Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Karakterisering van zwezerik-afhankelijke en Thymus-onafhankelijke Immunoglobulin Isotype reacties in muizen met behulp van Enzyme-linked Immunosorbent Assay

Published: September 7, 2018 doi: 10.3791/57843
Automatic Translation
1, 1, 2,3
1Department of Cell Biology and Neuroscience and Graduate Program in Cellular and Molecular Pharmacology, Rutgers University, 2Department of Cell Biology and Neuroscience, Rutgers University, 3Rutgers Cancer Institute of New Jersey

Summary

In deze paper beschrijven we een protocol karakteriseren T-afhankelijke en T-onafhankelijke immunoglobulin (Ig) isotype reacties in muizen met behulp van ELISA. Deze methode gebruikt alleen of in combinatie met stroom cytometry onderzoekers te identificeren van verschillen in de B-cel-gemedieerde Ig isotype reacties in muizen na T-afhankelijke en T-onafhankelijke antigeen immunisatie zal toestaan.

Abstract

Antilichamen, ook wel genoemd zoals immunoglobulinen (Ig), uitgescheiden door B-lymfocyten, plasmablasts/plasmacellen, Humorale immuniteit gedifferentieerde bieden een formidabele verdediging tegen invasie ziekteverwekkers via diverse mechanismen. Een belangrijk doel van vaccinatie is voor het opwekken van beschermende antigeen-specifieke antilichamen om levensbedreigende infecties te voorkomen. Zowel zwezerik-afhankelijke (TD) en zwezerik-onafhankelijke (TI) antigenen robuuste antigeen-specifiek IgM reacties kunnen uitlokken en ook de productie van isotype-switched antilichamen (IgG, IgA en IgE) kunnen veroorzaken evenals de generatie van geheugencellen B met behulp geboden door antigeen presentatie van cellen (APCs). Hier beschrijven we een protocol karakteriseren TD en TI Ig isotype reacties in muizen met behulp van de enzym-verbonden immunosorbent analyse (ELISA). In dit protocol, zijn TD en TI Ig reacties ontlokte bij muizen door intraperitoneaal (i.p.) immunisatie met hapten-geconjugeerde model antigenen TNP-HC (in aluin) en TNP-polysaccharide (in PBS), respectievelijk. Om te induceren TD geheugen reactie, wordt een booster immunisatie van TNP-HC in aluin gegeven op 3 weken na de eerste immunisatie met de dezelfde antigen/adjuvant. Muis sera worden geoogst op verschillende tijdstippen vóór en na immunisatie. Totaal serum Ig niveaus en TNP-specifieke antilichamen zijn vervolgens gekwantificeerd aan de hand van Ig isotype-specifieke Sandwich en indirecte ELISA, respectievelijk. Om correct kwantificeren de serumconcentratie van elke Ig isotype, moeten de monsters op passende wijze te passen binnen het lineaire bereik van de standaard curven worden verdund. Met behulp van dit protocol, hebben wij consequent betrouwbare resultaten verkregen met hoge specificiteit en de gevoeligheid. Wanneer gebruikt in combinatie met andere aanvullende methoden, zoals de stroom cytometry, in vitro cultuur van milt B-cellen en immunohistochemische zal kleuring (IHC), dit protocol toestaan onderzoekers een uitgebreide inzicht van antilichaam Reacties in een bepaalde experimentele setting.

Introduction

B-lymfocyten zijn de belangrijkste speler in de Humorale immuniteit en het enige celtype in zoogdieren die produceren antilichamen kunnen, ook aangeduid als immunoglobulinen (Ig)1,2. Antilichamen uitgescheiden door B-cellen zorgen voor een formidabele verdediging tegen invasie ziekteverwekkers via diverse mechanismen, met inbegrip van neutralisatie, opsonization en activering van de aanvulling, wat leidt tot protectieve immuniteit3. Secretie van antilichamen door B-cellen wordt alleen bereikt na volledige activering van bepaalde B-cellen, die normaal gesproken vereist dat twee verschillende signalen3. Signaal 1 doorgegeven door directe binding van het antigeen (Ag) naar de B-cel receptor (BHG) uitgedrukt op het oppervlak van specifieke naïef B cellen3. Afhankelijk van de bron van signaal 2, kan B-cel-activatie worden onderverdeeld in zwezerik-afhankelijke (TD) of zwezerik-onafhankelijke (TI)3,4. In een reactie TD antigeen wordt signaal 2 verzorgd door geactiveerde cognaat CD4 T helper (TH) cellen, die express CD154, de ligand voor de co-stimulatory receptor interactie CD40 uitgedrukt op B cellen1,2,3. In een reactie TI antigeen signaal 2 komt uit beide betrokkenheid van Toll-like receptoren (TLRs in het geval van type 1 TI Ag) of uitgebreide cross-linking van de BCRs (in het geval van type 2 TI Ag) op de B cellen3,4. Type 1 TI (TI-1) antigenen zijn microbiële liganden van TLRs, met inbegrip van bacteriële lipopolysacchariden (LPS), virale RNAs, en microbiële CpG DNA4,5. Type 2 TI (TI-2) antigenen zeer repetitieve structuur hebben, en zijn in staat om langdurige en voortdurende signalering naar de B-cel door meerdere cross-linking van de BCRs4,6. Typische voorbeelden van TI-2 antigenen zijn pneumokokken polysacchariden en hapten-geconjugeerde polysaccharide6,7. Zowel TD en TI antigenen robuuste antigeen-specifiek IgM reacties kunnen uitlokken en kunnen ook leiden tot de productie van isotype-switched antilichamen (IgG, IgA en IgE) met de hulp die geboden door antigeen presentatie van cellen (APCs) zoals dendritische cellen (DC's)1 ,2,3. Bovendien zowel TD en TI antigenen kunnen ertoe geheugen reacties met behulp van APCs, maar TD antigenen zijn efficiënter in inducerende geheugen B-cel generatie3,8.

In dit protocol zijn TD en TI Ig reacties ontlokte bij muizen door intraperitoneaal (i.p.) immunisatie met hapten-geconjugeerde model antigenen 2,4,6-trinitrophenyl-sleutelgat limpet hemocyanine (TNP-HC) en TNP-polysaccharide (neutraal, sterk vertakt en hoge-massa), respectievelijk9,10,11. TD-antigenen zijn het meestal gebruikt met adjuvans ter verbetering van de productie van antilichamen12. Hier in ons protocol, wordt TNP-HC geïnjecteerd met aluin, een veelgebruikte adjuvans in immunisatie studies12. Andere voorbeelden van hulpstoffen die kunnen worden gebruikt zijn volledig of onvolledig Freund van adjuvans (CFA- of IFA), monophosphoryl-lipide-A / trehalose dicorynomycolate ("Ribi" adjuvans), en apr oligodeoxynucleotides, etc.13, 14. na immunisatie, muis sera op verschillende tijdstippen worden geoogst en TNP-specifieke antistoffen in sera worden gekwantificeerd aan de hand van Ig isotype-specifieke enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA)9,10, 11.

ELISA is een plaat gebaseerde test die wijd is gebruikt als kenmerkend hulpmiddel in geneeskunde en ook als een analytisch hulpmiddel in biomedisch onderzoek15,16. Het wordt gebruikt voor het detecteren en kwantificeren van de analyten met inbegrip van antilichamen, hormonen, cytokinen, chemokines, en verschillende antigenen, enz. ELISA kan worden uitgevoerd in verschillende indelingen, met inbegrip van directe, indirecte, sandwich en competitieve ELISA15,16. In het algemeen, het gaat om de immobilisatie van het antigeen op een effen oppervlak, meestal een 96-wells microtiterplaat plaat, die is geïncubeerd met een primair antilichaam. Na incubatie is het unbound antilichaam weggewassen. In een directe ELISA, is het primaire antilichaam direct geconjugeerd met een enzym (meestal mierikswortelperoxidase of alkalische fosfatase), die een chromogenic substraat klieven kan om de opbrengst van een zichtbare kleurverandering gedetecteerd door een signaal-detectie-instrument, zoals een spectrofotometer15,16. Daarentegen als een enzym-verbonden secundair antilichaam wordt gebruikt voor het binden van het primaire antilichaam, wordt dan dit beschouwd als een indirecte ELISA15,16. Directe ELISA is sneller terwijl indirecte ELISA gevoeliger15,16 is. De platen zijn bekleed met een "capture" antilichaam gebruikt om te immobiliseren van het antigeen van belang in de monsters in een sandwich-ELISA, en vervolgens het vastgelegde antigeen kan worden opgespoord door een andere "" detectieantilichaam in een directe of indirecte wijze15, 16. Sandwich-ELISA biedt hoge specificiteit aangezien het antigeen wordt gedetecteerd door twee verschillende antilichamen van het antigeen. De competitie is gevestigd tussen de monster-antigeen en het plaat-gebonden antigeen voor de binding met het primaire antilichaam in een competitieve ELISA, en vervolgens de concentratie van antigeen in de steekproef wordt gekwantificeerd door het meten van de afname van het signaal van het substraat 15 , 16. competitieve ELISA kan worden uitgevoerd met behulp van de hierboven genoemde directe of indirecte indeling en is nuttig voor het opsporen van kleine antigenen met slechts één epitoop15,16.

Alternatieve technieken voor het meten van antilichamen omvatten radio-immunoassay (RIA), electrochemiluminescence (ECL) assay en oppervlak plasmon resonantie (SPR) assay17. RIA was de eerste immunoassay ontwikkeld dat maatregelen de aanwezigheid van een antigeen (of antilichaam) met hoge specificiteit en de gevoeligheid met behulp van radiolabeled reagentia18,19. Echter, als gevolg van de bezorgdheid van radioactieve toxiciteit, verwijderingskosten, houdbaarheid en speciale licenties te werken met radioactieve materialen, ELISA is een betere en meer handige techniek voor common gebruikt20,21. ECL is een hooggevoelige test waarin chemiluminescentie reacties worden gestart met behulp van elektriciteit te genereren zeer reactieve soorten uit stabiele precursoren op het oppervlak van een elektrode, en kunnen worden gebruikt voor het meten van de hoeveelheid analyten (zoals antigenen of antilichamen)22. Echter, ECL vereist een speciaal instrument en dus is niet zo breed gebruikt als ELISA23. SPR is een directe test die kan worden gebruikt voor het meten van de binding van liganden (bv., antilichamen) aan geïmmobiliseerd moleculen (bv., antigenen) op een sensor chip oppervlakte24. SPR detecteert de interacties in real-time heel concreet en vereist niet het gebruik van gelabelde reagentia zoals in ELISA. Echter, SPR ook vereist dat een speciale apparatuur en lagere gevoeligheid dan ELISA17heeft. Gezien de beperkingen van de alternatieve methoden, is ELISA de meest geschikte en handige techniek voor ons doel in dit protocol. Hier beschrijven we het gebruik van sandwich-ELISA voor de analyse van de totale Ig isotype-niveaus en de procedures van indirecte ELISA voor de analyse van antigeen-specifieke Ig isotypes.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Dit protocol volgt de richtsnoeren van de ethische commissie van de institutionele dierlijke onderzoek van Rutgers University. Alle muizen worden gebruikt overeenkomstig de richtsnoeren van de NIH en onder een dierlijke protocol goedgekeurd door de institutionele Animal Care en gebruik Comité.

1. bereiding van muizen en verzameling van naïeve muis Sera

  1. Houd alle muizen voor immunisatie experimenten in een specifieke pathogenen vrije dier faciliteit.
  2. Gebruik gender-matched, jonge volwassene (8-12 weken oud) van het knock-out en littermate controle muizen die dezelfde ouders en kooien voor immunisatie studies delen.
  3. Plan de immunisatie en serum collectie schema's zoals afgebeeld in Figuur 1.
  4. Oogst naïef serum van elke muis op 7 dagen (-7 dagen) vóór immunisatie. Volg de procedures van de retro-orbitaal bloeden en serum de voorbereiding zoals hieronder beschreven in stap 4.

2. voorbereiding van TNP-polysaccharide (een TI-antigeen) en TNP-HC (een TD-antigeen)

  1. Los de antigeen-poeders in steriele PBS (pH 7.4) grondig te maken van 0,5 mg/mL van TNP-polysaccharide materieel en 1 mg/mL TNP-HC stamoplossingen. Aliquoot elk antigeen stockoplossing in steriele microfuge buizen op 0,5 mL/buis, en houd de aliquots bij-80 ° C voor langdurige opslag. Vermijd meerdere bevriezen en ontdooien van het antigeen aliquots.
  2. Op de dag van de injectie, het berekenen van het volume van TNP-polysaccharide (50 µg/100 µL/muis) of TNP-HC (100 µg/100 µL/muis) moest volgens het aantal muizen worden geïnjecteerd. Ontdooi de juiste aantal TNP-polysaccharide of TNP-HC aliquots bij kamertemperatuur (RT).
  3. Voor TNP-HC injectie, eerst de aluin adjuvans (40 mg/mL) met 3 delen steriel PBS tot een eindconcentratie van 10 mg/mL verdund. Zorg ervoor dat de aluin adjuvans mengsel goed geschorste vóór verdunning.
  4. Combineren van gelijk volume van 10 mg/mL aluin adjuvans drijfmest uit stap 2.3 en de ontdooide TNP-HC-oplossing (1 mg/mL) in een polypropyleen tube van 5 mL, meng goed en Incubeer bij 37 ° C gedurende 30 minuten voorbereiden deze TNP-HC/aluin Meng vers vóór de injectie.

3. de immunisatie van muizen

  1. Uitvoeren intraperitoneaal (i.p.) injectie van TNP-polysaccharide of TNP-HC/aluin te immuniseren van de muizen met 1 mL insuline spuiten in een kast van de bioveiligheid. Plaats de naald op ongeveer 30° hoek bij voorkeur in de lagere juiste kwadrant van elke muis om te voorkomen dat de injectie in de inwendige organen.
  2. Injecteren i.p. 100 µL van TNP-polysaccharide per muis op dag 0 voor TI Ag immunisatie(Figuur 1).
  3. Injecteren i.p. 200 µL van het mengsel van de TNP-HC/aluin (vers bereid in stap 2.4) per muis op dag 0 voor TD Ag immunisatie. Herhaal de zelfde injectie op dag 21 als een booster vaccinatie voor geheugen studies (Figuur 1B).
  4. Na de injectie, elke muis terug te keren naar zijn kooi en bewaar alle de ingespoten muizen op voorwaarde van specifieke pathogenen vrije.

4. retro-orbitaal bloeden en Serum voorbereiding

  1. Muis sera op verschillende tijdstippen van de oogst: voor TNP-polysaccharide immunisatie, muis sera te verzamelen op dag -7 en 7 (Figuur 1A); verzamelen voor TNP-HC/aluin immunisatie, muis sera op dag -7, 7, 14 en 28 (Figuur 1B).
  2. Anesthetize voor Retro-orbitaal bloeden, elke muis met 5% Isofluraan gedurende 1-2 min. in een kabinet van bioveiligheid25. Pedaal reflex om ervoor te zorgen voldoende verdoving van elke muis uitvoeren.
  3. Houd de narcose muis in een hand met de wijsvinger en de duim trekken van de huid rond de oogbol terug, zodat de oogbol uit de socket-25 steekt. Plaats een niet-EDTA Pasteur pipet of capillaire buis onder een hoek van 45° in de binnenste hoek van de oogkas onder de oogbol25.
  4. Zachte neerwaartse druk uitoefenen en draai de pipet of buis zachtjes te breken in de ader en verzamelen van 150-200 µL bloed in de pipet of buis. Onmiddellijk het bloed overbrengen in een steriele 1,5 mL microfuge buis en de muis terug te keren naar zijn kooi te herstellen.
  5. Laat het bloed monsters op RT voor 1-2 h zitten te coaguleren.
  6. Centrifugeer het gestolde bloedmonsters bij 13.000 x g gedurende 10 minuten bij 4 ° C. De duidelijke serum bovenop de bloedklonter overbrengen in een nieuwe steriele 1,5 mL microfuge buis.
  7. Herhaal stap 4.6 nog een keer te verwijderen van de resterende bloedstolsel en verzamelen de duidelijke serum.
  8. Aliquot het serum in steriele 1,5 mL microfuge buizen op 50 µL/buis, en op te slaan van de sera bij-80 ° C.
  9. Het oog voor bloeden op verschillende tijdstippen, zodat elk van beide ogen is bloedde hooguit twee keer voor de hele experiment worden afgewisseld. Bij de terminal bloeden, maximaal 1 mL bloed van elke muis voor euthanasie te verzamelen. De muis met 5% CO2 gevolgd door cervicale dislocatie euthanaseren.
    Opmerking: Milt B cellen kunnen worden geoogst voor stroom cytometrische analyses en in vitro cultuur studies. Wij bereiden ook genomic DNA van splenocytes om te controleren of het genotype van elke muis.

5. muis Ig Isotype-specifieke ELISA

  1. Bereiden de buffers en oplossingen voor ELISA.
    1. Het bereiden van 500 mL koppeling Buffer (PBS, pH 7.4).
    2. Bereiden van Wash 500 mL (PBS-T (0,05% Tween-20), pH 7.4).
    3. Bereiden van 100 mL Buffer blokkeren (1% BSA in PBS, pH 7.4, opgeslagen bij 4 ° C).
    4. Bereiden 1 L voor substraat Buffer (1 M diethanolamine, pH 9,8 (97 milliliters diethanolamine in 1 L H2O, pH aangepast met behulp van 10 M HCl) en 0,5 mM MgCl2). De Buffer substraat beschermen tegen licht door inwikkeling van de fles met aluminiumfolie. Bewaren bij 4 ° C.
    5. 100 mL eindeoplossing (3 M NaOH) voor te bereiden.
  2. Coat de ELISA-plaatjes:
    1. Voor de totale serum Ig isotype ELISA, jas 96-Wells immuno platen met 10 µg/mL isotype-specifieke polyklonale geit-antimuis Ig vastleggen (M, G1, G2a, G2b, G3, A of E) Abs in koppeling Buffer (PBS) op 100 µL per putje.
    2. Jas voor TNP-specifieke Ig isotype ELISA, immuno 96-wells-platen met 10 µg/mL TNP(38)-BSA in PBS op 100 µL per putje.
    3. Jas voor hoge affiniteit TNP-specifieke Ig isotype ELISA, immuno 96-wells-platen met 10 µg/mL TNP(3)-BSA in PBS op 100 µL per putje26. Incubeer de platen bij 4 ° C's nachts.
  3. Na een incubatieperiode van de coating, het wassen van de platen 2 keer met 200 µL per putje van PBS-T. Negeren van de Wash-Buffer en de vlek de platen (tik elke plaat ondersteboven op een stapel papieren handdoeken) droog na elke wasbeurt.
  4. Blokkeren van de platen: toevoegen van 200 µL per putje van blokkeren (1% BSA in PBS) Buffer in de gecoate platen en Incubeer de platen gedurende 1 uur op RT.
  5. Terwijl de platen blokkeren, maak verdunningen van Ig isotype normen en serummonsters in Buffer blokkeren in een aparte, onbehandelde 96-wells-plaat duikt met 150 µL per putje.
    1. Bereiden van 250 ng/mL Ig isotype normen als de standaard beginconcentratie (St01) en 7 tot en met 10 van de seriële verdunningen 1:2 van de Ig-normen (St02 St07 of St10, Figuur 2).
    2. Bereiden muis serum monsters bij een verdunning 1:100 of 1:500 factor als de startende verdunning en 3 of 4 van 1:10 seriële verdunningen voor totale Ig isotype of 1:5 seriële verdunningen voor TNP-specifieke Ig isotype van elk serummonster(Figuur 2). IgE ELISA, bereiden serummonsters van de muis op een 1:2 verdunningsfactor als de startende verdunning en 3 1:5 seriële verdunningen voor elk serummonster maken.
  6. Na het blokkeren, was de platen uit stap 5.4 driemaal met 200 µL per putje van PBS-T en vlek droog de platen na elke wasbeurt.
  7. 100 µL per putje van verdunde Ig isotype normen (geschikt voor het vastleggen en detectie Abs) en verdund serummonsters van stap 5.5 overbrengen aan de platen bereid in stap 5.6. Incubeer de platen aan de normen en de monsters bij 4 ° C's nachts.
  8. Spoel de platen 3 keer met 200 µL per putje van PBS-T en vlek droog de platen na elke wasbeurt.
  9. In elke plaat, voeg 100 µL per putje van 10 µg/mL van een geschikte alkalisch fosfatase (AP)-geconjugeerd isotype-specifieke geit-antimuis Ig (M, G1, G2a, G2b, G3, A of E) Abs verdund in Buffer blokkeren.
  10. Incubeer de platen met AP-geconjugeerde Abs voor 1-2 h op RT. Voor de detectie van de IgE, Incubeer de platen gedurende 1-2 uur bij 37 ° C.
  11. 1 mg/mL substraat oplossing voor te bereiden door het oplossen van twee tabletten van 5 mg fosfatase substraat in 10 mL substraat Buffer.
  12. Wassen van elke plaat 5 keer met 200 µL per putje van PBS-T en vlek drogen de platen na elke wasbeurt.
  13. Voeg 100 µL per putje van substraat oplossing in elke plaat. Laat de reactie te ontwikkelen op RT, wat gewoonlijk slechts een paar minuten duurt.
  14. Lees elke plaat op 405 nm met behulp van een microplate-lezer met de bijbehorende software.
    1. Klik op "instellingen" om de golflengten "Lm1" op "405 nm" en klik "OK".
    2. Klik op 'sjabloon' om 'leeg' wells, "normen" wells en "onbekend" putten volgens de 96-wells-plaat setup te wijzen.
    3. "Normen" de wells, klikt u op "serie" om de "Eerste steekproef"als"St01", selecteer "Beginnen bij" aan "Top", en "repliceert" als "2". Controleren"Monster Descriptor", en invoergegevens naar "Standaardwaarde": Selecteer "eenheden"als"ng/mL", "Starting waarde" als "250", "Step by" als "2" ingesteld. Klik op "OK".
    4. Klik op "Lezen" om te lezen van de plaat als de meest standaard bereikt geconcentreerde een optische dichtheid (OD) van ~ 1.
    5. Klik op het menu "bestand" en klik op "Opslaan" om het bestand te slaan.
    6. Klik op "Lees" om te lezen van de plaat weer als de meest geconcentreerde standaard OD405 ~ 1,5, of 2, 2.5, respectievelijk overbelast.
  15. Zet de reactie stop door 25 µL per putje van 3 M NaOH toe te voegen. Voer stappen 5.12 tot 5.15 voor een plaat op een moment.
  16. ELISA gegevens met behulp van de software gekoppeld aan de lezer microplate analyseren:
    1. Controleer de waarden van de OD405 van de Ig isotype normen voor lees-bestanden en selecteer een passende lezing met goede lineaire spreiding van de normen voor gedetailleerde gegevensanalyse.
    2. Selecteer het programma van de 4-Parameter montage standaard curven uitzetten. Controleer het co-efficiënt van de standaard curve (R2), die vereist is om te worden > 0.98 om van goede gegevenskwaliteit te waarborgen.
    3. Controleer of de OD405-waarden van elk monster afnemen met toenemende verdunningsfactoren. De concentratie van alle putjes van de verdunde monster ophalen door te klikken op "Onbekenden".
    4. Selecteer een passende waterput van elk monster met OD405 in het lineaire bereik van de Ig isotype standaard curve voor de berekening van de concentratie.
    5. Berekenen van het serum Ig isotype concentratie van elk monster met behulp van de formule: serum Ig concentratie = geselecteerde goed concentratie x verdunningsfactor.
  17. Plot de grafieken en het uitvoeren van statistische analyses met behulp van een geschikte software9,10,11. Maak verticale scatter percelen van serum Ig isotype niveaus te vergelijken van de Ig-reacties in de hetzelfde tijdstip. Zorg voor TD geheugen reactie studies, de tijdsverloop respons curves te onderzoeken van de Ig isotype reacties vóór en na de booster immunisatie. Gebruik foutbalken wilt weergeven van de standaarddeviatie (SD) van elke groep van monsters. Om te vergelijken Ig isotype reacties tussen twee genotypen van muizen, gebruiken de ongepaarde t -test voor tweezijdige gegevens om te bepalen van de statistische significantie. De p waarde < 0.05 als aanzienlijk verschillende instellen

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Dit protocol hebben we gebruikt om te onderzoeken van de rollen van een kritische regulator van het immuunsysteem, de TRAF3, in TI en TD Ig isotype reacties9,10,11. TRAF3 direct of indirect regelt de signaaltransductie van een aantal aangeboren en adaptieve immuun receptoren, met inbegrip van de TNF receptor superfamilie, Toll-like receptoren en T cel receptor/CD28, o.a.27,28. We veronderstellen dat TRAF3 verschillende rollen in verschillende immuun cel subsets speelt te reguleren van antilichaam reacties. Om te testen deze hypothese, vastbesloten wij TI en TD Ig isotype antwoorden met behulp van voorwaardelijke TRAF3 knock-out muizen die het Traf3 gen specifiek verwijderd in de B-cellen, T-cellen, of myeloïde cellen, respectievelijk9,10hebben, 11. Representatieve collectie schema's immunisering en serum voor TI en TD Ig studies zijn afgebeeld in Figuur 1. Vertegenwoordiger IgG1 en IgG2b ELISA resultaten worden weergegeven in Figuur 2 en Figuur 3 om te illustreren hoe ELISA werkt. Deze omvatten de installatie van de plaat van verwaterde normen en monsters(Figuur 2),een afbeelding van de plaat na toevoeging van het AP-substraat (Figuur 2B), de Lees resultaten van OD405 (Figuur 2C, 2D), de waarden van standaard verdunningen (Figuur 2E, 2F), de standaard curven (Figuur 3A, 3B), de waarden van verdunde monsters (Figuur 3C, 3D) en de berekening van serum IgG1 en IgG2b concentratie in de monsters (Figuur 3E, 3F). Figuur 4 toont representatieve resultaten van totale Ig isotypes in sera van naïeve muizen. We toonden statistisch meer basale serum niveaus van IgM, IgG2a, IgG2b, IgG3 en IgA in B-cel-specifieke TRAF3- / - (B-TRAF3- / -) muizen als ten opzichte van gender en leeftijd-zoekwoorden TRAF3-voldoende littermate controle muizen (LMC). Deze hyperglobulinemia van B-TRAF3- / - muizen wordt veroorzaakt door het compartiment van de uitgebreide B-cel in perifere lymfoïde organen als gevolg van langdurige overleving van volwassen TRAF3- / - B cellen9. Figuur 5 toont de representatieve resultaten van TI en TD Ig isotype reacties van muizen op immunisatie met de TNP-polysaccharide en TNP-HC, respectievelijk. Deze resultaten bleek een significant hoger TI, TNP-specifieke IgG3 niveau en ook verhoogde TD, TNP-specifieke IgG2b bij myeloïde cel-specifieke TRAF3- / - (M-TRAF3- / -) muizen dan in LMC. Dergelijke verhoogde TI IgG3 en TD IgG2b reacties bij M-TRAF3- / - muizen waargenomen zijn waarschijnlijk te wijten aan de verhoogde productie van de pro-inflammatoire cytokines IL-6 en IL-12 door TRAF3- / - macrofagen en DCs na immunisatie11. Figuur 6 toont de representatieve resultaten van TD primaire en reacties van het geheugen van muizen op TNP-HC immunisatie. Deze resultaten aangetoond gedeeltelijk verminderde TD IgM primaire reactie en defecte IgG1 primaire en geheugen reacties in T-cel-specifieke TRAF3- / - (T-TRAF3- / -) muizen. De defecte TD primaire en geheugen reacties van T-TRAF3- / - muizen resultaat van verminderde activatie van TRAF3-- / - CD4 T-cellen bij T-cel receptor en CD28 co betrokkenheid10. Tezamen, het protocol beschreven in dit artikel toegestaan ons af te bakenen de specifieke rol van TRAF3 in verschillende immuun cel subsets bij het reguleren van TI en TD Ig isotype reacties in muizen.

Figure 1
Figuur 1 : Typisch TI en TD Ag immunisering en serum collectie planningen. (A) TNP-polysaccharide experimenten. (B) TNP-HC experimenten. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 2
Figuur 2 : Vertegenwoordiger IgG1 en IgG2b ELISA. (A) de 96-wells-plaat setup bevat de putten van blanco, 7 seriële verdunningen (1:2) van muis IgG1 en IgG2b-normen (St01 tot St07), en 4 seriële verdunningen (bij 1:10) van het 8 muis serum monsters (S1 aan S8). De concentratie van normen wordt gegeven aan de onderkant van elke standaard goed. De verdunningsfactor van de monsters wordt gegeven aan de onderkant van elk monster goed. (B) een beeld van de plaat op 5 min na toevoeging van het AP-substraat. De plaat Lees resultaten van IgG1 (C) en IgG2b (D) op 405 nm. De waarden van OD405 en concentraties van verschillende verdunningen van muis IgG1 (E) en muis IgG2b (F) normen. Conc, concentratie; BackCalcConc, berekend terug concentratie; OD, optische dichtheid; AvgOD, gemiddelde OD van de duplo's; SD, standaardafwijking; CV, variatiecoëfficiënt. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 3
Figuur 3 : Vertegenwoordiger IgG1 en IgG2b ELISA gegevensanalyse. De standaard curven van IgG1 (A) en IgG2b (B). De co-efficiënte R2 is > 0.98 in beide standaard curven. Pijlen geven aan dat het lineaire bereik van de standaard curven. Waarden van OD405 en concentraties van IgG1 (C) en IgG2b (D) in onbekenden (verdund serummonsters). R, bereik; Conc, concentratie. Berekening van de muis serum concentraties van IgG1 (E) en muis IgG2b (F) voor de 8 monsters. ND, niet aantoonbaar met deze ELISA. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 4
Figuur 4 : Representatieve resultaten van totale Ig isotypes in sera van naïeve muizen. Sera werden verzameld van gender-matched, 10-12 weken oud naïef LMC en B-TRAF3- / - muizen (n = 10 voor elk genotype; genetische achtergrond: 129xC57BL/6). Door ELISA werden basale serum niveaus van totale IgM, IgG1, IgG2a, IgG2b, IgG3, IgA en IgE bepaald. Statistische significantie werd bepaald met de test van de ongepaarde t voor tweezijdige gegevens. *, beduidend verschillend tussen LMC en B-TRAF3- / - muizen (p < 0,05); **, zeer aanzienlijk verschillend tussen LMC en B-TRAF3- / - muizen (p < 0,01). Dit cijfer is gewijzigd van Xie et al. 9. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 5
Figuur 5 : Representatieve resultaten van TI en TD Ig isotype reacties op TNP-polysaccharide en TNP-HC immunisatie, respectievelijk. Gender-matched, 8-12 weken oud LMC en M-TRAF3- / - muizen (genetische achtergrond: C57BL/6) werden geïmmuniseerd met 50 µg voor de TI Ag TNP-polysaccharide (bovenste paneel, n = 9 voor elk genotype) of 100 µg voor de TD Ag TNP-HC gemengd met aluin (onderste paneel, n = 12 voor elk genotype). Sera werden verzameld op dag 7 na immunisatie. Serum titers van anti-TNP IgM, IgG1, IgG2b, IgG3, IgA en IgE werden geanalyseerd door ELISA. Statistische significantie werd geanalyseerd met de ongepaarde t -test op tweezijdige gegevens. *, beduidend verschillend tussen LMC en M-TRAF3- / - muizen (p < 0,05). Dit cijfer is gewijzigd van Lalani et al. 11. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 6
Figuur 6 : Representatieve resultaten van TD primaire en geheugen Ig reacties op TNP-HC immunisatie. Gender-matched, 8-10 weken oud LMC en T-TRAF3- / - muizen (n = 10 voor elk genotype; genetische achtergrond: 129xC57BL/6) werden geïmmuniseerd met 100 µg voor de TD Ag TNP-HC gemengd met aluin op dag 0. Elke muis ontving ook een booster immunisatie met de dezelfde Ag en adjuvante op dag 21 na de eerste immunisatie. Serummonsters werden verzameld uit muizen op dag -7, 7, 14 en 28, respectievelijk. TNP-specifiek IgM en IgG1 niveaus in serummonsters werden gemeten door ELISA. Grafieken tonen de resultaten van 10 paren van LMC en T-TRAF3- / - muizen (bedoel ± SD). Statistische significantie werd geanalyseerd met de ongepaarde t -test op tweezijdige gegevens. *, beduidend verschillend tussen LMC en T-TRAF3- / - muizen (p < 0,05); **, zeer aanzienlijk verschillend tussen LMC en T-TRAF3- / - muizen (p < 0,01); , zeer aanzienlijk verschillend tussen LMC en T-TRAF3- / - muizen (p < 0,001). Dit cijfer is gewijzigd van Xie et al. 10. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Hier beschrijven we het protocol voor de karakterisatie van TD en TI Ig isotype reacties in muizen met behulp van ELISA. Succesvolle uitvoering van dit protocol vereist het gebruik van stoffen genoemd in tabel 1, waaronder assay ELISA-plaatjes, immunisatie Ags, muis Ig isotype-specifieke antilichamen en normen. Zorg moet worden genomen om te voorkomen met behulp van weefselkweek behandeld platen voor ELISA. Verdunningen van de normen en serummonsters moeten worden gedaan in afzonderlijke onbehandelde platen (ronde-onder) en vervolgens in de ELISA-plaatjes worden toegevoegd. Met behulp van dit protocol, hebben wij consequent betrouwbare resultaten verkregen met hoge specificiteit en de gevoeligheid.

Kritische stappen binnen dit protocol zijn Ag immunisatie, retro-orbitaal bloeden en Ig isotype-specifieke ELISA. Voor TD Ag immunisatie, moet TNP-HC/aluin mix grondig worden resuspended om ervoor te zorgen dat juiste hoeveelheid Ag/adjuvans wordt geïnjecteerd. Als bloedstolsels in de pipet of capillair tijdens het verbloeden van retro-orbitaal, onmiddellijk overschakelen naar een nieuwe Pipetteer of capillaire buis. Buffers en in ELISA gebruikte reagentia moeten duidelijke oplossingen en mag geen precipitaten, waardoor vals-positieve resultaten met abnormale OD405 -waarden kunnen bevatten. Bovendien, moeten bubbels worden vermeden in de putjes op alle stappen van de ELISA, waardoor ook een vals positieve of vals negatieve resultaten met abnormale OD405 -waarden. Deze incidentele fouten kunnen worden geminimaliseerd door het analyseren van monsters in duplicaten. Wassen stappen in ELISA Verwijder de niet-afhankelijke reagentia en antilichamen van de putten. Onvoldoende wassen oorzaken hoge achtergrondruis, maar overmatig wassen kan leiden tot een afname van de gevoeligheid door het verwijderen van gecoate antigenen of antilichamen29gebonden. Het aantal wassen tijden in dit protocol ELISA beschreven worden geoptimaliseerd op basis van onze ervaring.

Hierbij moet worden opgemerkt dat ELISA detectiegrenzen, die meestal door het lineaire bereik van de standaard curven worden gedefinieerd. Om correct kwantificeren de serumconcentratie van elke Ig isotype, moeten de monsters op passende wijze te passen binnen het lineaire bereik van de standaard curven worden verdund. Het is raadzaam testen seriële verdunningen van de monsters te selecteren de aangewezen verdunningsfactoren voor de berekening van Ig concentratie zoals beschreven in dit protocol. Echter, als de resultaten blijkt dat de verdunningsfactoren getest geven geen resultaten in het lineaire bereik van de standaard curve, extra ELISA moet worden uitgevoerd met behulp van verdunningsfactoren aangepast volgens de eerste resultaten van de ELISA. Als alle de verdunningen getest onder de ondergrens voor detectie, moeten originele serummonsters en kleinere verdunningsfactoren worden gebruikt. Als OD405 waarden vertonen geen proportionele vermindering met toenemende verdunningsfactor voor alle seriële verdunningen getest, dit geeft aan dat de vangst Ab- of omhullingsmaterialen Ag is verzadigd door alle verdunde monsters en verder hoger verdunningsfactoren moeten worden gebruikt. Naar aanleiding van dit protocol, zal overtuigende resultaten worden verkregen met hooguit 2 rondes van ELISA.

Factoren waarvan bekend is dat de invloed van antilichaam reacties in muizen zijn onder andere de stam (genetische achtergrond), geslacht, leeftijd, dieet en dier faciliteit milieu30,31,32,33,34 . Bijvoorbeeld, hoewel veel muis stammen IgG2a produceren, bepaalde stammen zoals C57BL/6 muizen produceren geen IgG2a maar IgG2c produceren in plaats daarvan35,,36. Recente bewijs identificeert ook commensale microbiota als een factor die antilichaam reacties37,38,39,40. Deze factoren in aanmerking genomen, raden we het gebruik van gender-matched, jonge volwassen nestgenoten van verschillende genotypen die de zelfde ouders en kooien voor TD en TI Ag immunisatie experimenten delen. Daarnaast muis tot muis variatie wordt vaak waargenomen voor muizen met genotype dezelfdeFiguur 4-6, voldoende repliceren nummers (meestal n > 8) van muizen zijn nodig voor elke genotype of een groep te verkrijgen statistisch zinvolle resultaten.

De Ig isotype-specifieke ELISA is nuttig bij het bepalen van de titers van verschillende Ig isotypes. Echter, deze methode alleen is niet voldoende om de onderliggende oorzaken van de geconstateerde verschillen in Ig isotype titers onthullen, en wordt daarom vaak gebruikt in combinatie met een verscheidenheid van complementaire benaderingen. Om te onderscheiden of het verschil in Ig isotype titers wordt veroorzaakt door verschillende aantallen B Ig-producerende cellen of verschillende efficiëntie van B-cellen bij Ig productie, stroom cytometry41,42,43 en Enzyme-Linked ImmunoSpot (ELISPOT)43,44,45 kan worden gebruikt. Voor het analyseren van de overleving van de B-cel proliferatie en germinal center vorming, omvatten alternatieve methoden stroom cytometry, in vitro cultuur van milt B-cellen en immunohistochemische kleuring gevolgd door microscopie9,26 ,41,46,47. Om het verhelderen van de veranderingen in de Ig isotype schakelen reacties in de B-cellen, in vitro cultuur van milt B-cellen en kwantitatieve RT-PCR van germline afschriften van Ig zware ketting gene segmenten meestal worden gebruikt41,43 ,48,49. Om te onderzoeken de oorzaak van de verschillen in affiniteit rijping, wordt somatische hypermutation (SHM) van het Ig zware ketting gen bepaald door sequentiebepaling van het VDJ regio50,51,52. Om te begrijpen van de verschillen in geheugen B-cel reacties, de frequentie en het aantal verschillende geheugen B-cel subsets nadat Ag immunisatie kan worden geanalyseerd door stroom cytometry met behulp van onlangs geïdentificeerd markers van muis B geheugencellen, waaronder CD38 CD80, CD73, PD-MB L2-cache CD62L en CCR68,53,,54,55. Samen, kunnen deze aanvullende methoden die worden gebruikt in combinatie met het huidige protocol onderzoekers te winnen van een grondig inzicht in reacties van antilichaam in een bepaalde experimentele setting.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

De auteurs hebben geen concurrerende financiële belangen.

Acknowledgments

Deze studie werd ondersteund door de National Institutes of Health grants R01 CA158402 (P. Xie) en R21 AI128264 (P. Xie), het ministerie van defensie verlenen W81XWH-13-1-0242 (P. Xie), een piloot-Award van de kanker instituut voor New Jersey door Grant nummer P30CA072720 van het National Cancer Institute (P. Xie), een Busch biomedische Grant (P. Xie), een Victor Stollar Fellowship (A. Lalani), en een Anne B. en James B. Leathem Fellowship (S. Zhu).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
VersaMax Tunable Microplate Reader MDS Analytical Technologies VERSAMAX Equipment to read the plates
SOFTmax PRO 5.3 MDS Analytical Technologies SOFTmax PRO 5.3 Software for the plate reader
GraphPad Prism GraphPad Prism Software for graphing and statistics
TNP-AECM-polysaccharide (FICOLL) Biosearch Technologies F-1300-10 A TI Ag for immunization
TNP-KLH Biosearch Technologies T-5060-5 A TD Ag for immunization
TNP(38)-BSA Biosearch Technologies T-5050-10 (conjugation ratio: 38) Coating Ag for TNP-specific ELISA
TNP(3)-BSA Biosearch Technologies T-5050-10 (conjugation ratio: 3) Coating Ag for high affinity TNP-specific Ig
Imject Alum Fisher Scientific  PI-77161 Alum adjuvant for immunization
Falcon Polypropylene tubes Fisher Scientific  14-959-11A For incubation of TNP-KLH/alum
BD Insulin Syringe Fisher Scientific  14-829-1B For i.p. injection of mice
Immuno 96-Well Plates, Flat-Bottom Fisher Scientific  14-245-61 For ELISA
Untreated 96-Well Microplates, Round-Bottom VWR 82050-622 For serial dilutions of standards and samples
Phosphatase substrate, 5 mg Tablets Sigma S0942-200TAB AP substrate
Diethanolamine VWR IC15251690 A component of AP substrate buffer
Goat anti-mouse IgM SouthernBiotech 1020-01 Capture Ab for mouse IgM
Goat anti-mouse IgG1 SouthernBiotech 1070-01 Capture Ab for mouse IgG1
Goat anti-mouse IgG2a SouthernBiotech 1080-01 Capture Ab for mouse IgG2a
Goat anti-mouse IgG2b SouthernBiotech 1090-01 Capture Ab for mouse IgG2b
Goat anti-mouse IgG3 SouthernBiotech 1100-01 Capture Ab for mouse IgG3
Goat anti-mouse IgA SouthernBiotech 1040-01 Capture Ab for mouse IgA
Goat anti-mouse IgE SouthernBiotech 1110-01 Capture Ab for mouse IgE
AP-Goat anti-mouse IgM SouthernBiotech 1020-04 Detection Ab for mouse IgM
AP-Goat anti-mouse IgG1 SouthernBiotech 1070-04 Detection Ab for mouse IgG1
AP-Goat anti-mouse IgG2a SouthernBiotech 1080-04 Detection Ab for mouse IgG2a
AP-Goat anti-mouse IgG2b SouthernBiotech 1090-04 Detection Ab for mouse IgG2b
AP-Goat anti-mouse IgG3 SouthernBiotech 1100-04 Detection Ab for mouse IgG3
AP-Goat anti-mouse IgA SouthernBiotech 1040-04 Detection Ab for mouse IgA
AP-Goat anti-mouse IgE SouthernBiotech 1110-04 Detection Ab for mouse IgE
Mouse IgM standard BD Biosciences 553472 TNP-specific IgM, Clone  G155-228
Mouse IgG1 standard BD Biosciences 554054 TNP-specific IgG1, Clone  107.3
Mouse IgG2a standard BD Biosciences 556651 TNP-specific IgG2a, Clone  G155-178
Mouse IgG2b standard BD Biosciences 554055 TNP-specific IgG2b, Clone  49.2
Mouse IgG3 standard BD Biosciences 553486 KLH-specific IgG3, Clone  A112-3
Mouse IgA standard BD Biosciences 550924 Mineral oil-induced IgA, Clone  MOPC-320
Mouse IgE standard BD Biosciences 557079 TNP-specific IgE, Clone  C38-2

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Moise, A., Nedelcu, F. D., Toader, M. A., Sora, S. M., Tica, A., Ferastraoaru, D. E., Constantinescu, I. Primary immunodeficiencies of the B lymphocyte. Journal of Medicine and Life. 3, 60-63 (2010).
  2. Bishop, G. A., Haxhinasto, S. A., Stunz, L. L., Hostager, B. S. Antigen-specific B-lymphocyte activation. Critical Reviews in Immunology. 23, 149-197 (2003).
  3. Murphy, K. Janeway's Immunobiology. 8th Edition. 1, (2012).
  4. Vinuesa, C. G., Chang, P. P. Innate B cell helpers reveal novel types of antibody responses. Nature Immunology. 14, 119-126 (2013).
  5. Bekeredjian-Ding, I., Jego, G. Toll-like receptors--sentries in the B-cell response. Immunology. 128, 311-323 (2009).
  6. Mond, J. J., Lees, A., Snapper, C. M. T cell-independent antigens type 2. Annual Review of Immunology. 13, 655-692 (1995).
  7. Garcia de Vinuesa, C., O'Leary, P., Sze, D. M., Toellner, K. M., MacLennan, I. C. T-independent type 2 antigens induce B cell proliferation in multiple splenic sites, but exponential growth is confined to extrafollicular foci. European Journal of Immunology. 29, 1314-1323 (1999).
  8. Kurosaki, T., Kometani, K., Ise, W. Memory B cells. Nature Reviews Immunology. 15, 149-159 (2015).
  9. Xie, P., Stunz, L. L., Larison, K. D., Yang, B., Bishop, G. A. Tumor necrosis factor receptor-associated factor 3 is a critical regulator of B cell homeostasis in secondary lymphoid organs. Immunity. 27, 253-267 (2007).
  10. Xie, P., Kraus, Z. J., Stunz, L. L., Liu, Y., Bishop, G. A. TNF Receptor-Associated Factor 3 Is Required for T Cell-Mediated Immunity and TCR/CD28 Signaling. The Journal of Immunology. 186, 143-155 (2011).
  11. Lalani, A. I., Moore, C. R., Luo, C., Kreider, B. Z., Liu, Y., Morse, H. C., Xie, P. Myeloid Cell TRAF3 Regulates Immune Responses and Inhibits Inflammation and Tumor Development in Mice. The Journal of Immunology. 194, 334-348 (2015).
  12. Lee, S., Nguyen, M. T. Recent advances of vaccine adjuvants for infectious diseases. Immune Network. 15, 51-57 (2015).
  13. Gavin, A. L., Hoebe, K., Duong, B., Ota, T., Martin, C., Beutler, B., Nemazee, D. Adjuvant-enhanced antibody responses in the absence of toll-like receptor signaling. Science. 314, 1936-1938 (2006).
  14. Klinman, D. M., Currie, D., Gursel, I., Verthelyi, D. Use of CpG oligodeoxynucleotides as immune adjuvants. Immunological Reviews. 199, 201-216 (2004).
  15. Gan, S. D., Patel, K. R. Enzyme immunoassay and enzyme-linked immunosorbent assay. Journal of Investigative Dermatology. 133, 12 (2013).
  16. Shah, K., Maghsoudlou, P. Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA): the basics. British Journal of Hospital Medicine. 77, 98-101 (2016).
  17. Nencini, F., Pratesi, S., Petroni, G., Matucci, A., Maggi, E., Vultaggio, A. Assays and strategies for immunogenicity assessment of biological agents. Drug Development Research. 75, Suppl 1 4-6 (2014).
  18. Haber, E., Page, L. B., Richards, F. F. Radio immunoassay employing gel filtration. Analytical Biochemistry. 12, 163-172 (1965).
  19. Yalow, R. S., Berson, S. A. Immunoassay of endogenous plasma insulin in man. 1960. Obesity Research. 4, 583-600 (1996).
  20. Lequin, R. M. Enzyme immunoassay (EIA)/enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). Clinical Chemistry. 51, 2415-2418 (2005).
  21. Wreghitt, T. G., Tedder, R. S., Nagington, J., Ferns, R. B. Antibody assays for varicella-zoster virus: comparison of competitive enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA), competitive radioimmunoassay (RIA), complement fixation, and indirect immunofluorescence assays. Journal of Medical Virology. 13, 361-370 (1984).
  22. Mathew, B. C., Biju, R. S., Thapalia, N. An overview of electrochemiluminescent (ECL) technology in laboratory investigations. Kathmandu University Medical Journal. 3, 91-93 (2005).
  23. Mikulskis, A., Yeung, D., Subramanyam, M., Amaravadi, L. Solution ELISA as a platform of choice for development of robust, drug tolerant immunogenicity assays in support of drug development. The Journal of Immunological Methods. 365, 38-49 (2011).
  24. Wadhwa, M., Bird, C., Dilger, P., Gaines-Das, R., Thorpe, R. Strategies for detection, measurement and characterization of unwanted antibodies induced by therapeutic biologicals. The Journal of Immunological Methods. 278, 1-17 (2003).
  25. Wolforth, J. B. Methods of Blood Collection in the Mouse. Laboratory Animals. 29, 47-53 (2000).
  26. Stunz, L. L., Busch, L. K., Munroe, M. E., Sigmund, C. D., Tygrett, L. T., Waldschmidt, T. J., Bishop, G. A. Expression of the Cytoplasmic Tail of LMP1 in Mice Induces Hyperactivation of B Lymphocytes and Disordered Lymphoid Architecture. Immunity. 21, 255-266 (2004).
  27. Xie, P. TRAF molecules in cell signaling and in human diseases. Journal of Molecular Signaling. 8, 7 (2013).
  28. Lalani, A. I., Zhu, S., Gokhale, S., Jin, J., Xie, P. TRAF molecules in inflammation and inflammatory diseases. Current Pharmacology Reports. 4, 64-90 (2018).
  29. Tate, J., Ward, G. Interferences in immunoassay. The Clinical Biochemist Reviews. 25, 105-120 (2004).
  30. Specter, S., Friedman, H. Age- and sex-related differences in antibody formation and blastogenic responsiveness of splenocytes from RIII mice developing virus-induced mammary adenocarcinoma. The Journal of the National Cancer Institute. 67, 1347-1351 (1981).
  31. Giefing-Kroll, C., Berger, P., Lepperdinger, G., Grubeck-Loebenstein, B. How sex and age affect immune responses, susceptibility to infections, and response to vaccination. Aging Cell. 14, 309-321 (2015).
  32. Kaminski, D. A., Stavnezer, J. Antibody class switching differs among SJL, C57BL/6 and 129 mice. International Immunology. 19, 545-556 (2007).
  33. Sellers, R. S., Clifford, C. B., Treuting, P. M., Brayton, C. Immunological variation between inbred laboratory mouse strains: points to consider in phenotyping genetically immunomodified mice. Veterinary Pathology. 49, 32-43 (2012).
  34. Conour, L. A., Murray, K. A., Brown, M. J. Preparation of animals for research--issues to consider for rodents and rabbits. Institute of Laboratory Animal Resources Journal. 47, 283-293 (2006).
  35. Vlkova, M., Rohousova, I., Hostomska, J., Pohankova, L., Zidkova, L., Drahota, J., Valenzuela, J. G., Volf, P. Kinetics of antibody response in BALB/c and C57BL/6 mice bitten by Phlebotomus papatasi. PLOS Neglected Tropical Diseases. 6, 1719 (2012).
  36. Mestas, J., Hughes, C. C. Of mice and not men: differences between mouse and human immunology. The Journal of Immunology. 172, 2731-2738 (2004).
  37. Ruane, D., Chorny, A., Lee, H., Faith, J., Pandey, G., Shan, M., Simchoni, N., Rahman, A., Garg, A., Weinstein, E. G., et al. Microbiota regulate the ability of lung dendritic cells to induce IgA class-switch recombination and generate protective gastrointestinal immune responses. The Journal of Experimental Medicine. 213, 53-73 (2016).
  38. Chorny, A., Puga, I., Cerutti, A. Innate signaling networks in mucosal IgA class switching. Advances in Immunology. 107, 31-69 (2010).
  39. Van Praet, J. T., Donovan, E., Vanassche, I., Drennan, M. B., Windels, F., Dendooven, A., Allais, L., Cuvelier, C. A., van de Loo, F., Norris, P. S., et al. Commensal microbiota influence systemic autoimmune responses. The EMBO Journal. 34, 466-474 (2015).
  40. Nguyen, Q. N., Himes, J. E., Martinez, D. R., Permar, S. R. The Impact of the Gut Microbiota on Humoral Immunity to Pathogens and Vaccination in Early Infancy. PLOS Pathogens. 12, 1005997 (2016).
  41. Jeevan-Raj, B. P., Robert, I., Heyer, V., Page, A., Wang, J. H., Cammas, F., Alt, F. W., Losson, R., Reina-San-Martin, B. Epigenetic tethering of AID to the donor switch region during immunoglobulin class switch recombination. The Journal of Experimental Medicine. 208, 1649-1660 (2011).
  42. Chen, Z., Getahun, A., Chen, X., Dollin, Y., Cambier, J. C., Wang, J. H. Imbalanced PTEN and PI3K Signaling Impairs Class Switch Recombination. The Journal of Immunology. 195, 5461-5471 (2015).
  43. Boboila, C., Yan, C., Wesemann, D. R., Jankovic, M., Wang, J. H., Manis, J., Nussenzweig, A., Nussenzweig, M., Alt, F. W. Alternative end-joining catalyzes class switch recombination in the absence of both Ku70 and DNA ligase 4. The Journal of Experimental Medicine. 207, 417-427 (2010).
  44. Shah, H. B., Koelsch, K. A. B-Cell ELISPOT: For the Identification of Antigen-Specific Antibody-Secreting Cells. Methods in Molecular Biology. 1312, 419-426 (2015).
  45. Bonsignori, M., Moody, M. A. Simultaneous Detection of Antigen-Specific IgG- and IgM-Secreting Cells with a B Cell Fluorospot Assay. Cells. 1, 15-26 (2012).
  46. Sasaki, Y., Derudder, E., Hobeika, E., Pelanda, R., Reth, M., Rajewsky, K., Schmidt-Supprian, M. Canonical NF-kappaB activity, dispensable for B cell development, replaces BAFF-receptor signals and promotes B cell proliferation upon activation. Immunity. 24, 729-739 (2006).
  47. Goodlad, J. R., Macartney, J. C. Germinal-center cell proliferation in response to T-independent antigens: a stathmokinetic, morphometric and immunohistochemical study in vivo. European Journal of Immunology. 25, 1918-1926 (1995).
  48. Xie, P., Poovassery, J., Stunz, L. L., Smith, S. M., Schultz, M. L., Carlin, L. E., Bishop, G. A. Enhanced Toll-like receptor (TLR) responses of TNFR-associated factor 3 (TRAF3)-deficient B lymphocytes. Journal of Leukocyte Biology. 90, 1149-1157 (2011).
  49. Kaku, H., Horikawa, K., Obata, Y., Kato, I., Okamoto, H., Sakaguchi, N., Gerondakis, S., Takatsu, K. NF-kappaB is required for CD38-mediated induction of C(gamma)1 germline transcripts in murine B lymphocytes. International Immunology. 14, 1055-1064 (2002).
  50. Dudley, D. D., Chaudhuri, J., Bassing, C. H., Alt, F. W. Mechanism and control of V(D)J recombination versus class switch recombination: similarities and differences. Advances in Immunology. 86, 43-112 (2005).
  51. Lange, H., Hecht, O., Zemlin, M., Trad, A., Tanasa, R. I., Schroeder, H. W., Lemke, H. Immunoglobulin class switching appears to be regulated by B-cell antigen receptor-specific T-cell action. European Journal of Immunology. 42, 1016-1029 (2012).
  52. Moore, C. R., Liu, Y., Shao, C. S., Covey, L. R., Morse, H. C., Xie, P. Specific deletion of TRAF3 in B lymphocytes leads to B lymphoma development in mice. Leukemia. 26, 1122-1127 (2012).
  53. Bergmann, B., Grimsholm, O., Thorarinsdottir, K., Ren, W., Jirholt, P., Gjertsson, I., Martensson, I. L. Memory B cells in mouse models. Scandinavian Journal of Immunology. 78, 149-156 (2013).
  54. McHeyzer-Williams, L. J., Milpied, P. J., Okitsu, S. L., McHeyzer-Williams, M. G. Class-switched memory B cells remodel BCRs within secondary germinal centers. Nature Immunology. 16, 296-305 (2015).
  55. Elgueta, R., Marks, E., Nowak, E., Menezes, S., Benson, M., Raman, V. S., Ortiz, C., O'Connell, S., Hess, H., Lord, G. M., et al. CCR6-dependent positioning of memory B cells is essential for their ability to mount a recall response to antigen. The Journal of Immunology. 194, 505-513 (2015).

Tags

Immunologie en infecties probleem 139 afhankelijk van de Thymus (TD) antigeen zwezerik-onafhankelijke (TI) antigeen immunoglobulin (Ig) Ig isotype geheugen reactie immunisatie adjuvans enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA)
Karakterisering van zwezerik-afhankelijke en Thymus-onafhankelijke Immunoglobulin Isotype reacties in muizen met behulp van Enzyme-linked Immunosorbent Assay
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Lalani, A. I., Zhu, S., Xie, P.… More

Lalani, A. I., Zhu, S., Xie, P. Characterization of Thymus-dependent and Thymus-independent Immunoglobulin Isotype Responses in Mice Using Enzyme-linked Immunosorbent Assay. J. Vis. Exp. (139), e57843, doi:10.3791/57843 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter