LMC. Tal aumento TI IgG3 y TD IgG2b respuestas observadas en ratones- / - M-TRAF3 probablemente debido al aumento de la producción de citoquinas proinflamatorias IL-6 e IL-12 macrófagos- / - TRAF3 y DCs después de vacunación11. La figura 6 muestra los resultados representativos de TD primario y las respuestas de la memoria de ratones a la inmunización de PNT-KLH. Estos resultados demostraron respuesta primaria de IgM TD parcialmente disminuida y primario defectuoso IgG1 y las respuestas de la memoria en ratones- / - (T-TRAF3- / -) de células T específicas TRAF3. El primario defectuoso TD y las respuestas de memoria resultado de ratones- / - T-TRAF3 de activación deteriorada de TRAF3- / - células de T CD4 receptor de células T y CD28 compromiso Co10. Tomados en conjunto, el protocolo descrito en este artículo nos permitida delinear los roles específicos de TRAF3 de subconjuntos diferentes de célula inmune en la regulación de TI y TD Ig isotipo respuestas en ratones.

Figure 1
Figura 1 : Horarios de colección típica de TI y TD Ag vacunas y suero. (A) PNT-polisacárido experimentos. (B) PNT-KLH experimentos. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 2
Figura 2 : Representante IgG1 e IgG2b ELISA. (A) la configuración de la placa de 96 pocillos incluye los pozos de vacío, 7 diluciones seriadas (1:2) de mouse IgG1 y IgG2b estándares (St01 para St07), y 4 diluciones seriadas (en 1:10) del suero de 8 ratón muestras (S1 a S8). La concentración de los estándares se da bien en la parte inferior de cada norma. El factor de dilución de las muestras se da bien en la parte inferior de cada muestra. (B) una imagen de la placa en 5 min después de la adición del sustrato AP. La placa Lee resultados de IgG1 (C) y IgG2b (D) a 405 nm. Los valores de concentraciones de diferentes diluciones de mouse IgG1 (E) y mouse IgG2b y OD405 (F) normas. Conc, concentración; BackCalcConc, nuevo calcula concentración; OD, densidad óptica; AvgOD, OD promedio de las repeticiones; SD, desviación estándar. CV, coeficiente de variación. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 3
Figura 3 : Representante IgG1 e IgG2b ELISA análisis de datos. Las curvas estándar de IgG1 (A) y IgG2b (B). El coeficiente R2 es > 0.98 en ambas curvas estándar. Las flechas indican el rango lineal de las curvas estándar. Valores de OD405 y concentración de IgG1 (C) y IgG2b (D) en incógnitas (muestras de suero diluido). R, rango; Conc, concentración. Cálculo de las concentraciones de suero de ratón de IgG1 (E) y IgG2b de ratón (F) para las 8 muestras. ND, no detectable por este ELISA. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 4
Figura 4 : Resultados representativos del total isotipos de Ig en el suero de ratones ingenuos. Sueros se obtuvieron de sexo-emparejado, 10-12 semanas de edad ingenuo LMC y B-TRAF3- / - ratones (n = 10 para cada genotipo; genética: 129xC57BL/6). Los niveles séricos basales de IgM total, IgG1, IgG2a, IgG2b, IgG3, IgA e IgE se determinaron mediante ELISA. Significación estadística se determinó con la prueba t para dos colas de datos. * significativamente diferente entre LMC y B-TRAF3- / - ratones (p < 0.05); **, muy significativamente diferentes entre los LMC y B-TRAF3- / - ratones (p < 0.01). Esta figura ha sido modificada de Xie et al. 9. haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 5
Figura 5 : Resultados representativos de TI y TD Ig isotipo respuestas a inmunización PNT-polisacárido y PNT-KLH, respectivamente. Sexo-emparejado, 8-12 semanas de edad LMC y M TRAF3- / - ratones (fondo genético: C57BL/6) fueron inmunizados con 50 μg de TI Ag PNT-polisacárido (panel superior, n = 9 para cada genotipo) o 100 μg de TD Ag PNT-KLH mezclado con alumbre (panel inferior, n = 12 para cada uno genotipo). Sueros fueron recogidos en el día 7 después de la inmunización. Títulos séricos de anti-PNT IgM, IgG1, IgG2b, IgG3, IgA e IgE se analizaron por ELISA. Significación estadística fue analizada con la prueba t para dos colas de datos. * significativamente diferente entre LMC y M TRAF3- / - ratones (p < 0.05). Esta figura ha sido modificada desde Lalani et al. 11. por favor haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 6
Figura 6 : Resultados representativos de TD primario y memoria Ig las respuestas a la inmunización de PNT-KLH. Sexo-emparejado, 8-10 semanas de edad LMC y TRAF3 T- / - ratones (n = 10 para cada genotipo; genética: 129xC57BL/6) fueron inmunizados con 100 μg de TD Ag PNT-KLH mezclado con alumbre en el día 0. Cada ratón también había recibido una inmunización de refuerzo con el mismo Ag y adyuvante el día 21 después de la primera inmunización. Muestras de suero fueron recogidas de los ratones en el día -7, 7, 14 y 28, respectivamente. Niveles de IgM e IgG1 PNT específicos en muestras de suero fueron medidos por ELISA. Los gráficos representan los resultados de 10 pares de LMC y T TRAF3 ratones- / - (media ± SD). Significación estadística fue analizada con la prueba t para dos colas de datos. * significativamente diferente entre LMC y TRAF3 T- / - ratones (p < 0.05); **, muy significativamente diferentes entre los LMC y TRAF3 T- / - ratones (p < 0,01); , altamente significativamente diferentes entre los LMC y TRAF3 T- / - ratones (p < 0,001). Esta figura ha sido modificada de Xie et al. 10. haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Discussion

Aquí, describimos el protocolo para la caracterización de las respuestas del TD y TI Ig isotipo en ratones usando ELISA. Exitosa implementación de este protocolo requiere el uso de materiales especificados en la tabla 1, incluyendo placas de ensayo ELISA, inmunización Ags, anticuerpos de isotipo-específicos de Ig de ratón y las normas. Debe tener cuidado de evitar el uso de las placas de cultivo de tejidos tratado para ELISA. Diluciones de los estándares y las muestras de suero deben ser en placas separadas sin tratar (fondo redondo) y luego en las placas de ELISA. Usando este protocolo, siempre hemos obtenido resultados confiables con sensibilidad y alta especificidad.

Pasos críticos en este protocolo incluyen inmunización Ag, sangrado retro orbital y ELISA específicos de isotipo de Ig. Para la vacunación de TD Ag, mezcla de PNT-KLH/alumbre debe ser completamente suspendida para asegurar que correcta cantidad de Ag/adyuvante se inyecta. Si los coágulos de sangre en la pipeta o tubo capilar durante el sangrado retro orbitario, inmediatamente cambie a un nuevo tubo de la pipeta o tubo capilar. Buffers y reactivos ELISA deben ser soluciones claras y no deben contener precipitados, que pueden dar resultados falsos positivos con valores anormales de405 de OD. Además, deben evitarse las burbujas en los pozos en todos los pasos de ELISA, que también pueden dar resultados falsos positivos o falsos negativos con valores anormales de405 de OD. Estos errores ocasionales pueden ser minimizados mediante el análisis de las muestras por duplicado. Pasos de lavado en ELISA quitar los reactivos y anticuerpos de los pozos. Lavado insuficiente causa mucho ruido de fondo, pero lavado excesivo puede conducir a una disminución en la sensibilidad mediante la eliminación de antígenos recubiertos o límite de anticuerpos29. El número de tiempos de lavado que se describen en el presente Protocolo de ELISA está optimizado en base a nuestra experiencia.

Cabe señalar que ELISA tiene límites de detección, que generalmente son definidos por el rango lineal de las curvas estándar. Para cuantificar correctamente la concentración de suero de cada isotipo de Ig, las muestras deben diluirse adecuadamente para encajar dentro de la gama linear de las curvas estándar. Recomendamos probar diluciones seriadas de las muestras para seleccionar los factores de dilución para el cálculo de la concentración de Ig como se describe en este protocolo. Sin embargo, si los resultados muestran que los factores de dilución probados no dan resultados en el rango lineal de la curva estándar, adicional ELISA necesita llevar a cabo utilizando factores de dilución ajustadas según los resultados iniciales de ELISA. Si todas las diluciones probadas están por debajo del límite de detección inferior, originales muestras de suero y factores de dilución menores deben usarse. Si OD405 valores no muestran disminución proporcional con aumento de factor de dilución de diluciones en serie todos probado, esto indica que la captura Ab o Ag de recubrimiento está saturado por todas las muestras diluidas y más deben usarse factores de dilución mayor. Siguiendo este protocolo, se obtendrán resultados concluyentes con a lo más 2 rondas de ELISA.

Factores que influyen en las respuestas del anticuerpo en ratones incluyen la cepa (fondo genético), género, edad, dieta y Animalario entorno30,31,32,33,34 . Por ejemplo, aunque muchas cepas de ratón producen IgG2a, ciertas cepas como ratones C57BL/6 no producen IgG2a pero producen IgG2c en lugar de35,36. La evidencia reciente también identifica microbiota comensal como un factor que afecta el anticuerpo respuestas37,38,39,40. Tomar estos factores en consideración, recomendamos el uso de pareados por sexo, los jóvenes adultos hermanos de camada de genotipos distintos que comparten los mismos padres y jaulas para los experimentos de vacunación de TD y TI Ag. Además, variación de ratón a ratón se observa con frecuencia para los ratones del mismo genotipo (figura 4–6), suficientes números repetidos (por lo general, n > 8) de los ratones se necesitan para que cada genotipo o grupo para obtener estadísticamente resultados significativos.

La ELISA específicos de isotipo de Ig es útil en la determinación de los títulos de los diferentes isotipos de Ig. Sin embargo, este método solo no es suficiente para revelar las causas subyacentes de las diferencias observadas en los títulos de isotipo de Ig y por lo tanto a menudo se usa en combinación con una variedad de enfoques complementarios. Para distinguir si la diferencia en títulos de isotipo de Ig es causada por diferentes números de células B productoras de Ig o diferente eficacia de las células B en la producción de Ig, flujo cytometry41,42,43 y enzima-ligado Puede utilizarse ImmunoSpot (ELISPOT)43,44,45 . Para analizar la supervivencia de la célula B, proliferación y formación de centro germinal, métodos alternativos incluyen la citometría de flujo, en vitro cultura de esplénico de células B y la coloración immunohistochemical seguido por microscopía9,26 ,41,46,47. Para aclarar los cambios de isotipo de Ig cambiar las respuestas en las células de B, en vitro cultura esplénicas de células de B y cuantitativa RT-PCR de las transcripciones del germline de Ig de cadena pesada gene segmentos son comúnmente utilizado41,43 ,48,49. Para investigar la causa de las diferencias en la maduración de la afinidad, la hipermutación somática (SHM) del gen de cadena pesada de Ig está determinada por la secuencia de la región VDJ50,51,52. Para entender las diferencias en las respuestas de células B de memoria, la frecuencia y el número de subconjuntos de células B de memoria diferente después de inmunización de Ag puede ser analizada por el flujo cytometry usando recientemente identificado marcadores de células de memoria B de ratón, incluyendo el CD38, CD80, CD73, PD-L2, CD62L y CCR68,53,54,55. Juntos, estos métodos complementarios en combinación con el protocolo actual permitirá a los investigadores obtener una comprensión completa de las respuestas del anticuerpo en un entorno experimental dado.

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Disclosures

Los autores tienen intereses financieros que compiten.

Acknowledgments

Este estudio fue apoyado por los institutos nacionales de becas en salud CA158402 R01 (P. Xie) y R21 AI128264 (P. Xie), el Ministerio de defensa conceder W81XWH-13-1-0242 (P. Xie), un premio de piloto del cáncer Institute de New Jersey a través de la concesión número P30CA072720 del Instituto Nacional del cáncer (P. Xie), una subvención Biomédica de Busch (P. Xie), una beca Stollar Victor (Lalani a.) y Anne B. y James B. Leathem beca (S. Zhu).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
VersaMax Tunable Microplate Reader MDS Analytical Technologies VERSAMAX Equipment to read the plates
SOFTmax PRO 5.3 MDS Analytical Technologies SOFTmax PRO 5.3 Software for the plate reader
GraphPad Prism GraphPad Prism Software for graphing and statistics
TNP-AECM-polysaccharide (FICOLL) Biosearch Technologies F-1300-10 A TI Ag for immunization
TNP-KLH Biosearch Technologies T-5060-5 A TD Ag for immunization
TNP(38)-BSA Biosearch Technologies T-5050-10 (conjugation ratio: 38) Coating Ag for TNP-specific ELISA
TNP(3)-BSA Biosearch Technologies T-5050-10 (conjugation ratio: 3) Coating Ag for high affinity TNP-specific Ig
Imject Alum Fisher Scientific  PI-77161 Alum adjuvant for immunization
Falcon Polypropylene tubes Fisher Scientific  14-959-11A For incubation of TNP-KLH/alum
BD Insulin Syringe Fisher Scientific  14-829-1B For i.p. injection of mice
Immuno 96-Well Plates, Flat-Bottom Fisher Scientific  14-245-61 For ELISA
Untreated 96-Well Microplates, Round-Bottom VWR 82050-622 For serial dilutions of standards and samples
Phosphatase substrate, 5 mg Tablets Sigma S0942-200TAB AP substrate
Diethanolamine VWR IC15251690 A component of AP substrate buffer
Goat anti-mouse IgM SouthernBiotech 1020-01 Capture Ab for mouse IgM
Goat anti-mouse IgG1 SouthernBiotech 1070-01 Capture Ab for mouse IgG1
Goat anti-mouse IgG2a SouthernBiotech 1080-01 Capture Ab for mouse IgG2a
Goat anti-mouse IgG2b SouthernBiotech 1090-01 Capture Ab for mouse IgG2b
Goat anti-mouse IgG3 SouthernBiotech 1100-01 Capture Ab for mouse IgG3
Goat anti-mouse IgA SouthernBiotech 1040-01 Capture Ab for mouse IgA
Goat anti-mouse IgE SouthernBiotech 1110-01 Capture Ab for mouse IgE
AP-Goat anti-mouse IgM SouthernBiotech 1020-04 Detection Ab for mouse IgM
AP-Goat anti-mouse IgG1 SouthernBiotech 1070-04 Detection Ab for mouse IgG1
AP-Goat anti-mouse IgG2a SouthernBiotech 1080-04 Detection Ab for mouse IgG2a
AP-Goat anti-mouse IgG2b SouthernBiotech 1090-04 Detection Ab for mouse IgG2b
AP-Goat anti-mouse IgG3 SouthernBiotech 1100-04 Detection Ab for mouse IgG3
AP-Goat anti-mouse IgA SouthernBiotech 1040-04 Detection Ab for mouse IgA
AP-Goat anti-mouse IgE SouthernBiotech 1110-04 Detection Ab for mouse IgE
Mouse IgM standard BD Biosciences 553472 TNP-specific IgM, Clone  G155-228
Mouse IgG1 standard BD Biosciences 554054 TNP-specific IgG1, Clone  107.3
Mouse IgG2a standard BD Biosciences 556651 TNP-specific IgG2a, Clone  G155-178
Mouse IgG2b standard BD Biosciences 554055 TNP-specific IgG2b, Clone  49.2
Mouse IgG3 standard BD Biosciences 553486 KLH-specific IgG3, Clone  A112-3
Mouse IgA standard BD Biosciences 550924 Mineral oil-induced IgA, Clone  MOPC-320
Mouse IgE standard BD Biosciences 557079 TNP-specific IgE, Clone  C38-2

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Inmunología e infección número 139 antígeno timo dependiente (TD) timo-independientes (TI) el antígeno inmunoglobulina (Ig) isotipo de Ig respuesta de la memoria inmunización adyuvante análisis enzima-ligado del inmunosorbente (ELISA)
Caracterización de las respuestas de isotipo de inmunoglobulina dependiente del timo y timo-independiente en ratones usando el análisis enzima-ligado del inmunosorbente
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Lalani, A. I., Zhu, S., Xie, P.… More

Lalani, A. I., Zhu, S., Xie, P. Characterization of Thymus-dependent and Thymus-independent Immunoglobulin Isotype Responses in Mice Using Enzyme-linked Immunosorbent Assay. J. Vis. Exp. (139), e57843, doi:10.3791/57843 (2018).

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