Summary
이 종이에 우리는 ELISA를 사용 하 여 마우스에서 T-종속 및 T-독립 면역 글로불린 (Ig) isotype 응답 하는 프로토콜을 설명 합니다. 이 방법은 단독으로 사용 하거나 흐름 함께에서 cytometry 쥐 T-종속 및 T 독립적인 항 원 면역 다음에 Ig 중재 하는 B 세포 isotype 응답 차이 식별 하는 연구를 수 있게 됩니다.
Abstract
또한 분 비 면역 글로불린 (Ig), B 세포, 체액 성 면역에서 plasmablasts/플라스마 세포 분화 되 나, 항 체는 다양 한 메커니즘을 통해 병원 균 침입에 대 한 강력한 방어를 제공 합니다. 예방 접종의 하나의 주요 목표는 생명을 위협 하는 감염을 방지 하기 위해 보호 항 원 특정 항 체를 유도 하는 것입니다. 모두 thymus-종속 (TD)와 thymus-독립 (TI) 항 강력한 항 원 특정 IgM 응답을 이끌어 낼 수 있습니다 또한 도움으로 메모리 B 세포의 생성 뿐만 아니라 isotype 전환 항 체 (IgG, IgA, ige의)의 생산을 일으킬 수 있다 항 원 제시 세포 (Apc)에 의해 제공. 여기, 우리는 효소 연결 된 immunosorbent 분석 결과 (ELISA)을 사용 하 여 마우스에 TD 및 TI Ig isotype 응답 하는 프로토콜을 설명 합니다. 이 프로토콜에서 TD와 TI 서 응답은 elicited 쥐에 hapten 활용 모델 항 (졸업생)에 TNP KLH와 (PBS)에 TNP-다 당 류와 복 (i.p.) 예방 접종에 의해 각각. TD 메모리 응답을 유도, 졸업생에 TNP KLH의 부스터 예방 접종 같은 항 원/보조 제와 함께 첫 번째 접종 후 3 주에 제공 됩니다. 예방접종 전후 다른 시간 지점에서 마우스 세라 수확. 총 혈 청 Ig 수준 그리고 TNP 특정 항 체는 이후 각각 Ig isotype-특정 샌드위치 및 간접적인 ELISA를 사용 하 여 계량. 올바르게 각 Ig isotype의 혈 청 농도 측정, 샘플 표준 곡선의 선형 범위에 맞게 적절 하 게 희석 해야 합니다. 이 프로토콜을 사용 하 여, 우리는 지속적으로 얻은 신뢰할 수 있는 결과 높은 특이성 및 감도. Cytometry, 비장 immunohistochemical 및 B 세포의 생체 외에서 문화 다른 상호 보완적인 방법으로 사용 하는 경우 얼룩 (IHC),이 프로토콜을 허용할 것 이다 항 체의 포괄적인 이해를 얻기 위해 연구원 주어진된 실험 설정에 응답 합니다.
Introduction
B 림프 구 체액 성 면역에 주요한 선수 및 포유류 생산 항 체, 면역 글로불린 (Ig)1,2라고도 할 수 있는 유일한 셀 형식이 있습니다. B 세포에 의해 은닉 하는 항 체 중립화, 보완 활성화, 보호 면역3선도, opsonization 등 다양 한 메커니즘을 통해 병원 균 침입에 대 한 강력한 방어를 제공 합니다. B 세포에 의해 항 체의 분 비는 일반적으로 두 가지 신호3특정 B 세포의 전체 활성화 후만 이루어집니다. 신호 1 B 세포 수용 체 (BCR) 특정 순진한 B 셀3의 표면에 표현 하는 항 원 (Ag)의 직접 바인딩에 의해 릴레이 됩니다. 신호 2의 원본에 따라 B 세포 활성화 thymus (TD) 또는 thymus-독립 (티)3,4로 나눌 수 있습니다. TD 항 응답에서 신호 2는 세포에 의해 활성화 된 동족 CD4 T 도우미 (TH), CD154, co-stimulatory 수용 체 CD40 B 세포1,2,3에 대 한 리간드를 표현 하는 제공 됩니다. TI 항 응답에서 신호 2 수용 체 통행세 같이의 어느 약혼에서 온다 (타입-1의 경우 TLRs TI Ag)는 BCRs의 광범위 한 cross-linking 또는 (2 형의 경우 TI Ag)는 b 세포3,4. 타입-1 티타늄 (TI 1) 항은 TLRs, 세균성 lipopolysaccharides (LPS), 바이러스 성 RNAs 등 미생물 CpG DNA4,5의 미생물 ligands. 2 형 티타늄 (TI-2) 항 원 높은 반복 구조, 있고 장기 및 영구 BCRs4,6의 여러 cross-linking에 의해 B 세포에 신호를 제공할 수 있습니다. TI-2 항의 전형적인 예로 폐 렴 구 균 다 당 류와 다 당 류 hapten 활용6,7있습니다. TD와 TI 항 강력한 항 원 특정 IgM 응답을 이끌어내는 수 고 또한 항 원 제시 세포 (Apc) 모 수석 세포 (DCs)1 에서 제공 하는 도움 isotype 전환 항 체 (IgG, IgA, ige의)의 생산을 일으킬 수 있다 2,3. 또한, TD와 TI 항 APCs의 도움으로 메모리 응답을 유도 하는 것 수 있지만 TD 항 메모리 B 세포 생성3,8유도에 더 효율적입니다.
이 프로토콜에서 TD와 TI 서 응답 TNP-다 당 류 (중립, 높은 분기 hapten 활용 모델 항 원 2,4,6-trinitrophenyl-열쇠 구멍 삿 hemocyanin (TNP KLH)와 복 (i.p.) 예방 접종에 의해 쥐에 elicited는 그리고 높은 질량), 각각9,,1011. TD 항 원 항 체12의 생산을 강화 하는 보조 일반적으로 사용 됩니다. 여기 우리의 프로토콜에 TNP KLH 졸업생, 면역 연구12에 일반적으로 사용 되는 보조로 주사 된다. 사용할 수 있는 adjuvants의 다른 예로 완전 하거나 불완전 한 Freund의 보조 제 (CFA 또는 아일랜드), monophosphoryl-지질 A / 트 레 할 로스 dicorynomycolate ("Ribi" 보조), 및 CpG oligodeoxynucleotides, 등13, 14. 예방 접종, 후 마우스 세라 다른 시간 지점에서 수확 하 고 세라에 TNP 특정 항 체 Ig isotype-특정 효소 연결 된 immunosorbent 분석 결과 (ELISA)9,10, 를 사용 하 여 계량은 11.
애 란은 의학에서 진단 도구와 또한 생물 의학 연구15,16분석 도구로 서 널리 사용 되는 접시 기반 분석 결과 이다. 그것은 감지 analytes 항 체, 호르몬, cytokines, 발산, 그리고 다양 한 항 원, 등등을 포함 하 여 계량 하는 데 사용 됩니다. ELISA는 직접, 간접, 샌드위치 및 경쟁적인 ELISA15,16를 포함 하 여 여러 가지 다른 형식에서 수행할 수 있습니다. 일반적으로, 그것은 일반적으로 결정 96 잘 접시, 기본 항 체와 알을 품는 고체 표면에 항 원 동원 정지를 포함 한다. 부 화, 후 언바운드 항 체는 멀리 세척 된다. 직접 ELISA에서 1 차적인 항 체는 효소 (일반적으로 양 고추냉이 과산화 효소 또는 알칼리 성 인산 가수분해 효소), 신호 검출 악기에 의해 감지와 같은 보이는 색상 변화를 비 기판 쪼개 다 수는에 직접 활용 한 분 광 광도 계15,16. 대조적으로, 효소 연결한 이차 항 체는 1 차 항 체를 바인딩하는 데 사용 됩니다, 다음이 간주 됩니다 간접적인 ELISA15,16. 직접 ELISA 간접적인 ELISA는 더 민감한15,16빠릅니다. 샌드위치 ELISA, 번호판, 샘플에 대 한 관심의 항을 무력화 하는 데 사용 하는 "캡처" 항 체로 코팅 하 고 캡처된 항 원 직접 또는 간접적인 방식으로15, 에 또 다른 "탐지" 항 체에 의해 검출 될 수 있다 16. 샌드위치 ELISA 항 원 antigen의 두 개의 서로 다른 항 체에 의해 감지 되 면 이후 높은 특이성을 제공. 경쟁적인 ELISA에서 경쟁 샘플 항 원 및 주 항 체 바인딩 위한 플레이트-바인딩 항 간에 설정 하 고 샘플에 있는 항 원 농도 기판에서 신호 감소를 측정 하 여 정량은 15 , 16. 경쟁 ELISA 위에서 언급 한 직접 또는 간접 형식을 사용 하 여 수행할 수 있습니다 및 단지 1 개의 epitope15,16작은 항 원의 검출을 위한 유용.
항 체의 측정에 대 한 대체 기술을 포함 라디오-immunoassay (RIA), electrochemiluminescence (ECL) 분석 결과 및 표면 플라스몬 공명 (SPR) 시험17. 리아 첫 번째 immunoassay 높은 특이성 및 방사선된 약18,19를 사용 하 여 감도 항 원 (항 체)의 존재 그 조치를 개발 했다. 그러나, 방사성 독성, 폐기 비용, 수명 및 방사성 재료와 함께 작동 하도록 특별 한 라이선스 문제로 인해 ELISA는 더 나은 하 고 일반에 대 한 더 편리한 기술20,21을 사용 하 여 키를 누릅니다. ECL은 chemiluminescent 반응 반응성이 매우 높은 종, 전극의 표면에 안정적인 선구자에서 생성 하는 전기를 사용 하 여 시작 되 고 analytes의 양을 측정 하는 데 사용 될 수 있는 매우 중요 한 분석 결과 (항 원 등 또는 항 체)22. 그러나, ECL 특별 한 계기를 요구 하 고 따라서 사용 되지 않습니다으로 광범위 하 게 일 라23. SPR은 직접 분석 결과 ligands의 바인딩은 측정 하는 데 사용할 수 있습니다 (예., 항 체)를 분자를 움직일 수 (예., 항 원) 센서에 칩 표면24. SPR 매우 구체적으로 실시간으로 상호 작용을 감지 하 고 ELISA로 이라는 시 약의 사용을 요구 하지 않습니다. 그러나, SPR 또한 특별 한 장비를 필요로 하 고 ELISA17보다 낮은 감도 있다. 다른 방법의 한계를 감안할 때, ELISA는이 프로토콜에 우리의 목적을 위해 가장 적합 하 고 편리한 기술 이다. 여기, 우리는 총 Ig isotype 수준 분석 및 항 원 특정 Ig isotypes의 분석에 대 한 간접적인 ELISA의 절차에 대 한 샌드위치 ELISA 사용 하 여를 설명합니다.
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Protocol
이 프로토콜의 럿 거 스 대학 기관 동물 실험 윤리 위원회의 지침을 따릅니다. 모든 마우스 기관 동물 관리 및 사용 위원회에 의해 승인 된 동물 프로토콜에서 NIH 지침에 따라 사용 됩니다.
1. 생쥐와 순진한 마우스 세라의 컬렉션의 준비
- 특정 병원 체-무료 동물 시설에에서 예방 접종 실험에 대 한 모든 마우스를 유지.
- 사용 하 여 일치 하는 성별, 젊은 성인 (8-12 주 이전) 녹아웃 및 littermate 같은 부모와 면역 연구에 대 한 감 금 소를 공유 하는 마우스 제어.
- 예방 접종 및 그림 1에서처럼 혈 청 수집 일정을 계획 합니다.
- 예방 접종 하기 전에 7 일 (-7 일)에서 각 마우스의 혈 청 순을 수확. 4 단계에서 아래의 자세한 역 궤도 출혈 및 혈 청 준비 절차를 따릅니다.
2. 준비 TNP-다 당 류 (티 원) TNP KLH (TD 항)
- TNP-다 당 류 주식과 TNP KLH 재고 솔루션의 1 mg/mL의 0.5 mg/mL을 철저 하 게 멸 균 PBS (pH 7.4)에 항 원 분말을 디졸브. Aliquot 각 항 0.5 mL/튜브, 살 균 microfuge 관으로 솔루션을 재고 하 고 장기 저장을 위한-80 ° C에는 aliquots를 유지. 여러 동결과 항 원 aliquots의 해 동 하지 마십시오.
- 주사 당일 계산 TNP-다 당 류의 볼륨 (50 µ g/100 µ L/마우스) 또는 TNP KLH (100 µ g/100 µ L/마우스) 주입에 쥐의 수에 따라 필요한. 적절 한 수의 상 온 (RT) TNP-다 당 류 또는 TNP KLH aliquots 녹여
- TNP KLH 주입을 위해 먼저 10 mg/mL의 최종 농도에 살 균 PBS의 3 볼륨 졸업생 보조 (40 mg/mL)를 희석. 졸업생 보조 제 혼합물은 잘 희석 하기 전에 일시 중단 된 다는 것을 확인 하십시오.
- 5 mL 폴 리 프로필 렌 튜브에 동등한 양의 단계 2.3 및 해 동된 TNP KLH 솔루션 (1 mg/mL)에서 10mg/mL 졸업생 보조 슬러리를 결합, 잘, 혼합 하 고 30 분이 TNP-KLH/졸업생 혼합 주사 전에 갓 준비에 대 한 37 ° C에서 품 어.
3입니다. 마우스의 면역
- TNP-다 당 류 또는 TNP-KLH/졸업생 면역 biosafety 내각에 1 mL 인슐린 주사기와 쥐의 복 (i.p.) 주사를 수행 합니다. 내부 장기에 주입을 방지 하기 위해 각 마우스의 더 낮은 오른쪽 사분면에 가급적 이면 약 30 ° 각도로 바늘을 삽입 합니다.
- 하루 0 TI Ag 예방 접종 (그림 1A)에 마우스 당 TNP-다 당 류의 i.p. 100 µ L를 주사.
- Ag는 TD 예방접종의 날 0 마우스 당 (신선한 단계 2.4에서에서 준비) TNP-KLH/졸업생 믹스의 i.p. 200 µ L를 주사. 메모리 연구 (그림 1B) 부스터 예방 접종으로 하루 21에 같은 주사를 반복 합니다.
- 주입, 후의 케이지를 각 마우스를 반환 하 고 특정 병원 체 자유로운 상태에서 모든 삽입 된 생쥐를 유지 합니다.
4. 레트로 궤도 출혈 및 혈 청 준비
- 다른 시간 지점에서 마우스 세라 수확:-7-7 (그림 1A); 하루에 마우스 세라 TNP-다 당 류 예방 접종에 대 한 수집 TNP-KLH/졸업생 예방 접종에 대 한 일-7, 7, 14, 28 (그림 1B)에 마우스 세라를 수집 합니다.
- 복고풍-궤도 출혈, 각 biosafety 캐비닛25에서 1-2 분 5 %isoflurane 마우스 anesthetize. 각 마우스의 적절 한 마 취를 위해 페달 반사를 수행 합니다.
- 집게와 엄지 다시 그렇게 소켓25에서 안구 돌출 안구 주위 피부를 당기고 한 손으로 마 취 마우스를 잡아. 눈알25아래 눈 소켓의 안쪽 모서리에 45 °의 각에서 비 heparinized 파스퇴르 피 펫 또는 모 세관 튜브를 삽입 합니다.
- 부드러운 하향 압력을 적용 하 고 피 펫 또는 정 맥에 침입 하 고 150-200 µ L 피 펫 또는 튜브에 혈액의 수집을 부드럽게 튜브를 회전. 즉시 살 균 1.5 mL microfuge 관에 혈액을 전송 하 고 복구할 수 그것의 감 금에 마우스를 반환 합니다.
- 혈액 샘플 1-2 h 응고를 위한 RT에 앉아 보자.
- 4 ° c.에서 10 분 13000 x g 에서 coagulated 혈액 샘플을 원심 새로운 살 균 1.5 mL microfuge 관에 혈액 응고의 위에 명확한 혈 청을 전송 합니다.
- 잔여 혈액 응고를 제거 하 고 명확한 혈 청 수집 단계 4.6 한 번 더 반복 합니다.
- 약 50 µ L/튜브, 살 균 1.5 mL microfuge 관으로 혈 청 수-80 ° c.에서 세라를 저장 하 고
- 각 눈은 모든 실험에 대 한 최대 두 번 출혈이 있도록 다른 시간 지점에서 출혈에 대 한 눈을 대체. 출혈 하는 터미널에서 안락사 하기 전에 각 마우스에서 최대 1 mL의 혈액을 수집 합니다. 5% CO2 자 궁 경부 전위 뒤 마우스를 안락사.
참고: 비장 B 세포 흐름 cytometric 분석 및 생체 외에서 문화 연구를 위한 수확 될 수 있습니다. 우리는 또한 각 마우스의 유전자 형을 확인 하기 위해 splenocytes에서 게놈 DNA를 준비 합니다.
5. 마우스 Ig Isotype-특정 ELISA
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버퍼 및 ELISA 하기 전에 솔루션을 준비 합니다.
- 500 mL 커플링 버퍼 (PBS, pH 7.4)을 준비 합니다.
- 세척 솔루션의 500 mL를 준비 (PBS-T (0.05% 트윈 20), pH 7.4).
- 100 mL 차단 버퍼의 준비 (1% BSA PBS, pH 7.4에 4 ° C에 저장).
- 1 L 기판 버퍼의 준비 (1 M diethanolamine, pH 9.8 (H2O, pH 10 M HCl을 사용 하 여 조정의 1 L에 diethanolamine의 97 mL)와 0.5 m m MgCl2). 알루미늄 호 일 병을 배치 하 여 빛 으로부터 기판 버퍼를 보호 합니다. 4 ° c.에 게
- 정지 솔루션 (3 M NaOH) 100 mL를 준비 합니다.
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ELISA 격판덮개 코트:
- 총 혈 청 Ig isotype ELISA에 대 한 96-잘 면역 접시 10 µ g/mL isotype-특정 캡처 polyclonal 염소 반대로 마우스 Ig의 코트 (M, g 1은, G2a, G2b, G3, A, 또는 E) Abs에 커플링 버퍼 (PBS)에 100 µ L/잘.
- TNP 특정 Ig isotype ELISA, 면역 96 잘 접시 10 µ g/mL의 PBS에 TNP(38)BSA에 100 µ L/잘 코트.
- 높은 선호도 TNP 특정 Ig isotype ELISA, 면역 96 잘 접시 10 µ g/mL PBS에 TNP(3)BSA의 100 µ L/잘26코트. 4 ° C에서 접시를 밤새 품 어.
- 코팅 부 화 후 2 번 200 µ L/잘 PBS-t와 접시 세척 워시 버퍼를 삭제 하 고 오 점 각 세척 후 번호판 (종이 타 올의 스택에 각 접시를 거꾸로 탭)를 건조.
- 번호판을 차단: 차단의 200 µ L/잘 추가 코팅된 판으로 (PBS에 1 %BSA)를 버퍼링 하 고 실시간에 1 시간에 대 한 번호판을 품 어
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번호판을 차단 하는 동안 Ig isotype 표준 및 별도, 치료 96 잘 접시에 150 µ L/잘 차단 버퍼에서 혈 청 샘플의 희석을 준비 합니다.
- 250 ng/mL Ig isotype 표준 시작 표준 농도 (St01)으로 준비 하 고 서 표준의 직렬 희석 1: 2의 7 ~ 10 할 (St02 St07 또는 St10, 그림 2A).
- 1: 100 또는 1: 500 희석에 샘플 시작 희석으로 요소 고 3 또는 4 1시 10분의 총 Ig isotype에 대 한 직렬 희석 또는 각 혈 청 샘플 (그림 2A) TNP 특정 Ig isotype에 대 한 1:5 직렬 희석 마우스 혈 청을 준비. IgE ELISA에 대 한 시작 희석으로 1:2 희석 요소에 마우스 혈 청 샘플을 준비 하 고 각 혈 청 샘플의 직렬 희석 1: 5의 3.
- 차단, 후 단계 5.4 세 번 200 µ L/PBS-T의 우물에서에서 접시를 세척 하 고 오 점 건조 판 각 세척 후.
- 5.6 단계에서 준비 된 접시를 100 µ L/잘 희석 Ig isotype 표준 (캡처 및 탐지 Abs에 대 한 적절 한) 및 희석된 혈 청 샘플 단계 5.5에서에서 전송. 표준 및 4 ° C에서 샘플 접시를 밤새 품 어.
- PBS-T의 200 µ L/잘 사용 3 회 접시를 세척 하 고 오 점 건조 판 각 세척 후.
- 각 접시에 추가 된 적절 한 알칼리 성 인산 가수분해 효소 (AP)의 10 µ g/mL의 100 µ L/잘-활용된 isotype 특정 염소 반대로 마우스 Ig (M, g 1은, G2a, G2b, G3, A, 또는 E) Abs 차단 버퍼에 희석.
- 실시간에서 1-2 h에 대 한 AP 활용 된 Abs와 번호판을 품 어 IgE 검출에 대 한 1-2 h 37 ° c.에 대 한 번호판을 품 어
- 5 mg 인산 가수분해 효소 기판 기판 버퍼의 10 ml에서의 2 개의 정제를 용 해 하 여 1 mg/mL 기판 솔루션의 준비.
- 각 판 5 번 PBS-T의 200 µ L/잘 세척 하 고 오 점 건조 판 각 세척 후.
- 100 µ L/잘 기판 솔루션의 각 접시에 추가 합니다. RT는 일반적으로 몇 분만에 개발 하는 반응을 수 있습니다.
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405에 각 접시를 읽고 nm microplate 리더를 사용 하 여 관련된 소프트웨어와 함께.
- "Lm1" 파장을 설정 하려면 "설정"을 클릭 "405 nm" "확인"을 클릭 합니다.
- "빈" 웰 스, "표준" 우물과 96 잘 접시 설치 프로그램에 "알 수 없는" 우물을 할당 하려면 "서식 파일"을 클릭 합니다.
- "표준" 우물 "시리즈" "첫 번째 샘플"로"St01" 설정 "시작"최고", 선택 하 고"복제""2"로 설정을 클릭 하십시오. "샘플 Descriptor"를 확인 하 고 "표준 값"을 입력: ""로"ng/mL단위"를 선택 "250"로 "시작 값", "단계" "2"로 설정. "확인"을 클릭 합니다.
- 클릭 하십시오 "읽기" 읽을 접시 가장 집중 표준에 도달 하는 때 ~ 1의 광학 밀도 (OD).
- "파일" 메뉴를 클릭 하 고 파일을 저장 하려면 "저장"을 클릭 합니다.
- 때 가장 집중된 표준 접근 ~ 1.5, 2, 2.5, OD405 각각 접시를 다시 읽기 "읽기"를 클릭 합니다.
- 25 µ L/3 M NaOH의 우물을 추가 하 여 반응을 중지 합니다. 한 번에 한 접시 5.12 5.15 단계를 완료 합니다.
-
Microplate 리더 소프트웨어를 사용 하 여 ELISA 데이터 분석:
- 읽기 파일의 Ig isotype 기준의 OD405 값을 확인 하 고 자세한 데이터 분석을 위한 기준의 좋은 선형 범위와 적절 한 독서를 선택 합니다.
- 4-매개 변수 피팅 프로그램 표준 곡선을 플롯을 선택 합니다. Co-효율적인 표준 곡선 (R2) > 0.98 좋은 데이터 품질을 보장 하기 위해 필요를 확인 하십시오.
- 각 샘플의 OD405 값 희석 요인 증가 함께 감소 여부를 확인 합니다. "미지수"를 클릭 하 여 모든 희석된 샘플 우물의 농도 검색 합니다.
- 농도 계산에 대 한 Ig isotype 표준 곡선의 선형 범위에서 OD405와 각 샘플의 적절 한 음을 선택 합니다.
- 계산 하는 수식을 사용 하 여 각 샘플의 Ig isotype 농도 혈 청: 혈 서 농도 = x 희석 요소 선택된 잘 농도.
- 그래프를 플롯 하 고 적절 한 소프트웨어9,,1011를 사용 하 여 통계 분석을 수행 합니다. 혈 청의 수직 점도 Ig isotype 레벨 비교 같은 시간 지점에서 Ig 응답을 확인 합니다. TD 메모리 응답 연구, 부스터 예방 접종 전후 Ig isotype 응답을 검사 시간 코스 응답 곡선을 확인 합니다. 오차 막대를 사용 하 여 샘플의 각 그룹의 표준 편차 (SD) 표시. Ig isotype 응답 마우스의 두 genotypes 사이 비교, 통계적 의미를 확인 하려면 양측 데이터에 대 한 짝이 없는 t 테스트를 사용 합니다. P 값 < 0.05로 상당히 다른 설정 합니다.
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Representative Results
우리는 면역 체계, TRAF3, TI 및 TD Ig isotype 응답9,,1011의 중요 한 레 귤 레이 터의 역할을 조사 하기 위해이 프로토콜을 이용 했다. TRAF3 직접 또는 간접적으로 통제 한다 타고 난 및 적응형 면역 수용 체, TNF 수용 체 superfamily를 포함 하 여 다 수의 신호 변환, 수용 체 통행세 같이 그리고 T 세포 수용 체/CD28, 다른 사람의 사이에서27,28. 우리는 TRAF3 항 체 응답 규제 하위 집합 다른 면역 세포에에서 뚜렷한 역할을 재생 가설. 이 가설을 테스트 하기 위해 우리는 Traf3 유전자 B 세포, T 세포, 또는 골수성 세포, 특히 삭제 각각9,10, 조건부 TRAF3 녹아웃 쥐를 사용 하 여 TI와 TD Ig isotype 응답 결정 11. 대표적인 면역 및 혈 청 수집 일정을 TI와 TD 서 연구는 그림 1에 묘사 된다. 대표 IgG1 및 IgG2b ELISA 결과 ELISA의 작동 방법을 설명 하기 위해 그림 2 와 그림 3 에 나와 있습니다. 희석된 표준 및 샘플 (그림 2A), AP 기판 (그림 2B), OD405의 읽기 결과의 추가 판의 이미지 플레이트 설치 포함 됩니다 (그림 2C, 2D) (그림 2E, 2 층) 표준 희석의 값, 표준 곡선 (그림 3A, 3B), 희석된 샘플 (그림 3C, 3D), 값 및 혈 청의 계산 IgG1 및 IgG2b (그림 3E, 3 층) 샘플에 대 한 농도 그림 4 는 순진한 쥐의 세라에 총 Ig isotypes의 대표적인 결과 보여 줍니다. 우리는 성별 및 나이-일치 TRAF3 충분 한 littermate 제어 마우스 (LMC)에 비해 B 세포 특정 TRAF3-/- (B-TRAF3/-) 마우스에 IgG2a, IgA, IgM, IgG3, IgG2b의 통계적으로 증가 기저 혈 청 수준을 시연. B-TRAF3/- 생쥐의이 hyperglobulinemia이 성숙 TRAF3-/- B 셀9의 머리말 붙인된 생존 때문 주변 림프 기관에 확장 된 B 세포 격실에 의해 발생 합니다. 그림 5 에서는 TI와 TD Ig의 대표적인 결과 TNP-다 당 류와 TNP KLH 면역 생쥐의 응답 isotype 각각. 이 결과 공개 상당히 높은 티, TNP 특정 IgG3 수준 또한 높은 TD, 골수성 세포 특정 TRAF3-/- (M-TRAF3-/-) 마우스 보다 LMC에 TNP 특정 IgG2b 수준. 같은 TI IgG3 증가 하 고 TD IgG2b M TRAF3/- 생쥐에서 관찰은 TRAF3-/- 세포와 면역11다음 DCs 프로 염증 성 cytokines 일리노이-6, 일리노이-12의 생산 증가 때문일. 그림 6 는 기본 TD의 대표적인 결과 TNP KLH 면역 생쥐의 메모리 응답을 보여 줍니다. 이러한 결과 부분적으로 감소 TD IgM 기본 응답 및 결함이 IgG1 기본 및 T 세포 관련 TRAF3-/- (T-TRAF3-/-) 생쥐에서 메모리 응답을 시연 했다. 결함이 있는 TD 기본 및 T 세포 수용 체와 CD28 공동 참여10시 TRAF3-/- CD4 T 세포의 장애 활성화에서 T-TRAF3/- 생쥐 결과의 메모리 응답입니다. 함께, TI와 TD 서 조절에 하위 집합 다른 면역 세포에에서 TRAF3의 특정 역할을 나타내는 수 있었습니다이 문서에서 설명 하는 프로토콜 isotype 응답에서에서 촬영 마우스.
그림 1 : 일반적인 TI와 TD Ag 면역 및 혈 청 컬렉션 일정. (A) TNP-다 당 류 실험. (B) TNP KLH 실험. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 2 : 대표 IgG1 및 IgG2b 일 라. (A) 96 잘 접시 설치 포함 공백, 쥐 IgG1의 7 연속 희석 (1:2) 및 IgG2b 표준의 우물 (St01 St07), 및 8 마우스 혈 청의 (에 1:10) 4 직렬 희석 (S8 S1). 표준 농도 잘 각 표준의 하단에 제공 됩니다. 샘플의 희석 요소는 잘 각 샘플의 하단에 제공 됩니다. (B) AP 기판의 추가 후 5 분 접시의 이미지. 접시 읽기 IgG1의 결과 (C) 및 IgG2b (D)에서 405 nm. (F) OD405와 다른 희석 마우스 IgG1 (E)와 마우스 IgG2b의 농도 값 기준. 광, 농도; BackCalcConc, 다시 계산 농도; OD, 광학 밀도; AvgOD, 복제;의 평균 세 SD, 표준 편차; 이력서, 변이 계수 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 3 : 대표 IgG1 및 IgG2b ELISA 데이터 분석. IgG1의 표준 곡선 (A) 및 IgG2b (B). 계수 R2 는 두 표준 곡선에 > 0.98입니다. 화살표는 표준 곡선의 선형 범위를 나타냅니다. 값 OD405 및 IgG1의 농도 (C) 및 IgG2b (D) 미지수 (희석된 혈 청 샘플)에서. R, 범위; 광, 농도 IgG1의 마우스 혈 청 농도의 계산 (E)와 마우스 IgG2b (F) 8 샘플에 대 한. ND,이 애 란에 의해 감지 하지입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 4 : 순진한 쥐의 세라에 총 Ig isotypes의 대표적인 결과. 세라 성별 일치 하는, 10-12 주 오래 된 순진한 LMC 및 B-TRAF3-/- 생쥐에서 수집 (n = 10; 각 유전자 형에 대 한 유전 배경: 129xC57BL/6). 총 IgM IgG1, IgG2a, IgG2b, IgG3, IgA, IgE의 기저 혈 청 수준 ELISA에 의해 결정 되었다. 통계적 의미는 양측 데이터에 대 한 짝이 없는 t 검정으로 결정 했다. *, 대마젤란은 하와 B-TRAF3/- 생쥐 (p < 0.05); 사이 크게 다른 * *, 아주 크게 다른 LMC 및 B-TRAF3/- 생쥐 (p < 0.01) 사이. 이 그림은 시 외에서 수정 되었습니다. 9. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 5 : TI 및 TD Ig isotype 응답 TNP-다 당 류 및 TNP KLH 면역의 대표적인 결과 각각. 성별-일치, 8-12 주 오래 된 LMC 및 M-TRAF3-/- 생쥐 (유전 배경: C57BL/6) 50 µ g의는 TI Ag TNP-다 당 류 접종 했다 (상단 패널, n = 9 각 유전자 형에 대 한) 또는 졸업생 100 µ g TD Ag TNP KLH의 혼합 (하단 패널, n = 12 각 유전자 형)입니다. 세라 예방 접종 후 7 일에 수집 되었다. 혈 청 titers 안티 TNP IgM IgG1, IgG2b, IgG3, IgA, IgE의는 ELISA에 의해 분석 되었다. 통계적 의미는 양측 데이터에 대 한 짝이 없는 t 검정 분석 했다. *, 대마젤란은 하와 M-TRAF3/- 생쥐 (p < 0.05) 사이 크게 다른. 이 그림은 Lalani 외에서 수정 되었습니다. 11. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 6 : TD 기본 및 메모리 Ig 응답 TNP KLH 면역의 대표적인 결과. 성별-일치, 8 10 주 오래 된 LMC 및 T-TRAF3/- 생쥐 (n = 10; 각 유전자 형에 대 한 유전 배경: 129xC57BL/6) 100 µ g의는 TD Ag TNP-KLH 졸업생에 하루 0 혼합 접종 했다. 각 마우스는 또한 첫 번째 접종 후 21 일 동일한 Ag와 보조 부스터 예방 접종을 받았다. 혈 청 샘플에서에서 수집 된 쥐-7, 7, 14, 28 일에 각각. 혈 청 샘플에 TNP 특정 IgM 및 IgG1 수준의 ELISA에 의해 측정 되었다. 그래프는 LMC 및 T-TRAF3/- 생쥐 (평균 ± SD)의 10 쌍의 결과 묘사. 통계적 의미는 양측 데이터에 대 한 짝이 없는 t 검정 분석 했다. *, 크게 다른 LMC 및 T-TRAF3/- 생쥐 (p < 0.05); * *, 아주 크게 다른 LMC 및 T-TRAF3/- 생쥐 (p < 0.01); 매우 크게 LMC 및 T-TRAF3/- 생쥐 (p < 0.001) 사이 다. 이 그림은 시 외에서 수정 되었습니다. 10. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
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Discussion
여기, 우리는 ELISA를 사용 하 여 마우스에 TD와 TI Ig isotype 응답 특성에 대 한 프로토콜을 설명 합니다. 이 프로토콜의 성공적인 구현에는 표 1, ELISA 분석 실험 접시, 예방접종 Ags, 마우스 Ig isotype-특정 항 체 및 표준에에서 지정 된 재료 사용을 해야 합니다. 애 란에 대 한 치료는 조직 배양 배지를 사용 하지 않도록 주의 해야 합니다. 표준 및 혈 청 샘플의 희석 별도 치료 플레이트 (라운드-하단)에서 수행 하 고 ELISA 격판덮개에 추가 해야 합니다. 이 프로토콜을 사용 하 여, 우리는 지속적으로 얻은 신뢰할 수 있는 결과 높은 특이성 및 감도.
이 프로토콜 내에서 중요 한 단계는 Ag 면역, 복고풍 궤도 출혈, 그리고 Ig isotype-특정 ELISA 포함 됩니다. TD Ag 예방 접종에 대 한 TNP-KLH/졸업생 믹스 철저 하 게 그 정확한 양의 Ag/보조 주입 되도록 resuspended 되어야 한다. 복고풍 궤도 출혈 하는 동안 피펫으로 또는 세관에 혈액 응고, 즉시 새로운 피펫으로 또는 모 세관 튜브로 변경. 버퍼 및 ELISA에 사용 된 시 약 명확한 솔루션 이며 비정상적인 OD405 값으로 거짓 긍정적인 결과 줄 수 있는 침전 물이 없어야 합니다. 또한, 거품은 또한 비정상적인 OD405 값 false 양수 또는 허위 부정적인 결과 줄 수 있는 모든 ELISA 단계에서 우물에 피해 야 한다. 중복에 샘플을 분석 하 여이 가끔 오류를 최소화할 수 있습니다. ELISA에서 세척 단계 우물에서 언바운드 시 약 및 항 체를 제거합니다. 부족 한 세척 하면 높은 배경 잡음, 하지만 과도 한 세척 코팅된 항을 제거 하 여 감도 감소로 이어질 수 있습니다 또는 항 체29바인딩된. 워시 번이 ELISA 프로토콜에서 설명의 숫자는 우리의 경험에 따라 최적화 되어 있다.
ELISA 표준 곡선의 선형 범위에 의해 일반적으로 정의 되는 검출 한계는 주목 한다. 올바르게 각 Ig isotype의 혈 청 농도 측정, 샘플 표준 곡선의 선형 범위에 맞게 적절 하 게 희석 해야 합니다. 이 프로토콜에서 설명 된 대로 Ig 농도의 계산에 대 한 적절 한 희석 요인 선택 샘플의 직렬 희석을 테스트 하는 것이 좋습니다. 그러나, 결과 테스트 희석 요인 표준 곡선의 선형 범위에서 결과 제공 하지 않는 경우, 추가 ELISA 필요가 초기 ELISA 결과 따라 조정 하는 희석 요소를 사용 하 여 수행. 테스트 모든 희석 낮은 검출 한계 아래 있다면, 원래 혈 청 샘플 및 작은 희석 요인 사용 해야 합니다. OD405 값과 비례 감소 표시 되지 않는 경우 테스트 모든 직렬 희석에 대 한 희석 비율 증가, 캡처 Ab 또는 Ag 코팅 모든 희석된 샘플에 의해 포화 그리고 더 높은 희석 요인 사용 해야 나타냅니다. 이 프로토콜에 따라 결정적인 결과 ELISA의 2 라운드에서 가장 얻을 수 것입니다.
쥐에 항 체 응답에 영향을 미칠 것으로 알려진 요인 포함 스트레인 (유전 배경), 성별, 나이, 다이어트 및 동물 시설 환경30,31,,3233,34 . 예를 들어 많은 마우스 긴장 IgG2a 생산, 비록 C57BL/6 쥐 같은 특정 긴장 IgG2a 생산 하지 하지만 대신35,36IgG2c를 생산. 최근의 증거는 또한 항 체 응답37,38,,3940에 영향을 미치는 요인으로 공생 microbiota를 식별 합니다. 이 요인을 고려해 서, 같은 부모와 TD와 TI Ag 면역 실험에 대 한 감 금 소를 공유 하는 다른 genotypes의 일치 하는 성별, 젊은 성인 littermates 사용 하 여를 좋습니다. 또한, 마우스 마우스 변형 자주 관찰 된다 (그림 4-6), 동일한 유전자 형의 마우스에 대 한 충분 한 복제 숫자 (일반적으로, n > 8) 쥐의 필요한 각 유전자 형 또는 그룹에 대 한 통계를 얻으려면 의미 있는 결과.
Ig isotype-특정 ELISA 다른 Ig isotypes의 titers 결정에 유용 합니다. 그러나,이 방법은 혼자 Ig isotype titers에서 관찰 된 차이의 근본 원인을 공개 하는 데 충분 하지 않습니다 그리고 따라서 자주 사용 되는 다양 한 무료 접근. Ig isotype titers에 차이 Ig 생산 B 세포의 서로 다른 숫자 또는 다른 효율성 Ig 생산에서 B 세포의 발생 여부를 구분, cytometry41,,4243 흐름 및 효소 연결 된 ImmunoSpot (ELISPOT)43,,4445 를 사용할 수 있습니다. B 세포 생존, 확산 및 어린 싹 센터 형성 분석, 대체 방법 포함 cytometry, 비장 B 세포의 immunohistochemical 얼룩 현미경9,26 뒤 생체 외에서 문화 ,41,,4647. Ig isotype 스위칭 응답 B 세포, 생체 외에서 문화 비장 B 세포의 양적 변화를 명료 하 게 RT-PCR 무거운 사슬 유전자 세그먼트는 일반적으로 Ig의 생식 성적 사용41,43 ,4849. 친 화력 성숙에 있는 다름의 원인 조사, Ig 무거운 사슬 유전자의 신체적인 hypermutation (SHM) VDJ 지역50,,5152의 연속에 의해 결정 됩니다. Ag 면역 흐름에 의해 분석 될 수 있다 후 메모리 B 세포 응답, 주파수 및 다른 메모리 B 세포 부분 집합의 수에 차이 이해 하기 cytometry 최근 사용 하 여 마우스 메모리 B 세포, CD38, CD80, CD73, PD-L2, 등의 표시를 확인 CD62L 및 CCR68,,5354,55. 함께, 이러한 상호 보완적인 방법을 함께 현재 프로토콜 사용 주어진된 실험 설정에 대 한 항 체 응답의 포괄적인 이해를 얻기 위해 연구원을 허용할 것 이다.
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Disclosures
저자 아무 경쟁 금융 관심사 있다.
Acknowledgments
이 연구는 건강 보조금 R01 CA158402의 국가 학회 (P. 시)에 의해 지원 되었다, R21 AI128264 (P. 시), 국방부의 부여 W81XWH-13-1-0242 (P. 시), 조종사 상 암 연구소의 뉴저지에서 보조금 번호 P30CA072720를 통해 국립 암 연구소 (P. 시), 부시 생명 부여 (P. 시), 빅터 Stollar 친교 (A. Lalani)는 앤 B. 그리고 제임스 B. Leathem 친교 (미 주).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| VersaMax Tunable Microplate Reader | MDS Analytical Technologies | VERSAMAX | Equipment to read the plates |
| SOFTmax PRO 5.3 | MDS Analytical Technologies | SOFTmax PRO 5.3 | Software for the plate reader |
| GraphPad Prism | GraphPad | Prism | Software for graphing and statistics |
| TNP-AECM-polysaccharide (FICOLL) | Biosearch Technologies | F-1300-10 | A TI Ag for immunization |
| TNP-KLH | Biosearch Technologies | T-5060-5 | A TD Ag for immunization |
| TNP(38)-BSA | Biosearch Technologies | T-5050-10 (conjugation ratio: 38) | Coating Ag for TNP-specific ELISA |
| TNP(3)-BSA | Biosearch Technologies | T-5050-10 (conjugation ratio: 3) | Coating Ag for high affinity TNP-specific Ig |
| Imject Alum | Fisher Scientific | PI-77161 | Alum adjuvant for immunization |
| Falcon Polypropylene tubes | Fisher Scientific | 14-959-11A | For incubation of TNP-KLH/alum |
| BD Insulin Syringe | Fisher Scientific | 14-829-1B | For i.p. injection of mice |
| Immuno 96-Well Plates, Flat-Bottom | Fisher Scientific | 14-245-61 | For ELISA |
| Untreated 96-Well Microplates, Round-Bottom | VWR | 82050-622 | For serial dilutions of standards and samples |
| Phosphatase substrate, 5 mg Tablets | Sigma | S0942-200TAB | AP substrate |
| Diethanolamine | VWR | IC15251690 | A component of AP substrate buffer |
| Goat anti-mouse IgM | SouthernBiotech | 1020-01 | Capture Ab for mouse IgM |
| Goat anti-mouse IgG1 | SouthernBiotech | 1070-01 | Capture Ab for mouse IgG1 |
| Goat anti-mouse IgG2a | SouthernBiotech | 1080-01 | Capture Ab for mouse IgG2a |
| Goat anti-mouse IgG2b | SouthernBiotech | 1090-01 | Capture Ab for mouse IgG2b |
| Goat anti-mouse IgG3 | SouthernBiotech | 1100-01 | Capture Ab for mouse IgG3 |
| Goat anti-mouse IgA | SouthernBiotech | 1040-01 | Capture Ab for mouse IgA |
| Goat anti-mouse IgE | SouthernBiotech | 1110-01 | Capture Ab for mouse IgE |
| AP-Goat anti-mouse IgM | SouthernBiotech | 1020-04 | Detection Ab for mouse IgM |
| AP-Goat anti-mouse IgG1 | SouthernBiotech | 1070-04 | Detection Ab for mouse IgG1 |
| AP-Goat anti-mouse IgG2a | SouthernBiotech | 1080-04 | Detection Ab for mouse IgG2a |
| AP-Goat anti-mouse IgG2b | SouthernBiotech | 1090-04 | Detection Ab for mouse IgG2b |
| AP-Goat anti-mouse IgG3 | SouthernBiotech | 1100-04 | Detection Ab for mouse IgG3 |
| AP-Goat anti-mouse IgA | SouthernBiotech | 1040-04 | Detection Ab for mouse IgA |
| AP-Goat anti-mouse IgE | SouthernBiotech | 1110-04 | Detection Ab for mouse IgE |
| Mouse IgM standard | BD Biosciences | 553472 | TNP-specific IgM, Clone G155-228 |
| Mouse IgG1 standard | BD Biosciences | 554054 | TNP-specific IgG1, Clone 107.3 |
| Mouse IgG2a standard | BD Biosciences | 556651 | TNP-specific IgG2a, Clone G155-178 |
| Mouse IgG2b standard | BD Biosciences | 554055 | TNP-specific IgG2b, Clone 49.2 |
| Mouse IgG3 standard | BD Biosciences | 553486 | KLH-specific IgG3, Clone A112-3 |
| Mouse IgA standard | BD Biosciences | 550924 | Mineral oil-induced IgA, Clone MOPC-320 |
| Mouse IgE standard | BD Biosciences | 557079 | TNP-specific IgE, Clone C38-2 |
References
- Moise, A., Nedelcu, F. D., Toader, M. A., Sora, S. M., Tica, A., Ferastraoaru, D. E., Constantinescu, I. Primary immunodeficiencies of the B lymphocyte. Journal of Medicine and Life. 3, 60-63 (2010).
- Bishop, G. A., Haxhinasto, S. A., Stunz, L. L., Hostager, B. S. Antigen-specific B-lymphocyte activation. Critical Reviews in Immunology. 23, 149-197 (2003).
- Murphy, K. Janeway's Immunobiology. 8th Edition. 1, (2012).
- Vinuesa, C. G., Chang, P. P. Innate B cell helpers reveal novel types of antibody responses. Nature Immunology. 14, 119-126 (2013).
- Bekeredjian-Ding, I., Jego, G.
- Mond, J. J., Lees, A., Snapper, C. M. T cell-independent antigens type 2. Annual Review of Immunology. 13, 655-692 (1995).
- Garcia de Vinuesa, C., O'Leary, P., Sze, D. M., Toellner, K. M., MacLennan, I. C. T-independent type 2 antigens induce B cell proliferation in multiple splenic sites, but exponential growth is confined to extrafollicular foci. European Journal of Immunology. 29, 1314-1323 (1999).
- Kurosaki, T., Kometani, K., Ise, W.
- Xie, P., Stunz, L. L., Larison, K. D., Yang, B., Bishop, G. A. Tumor necrosis factor receptor-associated factor 3 is a critical regulator of B cell homeostasis in secondary lymphoid organs. Immunity. 27, 253-267 (2007).
- Xie, P., Kraus, Z. J., Stunz, L. L., Liu, Y., Bishop, G. A. TNF Receptor-Associated Factor 3 Is Required for T Cell-Mediated Immunity and TCR/CD28 Signaling. The Journal of Immunology. 186, 143-155 (2011).
- Lalani, A. I., Moore, C. R., Luo, C., Kreider, B. Z., Liu, Y., Morse, H. C., Xie, P. Myeloid Cell TRAF3 Regulates Immune Responses and Inhibits Inflammation and Tumor Development in Mice. The Journal of Immunology. 194, 334-348 (2015).
- Lee, S., Nguyen, M. T. Recent advances of vaccine adjuvants for infectious diseases. Immune Network. 15, 51-57 (2015).
- Gavin, A. L., Hoebe, K., Duong, B., Ota, T., Martin, C., Beutler, B., Nemazee, D. Adjuvant-enhanced antibody responses in the absence of toll-like receptor signaling. Science. 314, 1936-1938 (2006).
- Klinman, D. M., Currie, D., Gursel, I., Verthelyi, D. Use of CpG oligodeoxynucleotides as immune adjuvants. Immunological Reviews. 199, 201-216 (2004).
- Gan, S. D., Patel, K. R. Enzyme immunoassay and enzyme-linked immunosorbent assay. Journal of Investigative Dermatology. 133, 12 (2013).
- Shah, K., Maghsoudlou, P. Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA): the basics. British Journal of Hospital Medicine. 77, 98-101 (2016).
- Nencini, F., Pratesi, S., Petroni, G., Matucci, A., Maggi, E., Vultaggio, A. Assays and strategies for immunogenicity assessment of biological agents. Drug Development Research. 75, Suppl 1 4-6 (2014).
- Haber, E., Page, L. B., Richards, F. F. Radio immunoassay employing gel filtration. Analytical Biochemistry. 12, 163-172 (1965).
- Yalow, R. S., Berson, S. A. Immunoassay of endogenous plasma insulin in man. 1960. Obesity Research. 4, 583-600 (1996).
- Lequin, R. M. Enzyme immunoassay (EIA)/enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). Clinical Chemistry. 51, 2415-2418 (2005).
- Wreghitt, T. G., Tedder, R. S., Nagington, J., Ferns, R. B. Antibody assays for varicella-zoster virus: comparison of competitive enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA), competitive radioimmunoassay (RIA), complement fixation, and indirect immunofluorescence assays. Journal of Medical Virology. 13, 361-370 (1984).
- Mathew, B. C., Biju, R. S., Thapalia, N. An overview of electrochemiluminescent (ECL) technology in laboratory investigations. Kathmandu University Medical Journal. 3, 91-93 (2005).
- Mikulskis, A., Yeung, D., Subramanyam, M., Amaravadi, L. Solution ELISA as a platform of choice for development of robust, drug tolerant immunogenicity assays in support of drug development. The Journal of Immunological Methods. 365, 38-49 (2011).
- Wadhwa, M., Bird, C., Dilger, P., Gaines-Das, R., Thorpe, R. Strategies for detection, measurement and characterization of unwanted antibodies induced by therapeutic biologicals. The Journal of Immunological Methods. 278, 1-17 (2003).
- Wolforth, J. B. Methods of Blood Collection in the Mouse. Laboratory Animals. 29, 47-53 (2000).
- Stunz, L. L., Busch, L. K., Munroe, M. E., Sigmund, C. D., Tygrett, L. T., Waldschmidt, T. J., Bishop, G. A. Expression of the Cytoplasmic Tail of LMP1 in Mice Induces Hyperactivation of B Lymphocytes and Disordered Lymphoid Architecture. Immunity. 21, 255-266 (2004).
- Xie, P. TRAF molecules in cell signaling and in human diseases. Journal of Molecular Signaling. 8, 7 (2013).
- Lalani, A. I., Zhu, S., Gokhale, S., Jin, J., Xie, P. TRAF molecules in inflammation and inflammatory diseases. Current Pharmacology Reports. 4, 64-90 (2018).
- Tate, J., Ward, G.
- Specter, S., Friedman, H. Age- and sex-related differences in antibody formation and blastogenic responsiveness of splenocytes from RIII mice developing virus-induced mammary adenocarcinoma. The Journal of the National Cancer Institute. 67, 1347-1351 (1981).
- Giefing-Kroll, C., Berger, P., Lepperdinger, G., Grubeck-Loebenstein, B. How sex and age affect immune responses, susceptibility to infections, and response to vaccination. Aging Cell. 14, 309-321 (2015).
- Kaminski, D. A., Stavnezer, J. Antibody class switching differs among SJL, C57BL/6 and 129 mice. International Immunology. 19, 545-556 (2007).
- Sellers, R. S., Clifford, C. B., Treuting, P. M., Brayton, C. Immunological variation between inbred laboratory mouse strains: points to consider in phenotyping genetically immunomodified mice. Veterinary Pathology. 49, 32-43 (2012).
- Conour, L. A., Murray, K. A., Brown, M. J. Preparation of animals for research--issues to consider for rodents and rabbits. Institute of Laboratory Animal Resources Journal. 47, 283-293 (2006).
- Vlkova, M., Rohousova, I., Hostomska, J., Pohankova, L., Zidkova, L., Drahota, J., Valenzuela, J. G., Volf, P. Kinetics of antibody response in BALB/c and C57BL/6 mice bitten by Phlebotomus papatasi. PLOS Neglected Tropical Diseases. 6, 1719 (2012).
- Mestas, J., Hughes, C. C. Of mice and not men: differences between mouse and human immunology. The Journal of Immunology. 172, 2731-2738 (2004).
- Ruane, D., Chorny, A., Lee, H., Faith, J., Pandey, G., Shan, M., Simchoni, N., Rahman, A., Garg, A., Weinstein, E. G., et al. Microbiota regulate the ability of lung dendritic cells to induce IgA class-switch recombination and generate protective gastrointestinal immune responses. The Journal of Experimental Medicine. 213, 53-73 (2016).
- Chorny, A., Puga, I., Cerutti, A. Innate signaling networks in mucosal IgA class switching. Advances in Immunology. 107, 31-69 (2010).
- Van Praet, J. T., Donovan, E., Vanassche, I., Drennan, M. B., Windels, F., Dendooven, A., Allais, L., Cuvelier, C. A., van de Loo, F., Norris, P. S., et al. Commensal microbiota influence systemic autoimmune responses. The EMBO Journal. 34, 466-474 (2015).
- Nguyen, Q. N., Himes, J. E., Martinez, D. R., Permar, S. R. The Impact of the Gut Microbiota on Humoral Immunity to Pathogens and Vaccination in Early Infancy. PLOS Pathogens. 12, 1005997 (2016).
- Jeevan-Raj, B. P., Robert, I., Heyer, V., Page, A., Wang, J. H., Cammas, F., Alt, F. W., Losson, R., Reina-San-Martin, B. Epigenetic tethering of AID to the donor switch region during immunoglobulin class switch recombination. The Journal of Experimental Medicine. 208, 1649-1660 (2011).
- Chen, Z., Getahun, A., Chen, X., Dollin, Y., Cambier, J. C., Wang, J. H. Imbalanced PTEN and PI3K Signaling Impairs Class Switch Recombination. The Journal of Immunology. 195, 5461-5471 (2015).
- Boboila, C., Yan, C., Wesemann, D. R., Jankovic, M., Wang, J. H., Manis, J., Nussenzweig, A., Nussenzweig, M., Alt, F. W. Alternative end-joining catalyzes class switch recombination in the absence of both Ku70 and DNA ligase 4. The Journal of Experimental Medicine. 207, 417-427 (2010).
- Shah, H. B., Koelsch, K. A. B-Cell ELISPOT: For the Identification of Antigen-Specific Antibody-Secreting Cells. Methods in Molecular Biology. 1312, 419-426 (2015).
- Bonsignori, M., Moody, M. A. Simultaneous Detection of Antigen-Specific IgG- and IgM-Secreting Cells with a B Cell Fluorospot Assay. Cells. 1, 15-26 (2012).
- Sasaki, Y., Derudder, E., Hobeika, E., Pelanda, R., Reth, M., Rajewsky, K., Schmidt-Supprian, M. Canonical NF-kappaB activity, dispensable for B cell development, replaces BAFF-receptor signals and promotes B cell proliferation upon activation. Immunity. 24, 729-739 (2006).
- Goodlad, J. R., Macartney, J. C. Germinal-center cell proliferation in response to T-independent antigens: a stathmokinetic, morphometric and immunohistochemical study in vivo. European Journal of Immunology. 25, 1918-1926 (1995).
- Xie, P., Poovassery, J., Stunz, L. L., Smith, S. M., Schultz, M. L., Carlin, L. E., Bishop, G. A. Enhanced Toll-like receptor (TLR) responses of TNFR-associated factor 3 (TRAF3)-deficient B lymphocytes. Journal of Leukocyte Biology. 90, 1149-1157 (2011).
- Kaku, H., Horikawa, K., Obata, Y., Kato, I., Okamoto, H., Sakaguchi, N., Gerondakis, S., Takatsu, K. NF-kappaB is required for CD38-mediated induction of C(gamma)1 germline transcripts in murine B lymphocytes. International Immunology. 14, 1055-1064 (2002).
- Dudley, D. D., Chaudhuri, J., Bassing, C. H., Alt, F. W. Mechanism and control of V(D)J recombination versus class switch recombination: similarities and differences. Advances in Immunology. 86, 43-112 (2005).
- Lange, H., Hecht, O., Zemlin, M., Trad, A., Tanasa, R. I., Schroeder, H. W., Lemke, H. Immunoglobulin class switching appears to be regulated by B-cell antigen receptor-specific T-cell action. European Journal of Immunology. 42, 1016-1029 (2012).
- Moore, C. R., Liu, Y., Shao, C. S., Covey, L. R., Morse, H. C., Xie, P. Specific deletion of TRAF3 in B lymphocytes leads to B lymphoma development in mice. Leukemia. 26, 1122-1127 (2012).
- Bergmann, B., Grimsholm, O., Thorarinsdottir, K., Ren, W., Jirholt, P., Gjertsson, I., Martensson, I. L. Memory B cells in mouse models. Scandinavian Journal of Immunology. 78, 149-156 (2013).
- McHeyzer-Williams, L. J., Milpied, P. J., Okitsu, S. L., McHeyzer-Williams, M. G. Class-switched memory B cells remodel BCRs within secondary germinal centers. Nature Immunology. 16, 296-305 (2015).
- Elgueta, R., Marks, E., Nowak, E., Menezes, S., Benson, M., Raman, V. S., Ortiz, C., O'Connell, S., Hess, H., Lord, G. M., et al. CCR6-dependent positioning of memory B cells is essential for their ability to mount a recall response to antigen. The Journal of Immunology. 194, 505-513 (2015).
