Summary
In questo articolo, descriviamo un protocollo per caratterizzare le risposte di isotipo dell'immunoglobulina (Ig) T-dipendenti e T-indipendente in topi usando ELISA. Questo metodo usato da solo o in combinazione con flusso cytometry permetterà ai ricercatori di identificare le differenze nelle risposte di isotipo Ig B cellulo-mediata nei topi dopo immunizzazione antigene T-dipendente e T-indipendente.
Abstract
Anticorpi, anche definiti come differenziano immunoglobuline (Ig), secernute dai linfociti B, cellule di plasmablasts/plasma, nell'immunità umorale forniscono una formidabile difesa contro l'invasione patogeni tramite diversi meccanismi. Uno degli obiettivi principali della vaccinazione è di indurre anticorpi protettivi di antigene-specifiche per prevenire le infezioni pericolose per la vita. Timo-dipendenti (TD) e gli antigeni timo-indipendenti (TI) possono suscitare risposte antigene-specifiche IgM di robuste e possono anche indurre la produzione di anticorpi isotipo-switched (IgG, IgA e IgE) così come la generazione di cellule B di memoria con l'aiuto fornito dalla (APCs) di cellule presentanti l'antigene. Qui, descriviamo un protocollo per caratterizzare le risposte di isotipo TD e TI Ig nei topi utilizzando analisi enzima-collegata dell'immunosorbente (ELISA). In questo protocollo, TD e TI Ig risposte sono tratte in topi tramite intraperitoneale (i.p.) immunizzazione con antigeni coniugato aptene modello TNP-KLH (in allume) e TNP-polisaccaride (in PBS), rispettivamente. Per indurre la risposta di memoria TD, un'immunizzazione di booster di TNP-KLH in allume è dato a 3 settimane dopo la prima immunizzazione con l'antigene stesso/adiuvante. Sieri di mouse vengono raccolte in diversi momenti prima e dopo l'immunizzazione. I livelli del siero Ig totali e anticorpi specifici per TNP successivamente sono quantificati tramite Ig specifici Sandwich ed ELISA indiretto, rispettivamente. Per quantificare correttamente la concentrazione nel siero di ogni isotipo Ig, i campioni devono essere opportunamente diluito per adattarsi all'interno della gamma lineare delle curve standard. Usando questo protocollo, abbiamo ottenuto sempre risultati affidabili con sensibilità e alta specificità. Quando usato in combinazione con altri metodi complementari quali la citometria a flusso, cultura in vitro di cellule di B spleniche e immunohistochemical che macchiano (IHC), questo protocollo permetterà ai ricercatori di acquisire una comprensione globale dell'anticorpo risposte in una determinata impostazione sperimentale.
Introduction
I linfociti B sono il principale attore in immunità umorale e l'unico tipo di cellula in mammiferi che sono in grado di produrre anticorpi, anche definiti come le immunoglobuline (Ig)1,2. Gli anticorpi secernuti dalle cellule di B forniscono una difesa formidabile contro l'invasione patogeni tramite diversi meccanismi di neutralizzazione, opsonizzazione e l'attivazione del complemento, che conduce a un'immunità protettiva3. Secrezione di anticorpi dalle cellule di B si raggiunge solo dopo la completa attivazione di cellule B specifiche, che normalmente richiede che due distinti segnali3. Segnale 1 viene inoltrato da binding diretto dell'antigene (Ag) per il recettore delle cellule B (BCR) espresso sulla superficie delle cellule di B ingenui specifiche3. A seconda della fonte di segnale 2, attivazione delle cellule B può essere suddivisa in timo-dipendenti (TD) o timo-indipendenti (TI)3,4. In risposta all'antigene un TD, segnale 2 è fornito da attivato cognate CD4 linfociti T helper (TH), che esprimono CD154, il ligando per il recettore co-stimolatore CD40 espresso sulle cellule di B1,2,3. In risposta all'antigene una TI, 2 segnale proviene da entrambi fidanzamento dei Toll-like receptors (TLRs nel caso tipo 1 TI Ag) o cross-linking vasto del BCRs (nel caso di tipo 2 TI Ag) sulla B cellule3,4. Gli antigeni di TI (TI-1) di tipo 1 sono microbiche ligandi dei TLR, inclusi lipopolisaccaridi batterici (LPS), RNA virale e microbica CpG DNA4,5. Gli antigeni di TI (TI-2) di tipo 2 hanno struttura altamente ripetitiva e sono in grado di fornire prolungata e persistente segnalazione alla cella B da più cross-linking del BCRs4,6. Tipici esempi di antigeni TI-2 pneumococcici polisaccaridi e polisaccaride coniugato aptene6,7. Gli antigeni sia TD e TI possono suscitare risposte antigene-specifiche IgM di robuste e possono anche indurre la produzione di anticorpi isotipo-switched (IgG, IgA e IgE) con l'aiuto fornito dall'antigene che presenta le cellule (APCs) quali le cellule dendritiche (DCs)1 ,2,3. Inoltre, gli antigeni sia TD e TI sono in grado di indurre risposte di memoria con l'aiuto di APC, ma gli antigeni TD sono più efficienti a indurre la memoria delle cellule di B generazione3,8.
In questo protocollo, TD e TI Ig risposte sono tratte in topi tramite immunizzazione intraperitoneale (i.p.) con emocianina di modello aptene coniugato antigeni 2, 4,6-trinitrophenyl-keyhole limpet (TNP-KLH) e TNP-polisaccaride (neutro, molto ramificato e a massa elevata), rispettivamente9,10,11. Gli antigeni TD sono usati solitamente con un adiuvante per migliorare la produzione di anticorpi12. Qui nel nostro protocollo, TNP-KLH viene iniettato con allume, un adiuvante comunemente utilizzato in studi di immunizzazione12. Altri esempi di coadiuvanti che possono essere utilizzati completa o incompleta l'adiuvante di Freund (CFA o IFA), monofosforil-lipidico A / trehalose dicorynomycolate ("Ribi" adiuvante) e CpG oligodeoxynucleotides, ecc.13, 14. dopo immunizzazione, sieri del mouse sono stati raccolti in diversi momenti e gli anticorpi di TNP-specifici nel siero sono quantificati tramite Ig specifici enzima-collegata dell'immunosorbente (ELISA) dosaggio9,10, 11.
ELISA è un saggio basato su piastra che è ampiamente usato come uno strumento di diagnostica in medicina e anche come strumento analitico in ricerca biomedica15,16. Esso viene utilizzato per rilevare e quantificare analiti compresi gli anticorpi, ormoni, citochine, chemochine e vari antigeni, ecc. ELISA può essere eseguita in diversi formati, tra cui diretto, indiretto, panino e competitivo ELISA15,16. In generale, coinvolge l'immobilizzazione dell'antigene ad una superficie solida, solitamente una piastra microtiter a 96 pozzetti, che viene incubata con un anticorpo primario. Dopo l'incubazione, l'anticorpo non legato è lavato via. In una ELISA diretta, l'anticorpo primario è direttamente coniugato ad un enzima (tipicamente perossidasi o fosfatasi alcalina), che può fendere un substrato cromogenico per produrre un cambiamento di colore visibile rilevato da uno strumento di rilevamento del segnale come un spettrofotometro15,16. Al contrario, se un anticorpo secondario enzima-collegata è usato per legare l'anticorpo primario, quindi questo è considerato come un'indiretta ELISA15,16. ELISA diretta è più velocemente mentre ELISA indiretto è più sensibile15,16. In un panino ELISA, le piastre sono rivestite con un anticorpo di "cattura" utilizzato per immobilizzare l'antigene di interesse nei campioni, e quindi l'antigene catturato può essere rilevato da un altro anticorpo di "rilevazione" in un modo diretto o indiretto15, 16. Sandwich ELISA offre alta specificità poiché l'antigene viene rilevato da due differenti anticorpi dell'antigene. In una ELISA competitivo, è istituita la competizione tra l'antigene del campione e l'antigene associato a piastra per il legame dell'anticorpo primario, e quindi alla concentrazione di antigene nel campione è quantificata misurando la riduzione del segnale dal substrato 15 , 16. ELISA competitivo può essere eseguita utilizzando il formato di diretto o indiretto di cui sopra ed è utile per la rilevazione degli antigeni piccoli con un solo epitopo15,16.
Tecniche alternative per la misurazione degli anticorpi comprendono radioimmunoanalisi (RIA), dosaggio elettrochemiluminescenza (ECL) analisi e superficie di risonanza plasmonica (SPR)17. RIA è stato il primo immunoassay sviluppato misure che la presenza di un antigene (o l'anticorpo) con elevata specificità e sensibilità usando reagenti radiomarcato18,19. Tuttavia, a causa delle preoccupazioni di tossicità radioattiva, i costi di smaltimento, shelf-life e licenze speciali per lavorare con materiali radioattivi, ELISA è una migliore e più conveniente tecnica comune utilizza20,21. ECL è un test altamente sensibile in cui reazioni chemiluminescenti sono avviate usando l'elettricità per generare specie altamente reattive da precursori stabili sulla superficie di un elettrodo e possono essere utilizzate per misurare la quantità di analiti (come antigeni o gli anticorpi)22. Tuttavia, ECL richiede uno strumento speciale e così non è usato nel senso più ampio come ELISA23. SPR è un dosaggio diretto che può essere utilizzato per misurare il grippaggio dei ligands (ad es., anticorpi) per immobilizzato molecole (ad es., antigeni) su un sensore chip superficie24. SPR rileva le interazioni in tempo reale in modo molto specifico e non richiede l'uso di reagenti etichettati come ELISA. Tuttavia, SPR inoltre richiede un'attrezzatura speciale e ha una sensibilità inferiore rispetto ELISA17. Date le limitazioni dei metodi alternativi, ELISA è la tecnica più adatta e conveniente per il nostro scopo in questo protocollo. Qui, descriviamo l'uso di sandwich ELISA per l'analisi dei livelli di isotipo Ig totali e le procedure di ELISA indiretto per l'analisi dell'antigene-specifiche Ig isotipi.
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Protocol
Questo protocollo segue le linee guida del comitato etico di ricerca animale istituzionale dell'Università di Rutgers. Tutti i topi sono utilizzati conformemente alle linee guida NIH e sotto un animale protocollo approvato dal comitato di uso e cura degli animali istituzionale.
1. preparazione di topi e raccolta di sieri ingenuo Mouse
- Tenere tutti i topi per esperimenti di immunizzazione in uno specifico impianto privo di agente patogeno animale.
- Uso genere-abbinato, giovane adulto (8 – 12 settimane) knockout e littermate controllare topi che condividono gli stessi genitori e gabbie per gli studi di immunizzazione.
- Pianificare l'immunizzazione e gli orari di raccolta del siero come raffigurato nella Figura 1.
- Vendemmia ingenuo siero di ogni mouse a 7 giorni (7 giorni) prima di immunizzazione. Seguire le procedure di preparazione del siero e di spurgo del retro-orbitale come dettagliato di seguito nel passaggio 4.
2. preparazione del TNP-polisaccaride (un antigene TI) e TNP-KLH (un antigene TD)
- Sciogliere le polveri di antigene in PBS sterile (pH 7.4) completamente per essere 0,5 mg/mL di brodo di TNP-polisaccaride e 1 mg/mL delle soluzioni madre TNP-KLH. Aliquotare ogni antigene stock soluzione in provette sterili microfuge 0,5 mL/Tube e mantenere le aliquote a-80 ° C per la conservazione a lungo termine. Evitare più gelo e disgelo delle aliquote dell'antigene.
- Il giorno di iniezione, calcolare il volume di TNP-polisaccaride (50 µ g/100 µ l/mouse) o TNP-KLH (100 µ g/100 µ l/topo) necessari in base al numero di topi per essere iniettato. Scongelare il numero appropriato di TNP-polisaccaride o TNP-KLH aliquote a temperatura ambiente (TA).
- Iniettabile di TNP-KLH, prima di diluire l'adiuvante di allume (40 mg/mL) con 3 volumi di PBS sterile ad una concentrazione finale di 10 mg/mL. Assicurarsi che la miscela di adiuvante di allume è ben sospesa prima diluizione.
- Combinare uguale volume di liquame di adiuvante di allume 10mg/mL da passo 2.3 e la soluzione di TNP-KLH scongelata (1 mg/mL) in una provetta di polipropilene da 5 mL, mescolare bene e incubare a 37 ° C per 30 min. Prepare questo TNP-KLH/allume mescolare appena prima dell'iniezione.
3. immunizzazione dei topi
- Eseguire l'iniezione intraperitoneale (i.p.) di TNP-polisaccaride o TNP-KLH/allume per immunizzare i topi con siringhe da insulina 1 mL in un armadio di sicurezza biologica. Inserire l'ago all'angolo di 30° circa, preferibilmente nel quadrante in basso a destro di ogni mouse per impedire injection in organi interni.
- Iniettare i.p. 100 µ l di TNP-polisaccaride per topo il giorno 0 per immunizzazione TI Ag (Figura 1A).
- Iniettare i.p. 200 µ l della miscela TNP-KLH/allume (preparata nel passaggio 2.4) per topo il giorno 0 per immunizzazione TD Ag. Ripetere l'iniezione stessa il giorno 21 come una vaccinazione di richiamo per gli studi di memoria (Figura 1B).
- Dopo l'iniezione, tornare ogni mouse alla sua gabbia e mantenere tutti i topi iniettati in condizione da organismi patogeni specifici.
4. retro-orbitale sanguinamento e preparazione del siero
- Sieri di mouse in diversi momenti della raccolta: per l'immunizzazione di TNP-polisaccaride, raccogliere sieri del mouse sul giorno -7 e 7 (Figura 1A); per l'immunizzazione di TNP-KLH/allume, raccogliere sieri del mouse sul giorno -7, 7, 14 e 28 (Figura 1B).
- Per Retro-orbitale sanguinamento, anestetizzare ogni mouse con isoflurano 5% per 1 – 2 min in un armadietto di biosicurezza25. Eseguire pedale reflex per garantire un'anestesia adeguata di ogni mouse.
- Tenere premuto il mouse anestetizzato in una mano con l'indice e il pollice tirando la pelle intorno al bulbo oculare indietro in modo che il bulbo oculare sporge fuori la presa25. Inserire una pipetta di Pasteur non eparinizzato o tubo capillare ad un angolo di 45° nell'angolo interno della cavità oculare sotto il bulbo oculare25.
- Applicare una leggera pressione verso il basso e ruotare la pipetta o il tubo dolcemente a rompere nella vena e raccogliere 150 – 200 µ l di sangue nella pipetta o tubo. Immediatamente trasferire il sangue in una provetta di microfuge sterili da 1,5 mL e tornare il mouse alla sua gabbia per recuperare.
- Cosi ' il sangue campioni sedersi al RT per 1 – 2 h coagulare.
- Centrifugare i campioni di sangue coagulato a 13.000 x g per 10 min a 4 ° C. Trasferire il siero chiaro in cima il coagulo di sangue in una provetta di microfuge sterili da 1,5 mL nuovo.
- Ripetere il passaggio 4.6 ancora una volta per rimuovere il coagulo di sangue residuo e raccogliere il siero chiaro.
- Aliquota del siero nei tubi del microfuge sterili da 1,5 mL 50 µ l/Tube e conservare i sieri a-80 ° C.
- Si alternano l'occhio per sanguinamento in momenti diversi in modo che ogni occhio è bled al massimo due volte per l'intero esperimento. Al terminale del sanguinamento, è possibile raccogliere fino a 1 mL di sangue da ogni mouse prima di eutanasia. Eutanasia il mouse con 5% CO2 seguita da dislocazione cervicale.
Nota: Le cellule B splenica possono essere raccolto per analisi cytometric di flusso e gli studi della coltura in vitro . Prepariamo anche DNA genomico da splenocytes per verificare il genotipo di ogni mouse.
5. Mouse Ig specifici ELISA
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Preparare i buffer e soluzioni prima di ELISA.
- Preparare 500 mL di accoppiamento Buffer (PBS, pH 7.4).
- Preparare 500 mL di soluzione di lavaggio (PBS-T (0.05% Tween 20), pH 7.4).
- Preparare 100 mL di tampone di blocco (BSA 1% in PBS, pH 7.4, conservato a 4 ° C).
- Preparare 1 L di tampone substrato (1m dietanolammina, pH 9,8 (97 mL di dietanolammina in 1 L di H2O, pH regolato con 10 M HCl) e 0,5 mM MgCl2). Proteggere il tampone del substrato dalla luce avvolgendo la bottiglia con carta stagnola. Conservare a 4 ° C.
- Preparare 100 mL di soluzione di arresto (3 M NaOH).
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Rivestire le piastre ELISA:
- Per totale del siero Ig isotipo ELISA, cappotto piastre a 96 pozzetti immuno 10 µ g/ml di specifici attiva policlonale di capra anti-mouse Ig (M, G1, G2a, G2b, G3, A o E) Abs in accoppiamento Buffer (PBS) a 100 µ l/pozzetto.
- Per Ig TNP-specifico isotipo ELISA, cappotto piastre a 96 pozzetti immuno 10 µ g/ml di TNP(38)-BSA in PBS a 100 µ l/pozzetto.
- Per alta affinità specifici TNP Ig isotipo ELISA, cappotto piastre a 96 pozzetti immuno 10 µ g/ml di TNP(3)-BSA in PBS a 100 µ l/pozzetto26. Incubare le piastre a 4 ° C durante la notte.
- Dopo l'incubazione di rivestimento, lavare le piastre 2 volte con 200 µ l/pozzetto di PBS-T. Gettare il tampone di lavaggio e macchia asciugare le piastre (tocca ogni piastra capovolta su una pila di asciugamani di carta) dopo ogni lavaggio.
- Bloccare le piastre: aggiungere 200 µ l/pozzetto di Blocking Buffer (1% BSA in PBS) nelle piastre rivestite e incubare le piastre per 1 h a TA.
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Mentre stanno bloccando le piastre, preparare diluizioni dello standard di isotipo Ig e campioni di siero in blocco Buffer in una piastra a 96 pozzetti separato, non trattato a 150 µ l/pozzetto.
- Preparare 250 standard di isotipo Ig ng/mL come la concentrazione iniziale di standard (St01) e fare 7 su 10 di diluizioni seriali 1:2 delle norme Ig (St02 St07 o St10, Figura 2A).
- Preparare il siero del mouse fattore come la diluizione iniziale di campioni a una diluizione 1: 100 o 1: 500 e fare 3 o 4 di 01:10 diluizioni seriali per totale Ig isotipo o diluizioni seriali 1:5 per isotipo Ig TNP-specifiche di ciascun campione di siero (Figura 2A). Per IgE ELISA, preparare i campioni di siero del mouse a un fattore di diluizione di 1:2 come la diluizione iniziale e fare 3 di diluizioni seriali 1:5 di ogni campione di siero.
- Dopo il blocco, lavare i piatti dal passaggio 5.4 tre volte con 200 µ l/pozzetto di PBS-T e macchia asciugare le piastre dopo ogni lavaggio.
- Trasferire 100 µ l/pozzetto di diluito standard di isotipo Ig (appropriato per la cattura e la rilevazione dell'Abs) e campioni di siero diluito dal passaggio 5.5 alle piastre preparate al punto 5.6. Incubare le piastre con gli standard e i campioni a 4 ° C durante la notte.
- Lavare le piastre 3 volte con 200 µ l/pozzetto di PBS-T e macchia asciugare le piastre dopo ogni lavaggio.
- In ogni piatto, aggiungere 100 µ l/pozzetto di 10 µ g/mL di un'appropriato della fosfatasi alcalina (AP)-anti-topo di capra coniugata con specifico isotipo Ig (M, G1, G2a, G2b, G3, A o E) Abs diluito in un tampone di bloccaggio.
- Incubare le piastre con AP-coniugato Abs per 1-2 h a TA. Per il rilevamento di IgE, incubare le piastre per 1 – 2 h a 37 ° C.
- Preparare 1 mg/mL di soluzione di substrato sciogliendo due compresse di substrato di fosfatasi 5 mg in 10 mL di tampone substrato.
- Lavare ogni piastra 5 volte con 200 µ l/pozzetto di PBS-T e macchia asciugare le piastre dopo ogni lavaggio.
- Aggiungere 100 µ l/pozzetto di soluzione di substrato in ogni piatto. Consentire la reazione a svilupparsi a RT, che di solito richiede solo pochi minuti.
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Leggere ogni piastra a 405 nm utilizzando un lettore di micropiastre con il suo software associato.
- Fare clic su "Impostazioni" per impostare le lunghezze d'onda "Lm1" presso "405 nm" e fare clic su "OK".
- Fare clic su "Template" per assegnare il "vuoto" pozzi, pozzi "standard" e "sconosciuto" secondo il programma di installazione di piastra a 96 pozzetti.
- Per pozzi "standard", fare clic su "serie" per impostare il "Primo esempio di"come"St01", selezionare "Inizia da" al "Top" e impostare "replica" come "2". Verifica"Campione Descriptor" e "Valore Standard" di input: selezionare "unità"come"ng/mL", impostare "valore a partire" come "250", impostare "passaggio da" come "2". Fare clic su "OK".
- Clicca su "Leggi" per leggere la piastra quando la maggior parte concentrati standard raggiunge una densità ottica (OD) di ~ 1.
- Fare clic sul menu "File" e fare clic su "Salva" per salvare il file.
- Fare clic su "Read" per leggere la piastra nuovamente quando lo standard più concentrato si avvicina OD405 di ~ 1.5, 2 e 2.5, rispettivamente.
- Fermare la reazione aggiungendo 25 µ l/pozzetto di 3 M NaOH. La procedura 5.12-5.15 per un piatto alla volta.
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Analizzare i dati di ELISA utilizzando il software associato il lettore di micropiastre:
- Controllare i valori di OD405 gli standard di isotipo Ig di leggere file e selezionare una lettura adeguata con buona gamma lineare degli standard per l'analisi dettagliata dei dati.
- Selezionare il programma di montaggio 4 parametri per tracciare curve standard. Controllare il coefficiente della curva standard (R2), che è richiesta di essere > 0.98 per garantire dati di buona qualità.
- Verifica se i valori di OD405 di ogni campione di diminuiscono con l'aumento di fattori di diluizione. Recuperare la concentrazione di tutti i pozzetti campione diluito facendo clic su "Incognite".
- Selezionare un pozzo appropriato di ciascun campione con OD405 nell'intervallo lineare della curva standard isotipo Ig per il calcolo della concentrazione.
- Calcolare la concentrazione di isotipo Ig di ciascun campione utilizzando la formula del siero: concentrazione di Ig del siero = concentrazione di ben selezionato x fattore di diluizione.
- Tracciare grafici ed eseguire analisi statistiche utilizzando un software appropriato9,10,11. Fare grafici a dispersione verticale del siero i livelli di isotipo Ig per confrontare le risposte di Ig presso lo stesso punto di tempo. Per gli studi di reazione di memoria TD, fare le curve di risposta di corso di tempo per esaminare le risposte di isotipo Ig prima e dopo la vaccinazione di richiamo. Utilizzare barre di errore per mostrare la deviazione standard (SD) di ciascun gruppo di campioni. Per confrontare le risposte di isotipo Ig tra due genotipi dei topi, utilizzare lo spaiato t test per dati a due code per determinare la significatività statistica. Impostare il valore di p < 0,05 come significativamente diverso.
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Representative Results
Abbiamo usato questo protocollo per indagare i ruoli di un critico regolatore del sistema immunitario, TRAF3, a TI e TD Ig isotipo risposte9,10,11. TRAF3 direttamente o indirettamente regola la trasduzione del segnale di un numero di recettori immuni innati e adattivi, tra cui la superfamiglia dei recettori del TNF, recettori Toll-like e T cell receptor/CD28, tra gli altri27,28. Supponiamo che TRAF3 svolge ruoli distinti in sottogruppi differenti delle cellule immuni di regolare le risposte dell'anticorpo. Per verificare questa ipotesi, abbiamo determinato le risposte di isotype TI e TD Ig utilizzando topi di knock-out condizionali TRAF3 che hanno il gene Traf3 in particolare eliminato in linfociti B, cellule T o cellule mieloidi, rispettivamente9,10, 11. Orari di raccolta rappresentante immunizzazione e siero per studi TI e TD Ig sono illustrati nella Figura 1. Rappresentante IgG1 ed ELISA IgG2b risultati sono mostrati in Figura 2 e Figura 3 per illustrare il funzionamento di ELISA. Questi includono la piastra di supporto di standard diluito e campioni (Figura 2A), un'immagine della piastra dopo l'aggiunta del substrato AP (Figura 2B), i risultati di lettura di OD405 (Figura 2C, 2D), i valori delle diluizioni standard (Figura 2E, 2F), le curve standard (Figura 3A, 3B), i valori di campioni diluiti (Figura 3C, 3D) e il calcolo del siero IgG1 e IgG2b concentrazioni nei campioni (Figura 3E, 3F). La figura 4 Mostra i risultati rappresentativi del totale Ig isotipi nel siero dei topi ingenuo. Abbiamo dimostrato statisticamente aumentati livelli basali del siero di IgG2a, IgG2b, IgG3, IgM e IgA in B cellula-specifico TRAF3- / - (B-TRAF3- / -) topi rispetto ai topi di controllo di sesso ed età-abbinato TRAF3-sufficiente littermate (LMC). Questo hyperglobulinemia dei topi- / - B-TRAF3 è causato da vano espanso a cellule B negli organi linfoidi periferici dovuto la sopravvivenza prolungata di maturo TRAF3- / - B cellule9. La figura 5 Mostra i risultati rappresentativi di TI e TD Ig isotipo risposte dei topi ad immunizzazione con TNP-polisaccaride e TNP-KLH, rispettivamente. Questi risultati hanno rivelato un significativamente più alto TI, IgG3 TNP-specifico livello e anche elevati TD, IgG2b TNP specifici livelli in mieloide cellula-specifico TRAF3- / - (M-TRAF3- / -) topi rispetto nella LMC. Tale aumentata TI IgG3 e TD IgG2b risposte osservate nei topi di M-TRAF3- / - sono probabilmente dovuto produzione aumentata delle citochine pro-infiammatorie IL-6 e IL-12 da TRAF3- / - macrofagi e DCs dopo immunizzazione11. Figura 6 Mostra i risultati rappresentativi del TD primaria e risposte di memoria dei topi all'immunizzazione di TNP-KLH. Questi risultati hanno dimostrato risposta primaria TD IgM parzialmente in diminuzione e difettoso IgG1 primario e memoria risposte a cellula T specifiche TRAF3- / - (T-TRAF3- / -) topi. Il difettoso TD primaria e le risposte di memoria del T-TRAF3- / - risultato di topi da alterata attivazione delle cellule T CD4 di TRAF3- / - al recettore delle cellule T e CD28 co-fidanzamento10. Presi insieme, il protocollo descritto in questo articolo ci ha permesso di delineare i ruoli specifici di TRAF3 in sottoinsiemi di cellule immuni differenti nella regolazione TI e TD Ig isotipo risposte nei topi.
Figura 1 : Pianificazioni di raccolta del siero e di immunizzazione tipico TI e TD Ag. (A) TNP-polisaccaride esperimenti. (B) TNP-KLH esperimenti. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2 : Rappresentante IgG1 e IgG2b ELISA. (A), l'installazione della piastra a 96 pozzetti include i pozzi di blank, 7 diluizioni seriali (1:2) del mouse IgG1 e IgG2b standard (St01 per St07), e 4 diluizioni seriali (alle 01:10) del siero del 8 mouse campioni (S1 a S8). La concentrazione degli standard è dato bene nella parte inferiore di ogni livello. Il fattore di diluizione dei campioni è dato anche nella parte inferiore di ogni campione. (B) un'immagine della piastra a 5 min dopo l'aggiunta del substrato AP. La piastra leggere risultati di IgG1 (C) e IgG2b (D) a 405 nm. I valori di OD405 e concentrazioni diverse diluizioni del mouse IgG1 (E) e al topo IgG2b (F) standard. Conc, concentrazione; BackCalcConc, torna calcolato concentrazione; OD, densità ottica; AvgOD, OD medio dei replicati; DS, deviazione standard; CV, coefficiente di variazione. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3 : Analisi di dati rappresentante IgG1 ed ELISA IgG2b. Le curve standard di IgG1 (A) e IgG2b (B). Il coefficiente R2 è > 0.98 in entrambe le curve standard. Le frecce indicano la gamma lineare di curve standard. Valori di OD405 e le concentrazioni di IgG1 (C) e IgG2b (D) in incognite (campioni di siero diluito). R, gamma; Conc, concentrazione. Calcolo delle concentrazioni nel siero del mouse di IgG1 (E) e il topo IgG2b (F) per 8 campioni. ND, non rilevabile da questa ELISA. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4 : Risultati rappresentativi di isotipi di Ig totale nel siero dei topi ingenuo. Sieri sono stati raccolti da genere-abbinato, 10-12 settimane vecchio ingenuo LMC e B-TRAF3- / - topi (n = 10 per ciascun genotipo; background genetico: 129xC57BL/6). Livelli sierici basali di totale IgM, IgG1, IgG2a, IgG2b, IgG3, IgA e IgE sono stati determinati da ELISA. Significatività statistica è stata determinata con lo spaiato t test per dati a due code. *, significativamente differenti fra i topi- / - LMC e B-TRAF3 (p < 0,05); * *, molto significativamente differente tra LMC e B-TRAF3- / - topi (p < 0,01). Questa figura è stata modificata da Xie et al. 9. per favore clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 5 : Risultati rappresentativi delle risposte di isotype TI e TD Ig ad immunizzazione TNP-polisaccaride e TNP-KLH, rispettivamente. Genere-abbinato, 8-12 settimane vecchio LMC e M-TRAF3- / - topi (background genetico: C57BL/6) sono stati immunizzati con 50 µ g di TI Ag TNP-polisaccaride (pannello superiore, n = 9 per ciascun genotipo) o 100 µ g di TD Ag TNP-KLH mescolato con allume (pannello inferiore, n = 12 per ogni genotipo). Sieri sono stati raccolti il giorno 7 dopo immunizzazione. I titoli di IgM anti-TNP, IgG1, IgG2b, IgG3, IgA e IgE del siero sono stati analizzati da ELISA. Significatività statistica è stata analizzata con lo spaiato t test per dati a due code. *, significativamente differenti fra i topi- / - LMC e M-TRAF3 (p < 0,05). Questa figura è stata modificata da Leonardi et al. 11. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 6 : Risultati rappresentativi delle risposte di TD primaria e memoria Ig ad immunizzazione TNP-KLH. Genere-abbinato, 8-10 settimane vecchio LMC e T-TRAF3- / - topi (n = 10 per ciascun genotipo; background genetico: 129xC57BL/6) sono stati immunizzati con 100 µ g di TD Ag TNP-KLH mescolato con allume il giorno 0. Ogni mouse ha anche ricevuto un'immunizzazione booster con la stessa Ag e adiuvante il giorno 21 dopo la prima immunizzazione. Campioni di siero sono stati raccolti da topi giorno -7, 7, 14 e 28, rispettivamente. Livelli di IgM e IgG1 di TNP-specific in campioni di siero sono stati misurati dall'ELISA. Grafici raffigurano i risultati di 10 paia di LMC e T-TRAF3- / - topi (media ± DS). Significatività statistica è stata analizzata con lo spaiato t test per dati a due code. *, significativamente differenti fra i topi- / - LMC e T-TRAF3 (p < 0,05); * *, molto significativamente differenti fra i topi- / - LMC e T-TRAF3 (p < 0,01); , altamente significativamente differenti fra i topi- / - LMC e T-TRAF3 (p < 0,001). Questa figura è stata modificata da Xie et al. 10. per favore clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
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Discussion
Qui, descriviamo il protocollo per la caratterizzazione delle risposte di isotipo TD e TI Ig in topi usando ELISA. Efficace attuazione del presente protocollo richiede l'uso di materiali specificati in tabella 1, compreso le piastre di dosaggio ELISA, immunizzazione Ags, mouse Ig specifici anticorpi e standard. Prestare la massima attenzione per evitare di utilizzare piastre di coltura del tessuto trattato per ELISA. Diluizioni degli standard e dei campioni di siero dovrebbero essere fatte in piastre separate non trattati (fondo tondo) e poi aggiunto nelle piastre ELISA. Usando questo protocollo, abbiamo ottenuto sempre risultati affidabili con sensibilità e alta specificità.
Immunizzazione Ag, retro-orbitale sanguinamento e Ig specifici ELISA includono passaggi critici all'interno di questo protocollo. Per l'immunizzazione di TD Ag, mix di TNP-KLH/allume deve essere accuratamente risospese per garantire il corretto importo di Ag/adiuvante viene iniettato. Se i coaguli di sangue nel dispensare o tubo capillare durante lo spurgo retro-orbitale, cambiare immediatamente ad un nuovo tubo di dispensare o capillare. Buffer e dei reagenti utilizzati in ELISA dovrebbero essere soluzioni chiare e non devono contenere precipitati, che possono dare risultati falsi positivi con valori di405 OD anormali. Inoltre, le bolle dovrebbero essere evitate nei pozzetti in tutte le fasi di ELISA, che possono anche dare risultati falsi positivi o falsi negativi con valori di405 OD anormali. Questi errori occasionali possono essere minimizzati analizzando campioni in duplicato. Lavaggi in ELISA rimuovere i reagenti non associati e anticorpi dai pozzetti. Un lavaggio insufficiente provoca rumore di fondo elevato, ma lavaggio eccessivo può portare ad una diminuzione nella sensibilità rimuovendo antigeni o associato anticorpi29. I numeri dei tempi di lavaggio descritte in questo protocollo di ELISA vengono ottimizzati in base alla nostra esperienza.
Dovrebbe essere notato che ELISA ha dei limiti di rilevamento, che sono solitamente definiti dalla gamma lineare di curve standard. Per quantificare correttamente la concentrazione nel siero di ogni isotipo Ig, i campioni devono essere opportunamente diluito per adattarsi all'interno della gamma lineare delle curve standard. Si consiglia di testare diluizioni seriali dei campioni per selezionare i fattori di diluizione appropriata per il calcolo della concentrazione di Ig, come descritto in questo protocollo. Tuttavia, se i risultati mostrano che i fattori di diluizione testati non danno risultati in campo lineare della curva standard, ulteriori ELISA devono essere eseguite utilizzando fattori di diluizione regolate secondo i primi risultati di ELISA. Se tutte le diluizioni testate sono sotto il limite inferiore di rilevamento, è necessario utilizzare campioni di siero originale e più piccoli fattori di diluizione. Se i valori di OD405 non mostrano diminuzione proporzionale con aumentando il fattore di diluizione per tutte le diluizioni seriali testati, questo indica che la cattura di Ab o rivestimento Ag è saturo da tutti i campioni diluiti e ulteriormente più elevati fattori di diluizione devono essere utilizzati. A seguito di questo protocollo, si otterranno risultati conclusivi con al massimo 2 giri di ELISA.
I fattori che sono noti per influenzare le risposte dell'anticorpo in topi comprendono il ceppo (patrimonio genetico), sesso, età, dieta e struttura animale ambiente30,31,32,33,34 . Ad esempio, anche se molti ceppi murini producono IgG2a, alcuni ceppi come topi C57BL/6 non producono IgG2a, ma producono IgG2c invece35,36. La prova recente inoltre identifica commensale microbiota come un fattore che condiziona l'anticorpo risposte37,38,39,40. Tener conto di questi fattori, si consiglia l'uso di genere-abbinato, giovane adulto littermates di genotipi differenti che condividono gli stessi genitori e le gabbie per gli esperimenti di immunizzazione TD e TI Ag. Inoltre, variazione del mouse-mouse è osservata frequentemente per topi dello stesso genotipo (Figura 4–6), un numero sufficiente replica (in genere, n > 8) dei topi sono necessarie per ciascun genotipo o gruppo per ottenere statisticamente risultati significativi.
L'ELISA specifico isotipo Ig è utile per determinare i titoli dei diversi isotipi di Ig. Tuttavia, questo metodo da solo non è sufficiente per rivelare le cause alla base delle differenze osservate nei titoli di isotipo Ig e quindi è spesso usato in combinazione con una varietà di approcci complementari. Per differenziare se la differenza nei titoli di isotipo Ig è causata da diversi numeri dei linfociti B con produzione di Ig o diversa efficienza delle cellule B alla produzione di Ig, flusso cytometry41,42,43 ed Enzyme-Linked Può essere utilizzato ImmunoSpot (ELISPOT)43,44,45 . Per analizzare la sopravvivenza delle cellule B, la proliferazione e la formazione di centro germinativo, metodi alternativi includono citometria a flusso, coltura in vitro di cellule spleniche di B e la macchiatura immunohistochemical seguita da microscopia9,26 ,41,46,47. Per delucidare le modifiche in Ig isotype commutazione responses in cellule di B, cultura in vitro delle cellule di B spleniche e quantitative RT-PCR delle trascrizioni di germline di Ig, segmenti di gene della catena pesante sono comunemente usato41,43 ,48,49. Per studiare la causa delle differenze nella maturazione di affinità, ipermutazione somatica (SHM) del gene della catena pesante di Ig è determinato dal sequenziamento del VDJ regione50,51,52. Per comprendere le differenze nelle risposte delle cellule B memoria, la frequenza e il numero di sottoinsiemi di cellule B di memoria differenti dopo immunizzazione Ag possa essere analizzato tramite flusso cytometry utilizzando recentemente identificati marcatori delle cellule B memoria del topo, tra cui CD38, CD80, CD73, PD-L2, CD62L e CCR68,53,54,55. Insieme, questi metodi complementari utilizzati in combinazione con il protocollo attuale permetterà ai ricercatori di acquisire una comprensione globale di risposte anticorpali in un determinato ambiente sperimentale.
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Disclosures
Gli autori non hanno nessun concorrenti interessi finanziari.
Acknowledgments
Questo studio è stato sostenuto dagli istituti nazionali di sovvenzioni salute CA158402 R01 (P. Xie) e AI128264 R21 (P. Xie), il dipartimento della difesa concedere W81XWH-13-1-0242 (P. Xie), un premio di pilota il Cancer Institute del New Jersey attraverso Grant numero P30CA072720 dal National Cancer Institute (P. Xie), una sovvenzione di biomedica Busch (P. Xie), una borsa di studio Stollar Victor (a. Levi) e un B. Anne e James B. Leathem Fellowship (S. Zhu).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| VersaMax Tunable Microplate Reader | MDS Analytical Technologies | VERSAMAX | Equipment to read the plates |
| SOFTmax PRO 5.3 | MDS Analytical Technologies | SOFTmax PRO 5.3 | Software for the plate reader |
| GraphPad Prism | GraphPad | Prism | Software for graphing and statistics |
| TNP-AECM-polysaccharide (FICOLL) | Biosearch Technologies | F-1300-10 | A TI Ag for immunization |
| TNP-KLH | Biosearch Technologies | T-5060-5 | A TD Ag for immunization |
| TNP(38)-BSA | Biosearch Technologies | T-5050-10 (conjugation ratio: 38) | Coating Ag for TNP-specific ELISA |
| TNP(3)-BSA | Biosearch Technologies | T-5050-10 (conjugation ratio: 3) | Coating Ag for high affinity TNP-specific Ig |
| Imject Alum | Fisher Scientific | PI-77161 | Alum adjuvant for immunization |
| Falcon Polypropylene tubes | Fisher Scientific | 14-959-11A | For incubation of TNP-KLH/alum |
| BD Insulin Syringe | Fisher Scientific | 14-829-1B | For i.p. injection of mice |
| Immuno 96-Well Plates, Flat-Bottom | Fisher Scientific | 14-245-61 | For ELISA |
| Untreated 96-Well Microplates, Round-Bottom | VWR | 82050-622 | For serial dilutions of standards and samples |
| Phosphatase substrate, 5 mg Tablets | Sigma | S0942-200TAB | AP substrate |
| Diethanolamine | VWR | IC15251690 | A component of AP substrate buffer |
| Goat anti-mouse IgM | SouthernBiotech | 1020-01 | Capture Ab for mouse IgM |
| Goat anti-mouse IgG1 | SouthernBiotech | 1070-01 | Capture Ab for mouse IgG1 |
| Goat anti-mouse IgG2a | SouthernBiotech | 1080-01 | Capture Ab for mouse IgG2a |
| Goat anti-mouse IgG2b | SouthernBiotech | 1090-01 | Capture Ab for mouse IgG2b |
| Goat anti-mouse IgG3 | SouthernBiotech | 1100-01 | Capture Ab for mouse IgG3 |
| Goat anti-mouse IgA | SouthernBiotech | 1040-01 | Capture Ab for mouse IgA |
| Goat anti-mouse IgE | SouthernBiotech | 1110-01 | Capture Ab for mouse IgE |
| AP-Goat anti-mouse IgM | SouthernBiotech | 1020-04 | Detection Ab for mouse IgM |
| AP-Goat anti-mouse IgG1 | SouthernBiotech | 1070-04 | Detection Ab for mouse IgG1 |
| AP-Goat anti-mouse IgG2a | SouthernBiotech | 1080-04 | Detection Ab for mouse IgG2a |
| AP-Goat anti-mouse IgG2b | SouthernBiotech | 1090-04 | Detection Ab for mouse IgG2b |
| AP-Goat anti-mouse IgG3 | SouthernBiotech | 1100-04 | Detection Ab for mouse IgG3 |
| AP-Goat anti-mouse IgA | SouthernBiotech | 1040-04 | Detection Ab for mouse IgA |
| AP-Goat anti-mouse IgE | SouthernBiotech | 1110-04 | Detection Ab for mouse IgE |
| Mouse IgM standard | BD Biosciences | 553472 | TNP-specific IgM, Clone G155-228 |
| Mouse IgG1 standard | BD Biosciences | 554054 | TNP-specific IgG1, Clone 107.3 |
| Mouse IgG2a standard | BD Biosciences | 556651 | TNP-specific IgG2a, Clone G155-178 |
| Mouse IgG2b standard | BD Biosciences | 554055 | TNP-specific IgG2b, Clone 49.2 |
| Mouse IgG3 standard | BD Biosciences | 553486 | KLH-specific IgG3, Clone A112-3 |
| Mouse IgA standard | BD Biosciences | 550924 | Mineral oil-induced IgA, Clone MOPC-320 |
| Mouse IgE standard | BD Biosciences | 557079 | TNP-specific IgE, Clone C38-2 |
References
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