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Immunology and Infection

Charakterisierung der Thymus-abhängig und Thymus-unabhängige Immunglobulin Isotype Antworten bei Mäusen mit Enzym-linked Immunosorbentprobe Assay

Published: September 7, 2018 doi: 10.3791/57843
Automatic Translation
1, 1, 2,3
1Department of Cell Biology and Neuroscience and Graduate Program in Cellular and Molecular Pharmacology, Rutgers University, 2Department of Cell Biology and Neuroscience, Rutgers University, 3Rutgers Cancer Institute of New Jersey

Summary

In diesem Artikel beschreiben wir ein Protokoll zur Charakterisierung von T-abhängigen und T-unabhängige Immunglobulin (Ig) Isotype Antworten bei Mäusen mittels ELISA. Diese Methode verwendet, allein oder in Kombination mit Flow Cytometry wird erlauben Forschern, Unterschiede in der B-Zell-vermittelten Ig Isotype Antworten bei Mäusen nach T-abhängigen und T-unabhängige Antigen-Immunisierung zu identifizieren.

Abstract

Antikörper, auch bezeichnet als Immunglobuline (Ig), abgesondert von B-Lymphozyten, Plasmablasts/Plasmazellen im humorale Immunität unterschieden bieten eine gewaltige Verteidigung gegen eindringende Krankheitserreger über vielfältige Mechanismen. Ein wichtiges Ziel der Impfung ist, schützende Antigen-spezifische Antikörper, lebensbedrohliche Infektionen zu verhindern. Thymus-abhängig (TD) und Thymus-unabhängige (TI) Antigene robuste Antigen-spezifische IgM Antworten entlocken können und können auch induzieren die Produktion von Isotype geschalteten Antikörpern (IgG, IgA und IgE) sowie die Generierung von Speicherzellen B mit Hilfe durch antigenpräsentierende Zellen (APCs) bereitgestellt. Hier beschreiben wir ein Protokoll zur Charakterisierung von TD und TI Ig Isotype Reaktionen bei Mäusen mit Enzym-linked Immunosorbentprobe Assay (ELISA). In diesem Protokoll sind TD und TI Ig Antworten durch intraperitoneale (i.p.) Immunisierung mit konjugierten Hapten Modell Antigene TNP-KLH (in Alaun) und TNP-Polysaccharid (mit PBS-Puffer), bzw. in den Mäusen ausgelöst. Um TD Speicher Reaktion hervorzurufen, ist eine Auffrischimpfung von TNP-KLH in Alaun 3 Wochen nach der ersten Impfung mit dem gleichen Antigen/adjuvante gegeben. Maus-Seren werden zu verschiedenen Zeitpunkten vor und nach der Immunisierung geerntet. Insgesamt Ig Serumspiegel und TNP-spezifische Antikörper sind anschließend quantifiziert mit Ig Isotype-spezifische Sandwich und indirekten ELISA, beziehungsweise. Um die Serumkonzentration von jedem Ig Isotype korrekt zu quantifizieren, müssen die Proben entsprechend verdünnt werden, um innerhalb des linearen Bereichs der standard Kurven passen. Unter Verwendung dieses Protokolls, haben wir konsequent zuverlässige Ergebnisse mit hoher Spezifität und Sensitivität erreicht. Bei Verwendung in Kombination mit anderen ergänzenden Methoden wie Durchflusszytometrie, in-vitro- Kultur der Milz B-Zellen und immunhistochemische können Färbung (IHC), dieses Protokoll Forscher, ein umfassendes Verständnis des Antikörpers zu gewinnen Antworten in einer bestimmten experimentellen Einstellung.

Introduction

B-Lymphozyten sind der Hauptakteur in humorale Immunität und die einzige Zelltyp bei Säugetieren, die in der Lage, die Produktion von Antikörpern, auch als Immunglobuline (Ig)1,2bezeichnet sind. Abgesondert von B-Zellen Antikörper bieten eine gewaltige Verteidigung gegen eindringende Krankheitserreger über vielfältige Mechanismen, einschließlich Neutralisation, Opsonization und Komplementaktivierung führt zu schützende Immunität3. Sekretion von Antikörpern durch B-Zellen wird erst nach der vollständigen Aktivierung von bestimmten B-Zellen, die erfordert in der Regel zwei unterschiedliche Signale,3erreicht. Signal 1 wird durch die direkte Bindung des Antigens (Ag) an den B-Zell-Rezeptor (BCR) ausgedrückt auf der Oberfläche von bestimmten naive B Zellen3weitergeleitet. Abhängig von der Quelle des Signals 2 kann Thymus-abhängig (TD) oder Thymus-unabhängige (TI)3,4B-Zell-Aktivierung unterteilt werden. Ein TD-Antigen-Reaktion liefert Signal 2 aktivierten cognate CD4 T (TH)-Helferzellen, die CD154, die Liganden für den co-stimulatory-Rezeptor CD40 ausgedrückt auf B Zellen1,2,3zum Ausdruck bringen. Ein TI-Antigen-Reaktion, Signal 2 entstammt entweder Engagement von Toll-Like-Rezeptoren (TLRs bei Typ 1 TI-Ag) oder umfangreiche Vernetzung der BCR (bei Typ-2 TI Ag) auf der B-Zellen3,4. Typ 1 TI (TI-1) Antigene sind mikrobielle Liganden der TLRs, einschließlich der bakteriellen Lipopolysacchariden (LPS), virale RNA und mikrobielle CpG-DNA4,5. Typ 2 TI (TI-2) Antigene haben stark repetitiven Struktur und liefern längere und anhaltende Signalisierung zu B-Zellen durch mehrere Vernetzung der BCR4,6. Typische Beispiele für TI-2-Antigene sind Pneumokokken Polysaccharide und Hapten konjugierte Polysaccharid-6,-7. TD und TI Antigene können robuste Antigen-spezifische IgM Antworten entlocken und induzieren können auch die Produktion von Isotype geschalteten Antikörpern (IgG, IgA und IgE) mit der Hilfe von antigenpräsentierende Zellen (APCs) wie Dendritische Zellen (DCs)1 ,2,3. Darüber hinaus TD und TI Antigene sind in der Lage, Speicher-Reaktionen mit Hilfe von APCs induzieren, aber TD Antigene sind effizienter, induzierende Speicher B-Zell-Generation3,8.

In diesem Protokoll sind TD und TI Ig Antworten bei Mäusen durch intraperitoneale (i.p.) Immunisierung mit Hapten konjugiert Modell Antigene 2,4,6-Trinitrophenyl-Keyhole Limpet Hemocyanin (TNP-KLH) und TNP-Polysaccharid (Neutral, stark verzweigte ausgelöst. und hoher Masse), bzw.9,10,11. TD Antigene sind in der Regel mit Adjuvans zur die Produktion von Antikörpern12zu erhöhen. Hier in unserem Protokoll TNP-KLH mit Alaun, eine häufig verwendete adjuvante Impfung Studien12injiziert. Andere Beispiele für Hilfsstoffe, die verwendet werden können vollständig oder unvollständig Freund des Adjuvans (CFA oder IFA), Monophosphoryl-Lipid A / Trehalose Dicorynomycolate ("Ribi" adjuvante) und CpG oligodeoxynukleotiden, etc.13, 14. nach der Immunisierung, Maus Sera werden zu verschiedenen Zeitpunkten geerntet und TNP-spezifischen Antikörper im Serum quantifiziert mit Ig Isotype-spezifischen Enzym-linked Immunosorbentprobe Assay (ELISA)9,10, 11.

ELISA ist ein Teller-basierte Assay, der weithin als Diagnosewerkzeug in der Medizin und auch als analytisches Werkzeug in der biomedizinischen Forschung15,16verwendet wird. Es dient zum erkennen und quantifizieren Analyten einschließlich Antikörper, Hormone, Zytokine, Chemokine, und verschiedene Antigene, etc.. ELISA kann in verschiedenen Formaten, einschließlich direkte, indirekte, Sandwich und wettbewerbsfähigen ELISA15,16durchgeführt werden. Im Allgemeinen geht es um die Immobilisierung des Antigens an einer festen Oberfläche, in der Regel einer 96-Well Mikrotiterplatte, die mit einem primären Antikörper inkubiert. Nach der Inkubation wird die ungebundene Antikörper abgewaschen. In eine direkte ELISA der primäre Antikörper direkt mit einem Enzym (in der Regel Meerrettich Peroxidase oder alkalische Phosphatase), die einem chromogenen Substrat um einen sichtbaren Farbumschlag erkannt durch ein Signal-Erkennung-Instrument wie Ausbeute Spalten kann konjugiert ist ein Spektralphotometer15,16. Im Gegensatz dazu, wenn ein Enzym-linked Sekundärantikörper verwendet wird, um den primären Antikörper binden, dann gilt dies als eine indirekte ELISA15,16. Direkte ELISA ist schneller während indirekte ELISA empfindlicher15,16. In einem Sandwich ELISA die Platten sind mit einem "einfangen" Antikörper verwendet, um das Antigen des Interesses an den Proben zu immobilisieren beschichtet, und dann das aufgenommene Antigen erkannt werden, von einem anderen "detektionsantikörper" in eine direkte oder indirekte Weise15, 16. Sandwich ELISA bietet hohen Spezifität, da das Antigen durch zwei verschiedene Antikörper an das Antigen erkannt wird. In einem wettbewerbsfähigen ELISA die Konkurrenz zwischen Probe Antigen und die Platte gebundene Antigen für die Bindung an den Primärantikörper ansässig ist, und dann die Antigenkonzentration in der Probe wird durch die Messung des Rückgang der Signal vom Substrat quantifiziert 15 , 16. wettbewerbsfähige ELISA durchgeführt werden kann, mit dem oben genannten direkten oder indirekten-Format und eignet sich für die Erkennung von kleinen Antigene mit nur ein Epitop15,16.

Alternative Verfahren zur Messung der Antikörper gehören Radio-Immunoassay (RIA), Electrochemiluminescence (ECL) Assay und Surface Plasmon Resonance (SPR) assay17. RIA war, dass die ersten Immunoassay entwickelt, dass die Maßnahmen die Anwesenheit eines Antigens (oder Antikörper) mit hoher Spezifität und Sensitivität mit radioaktiven Reagenzien18,19. Jedoch, aufgrund von Bedenken der radioaktiven Toxizität, Entsorgungskosten, Haltbarkeit und spezielle Lizenzen mit radioaktiven Stoffen zu arbeiten, ELISA ist eine bessere und bequemere Technik für gemeinsame nutzt20,21. ECL ist ein hochsensibler Assay in der Chemilumineszenz-Reaktionen werden initiiert, unter Verwendung der Elektrizität, um hoch reaktive Spezies aus stabilen Vorstufen auf der Oberfläche der Elektrode zu generieren, und können verwendet werden, um die Menge des Analyten zu messen (z. B. Antigene oder Antikörper)22. Allerdings erfordert ein spezielles Instrument ECL und somit nicht so breit als ELISA23eingesetzt. SPR ist ein direkter Assay, die verwendet werden kann, um die Bindung des Liganden zu messen (zB., Antikörper), immobilisiert Moleküle (zB., Antigene) auf einem Sensor chip-Oberfläche24. SPR erkennt die Interaktionen in Echtzeit sehr spezifisch und erfordert nicht die Verwendung von markierten Reagenzien wie ELISA. Allerdings erfordert eine spezielle Ausrüstung SPR auch und hat eine geringeren Empfindlichkeit als ELISA17. Angesichts der Einschränkungen der alternativen Methoden, ist ELISA die am besten geeignete und günstige Technik für unsere Zwecke in diesem Protokoll. Hier beschreiben wir die Verwendung von Sandwich ELISA für die Analyse der gesamten Ig Isotype Ebenen und das Verfahren der indirekten ELISA für die Analyse der Antigen-spezifische Ig Klassen.

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Protocol

Dieses Protokoll folgt den Richtlinien des institutionellen Tierforschung Ethik-Kommission der Rutgers University. Alle Mäuse dienen nach NIH-Richtlinien und eine tierische Protokolls durch die institutionelle Animal Care and Use Committee genehmigt.

1. Vorbereitung von Mäusen und Sammlung von naiven Maus Sera

  1. Halten Sie alle Mäuse für Immunisierung Experimente in einem bestimmten Pathogen-freies Tierhaus.
  2. Mäuse, die die gleichen Eltern und Käfige für Immunisierung Studien Teilen Steuern Gebrauch Geschlecht abgestimmt, junger Erwachsener (8 – 12 Wochen alt) ko und stellt.
  3. Planen Sie die Immunisierung und Serum Sammlung Zeitpläne wie in Abbildung 1dargestellt.
  4. Ernten Sie naiv Serum von jeder Maus 7 Tage (-7 Tage) vor der Impfung. Folgen Sie den Retro-Orbital Blutungen und Serum Vorbereitung Anweisungen wie unten in Schritt 4 beschrieben.

2. Vorbereitung der TNP-Polysaccharid (ein TI-Antigen) und TNP-KLH (ein TD-Antigen)

  1. Lösen Sie die Antigen-Pulver mit sterilen PBS-Puffer (pH 7,4) gründlich zu 0,5 mg/mL von TNP-Polysaccharid-Lager und 1 mg/mL der Stammlösungen TNP-KLH. Aliquoten jedes Antigen Lösung in sterilen Microfuge Röhren bei 0,5 mL/Tube auf Lager, und halten Sie die Aliquote bei-80 ° C für die langfristige Lagerung. Vermeiden Sie mehrere Einfrieren und Auftauen von Antigen Aliquote.
  2. Am Tag Injektion berechnen das Volumen der TNP-Polysaccharid (50 µg/100 µL/Maus) oder TNP-KLH (100 µg/100 µL/Maus) musste nach der Anzahl der Mäuse injiziert werden. Tauen Sie entsprechende Anzahl von TNP-Polysaccharid oder TNP-KLH Aliquote bei Raumtemperatur (RT).
  3. TNP-KLH Injektionslösung zuerst verdünnen Sie Alaun Adjuvans (40 mg/mL) mit 3 Bände von sterilen PBS, eine Endkonzentration von 10 mg/mL. Stellen Sie sicher, dass die Alaun adjuvante Mischung gut abgehängte vor Verdünnung ist.
  4. Gleiches Volumen von 10 mg/mL Alaun adjuvante Gülle aus Schritt 2.3 und die aufgetauten TNP-KLH-Lösung (1 mg/mL) in eine 5 mL-Polypropylen-Rohr zu kombinieren, gut mischen und Inkubation bei 37 ° C für 30 min. dieser TNP-KLH/Alaun mischen frisch vor der Injektion vorbereiten.

3. Immunisierung von Mäusen

  1. Führen Sie intraperitoneal (i.p.) Injektion von TNP-Polysaccharid oder TNP-KLH/Alaun, die Mäuse mit 1 mL Insulinspritzen in einem Biosafety-Schrank zu immunisieren. Stechen Sie die Nadel im ca. 30° Winkel vorzugsweise im unteren rechten Quadranten von jeder Maus-Injektion in den inneren Organen zu verhindern.
  2. I.p. 100 µL der TNP-Polysaccharid per Mausklick am Tag 0 für TI Ag Immunisierung (Abb. 1A) zu injizieren.
  3. I.p. 200 µL der TNP-KLH/Alaun-Mix (frisch zubereitet im Schritt 2.4) per Mausklick am Tag 0 für TD Ag Immunisierung zu injizieren. Wiederholen Sie die gleichen Injektion am Tag 21 als eine Auffrischimpfung für Speicher-Studien (Abbildung 1B).
  4. Nach der Injektion jede Maus zu seinem Käfig zurückkehren und die injizierten Mäusen in bestimmten Pathogen-freies Zustand zu halten.

4. Retro-Orbital Blutungen und Serum-Vorbereitung

  1. Maus-Sera zu verschiedenen Zeitpunkten zu ernten: für TNP-Polysaccharid Impfung sammeln Maus Sera am Tag -7 und 7 (Abb. 1A); für TNP-KLH/Alaun-Immunisierung sammeln Sie Maus Sera am Tag -7, 7, 14 und 28 (Abbildung 1B).
  2. Für Retro-Orbital Blutungen jede Maus mit 5 % Isofluran für 1 – 2 min. in einer Biosafety Schrank25zu betäuben. Führen Sie Pedal Reflex um ausreichende Anästhesie des jede Maus zu gewährleisten.
  3. Halten Sie die narkotisierten Maus in der einen Hand mit Zeigefinger und Daumen ziehen die Haut um den Augapfel zurück, so dass der Augapfel aus der Steckdose25hineinragt. Legen Sie eine nicht-heparinisierten Pasteurpipette oder Kapillarrohr in einem Winkel von 45° in den inneren Augenwinkel die Augenhöhle unter den Augapfel-25.
  4. Üben Sie sanften Druck nach unten und drehen Sie die Pipette oder Rohr sanft zu brechen in die Vene und 150 – 200 µL Blut in die Pipette oder Rohr zu sammeln. Sofort das Blut zu übertragen, um einem sterilen 1,5 mL Microfuge Rohr und die Maus in seinen Käfig zu erholen zurück.
  5. Lassen Sie das Blut, die Proben bei RT für 1 – 2 h zur Koagulation sitzen.
  6. Zentrifugieren Sie die blutkoagel Proben bei 13.000 X g für 10 min bei 4 ° C. Übertragen Sie das klare Serum auf das Blutgerinnsel zu einem neuen sterilen 1,5 mL Microfuge Schlauch.
  7. Wiederholen Sie Schritt 4.6 noch einmal residual Blutgerinnsel entfernen und das klare Serum zu sammeln.
  8. Aliquoten das Serum in sterilen 1,5 mL Microfuge Röhren bei 50 µL/Tube, und speichern Sie die Sera bei-80 ° C.
  9. Wechseln Sie das Auge für Blutungen zu unterschiedlichen Zeitpunkten, so dass jedes Auge höchstens zweimal für das ganze Experiment ausgeblutet ist. Am Terminal Blutungen sammeln Sie bis zu 1 mL Blut aus jeder Maus vor Euthanasie. Einschläfern Sie die Maus mit 5 % CO2 gefolgt von zervikale Dislokation.
    Hinweis: Milz B-Zellen für Durchfluss durchflusszytometrischen Untersuchungen und in-vitro- Kultur-Studien geerntet werden können. Wir bereiten auch genomischen DNA aus splenocyten, den Genotyp der jede Maus zu überprüfen.

(5) Maus Ig Isotype-spezifischen ELISA

  1. Bereiten Sie den Puffer und Lösungen vor ELISA.
    1. Bereiten Sie 500 mL Kupplung Puffer (PBS, pH 7.4).
    2. 500 mL Waschlösung vorbereiten (PBS-T (0,05 % Tween 20), pH 7.4).
    3. Bereiten Sie 100 mL Puffer blockiert (1 % BSA mit PBS-Puffer, pH 7,4, bei 4 ° C gelagert).
    4. Bereiten Sie 1 L Substratpuffer (1 M Diethanolamin, pH 9,8 (97 mL Diethanolamin in 1 L H2O, pH mit 10 M HCl eingestellt) und 0,5 mM MgCl2). Schützen Sie durch die Flasche mit Alufolie umwickeln der Substratpuffer vor Licht. Shop bei 4 ° C.
    5. 100 mL Stopp-Lösung (3 M NaOH) vorzubereiten.
  2. Die ELISA-Platten zu beschichten:
    1. Für total Serum Ig Isotype ELISA, 96-Well-Immuno Platten mit 10 µg/mL Isotype-spezifische erfassen polyklonale Ziege Anti-maus Ig Mantel (M, G1, G2a, G2b, G3, A oder E) Abs in Kupplung Puffer (PBS) in 100 µL/Well.
    2. Für TNP-spezifische Ig Isotype ELISA Mantel 96-Well-Immuno Platten mit 10 µg/mL von TNP(38)-BSA mit PBS-Puffer bei 100 µL/Well.
    3. Für hohe Affinität TNP-spezifische Ig Isotype ELISA Mantel 96-Well-Immuno Platten mit 10 µg/mL von TNP(3)-BSA mit PBS-Puffer bei 100 µL/Well26. Über Nacht inkubieren Sie die Platten bei 4 ° C.
  3. Waschen Sie nach der Beschichtung Inkubation die Platten 2 Mal mit 200 µL/Well des PBS-T. Verwerfen der Waschpuffer und Fleck Trocknen der Platten (tippen Sie auf jede Platte auf dem Kopf stehend auf einem Stapel Papier Handtücher) nach jedem Waschen.
  4. Blockieren die Platten: Fügen Sie 200 µL/Well des Blocking-Puffer (1 % BSA mit PBS-Puffer) in den beschichteten Platten und inkubieren Sie die Platten für 1 h bei RT
  5. Während die Platten blockiert sind, bereiten Sie Verdünnungen der Ig Isotype Standards und Serumproben in Blocking-Puffer in einer separaten, unbehandelte 96-Well-Platte bei 150 µL/Well.
    1. 250 ng/mL Ig Isotype Normen als Ausgangspunkt Standardkonzentration (St01) vorzubereiten und zu treffen 7 bis 10 von 1:2 serielle Verdünnungen der Ig Standards (St02 St07 oder St10, Abbildung 2A).
    2. Bereiten Sie Maus Serum Proben bei einer Verdünnung von 1: 100 oder 1: 500 Faktor als Ausgangspunkt Verdünnung und 3 oder 4 01:10 serielle Verdünnungen für insgesamt Ig Isotype oder 1:5 serielle Verdünnungen für TNP-spezifische Ig Isotype jeder Serum-Probe (Abb. 2A). Bereiten Sie für IgE ELISA Maus Serumproben mit dem 1:2 Verdünnungsfaktor als Ausgangspunkt Verdünnung, und machen Sie 3 von 1:5 Verdünnungsreihen jeder Serum-Probe.
  6. Nach der Blockierung, waschen Sie die Platten aus Schritt 5.4 dreimal mit 200 µL/Well des PBS-T und Fleck Trocknen der Platten nach jedem Waschen.
  7. Übertragen Sie 100 µL/Well verdünnten Ig Isotype Standards (geeignet für die Erfassung und Erkennung Abs) und verdünnten Serumproben aus Schritt 5.5 an den Platten im Schritt 5.6 vorbereitet. Über Nacht inkubieren Sie die Platten mit den Standards und Proben bei 4 ° C.
  8. Waschen Sie die Platten 3 Mal mit 200 µL/Well des PBS-T und Fleck Trocknen der Platten nach jedem Waschen.
  9. In jeder Platte hinzufügen 100 µL/Well von 10 µg/mL eine entsprechende alkalische Phosphatase (AP)-konjugierten Isotype-spezifische Ziege Anti-maus Ig (M, G1, G2a, G2b, G3, A oder E) Abs in Blocking-Puffer verdünnt.
  10. Inkubieren Sie die Platten mit AP-konjugierten Abs für 1-2 h bei RT Inkubieren Sie für die Erkennung von IgE die Platten für 1 – 2 h bei 37 ° c
  11. Bereiten Sie 1 mg/mL Substratlösung durch zwei Tabletten 5 mg Phosphatase Substrat in 10 mL Substratpuffer auflösen.
  12. Jede Platte 5 Mal mit 200 µL/Well des PBS-T waschen und Fleck Trocknen der Platten nach jedem Waschen.
  13. 100 µL/Well der Substratlösung in jeder Platte hinzufügen. Lassen Sie die Reaktion bei RT, zu entwickeln, die in der Regel nur wenige Minuten dauert.
  14. Lesen Sie jede Platte bei 405 nm unter Verwendung eines Mikrotestplatte Lesers mit der zugehörigen Software.
    1. Klicken Sie auf "Einstellungen" um die Wellenlängen "Lm1" eingestellt "405 nm" und klicken Sie auf "OK".
    2. Klicken Sie auf "Vorlage", "leer" Brunnen, Brunnen "Standards" und "unbekannt" Brunnen gemäß den 96-Well-Platte-Einstellungen zuweisen.
    3. "Standards" Brunnen klicken Sie auf "Serie", um "Erstmuster"als"St01" festlegen, wählen "Starten von" an "oben" und "repliziert" als "2" gesetzt. Überprüfen Sie"Probe DescriptoR" und "Standardwert": Wählen Sie "Geräte"als"ng/mL", "Start-Wert" als "250", "Schritt", als "2" gesetzt. Klicken Sie auf "OK".
    4. Klicken Sie auf "Lesen" um der Platte zu lesen, wenn die meisten standard erreicht konzentrierten eine optische Dichte (OD) von ~ 1.
    5. Klicken Sie im Menü "Datei" und klicken Sie auf "Speichern", um die Datei zu speichern.
    6. Klicken Sie auf "Lesen", um die Platte wieder zu lesen, nähert sich der konzentrierteste Standard OD405 von ~ 1.5, 2 und 2,5, beziehungsweise.
  15. Stoppen Sie die Reaktion durch Zugabe von 25 µL/Well von 3 M NaOH. Führen Sie die Schritte 5.12 um 5.15 für eine Platte zu einem Zeitpunkt.
  16. ELISA Datenanalyse mit Hilfe der Software der Mikrotestplatte Leser zugeordnet:
    1. Überprüfen Sie die OD405-Werte der Ig Isotype Standards lesen Sie Dateien und wählen Sie eine entsprechende Lesung mit guten linearen Bereich der Standards für detaillierte Datenanalyse.
    2. Wählen Sie das passende 4-Parameter Programm standard Kurven Plotten. Überprüfen Sie die Koeffizienten der Standardkurve (R2), die > 0,98 gute Datenqualität sicherzustellen werden muss.
    3. Überprüfen Sie, ob die OD405-Werte jeder Probe sinken mit zunehmender Verdünnungsfaktoren. Rufen Sie die Konzentration von allen verdünnten Probe Brunnen durch Klicken auf "Unbekannten ab".
    4. Wählen Sie eine geeignete gut jeder Probe mit OD405 im linearen Bereich der Ig Isotype Standardkurve für die Berechnung der Konzentration.
    5. Das Serum Ig Isotype Konzentration von jeder Probe mit Hilfe der Formel zu berechnen: Serum Ig Konzentration = ausgewählte gut Konzentration x Verdünnungsfaktor.
  17. Plotten von Grafiken und statistischen Analysen mit Hilfe einer entsprechenden Software9,10,11. Stellen Sie vertikale Streudiagrammen Serum Ig Isotype Ebenen, die Ig-Antworten zum gleichen Zeitpunkt zu vergleichen. Machen Sie für TD Speicher Antwort Studien die Zeitverlauf Wirkungs-Kurven, die Ig Isotype Antworten vor und nach der Auffrischimpfung zu untersuchen. Verwenden Sie Fehlerindikatoren Standardabweichung (SD) der einzelnen Proben zeigen. Um Ig Isotype Reaktionen zwischen zwei Genotypen von Mäusen zu vergleichen, verwenden des ungepaarten t -Tests für zwei-tailed Daten um die statistische Signifikanz bestimmen. Festlegen der p -Wert < 0,05 als deutlich anders.

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Representative Results

Wir haben dieses Protokoll verwendet, um die Rollen von einem kritischen Regler des immunen Systems, TRAF3, TI und TD Ig Isotype Antworten9,10,11zu untersuchen. TRAF3 direkt oder indirekt regelt die Signaltransduktion eine Reihe von angeborenen und der adaptiven Immunsystems Rezeptoren, einschließlich der TNF-Rezeptor-Superfamilie, Toll-Like-Rezeptoren und T-Zell-Rezeptor/CD28, unter anderem27,28. Wir vermuten, dass TRAF3 spielt verschiedene Rollen in verschiedenen Immunzellen Teilmengen Antikörperantworten regulieren. Um diese Hypothese zu testen, haben wir TI und TD Ig Isotype Antworten mit bedingten TRAF3-Knockout-Mäusen, die das Traf3 gen gezielt in B-Zellen, T-Zellen oder myeloische Zellen gelöscht bzw.9,10haben festgestellt, 11. Repräsentative Immunisierung und Serum Sammlung Zeitpläne für TI und TD Ig Studien sind in Abbildung 1dargestellt. Vertreter IgG1 und IgG2b ELISA-Ergebnisse sind in Abbildung 2 und Abbildung 3 zu veranschaulichen, wie ELISA funktioniert dargestellt. Dazu gehören die Platte Einrichtung der verdünnten Standards und Proben (Abb. 2A), ein Bild von der Platte nach der Zugabe des Substrates AP (Abbildung 2B), die lesen Sie Ergebnisse der OD405 (Abbildung 2C, 2D), die Werte der standard Verdünnungen (Abbildung 2E, 2F), Standardkurven (Bild 3A, 3 b), die Werte der verdünnten Proben (Abbildung 3C, 3D) und die Berechnung von Serum IgG1 und IgG2b Konzentrationen in den Proben (Abbildung 3E, 3F). Abbildung 4 zeigt repräsentative Ergebnisse der gesamten Ig-Klassen im Sera naive Mäuse. Wir zeigten statistisch erhöhten basalen Serumspiegel von IgG2a, IgG2b, IgG3, IgM und IgA in B-Zell-spezifische TRAF3- / - (B-TRAF3- / -) Mäusen im Vergleich zu Geschlecht und Alter-passende TRAF3 ausreichend stellt Kontroll-Mäusen (LMC). Diese Hyperglobulinemia von B-TRAF3- / - Mäusen verursacht durch die erweiterte B Zellkompartiment in den peripheren lymphatischen Organen aufgrund längerem Überleben der Reifen TRAF3- / - B Zellen9. Abbildung 5 zeigt die repräsentativen Ergebnisse von TI und TD Ig Isotype Antworten von Mäusen auf Immunisierung mit TNP-Polysaccharid und TNP-KLH, beziehungsweise. Diese Ergebnisse zeigten eine deutlich höhere TI TNP-spezifische IgG3 Ebene und auch erhöhten TD TNP-spezifische IgG2b Ebenen in myeloische zellspezifische TRAF3- / - (M-TRAF3- / -) Mäuse als im LMC. So erhöht TI IgG3 und TD IgG2b Antworten in M-TRAF3- / - Mäusen beobachtet werden wahrscheinlich durch erhöhte Produktion von Pro-inflammatorischen Zytokinen IL-6 und IL-12 TRAF3- / - Makrophagen und DCs nach Immunisierung11. Abbildung 6 zeigt die repräsentative Ergebnisse der primären TD und Speicher und Beantwortung von Mäusen TNP-KLH-Immunisierung. Diese Ergebnisse zeigen teilweise verminderte TD IgM primäre Reaktion und primäre defekte IgG1 und Speicher Reaktionen in T-Zell-spezifische TRAF3- / - (T-TRAF3- / -) Mäuse. Der primäre defekt TD und Speicher Antworten von T-TRAF3- / - Mäusen Ergebnis beeinträchtigt Aktivierung des TRAF3- / - CD4-T-Zellen bei der T-Zell-Rezeptor und CD28 Co Engagement10. Zusammen genommen, das Protokoll beschrieben in diesem Artikel erlaubt uns, die spezifischen Rollen von TRAF3 in verschiedenen Immunzellen Teilmengen bei der Regulierung von TI und TD Ig abzugrenzen Isotype Antworten bei Mäusen.

Figure 1
Abbildung 1 : Typische TI und TD Ag Immunisierung und Serum Sammlung Zeitpläne. (A) TNP-Polysaccharid experimentiert. (B) TNP-KLH experimentiert. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 2
Abbildung 2 : Vertreter IgG1 und IgG2b ELISA. (A) das 96-Well-Platte-Setup enthält die Brunnen leer, 7 serielle Verdünnungen (1:2) Maus IgG1 und IgG2b Standards (St01, St07) und 4 seriellen Verdünnungen (bei 01:10) 8 Maus Serum Proben (S1 bis S8). Die Konzentration des Standards ist nun am unteren Rand jeder Norm gegeben. Der Verdünnungsfaktor der Proben ist nun am unteren Rand jeder Probe gegeben. (B) ein Bild von der Platte in 5 Minuten nach der Zugabe des Substrates AP. Die Platte lesen Ergebnisse von IgG1 (C) und IgG2b (D) bei 405 nm. Die Werte der OD405 und die Konzentrationen der verschiedenen Verdünnungen der Maus IgG1 (E) und Maus IgG2b (F) Normen. Konz, Konzentration; BackCalcConc, wieder berechnet Konzentration; OD, optische Dichte; AvgOD, durchschnittliche OD von der Wiederholungen; SD, Standardabweichung; CV, Variationskoeffizient. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 3
Abbildung 3 : Vertreter IgG1 und IgG2b ELISA Datenanalyse. Die Standardkurven IgG1 (A) und IgG2b (B). Die Koeffizienten R2 ist > 0,98 in beiden Standardkurven. Pfeile zeigen den linearen Bereich der standard Kurven. Werte der OD405 und der Konzentrationen von IgG1 (C) und IgG2b (D) in unbekannten (verdünnte Serumproben). R, Bereich; Konz, Konzentration. Berechnung des Maus-Serum-Konzentrationen von IgG1 (E) und die Maus IgG2b (F) für die 8 Proben. ND, durch diese ELISA nicht nachweisbar. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 4
Abbildung 4 : Repräsentative Ergebnisse der gesamten Ig-Klassen im Sera naive Mäuse. Seren wurden gesammelt von Geschlecht abgestimmt, 10-12 Wochen alte naive LMC und B-TRAF3- / - Mäuse (n = 10 für jeden Genotyp; genetischen Hintergrund: 129xC57BL/6). Basalen Serumspiegel von insgesamt IgM, IgG1, IgG2a, IgG2b, IgG3, IgA und IgE wurden mittels ELISA bestimmt. Statistischer Signifikanz wurde mit dem ungepaarten t -Test für zwei-tailed Daten ermittelt. *, deutlich anders zwischen LMC und B-TRAF3- / - Mäusen (p < 0,05); **, LMC und B-TRAF3- / - Mäuse (p < 0,01) sehr deutlich unterscheiden. Diese Zahl wurde von Xie Et al.modifiziert. 9. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 5
Abbildung 5 : Repräsentative Ergebnisse der TI und TD Ig Isotype Reaktionen auf TNP-Polysaccharid und TNP-KLH Immunisierung bzw.. Geschlecht abgestimmt, 8-12 Wochen alt LMC und M-TRAF3- / - Mäuse (genetischen Hintergrund: C57BL/6) wurden mit 50 µg von TI Ag TNP-Polysaccharid geimpft (Abdeckung, n = 9 für jeden Genotyp) oder 100 µg des TD Ag TNP-KLH gemischt mit Alaun (Bodenplatte, n = 12 für jede Genotyp). Seren wurden am 7. Tag nach der Immunisierung gesammelt. Serum-Titer von Anti-TNP IgM, IgG1, IgG2b, IgG3, IgA und IgE wurden von ELISA analysiert. Statistischer Signifikanz wurde mit dem ungepaarten t -Test für zwei-tailed Daten analysiert. *, LMC und M-TRAF3- / - Mäuse (p < 0,05) signifikant unterschiedlich. Diese Zahl wurde von Lalani Et al.modifiziert. 11. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 6
Abbildung 6 : Repräsentative Ergebnisse der TD Primär- und Speicher Ig Reaktionen auf TNP-KLH Immunisierung. Geschlecht-abgestimmt, ca. 8-10 Wochen alt LMC und T-TRAF3- / - Mäuse (n = 10 für jeden Genotyp; genetischen Hintergrund: 129xC57BL/6) mit 100 µg von der TD Ag TNP-KLH gemischt mit Alaun am Tag 0 immunisiert wurden. Jede Maus erhielt auch eine Auffrischimpfung mit den selben Ag und adjuvante am 21. Tag nach der ersten Impfung. Serumproben wurden von Mäusen am Tag -7, 7, 14 und 28, gesammelt. TNP-spezifische IgM und IgG1-Konzentrationen in Serumproben wurden mittels ELISA gemessen. Grafiken zeigen die Ergebnisse von 10 Paaren von LMC und T-TRAF3- / - Mäusen (Mittelwert ± SD). Statistischer Signifikanz wurde mit dem ungepaarten t -Test für zwei-tailed Daten analysiert. *, deutlich anders zwischen LMC und T-TRAF3- / - Mäusen (p < 0,05); **, sehr unterschiedlich zwischen LMC und T-TRAF3- / - Mäusen (p < 0,01); , hoch signifikant unterschiedlich zwischen LMC und T-TRAF3- / - Mäuse (p < 0,001). Diese Zahl wurde von Xie Et al.modifiziert. 10. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

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Discussion

Hier beschreiben wir das Protokoll für die Charakterisierung von TD und TI Ig Isotype Reaktionen bei Mäusen mittels ELISA. Erfolgreiche Umsetzung dieses Protokolls erfordert die Verwendung von Materialien, die in Tabelle 1, einschließlich ELISA-Assay-Platten, Immunisierung Ags, Maus Ig Isotype-spezifische Antikörper und Normen angegeben. Darauf sollte geachtet werden, vermeiden die Verwendung von Gewebekultur behandelt Platten für ELISA. Verdünnungen der Standards und Serumproben sollten in separaten unbehandelten Platten (Rundboden) gemacht und dann in die ELISA-Platten hinzugefügt. Unter Verwendung dieses Protokolls, haben wir konsequent zuverlässige Ergebnisse mit hoher Spezifität und Sensitivität erreicht.

Wichtige Schritte in dieses Protokoll Gehören Ag Immunisierung, Retro-Orbital Blutungen und Ig Isotype-spezifischen ELISA. Für TD Ag Immunisierung sollte TNP-KLH/Alaun Mischung gründlich Nukleinsäuretablette werden, um sicherzustellen, dass korrekte Ag/adjuvante eingespritzt wird. Wenn Blut gerinnt im pipettieren oder Kapillarrohr während Retro-Orbital Blutungen, sofort zu einem neuen pipettieren oder Kapillare Schlauch ändern. Puffer und Reagenzien in ELISA sollte klare Lösungen und sollte nicht enthalten Ausscheidungen, die falsch-positive Ergebnisse mit abnormen OD-405 -Werte geben können. Darüber hinaus sollten Bläschen in den Vertiefungen an alle ELISA Schritte vermieden werden, die auch falsch positive oder falsch-negative Ergebnisse mit abnormen OD-405 -Werte geben kann. Diese gelegentliche Fehler können durch die Analyse von Proben in Duplikate minimiert werden. Waschschritte im ELISA entfernen die ungebundene Reagenzien und Antikörper aus dem Brunnen. Unzureichende Reinigung verursacht hohe Geräuschkulisse, aber übermäßiges waschen kann führen zu einer Abnahme der Empfindlichkeit durch Entfernen von beschichteten Antigene oder Antikörper29gebunden. Die Zahl der Waschzeiten in diesem ELISA Protokoll beschrieben werden optimiert, basierend auf unserer Erfahrung.

Es sei darauf hingewiesen, dass ELISA hat Nachweisgrenzen, die in der Regel durch den linearen Bereich der standard Kurven definiert sind. Um die Serumkonzentration von jedem Ig Isotype korrekt zu quantifizieren, müssen die Proben entsprechend verdünnt werden, um innerhalb des linearen Bereichs der standard Kurven passen. Wir empfehlen Verdünnungsreihen der Proben, wählen die entsprechende Verdünnungsfaktoren für die Berechnung der Ig Konzentration wie in diesem Protokoll beschrieben. Wenn die Ergebnisse zeigen, dass die Verdünnungsfaktoren getestet nicht im linearen Bereich der Standardkurve Ergebnissen, zusätzliche ELISA müssen jedoch mit Verdünnungsfaktoren angepasst die Ausgangsresultate ELISA durchgeführt werden. Wenn alle Verdünnungen getestet unter der unteren Nachweisgrenze, müssen original Serumproben und kleinere Verdünnungsfaktoren verwendet werden. Wenn OD-405 -Werte zeigen nicht proportional Abnahme mit zunehmender Verdünnungsfaktor für alle seriellen Verdünnungen getestet, dies bedeutet, dass die Erfassung Ab oder Beschichtung Ag durch alle verdünnten Proben gesättigt ist und weitere höhere Verdünnungsfaktoren verwendet werden müssen. Im Anschluss an dieses Protokoll erhalten aussagekräftige Ergebnisse mit höchstens 2 Runden von ELISA.

Faktoren, die bekanntermaßen Antikörperantworten bei Mäusen beeinflussen gehören die Belastung (genetische Hintergrund), Geschlecht, Alter, Ernährung und Tierhaltung Umwelt30,31,32,33,34 . Zum Beispiel obwohl viele Mausstämme IgG2a produzieren, bestimmte Stämme wie C57BL/6 Mäusen produzieren keine IgG2a aber stattdessen35,36IgG2c zu produzieren. Neuere Erkenntnisse identifiziert auch Kommensale Mikrobiota als ein Faktor für Antikörper Antworten37,38,39,40. Diese Faktoren berücksichtigt werden, empfehlen wir die Verwendung von Geschlecht abgestimmt, junge Erwachsene wurfgeschwistern der verschiedenen Genotypen, die die gleichen Eltern und Käfige für TD und TI Ag Immunisierung Experimente teilen. Darüber hinaus Maus, Maus-Variante ist häufig zu beobachten bei Mäusen des gleichen Genotyps (Abbildung 4–6), replizieren in ausreichender Zahl (in der Regel n > 8) von Mäusen sind erforderlich für jede Genotyp oder Gruppe statistisch zu erhalten aussagekräftige Ergebnisse.

Die Ig Isotype-spezifischen ELISA ist hilfreich bei der Bestimmung der Titer von verschiedenen Ig-Klassen. Jedoch diese Methode allein reicht nicht aus, um die tieferen Ursachen der beobachteten Unterschiede in Ig Isotype Titer zu offenbaren, und wird daher oft in Kombination mit einer Vielzahl von komplementären Ansätzen verwendet. Um zu unterscheiden, ob der Unterschied in der Ig Isotype Titer durch unterschiedliche Anzahl von Ig-produzierenden B-Zellen oder unterschiedliche Effizienz der B-Zellen bei der Ig-Produktion verursacht wird, fließen Cytometry41,42,43 und Enzym-Linked ImmunoSpot (ELISPOT)43,44,45 kann verwendet werden. B-Zellen überleben, Verbreitung und germinal Center Bildung zu analysieren, sind alternative Methoden Durchflusszytometrie, in-vitro- Kultur von Milz B-Zellen und immunhistochemische Färbung gefolgt von Mikroskopie9,26 ,41,46,47. RT-PCR der Keimbahn Abschriften der Ig schwere Kette Gen-Abschnitte häufig sind verwendet um die Veränderungen der Ig Isotype Wechsel in B-Zellen in Vitro Kultur der Milz B-Zellen und quantitative Antworten zu erhellen41,43 ,48,49. Um die Ursache für Unterschiede in der Affinität Reifung zu untersuchen, wird durch Sequenzierung der VDJ Region50,51,52somatische Hypermutation (SHM) des Gens Ig schwere Kette bestimmt. Um zu verstehen, Unterschiede in der Gedächtnis-B-Zell-Antworten, die Frequenz und Anzahl der verschiedenen Speicher B Zelle Teilmengen nach Ag Immunisierung durch Strömung analysiert werden kann identifiziert zytometrie vor kurzem mit Markierungen der Maus Gedächtnis B Zellen, einschließlich CD38, CD80, CD73, PD-L2, CD62L und CCR68,53,54,55. Zusammen, ermöglicht diese komplementäre Methoden in Kombination mit dem aktuellen Protokoll Forscher, ein umfassendes Verständnis der Antikörperantworten in einer bestimmten experimentellen Einstellung zu gewinnen.

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Disclosures

Die Autoren haben keinen finanziellen Interessenkonflikt.

Acknowledgments

Diese Studie wurde unterstützt von den National Institutes of Health Zuschüsse R01 CA158402 (P. xxx) und R21 AI128264 (P. Xie), dem Department of Defense gewähren W81XWH-13-1-0242 (s. Xie), ein Pilot Award vom Cancer Institute of New Jersey durch Grant Nummer P30CA072720 vom National Cancer Institute (s. xxx), ein Busch biomedizinische Grant (s. xxx), Victor Stollar Stipendiat (A. Lalani) und Anne B. und James B. Leathem Fellowship (S. Zhu).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
VersaMax Tunable Microplate Reader MDS Analytical Technologies VERSAMAX Equipment to read the plates
SOFTmax PRO 5.3 MDS Analytical Technologies SOFTmax PRO 5.3 Software for the plate reader
GraphPad Prism GraphPad Prism Software for graphing and statistics
TNP-AECM-polysaccharide (FICOLL) Biosearch Technologies F-1300-10 A TI Ag for immunization
TNP-KLH Biosearch Technologies T-5060-5 A TD Ag for immunization
TNP(38)-BSA Biosearch Technologies T-5050-10 (conjugation ratio: 38) Coating Ag for TNP-specific ELISA
TNP(3)-BSA Biosearch Technologies T-5050-10 (conjugation ratio: 3) Coating Ag for high affinity TNP-specific Ig
Imject Alum Fisher Scientific  PI-77161 Alum adjuvant for immunization
Falcon Polypropylene tubes Fisher Scientific  14-959-11A For incubation of TNP-KLH/alum
BD Insulin Syringe Fisher Scientific  14-829-1B For i.p. injection of mice
Immuno 96-Well Plates, Flat-Bottom Fisher Scientific  14-245-61 For ELISA
Untreated 96-Well Microplates, Round-Bottom VWR 82050-622 For serial dilutions of standards and samples
Phosphatase substrate, 5 mg Tablets Sigma S0942-200TAB AP substrate
Diethanolamine VWR IC15251690 A component of AP substrate buffer
Goat anti-mouse IgM SouthernBiotech 1020-01 Capture Ab for mouse IgM
Goat anti-mouse IgG1 SouthernBiotech 1070-01 Capture Ab for mouse IgG1
Goat anti-mouse IgG2a SouthernBiotech 1080-01 Capture Ab for mouse IgG2a
Goat anti-mouse IgG2b SouthernBiotech 1090-01 Capture Ab for mouse IgG2b
Goat anti-mouse IgG3 SouthernBiotech 1100-01 Capture Ab for mouse IgG3
Goat anti-mouse IgA SouthernBiotech 1040-01 Capture Ab for mouse IgA
Goat anti-mouse IgE SouthernBiotech 1110-01 Capture Ab for mouse IgE
AP-Goat anti-mouse IgM SouthernBiotech 1020-04 Detection Ab for mouse IgM
AP-Goat anti-mouse IgG1 SouthernBiotech 1070-04 Detection Ab for mouse IgG1
AP-Goat anti-mouse IgG2a SouthernBiotech 1080-04 Detection Ab for mouse IgG2a
AP-Goat anti-mouse IgG2b SouthernBiotech 1090-04 Detection Ab for mouse IgG2b
AP-Goat anti-mouse IgG3 SouthernBiotech 1100-04 Detection Ab for mouse IgG3
AP-Goat anti-mouse IgA SouthernBiotech 1040-04 Detection Ab for mouse IgA
AP-Goat anti-mouse IgE SouthernBiotech 1110-04 Detection Ab for mouse IgE
Mouse IgM standard BD Biosciences 553472 TNP-specific IgM, Clone  G155-228
Mouse IgG1 standard BD Biosciences 554054 TNP-specific IgG1, Clone  107.3
Mouse IgG2a standard BD Biosciences 556651 TNP-specific IgG2a, Clone  G155-178
Mouse IgG2b standard BD Biosciences 554055 TNP-specific IgG2b, Clone  49.2
Mouse IgG3 standard BD Biosciences 553486 KLH-specific IgG3, Clone  A112-3
Mouse IgA standard BD Biosciences 550924 Mineral oil-induced IgA, Clone  MOPC-320
Mouse IgE standard BD Biosciences 557079 TNP-specific IgE, Clone  C38-2

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Immunglobulin (Ig) Ig Isotype Speicher Antwort Immunisierung Immunologie und Infektion Ausgabe 139 Thymus-abhängig (TD) Antigen Thymus-unabhängige (TI) Antigen adjuvante Enzym-linked Immunosorbentprobe Assay (ELISA)
Charakterisierung der Thymus-abhängig und Thymus-unabhängige Immunglobulin Isotype Antworten bei Mäusen mit Enzym-linked Immunosorbentprobe Assay
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Lalani, A. I., Zhu, S., Xie, P. Characterization of Thymus-dependent and Thymus-independent Immunoglobulin Isotype Responses in Mice Using Enzyme-linked Immunosorbent Assay. J. Vis. Exp. (139), e57843, doi:10.3791/57843 (2018).

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