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Immunology and Infection

Caractérisation des Thymus-dépendants et indépendants de Thymus immunoglobuline Isotype réponses chez la souris à l’aide d’Enzyme-linked Immunosorbent Assay

Published: September 7, 2018 doi: 10.3791/57843
Automatic Translation
1, 1, 2,3
1Department of Cell Biology and Neuroscience and Graduate Program in Cellular and Molecular Pharmacology, Rutgers University, 2Department of Cell Biology and Neuroscience, Rutgers University, 3Rutgers Cancer Institute of New Jersey

Summary

Dans cet article, nous décrivons un protocole afin de caractériser les T-dépendants et indépendants de T les réponses isotype immunoglobuline (Ig) chez la souris à l’aide d’ELISA. Cette méthode utilisée seule ou en combinaison avec écoulement cytometry permettra aux chercheurs d’identifier les différences dans les réponses d’isotype Ig médiée par les lymphocytes B chez les souris après vaccination antigène T-dépendants et indépendants de T.

Abstract

Anticorps, appelés également comme différencient d’immunoglobulines (Ig), sécrétées par les lymphocytes B, plasmablasts/plasmocytes, immunité humorale fournissent une formidable défense contre l’invasion des agents pathogènes par l’intermédiaire de divers mécanismes. Un objectif majeur de la vaccination est d’induire des anticorps spécifiques de l’antigène protecteurs pour prévenir les infections mortelles. Les antigènes de thymus-indépendants (TI) et dépendant du thymus (TD) peuvent obtenir des réponses de IgM spécifiques de l’antigène robustes et peuvent également induire la production d’isotype commutation anticorps (IgG, IgA et IgE) ainsi que la production de cellules B mémoire à l’aide fourni par antigène présentant des cellules (CPA). Nous décrivons ici un protocole afin de caractériser les réponses d’isotype TD et TI Ig chez la souris à l’aide de dosage immuno-enzymatique (ELISA). Dans le présent protocole, les réponses de TD et TI Ig sont provoquées chez les souris par voie intrapéritonéale (i.p.) immunisation avec des antigènes conjugués haptène modèle PNT-KLH (dans l’alun) et PNT-polysaccharide (PBS), respectivement. Pour induire la réponse mémoire TD, une vaccination de rappel du TNP-KLH dans l’alun est donnée 3 semaines après la première vaccination avec le même antigène/adjuvant. Sérums de souris sont récoltées à des moments différents avant et après la vaccination. Total sérique Ig et anticorps spécifiques PNT sont ensuite quantifiées à l’aide "sandwich" de Ig isotype-spécifiques et test ELISA indirect, respectivement. Afin de correctement quantifier la concentration sérique de chaque isotype Ig, les échantillons doivent être convenablement diluée pour s’adapter au sein de la gamme de linéarité des courbes standards. Utilisant ce protocole, nous avons toujours obtenu des résultats fiables avec sensibilité et une spécificité élevée. Lorsqu’il est utilisé en combinaison avec d’autres méthodes complémentaires tels que la cytométrie en flux, in vitro culture spléniques des cellules B et immunohistochemical souillant (IHC), ce protocole permettra aux chercheurs d’acquérir une compréhension globale des anticorps réponses dans un cadre expérimental donné.

Introduction

Les lymphocytes B sont le principal acteur dans l’immunité humorale et le seul type de cellules chez les mammifères qui sont capables de produire des anticorps, appelés également immunoglobulines (Ig)1,2. Les anticorps sécrétés par les lymphocytes B fournissent une formidable défense contre l’invasion des agents pathogènes par l’intermédiaire de divers mécanismes, y compris la neutralisation, opsonisation et activation du complément, conduisant à l’immunité protectrice3. Sécrétion d’anticorps par les lymphocytes B n’est possible qu’après la pleine activation des cellules B spécifiques, qui nécessite, en principe que deux distincts des signaux3. Signal 1 est relayé par une liaison directe de l’antigène (Ag) pour le récepteur des cellules B (BCR) exprimé à la surface de cellules naïves spécifiques B3. Selon la source de Signal 2, activation des lymphocytes B se divisent en dépendant du thymus (TD) ou de thymus-indépendants (TI)3,4. Une réaction antigène de TD, 2 Signal est fourni par apparenté CD4 helper (TH) les lymphocytes T activés, qui expriment CD154, le ligand pour le récepteur de costimulation CD40 exprimé sur les cellules de B1,2,3. Une réaction antigène de TI, Signal 2 vient de l’engagement des récepteurs Toll-like (TLR dans le cas type 1 TI Ag) ou réticulation étendue des RCO (dans le cas type 2 TI Ag) sur le B cellules3,4. Antigènes de TI (TI-1) de type 1 sont des ligands microbiennes du TLR, y compris bactériens lipopolysaccharides (LPS), l’ARN viral et microbienne ADN CpG4,5. Antigènes de TI (TI-2) de type 2 ont une structure très répétitive et sont en mesure de livrer prolongée et persistante de signalisation à la cellule de B par réticulation multiples de la RCO4,6. TI-2 antigènes sont les polysaccharides antipneumococciques et polysaccharidiques conjugués haptène6,7. Les TD et TI antigènes peuvent obtenir des réponses de IgM spécifiques de l’antigène robustes et peuvent également induire la production d’isotype commutation anticorps (IgG, IgA et IgE) avec l’aide apportée par l’antigène présentant des cellules (CPA) telles que les cellules dendritiques (CD)1 ,2,3. En outre, antigènes TD et de TI sont capables d’induire des réponses de la mémoire à l’aide de TTB, mais TD antigènes sont plus efficaces pour induire la mémoire cellulaire B génération3,8.

Dans le présent protocole, les réponses TD et TI Ig sont provoquées chez les souris par voie intrapéritonéale (i.p.) immunisation avec hémocyanine de patelle de 2,4,6-phényl-serrure d’antigènes conjugués haptène modèle (TNP-KLH) et PNT-polysaccharide (neutre, très ramifié et de masse élevée), respectivement9,10,11. Antigènes TD sont habituellement utilisés avec un adjuvant pour améliorer la production d’anticorps12. Ici, dans notre protocole, PNT-KLH est injecté à l’alun, un adjuvant couramment utilisé dans la vaccination études12. Autres exemples d’adjuvants qui peuvent être utilisés, complet ou incomplet de Freund (CFA ou IFA), monophosphoryl lipide A / dicorynomycolate de tréhalose (« Ribi » adjuvant) et CpG oligodeoxynucleotides, etc.13, 14. après l’immunisation, les sérums de souris sont récoltées à différents moments et anticorps PNT-spécifiques dans le sérum sont quantifiés à l’aide de Ig isotype-spécifiques enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA)9,10, 11.

ELISA est un axée sur la plaque qui est largement utilisé comme un outil de diagnostic en médecine et aussi comme outil d’analyse en recherche biomédicale15,16. Il est utilisé pour la détection et la quantification des analytes, y compris les anticorps, hormones, cytokines, chimiokines et divers antigènes, etc.. ELISA peut être effectuée dans différents formats, y compris direct, indirect, sandwich et concurrentiel ELISA15,16. En général, il s’agit de l’immobilisation de l’antigène sur une surface solide, habituellement, une plaque de Microplaque 96 puits, qui est incubée avec l’anticorps primaire. Après incubation, l’anticorps non lié est éliminé. Dans un ELISA direct, l’anticorps primaire est directement conjugué à une enzyme (généralement la peroxydase de raifort ou phosphatase alcaline), qui peut fendre un substrat chromogène pour produire un changement de couleur visible détecté par un instrument de détection de signal comme une spectrophotomètre15,16. En revanche, si un anticorps secondaire lié à l’enzyme est utilisé pour lier les anticorps primaire, alors cela est considéré comme un de15,ELISA indirect16. ELISA direct est plus rapide tandis que le test ELISA indirect est plus sensible15,16. Dans un "sandwich" ELISA, les plaques sont recouverts d’un anticorps de « capture » utilisé pour immobiliser l’antigène d’intérêt dans les échantillons, et puis l’antigène capturé peut être détectée par un autre anticorps « détection » dans une manière directe ou indirecte de15, 16. ELISA Sandwich offre une spécificité élevée étant donné que l’antigène est détecté par deux types d’anticorps de l’antigène. Dans un ELISA concurrent, la compétition s’établit entre l’antigène d’échantillon et l’antigène de la plaque de liaison pour la liaison à l’anticorps primaire, et puis la concentration de l’antigène dans l’échantillon est quantifiée par la mesure de la réduction du signal du substrat 15 , 16. ELISA concurrent peut être effectuée en utilisant le format direct ou indirect mentionné ci-dessus et est utile pour la détection des antigènes petits avec qu’un seul épitope15,16.

Des techniques alternatives pour la mesure des anticorps incluent radio-immunoessai (RIA),17de dosage par électrochimiluminescence (ECL) dosage et surface résonance plasmon (SPR). RIA a été le premier immuno-essai développé qui mesure la présence d’un antigène (ou anticorps) avec grande spécificité et une sensibilité à l’aide de réactifs radiomarquées18,19. Toutefois, en raison des préoccupations de toxicité radioactive, de coûts d’élimination, de conservation et de licences spéciales pour travailler avec des matériaux radioactifs, ELISA est un meilleur et plus pratique technique commun utilise20,21. ECL est un dosage très sensible dans lequel les réactions chimiluminescentes commencent à utiliser de l’électricité pour générer des espèces très réactives de précurseurs stables sur la surface d’une électrode et peuvent être utilisées pour mesurer la quantité d’analytes (tels que les antigènes ou les anticorps)22. Cependant, ECL nécessite un instrument spécial et est donc pas aussi largement utilisé comme ELISA23. SPR est un dosage direct qui peut être utilisé pour mesurer la fixation des ligands (e.g., anticorps) à immobilisé molécules (e.g., antigènes) sur un capteur à puce surface24. SPR détecte les interactions en temps réel très particulier et ne nécessite pas l’utilisation de réactifs marqués comme ELISA. Cependant, SPR nécessite un équipement spécial et a une sensibilité plus faible que ELISA17. Compte tenu des limites des méthodes alternatives, ELISA est la technique plus pratique et le plus appropriée pour notre but dans ce protocole. Nous décrivons ici l’utilisation du sandwich ELISA pour l’analyse des niveaux d’isotype Ig totales et les procédures de test ELISA indirect pour l’analyse des isotypes Ig spécifiques de l’antigène.

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Protocol

Ce protocole suit les directives du Comité d’éthique institutionnel de recherche animale de l’Université Rutgers. Toutes les souris sont utilisés conformément aux lignes directrices des NIH et sous un animal protocole approuvé par le Comité de l’emploi et d’institutionnels animalier.

1. préparation des souris et des Collection de sérums de souris naïves

  1. Gardez toutes les souris pour des expériences de vaccination à l’animalerie exempts d’agents pathogènes spécifiques.
  2. Knockout de même sexe, les jeunes adultes (âgés de 8 à 12 semaines) utilisation et même portée contrôle souris qui partagent les mêmes parents et cages pour les études de la vaccination.
  3. Plan de l’immunisation et les horaires de collecte du sérum tel que représenté dans la Figure 1.
  4. Récolter sérum naïf de chaque souris à 7 jours (-7 jours) avant la vaccination. Suivez les procédures rétro-orbitaire hémorragie et sérum préparation tel que décrit ci-après à l’étape 4.

2. préparation du TNP-polysaccharide (un antigène de TI) et PNT-KLH (un antigène de TD)

  1. Dissoudre les poudres d’antigène dans du PBS stérile (pH 7,4) bien faire 0,5 mg/mL de stock PNT-polysaccharide et 1 mg/mL de solution mère PNT-KLH. Aliquote chaque antigène solution mère dans des microtubes stériles à 0,5 mL/tube et garder les aliquotes à-80 ° C pour le stockage à long terme. Évitez les multiples de gel et de dégel des aliquotes de l’antigène.
  2. Le jour de l’injection, calculer le volume du TNP-polysaccharide (50 µg/100 µL/souris) ou PNT-KLH (100 µg/100 µL/souris) nécessaires selon le nombre de souris à doser. Décongeler le nombre approprié de PNT-polysaccharide ou PNT-KLH aliquotes à température ambiante (RT).
  3. Pour injection de PNT-KLH, tout d’abord diluer l’adjuvant d’alun (40 mg/mL) et 3 volumes de PBS stérile à une concentration finale de 10 mg/mL. Assurez-vous que le mélange d’adjuvant d’alun est bien suspendu avant dilution.
  4. Combiner un volume égal de 10 mg/mL alun adjuvant lisier à l’étape 2.3 et la solution de PNT-KLH décongelée (1 mg/mL) dans un tube en polypropylène 5 mL, bien mélanger et laisser incuber à 37 ° C pendant 30 min. Préparez ce PNT-KLH/alun mélanger fraîchement avant l’injection.

3. immunisation de souris

  1. Effectuer l’injection intrapéritonéale (i.p.) de PNT-polysaccharide ou PNT-KLH/alun d’immuniser les souris avec des seringues à insuline 1 mL dans une enceinte de sécurité biologique. Insérer l’aiguille à angle d’environ 30° de préférence dans le quadrant inférieur droit de chaque souris pour empêcher l’injection dans les organes internes.
  2. Injecter i.p. 100 µL du TNP-polysaccharide par souris le jour 0 de vaccination TI Ag (Figure 1A).
  3. Injecter i.p. 200 µL du mélange PNT-KLH/alun (fraîchement préparé à l’étape 2.4) par souris au jour 0 pour la vaccination de l’Ag de la TD. Renouveler l’injection même sur 21 jours comme une vaccination de rappel pour les études (Figure 1B) de la mémoire.
  4. Après l’injection, retourner chaque souris à sa cage et garder toutes les souris injectées dans un État exempt d’agents pathogènes spécifique.

4. rétro-orbitaire hémorragie et préparation de sérum

  1. Récolter les sérums de souris à des moments différents : pour la vaccination de PNT-polysaccharide, recueillir les sérums de souris jour -7 et 7 (Figure 1A) ; pour la vaccination de PNT-KLH/alun, recueillir des sérums de souris jour -7, 7, 14 et 28 (Figure 1B).
  2. Pour rétro-orbitaire hémorragie, anesthésier chaque souris avec 5 % isoflurane pendant 1 à 2 min dans une armoire de biosécurité25. Effectuer la pédale réflexe afin d’assurer une anesthésie adéquate de chaque souris.
  3. Maintenez la souris anesthésiée dans une main avec l’index et le pouce en tirant la peau autour du globe oculaire arrière de façon que le globe oculaire fait saillie hors de la prise de25. Insérez le tube capillaire ou sans héparine de pipette Pasteur à un angle de 45° dans le coin interne de l’orbite sous le globe oculaire25.
  4. Appliquez une légère pression vers le bas et faites tourner la pipette ou le tube doucement pour percer dans la veine et recueillir 150 – 200 µL de sang dans la pipette ou le tube. Immédiatement transférer le sang dans un tube de microtubes stériles de 1,5 mL et regagner sa cage pour récupérer de la souris.
  5. Couler le sang échantillons s’asseoir à la droite pendant 1 à 2 h à coaguler.
  6. Centrifuger les échantillons de sang coagulé à 13 000 x g pendant 10 min à 4 ° C. Transférer le sérum clair sur le dessus le caillot de sang dans un nouveau tube de microtubes stériles de 1,5 mL.
  7. Répétez l’étape 4.6 une fois de plus pour retirer le caillot de sang résiduel et recueillir le sérum clair.
  8. Aliquote du sérum dans des microtubes stériles de 1,5 mL à 50 µL/tube et stocker les sérums à-80 ° C.
  9. Remplaçant le œil pour saignement à différents moments afin que chacun des deux yeux sont saigné au plus deux fois pour l’expérience entière. Au terminal de saignement, recueillir à 1 mL de sang de chaque souris avant l’euthanasie. Euthanasier la souris avec 5 % de CO2 suivi par dislocation cervicale.
    Remarque : Les cellules spléniques de B peuvent être récoltées pour analyses de cytométrie en flux et études de la culture in vitro . Nous préparons également l’ADN génomique de splénocytes pour vérifier le génotype de chaque souris.

5. souris Ig Isotype-spécifiques ELISA

  1. Préparer les mémoires tampons et solutions avant d’ELISA.
    1. Préparer 500 mL de tampon de couplage (PBS, pH 7,4).
    2. Préparer 500 mL de Solution de lavage (PBS-T (0,05 % Tween 20), pH 7,4).
    3. Préparer 100 mL de tampon de blocage (1 % BSA dans du PBS, pH 7,4, stocké à 4 ° C).
    4. Préparer 1 L de tampon de substrat (diéthanolamine 1 M, pH 9,8 (97 mL de diéthanolamine dans 1 L de H2O, pH ajusté à l’aide de 10 M HCl) et 0,5 mM MgCl2). Protéger la mémoire tampon de substrat de la lumière en enveloppant la bouteille avec du papier aluminium. Conserver à 4 ° C.
    5. Préparer 100 mL de solution d’arrêt (3 M NaOH).
  2. Enduire les plaques ELISA :
    1. Pour l’isotype d’Ig sériques totales ELISA, enduire plaques immuno 96 puits 10 µg/ml d’isotype-spécifiques, capture de chèvre polyclonaux anti-souris Ig (M, G2a, G2b, G1, G3, A ou E) Abs au tampon de couplage (PBS) à 100 µL/puits.
    2. Pour l’isotype Ig spécifiques PNT ELISA, enduire plaques d’immuno 96 puits 10 µg/ml de TNP(38)-BSA dans du PBS à 100 µL/puits.
    3. Pour l’isotype Ig PNT spécifiques de haute affinité ELISA, enduire plaques d’immuno 96 puits avec 10 µg/mL de PNT(3)-BSA dans du PBS à 100 µL/puits26. Incuber les plaques à 4 ° C jusqu’au lendemain.
  3. Après incubation de revêtement, laver les plaques 2 fois avec 200 µL/puits de PBS-T. Jeter le tampon de lavage et la tache sécher les plaques (tapez chaque plaque à l’envers sur une pile de serviettes en papier) après chaque lavage.
  4. Bloquer les plaques : ajouter 200 µL/puits de blocage du Buffer (1 % de BSA dans du PBS) dans les plaques revêtues et incuber les boîtes pendant 1 h à température ambiante.
  5. Alors que les plaques sont bloquent, préparer des dilutions de normes isotype Ig et des échantillons de sérum dans un tampon bloquant dans une plaque à 96 puits distincte et non traitée à 150 µL/puits.
    1. Préparer des 250 ng/mL Ig isotype normes comme la concentration initiale standard (St01) et faire 7 à 10 de 1:2 dilutions successives des normes Ig (St02 St07 ou St10, Figure 2A).
    2. Préparer le sérum de souris échantillons à une dilution au 1/100 ou 1/500 facteur comme la dilution de départ et faire 3 ou 4 du 01:10 dilutions en série pour total isotype Ig ou des dilutions 1:5 pour l’isotype Ig PNT spécifiques de chaque échantillon de sérum (Figure 2A). Pour ELISA IgE, préparer des échantillons de sérum de souris à un facteur de dilution de 1:2 que la dilution de départ et faire 3 de dilutions en série 1:5 de chaque échantillon de sérum.
  6. Après le blocage, laver les plaques de l’étape 5.4 trois fois avec 200 µL/puits de PBS-T et la tache sécher les plaques après chaque lavage.
  7. Transférer 100 µL/puits de dilué normes d’isotype Ig (appropriées pour la capture et la détection Abs) et des échantillons de sérum dilué de l’étape 5.5 aux plaques préparées à l’étape 5,6. Incuber les plaques avec les normes et les échantillons à 4 ° C jusqu’au lendemain.
  8. Laver les plaques 3 fois avec 200 µL/puits de PBS-T et la tache sécher les plaques après chaque lavage.
  9. Dans chaque assiette, ajouter 100 µL/puits de 10 µg/mL d’une phosphatase alcaline appropriée (AP)-conjugués isotype-spécifiques au chèvre anti-souris Ig (M, G2a, G2b, G1, G3, A ou E) Abs dilué dans un tampon bloquant.
  10. Incuber les boîtes avec AP-conjugué Abs pendant 1-2 h à température ambiante. Pour la détection de l’IgE, incuber les boîtes pendant 1 à 2 h à 37 ° C.
  11. Préparer 1 mg/mL de Solution de substrat en dissolvant deux comprimés de substrat de phosphatase de 5 mg dans 10 mL de tampon de substrat.
  12. Lavez chaque plaque 5 fois avec 200 µL/puits de PBS-T et la tache sécher les plaques après chaque lavage.
  13. Ajouter 100 µL/puits de la Solution de substrat dans chaque boîte. Permettre la réaction se développer au RT, qui prend généralement que quelques minutes.
  14. Lire chaque plaque à 405 nm en utilisant un lecteur de microplaques avec son logiciel associé.
    1. Cliquez sur «paramètres» pour régler la longueur d’onde «Lm1» à "405 nm» et cliquez sur «OK».
    2. Cliquez sur le «modèle» pour affecter les puits «vide», de puits de «normes» et de «inconnu» puits selon le paramétrage de la plaque à 96 puits.
    3. Pour les puits de «normes», cliquez sur «série» pour définir le «Premier échantillon« sous »St01», sélectionnez «Démarrer de» au «Top» et «réplique» «2». Vérifiez «Échantillon Descriptor » et saisissez «Valeur Standard» : sélectionnez «unités« sous »ng/mL», «valeur de départ» que «250», définir «étape de» «2». Cliquez sur «OK».
    4. Cliquez sur « Lire » pour lire la plaque quand la plupart concentrées standard atteint une densité optique (do) de ~ 1.
    5. Cliquez sur le menu «fichier» et cliquez sur «Enregistrer» pour enregistrer le fichier.
    6. Cliquez sur «lire» pour relire la plaque quand la norme plus concentrée approche OD405 de ~ 1,5, 2 et 2.5, respectivement.
  15. Arrêter la réaction en ajoutant 25 µL/puits de 3 M NaOH. Toutes les étapes 5.12 à 5.15 pour une plaque à la fois.
  16. Analyser les données d’ELISA en utilisant le logiciel associé au lecteur de microplaque :
    1. Vérifiez les valeurs de OD405 des normes de fichiers lus isotype Ig et sélectionnez une lecture appropriée avec bonne gamme linéaire des normes pour l’analyse des données détaillées.
    2. Sélectionnez le programme de montage de 4 paramètres pour tracer des courbes d’étalonnage. Vérifier le coefficient de la courbe d’étalonnage (R2), qui doit être > 0,98 pour assurer la bonne qualité.
    3. Vérifiez si les valeurs OD405 de chaque échantillon diminuent avec l’augmentation des facteurs de dilution. Récupérer la concentration de tous les puits de l’échantillon dilué en cliquant sur « Inconnues ».
    4. Sélectionnez un puits correspondant de chaque échantillon avec OD405 dans la gamme linéaire de la courbe d’étalonnage isotype Ig pour le calcul de la concentration.
    5. Calculer la concentration isotype Ig de chaque échantillon à l’aide de la formule du sérum : sérum concentration Ig = concentration du bien sélectionnée x facteur de dilution.
  17. Tracer les graphes et effectuer des analyses statistiques à l’aide d’un logiciel approprié9,10,11. Faire des diagrammes de dispersion verticale de sérum niveaux isotype Ig pour comparer les réponses de Ig à l’instant même. Pour les études de réponse mémoire TD, faire les courbes de réponse de temps pour examiner les réponses d’isotype Ig avant et après la vaccination de rappel. Barres d’erreur permet d’afficher l’écart-type (SD) de chaque groupe d’échantillons. Pour comparer les réponses isotype Ig entre deux génotypes de souris, utiliser le test de non-appariés t pour données bilatéral afin de déterminer la signification statistique. Définissez la valeur de p < 0,05 sensiblement différents.

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Representative Results

Nous avons utilisé ce protocole pour enquêter sur le rôle d’un régulateur essentiel du système immunitaire, TRAF3, TI et TD Ig isotype réponses9,10,11. TRAF3 directement ou indirectement réglemente la transduction des signaux d’un certain nombre de récepteurs immunitaires innées et adaptatives, y compris de la superfamille des récepteurs TNF, récepteurs Toll-like et T cell receptor/CD28, entre autres27,28. Nous émettons l’hypothèse que TRAF3 joue des rôles distincts en sous-ensembles de différentes cellules immunitaires pour réguler la production d’anticorps. Pour tester cette hypothèse, nous avons déterminé les réponses isotype TI et TD Ig en utilisant des souris knockout TRAF3 conditionnelles qui possèdent ce gène Traf3 supprimé spécifiquement dans les cellules B, les lymphocytes T ou des cellules myéloïdes, respectivement9,10, 11. Représentant vaccination et sérum collection tableau des études TI et TD Ig est représentés dans la Figure 1. Résultats représentant IgG1 et IgG2b ELISA sont présentés dans la Figure 2 et Figure 3 pour illustrer le fonctionne de ELISA. Il s’agit de la configuration de la plaque d’échantillons (Figure 2A), une image de la plaque après addition du substrat AP (Figure 2B), les résultats de lecture de OD405 et étalons dilués (Figure 2C, 2D), les valeurs des dilutions standards (Figure 2E, 2F), les courbes standards (Figure 3A, 3 b), les valeurs des échantillons dilués (Figure 3C, 3D) et le calcul du sérum IgG1 et IgG2b concentrations dans les échantillons (Figure 3E, 3F). La figure 4 montre des résultats représentatifs des isotypes d’Ig totales dans les sérums de souris naïves. Nous avons démontré statistiquement une augmentation basale sériques de IgG2a, IgG2b, IgG3, IgM et IgA spécifiques des cellules de B TRAF3- / - souris (B-TRAF3- / -) par rapport aux souris témoins du sexe - et appariés selon l’âge TRAF3-suffisante même portée (LMC). Cette Hyperglobulinémie de B-TRAF3- / - souris est causée par le compartiment élargi des lymphocytes B dans les organes lymphoïdes périphériques en raison d’une survie prolongée des matures TRAF3- / - B cellules9. Figure 5 montre les résultats représentatifs de TI et TD Ig isotype réponses des souris à la vaccination avec le TNP-polysaccharide et PNT-KLH, respectivement. Ces résultats ont révélé un TI significativement plus élevée, PNT spécifiques IgG3 niveau et aussi élevé TD, IgG2b PNT propres niveaux dans myéloïde spécifiques des cellules TRAF3- / - (M-TRAF3- / -) souris que chez LMC. Tel a augmenté IgG3 TI et TD IgG2b réponses observées chez les souris- / - M-TRAF3 sont probables dus à l’augmentation de la production des cytokines pro-inflammatoires IL-6 et IL-12 par les TRAF3- / - macrophages et DCs après vaccination11. La figure 6 montre les résultats représentatifs du TD primaire et réponses de la mémoire de souris à l’immunisation de PNT-KLH. Ces résultats ont démontré partiellement une diminution TD IgM réponse primaire et primaire défectueux IgG1 et réponses de la mémoire chez les souris- / - (T-TRAF3- / -) de lymphocytes T spécifiques TRAF3. Le TD défectueux primaire et réponses mémoire du résultat sur le T-TRAF3- / - la souris de l’activation altérée de TRAF3 des cellules T CD4- / - sur le récepteur des cellules T et CD28 engagement co10. Pris ensemble, le protocole décrit dans cet article nous a permis de délimiter les rôles spécifiques de TRAF3 en sous-ensembles de différentes cellules immunitaires dans la régulation de TI et TD Ig isotype réponses chez les souris.

Figure 1
Figure 1 : Typique TI et TD Ag vaccination et sérum horaires collection. (A) PNT-polysaccharide expérimente. (B) PNT-KLH expériences. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 2
Figure 2 : Représentant IgG1 et IgG2b ELISA. (A) le programme d’installation de la plaque à 96 puits inclut les puits du blank, 7 dilutions successives (1:2) de souris IgG1 et IgG2b normes (St01 à St07), et 4 dilutions en série (à 01:10) du sérum 8 souris échantillons (S1 à S8). La concentration des normes est donnée au bas de chaque norme bien. Le facteur de dilution des échantillons est donné au bas de chaque échantillon bien. (B) une image de la plaque à 5 min après l’addition du substrat AP. La plaque de lire les résultats des IgG1 (C) et IgG2b (D) à 405 nm. Les valeurs des concentrations des dilutions différentes de souris IgG1 (E) et de la souris IgG2b et OD405 (F) des normes. Conc, concentration ; BackCalcConc, retour calculée concentration ; OD, densité optique ; AvgOD, do moyenne des répliques ; SD, écart-type ; CV, coefficient de variation. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 3
Figure 3 : Analyse des données représentant IgG1 et ELISA IgG2b. Les courbes standards des IgG1 (A) et IgG2b (B). Le coefficient R2 est > 0,98 dans les deux courbes standard. Les flèches indiquent la gamme de linéarité des courbes standards. Les valeurs des concentrations des IgG1 et OD405 (C) et IgG2b (D) à inconnues (échantillons de sérum dilué). R, gamme ; Conc, concentration. Calcul des concentrations de sérum de souris des IgG1 (E) et IgG2b de souris (F) pour les 8 échantillons. ND, non détectable par ce ELISA. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 4
Figure 4 : Résultats représentatifs des isotypes d’Ig totales dans les sérums de souris naïves. Sérums provenaient de même sexe, âgés de 10 à 12 semaines LMC et B-TRAF3- / - souris naïves (n = 10 pour chaque génotype ; fond génétique : 129xC57BL/6). Sériques basale des IgM totales, IgG1, IgG2a, IgG2b, IgG3, IgA et IgE ont été déterminées par ELISA. Signification statistique a été déterminée avec le test de non-appariés t pour données à deux queues. *, significativement différent entre les LMC et B-TRAF3- / - souris (p < 0,05) ; **, très significativement différente entre les LMC et B-TRAF3- / - souris (p < 0,01). Ce chiffre a été modifié par Xie et al. 9. s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 5
Figure 5 : Résultats représentatifs des TI et TD Ig isotype réponses au TNP-polysaccharide et PNT-KLH vaccination, respectivement. Assortie des sexes, âgés de 8 à 12 semaines Cat et M-TRAF3- / - souris (bagage génétique : C57BL/6) ont été immunisés avec 50 µg de l’Ag TI PNT-polysaccharide (panneau supérieur, n = 9 pour chaque génotype) ou 100 µg de la TD Ag PNT-KLH mélangé à l’alun (panneau inférieur, n = 12 dans chaque génotype). Sérum ont été prélevés sur le 7e jour après la vaccination. Les titres sériques d’IgM anti-PNT, IgG1, IgG2b, IgG3, IgA et IgE ont été analysés par ELISA. Signification statistique a été analysée avec le test de non-appariés t pour données à deux queues. *, significativement différent entre Cat et M-TRAF3- / - souris (p < 0,05). Ce chiffre a été modifié par Lafaye et al. 11. s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 6
Figure 6 : Résultats représentatifs des réponses du TD primaire et de la mémoire de la Ig à l’immunisation de PNT-KLH. Assortie des sexes, âgés de 8 à 10 semaines LMC et T-TRAF3- / - souris (n = 10 pour chaque génotype ; fond génétique : 129xC57BL/6) ont été immunisés avec 100 µg de la TD Ag PNT-KLH, mélangé avec l’alun sur jour 0. Chaque souris a également reçu une vaccination de rappel avec la même Ag et adjuvant sur 21 jours après la première vaccination. Échantillons de sérum ont été prélevés des souris jour -7, 7, 14 et 28, respectivement. PNT spécifiques IgM et IgG1 niveaux dans le sérum ont été mesurés par ELISA. Graphiques illustrent les résultats de 10 paires de LMC et T-TRAF3- / - souris (moyenne ± écart-type). Signification statistique a été analysée avec le test de non-appariés t pour données à deux queues. *, significativement différent entre les CAT et les T-TRAF3- / - souris (p < 0,05) ; **, très significativement différente entre les CAT et les T-TRAF3- / - souris (p < 0,01) ; , très significativement différente entre LMC et T-TRAF3- / - souris (p < 0,001). Ce chiffre a été modifié par Xie et al. 10. s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

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Discussion

Nous décrivons ici le protocole pour la caractérisation des réponses d’isotype TD et TI Ig chez la souris à l’aide d’ELISA. Mise en œuvre réussie de ce protocole nécessite l’emploi de matériaux spécifiés dans le tableau 1, y compris les plaques de dosage ELISA, vaccination Ags, anticorps de souris Ig isotype-spécifiques et standards. Il faut éviter d’utiliser des plaques de culture de tissus traitée pour ELISA. Les dilutions des normes et des échantillons de sérum devraient être faites en plaques non traités distincts (fond rond) et ensuite ajoutées dans les plaques ELISA. Utilisant ce protocole, nous avons toujours obtenu des résultats fiables avec sensibilité et une spécificité élevée.

Étapes critiques au sein de ce protocole comprennent Ag vaccination, hémorragie rétro-orbitaire et Ig isotype-spécifiques ELISA. Pour la vaccination de TD Ag, mix de PNT-KLH/alun devrait être charrié soigneusement pour assurer ce exact quantité d’Ag/adjuvant est injectée. Si le sang des caillots dans la pipette ou un tube capillaire au cours de l’hémorragie rétro-orbitaire, changez immédiatement dans un nouveau tube pipette ou capillaire. Tampons et des réactifs utilisés dans ELISA devraient être des solutions claires et ne doivent pas contenir des précipités, qui peuvent donner des résultats faussement positifs avec des valeurs anormales de405 OD. En outre, les bulles devraient être évitées dans les puits à toutes les étapes d’ELISA, qui peuvent aussi donner des résultats faussement positifs ou fausses négatifs avec des valeurs anormales de405 OD. Ces erreurs occasionnelles peuvent être réduits en analysant des échantillons en double. Les étapes de lavage en ELISA supprimer les réactifs non liés et les anticorps provenant des puits. Lavage insuffisant provoque des bruits ambiants sont faibles, mais le lavage excessif peut conduire à une diminution de sensibilité en enlevant les antigènes enduits ou lié à des anticorps29. Le nombre de fois de lavage décrites dans le présent protocole ELISA est optimisé basé sur notre expérience.

Il est à noter que l’ELISA a des limites de détection, qui sont habituellement définis par la gamme de linéarité des courbes standards. Afin de correctement quantifier la concentration sérique de chaque isotype Ig, les échantillons doivent être convenablement diluée pour s’adapter au sein de la gamme de linéarité des courbes standards. Nous vous recommandons de tester des dilutions successives des échantillons pour sélectionner les facteurs de dilution appropriée pour le calcul de la concentration des Ig tel que décrit dans le présent protocole. Cependant, si les résultats montrent que les facteurs de dilution testés ne donnent pas de résultats dans la gamme linéaire de la courbe d’étalonnage, supplémentaires ELISA doivent être effectuées à l’aide de facteurs de dilution ajustées selon les premiers résultats de l’ELISA. Si toutes les dilutions testées sont inférieures à la limite inférieure de détection, des échantillons de sérum originaux et petits facteurs de dilution doivent servir. Si les valeurs de405 OD ne montrent pas de diminution proportionnelle avec augmente le facteur de dilution pour les dilutions en série tous testé, cela indique que la capture Ab ou revêtement Ag est saturé de tous les échantillons dilués et autres facteurs de dilution plus élevés doivent être utilisées. Suite à ce protocole, des résultats concluants seront obtenues avec au maximum 2 tours d’ELISA.

Les facteurs qui sont connues pour influencer la production d’anticorps chez la souris sont la souche (bagage génétique), sexe, âge, alimentation et animalerie environnement30,31,32,33,34 . Par exemple, bien que plusieurs souches de souris produisent IgG2a, certaines souches comme les souris C57BL/6 ne produisent pas d’IgG2a mais produisent IgG2c au lieu de35,36. Des preuves récentes identifie également le microbiote commensal comme un facteur influant sur les réponses d’anticorps37,38,39,40. Compte tenu de ces facteurs, nous recommandons l’utilisation de la correspondance entre les sexes, les jeunes frères adultes de génotypes différents qui partagent les mêmes parents et cages pour des expériences de vaccination DT et TI Ag. En outre, souris à variation est fréquemment observée chez les souris du même génotype (Figure 4–6), nombre suffisant de répliquer (en général, n > 8) de souris sont nécessaires pour chaque génotype ou le groupe pour obtenir statistiquement résultats significatifs.

L’Ig isotype-spécifiques ELISA est utile pour déterminer les titres des différents isotypes Ig. Toutefois, cette méthode seule ne suffit pas à révéler les causes sous-jacentes des différences observées dans les titres d’isotype Ig et par conséquent est souvent utilisée en combinaison avec une variété d’approches complémentaires. Pour différencier si la différence de titres d’isotype Ig est causée par différents nombres de cellules productrices de Ig B ou l’efficacité différente des cellules B chez production Ig, flow cytometry41,42,43 et Enzyme-Linked ImmunoSpot (ELISPOT)43,44,45 peut être utilisé. Pour analyser la formation centre germinatif, la prolifération et la survie des cellules B, des méthodes alternatives incluent la cytométrie en flux, la culture in vitro de cellules de B spléniques et immunohistochemical souillant suivi par microscopie9,26 ,41,46,47. Afin d’élucider les changements dans l’isotype Ig commutation de cellules B, culture in vitro de cellules de B spléniques et quantitative RT-PCR des transcrits de lignée germinale d’Ig segments de gènes de chaîne lourde sont communément utilisé41,43 ,48,49. Pour enquêter sur la cause des différences dans la maturation de l’affinité, le hypermutation somatique (SHM) du gène de chaîne lourde Ig est déterminé par séquençage du VDJ région50,51,52. Pour comprendre les différences dans les réponses de lymphocytes B mémoire, la fréquence et le nombre de sous-ensembles de lymphocytes B mémoire différent après que vaccination Ag peut être analysée par écoulement cytometry utilisant récemment identifié des marqueurs de cellules B mémoire de souris, y compris CD38, CD80, CD73, PD-L2, CD62L et CCR68,53,,du5455. Ensemble, ces méthodes complémentaires utilisés en combinaison avec le protocole actuel permettra aux chercheurs d’obtenir une compréhension globale de la production d’anticorps dans un cadre expérimental donné.

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Disclosures

Les auteurs n’ont aucun intérêt financier concurrentes.

Acknowledgments

Cette étude a été financée par les instituts nationaux de santé subventions R01 CA158402 (P. xxx) et R21 AI128264 (P. Xie), le Department of Defense accorder W81XWH-13-1-0242 (P. xxx), une bourse de pilote depuis le Cancer Institute du New Jersey par Grant nombre P30CA072720 de l’Institut National du Cancer (P. xxx), une subvention de recherche biomédicale de Busch (P. xxx), une bourse Stollar Victor (a. Lalani) et une Anne B. et bourse de James B. Leathem (S. Zhu).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
VersaMax Tunable Microplate Reader MDS Analytical Technologies VERSAMAX Equipment to read the plates
SOFTmax PRO 5.3 MDS Analytical Technologies SOFTmax PRO 5.3 Software for the plate reader
GraphPad Prism GraphPad Prism Software for graphing and statistics
TNP-AECM-polysaccharide (FICOLL) Biosearch Technologies F-1300-10 A TI Ag for immunization
TNP-KLH Biosearch Technologies T-5060-5 A TD Ag for immunization
TNP(38)-BSA Biosearch Technologies T-5050-10 (conjugation ratio: 38) Coating Ag for TNP-specific ELISA
TNP(3)-BSA Biosearch Technologies T-5050-10 (conjugation ratio: 3) Coating Ag for high affinity TNP-specific Ig
Imject Alum Fisher Scientific  PI-77161 Alum adjuvant for immunization
Falcon Polypropylene tubes Fisher Scientific  14-959-11A For incubation of TNP-KLH/alum
BD Insulin Syringe Fisher Scientific  14-829-1B For i.p. injection of mice
Immuno 96-Well Plates, Flat-Bottom Fisher Scientific  14-245-61 For ELISA
Untreated 96-Well Microplates, Round-Bottom VWR 82050-622 For serial dilutions of standards and samples
Phosphatase substrate, 5 mg Tablets Sigma S0942-200TAB AP substrate
Diethanolamine VWR IC15251690 A component of AP substrate buffer
Goat anti-mouse IgM SouthernBiotech 1020-01 Capture Ab for mouse IgM
Goat anti-mouse IgG1 SouthernBiotech 1070-01 Capture Ab for mouse IgG1
Goat anti-mouse IgG2a SouthernBiotech 1080-01 Capture Ab for mouse IgG2a
Goat anti-mouse IgG2b SouthernBiotech 1090-01 Capture Ab for mouse IgG2b
Goat anti-mouse IgG3 SouthernBiotech 1100-01 Capture Ab for mouse IgG3
Goat anti-mouse IgA SouthernBiotech 1040-01 Capture Ab for mouse IgA
Goat anti-mouse IgE SouthernBiotech 1110-01 Capture Ab for mouse IgE
AP-Goat anti-mouse IgM SouthernBiotech 1020-04 Detection Ab for mouse IgM
AP-Goat anti-mouse IgG1 SouthernBiotech 1070-04 Detection Ab for mouse IgG1
AP-Goat anti-mouse IgG2a SouthernBiotech 1080-04 Detection Ab for mouse IgG2a
AP-Goat anti-mouse IgG2b SouthernBiotech 1090-04 Detection Ab for mouse IgG2b
AP-Goat anti-mouse IgG3 SouthernBiotech 1100-04 Detection Ab for mouse IgG3
AP-Goat anti-mouse IgA SouthernBiotech 1040-04 Detection Ab for mouse IgA
AP-Goat anti-mouse IgE SouthernBiotech 1110-04 Detection Ab for mouse IgE
Mouse IgM standard BD Biosciences 553472 TNP-specific IgM, Clone  G155-228
Mouse IgG1 standard BD Biosciences 554054 TNP-specific IgG1, Clone  107.3
Mouse IgG2a standard BD Biosciences 556651 TNP-specific IgG2a, Clone  G155-178
Mouse IgG2b standard BD Biosciences 554055 TNP-specific IgG2b, Clone  49.2
Mouse IgG3 standard BD Biosciences 553486 KLH-specific IgG3, Clone  A112-3
Mouse IgA standard BD Biosciences 550924 Mineral oil-induced IgA, Clone  MOPC-320
Mouse IgE standard BD Biosciences 557079 TNP-specific IgE, Clone  C38-2

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Immunologie et Infection numéro 139 antigène dépendant du Thymus (TD) l’antigène (TI) indépendant du thymus immunoglobuline (Ig) isotype Ig réponse de la mémoire vaccination adjuvant immuno enzymatique (ELISA)
Caractérisation des Thymus-dépendants et indépendants de Thymus immunoglobuline Isotype réponses chez la souris à l’aide d’Enzyme-linked Immunosorbent Assay
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Lalani, A. I., Zhu, S., Xie, P. Characterization of Thymus-dependent and Thymus-independent Immunoglobulin Isotype Responses in Mice Using Enzyme-linked Immunosorbent Assay. J. Vis. Exp. (139), e57843, doi:10.3791/57843 (2018).

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