Summary
כאן, אנו מציגים פרוטוקול כדי למדוד את התקפה אלימה של חיידקים פלנקטוניים או צמוד-השטח באמצעות discoideum ד (אמבה) כמחשב מארח. התקפה אלימה נמדד על פני תקופה של 1 h, המארח הורג הוא לכמת באמצעות מיקרוסקופ פלורסצנטיות וניתוח התמונה. נדגים את פרוטוקול זה באמצעות החיידק aeruginosa פ.
Abstract
מבחני התקפה אלימה חיידקי מסורתי לערב חשיפה ממושכת של חיידקים במשך מספר שעות, התאים המארחים. במהלך תקופה זו, חיידקים יכולים לעבור השינויים בפיזיולוגיה עקב החשיפה לסביבת הגידול מארח ואת נוכחותם של התאים מארח. פיתחנו assay למדוד במהירות את מצב התקפה אלימה של חיידקים כי למזער את מידת שאליו הבקטריה גדלה בנוכחות התאים המארחים. חיידקים, amoebae מעורבבים יחד, ותשמרו על מטוס יחיד הדמיה באמצעות רכיב pad אגר. ההליך משתמש פלורסצנטיות בתא יחיד הדמיה עם אסתר calcein-acetoxymethyl (calcein-AM) כמחוון של בריאות התא המארח. ידי קרינה פלואורסצנטית של התאים המארחים ניתוח לאחר h 1 של חשיפה של התאים המארחים חיידקים באמצעות מיקרוסקופ epifluorescence. התמונה ניתוח תוכנה משמשת לחישוב בעל אינדקס הרג המארח. בשיטה זו נעשה שימוש כדי למדוד התקפה אלימה בתוך פלנקטוניים ומחוברת משטח Pseudomonas aeruginosa תת אוכלוסיות במשך השלב ההתחלתי של ביופילמים, שעשוי להיות מותאם חיידקים אחרים ושלבים אחרים biofilm הצמיחה. פרוטוקול זה מספק שיטה מהיר וחזק של מדידת התקפה אלימה, מונע רבים של המורכבויות המשויכות את הצמיחה ואת התחזוקה של שורות תאים בתרבית. התקפה אלימה פנוטיפים נמדד כאן באמצעות amoebae יש גם מאומתים באמצעות העכבר מקרופאגים. בפרט, זה וזמינותו שימש להקים את התקפה אלימה upregulates מצורף משטח aeruginosa פ.
Introduction
זיהום חיידקי הוא אחד הגורמים המובילים התמותה האדם וחיות1,2. היכולת למדוד התקפה אלימה של חיידקים תרבויות או biofilms חשוב הגדרות בריאות ומחקר. כאן, אנו מתארים שיטה רב תכליתי, מהירה, פשוטה יחסית לכמת התקפה אלימה חיידקי. האורגניזם האיקריוטים Dictyostelium discoideum (אמבה) משמש האורגניזם המארח מודל. ד discoideum שימש כמארח כדי לזהות גורמים התקפה אלימה Pseudomonas aeruginosa (aeruginosa פ)3,4,5 ו אחרים חיידקים6,7 ,8 , היא חשופה בעיקר אותם התקפה אלימה גורמים להרוג תאים בתרבית של כולל סוג III הפרשת9,10. מבחני התקפה אלימה הקודם באמצעות discoideum ד מעורב חשיפה ממושכת של חיידקים עם תאים discoideum ד במהלך שעות3,4,5. הפרוטוקול, כאן, מציג שיטה מהירה של קביעת התקפה אלימה באמצעות זה אמבה. פרוטוקול זה (איור 1) מתאר כיצד: (1) לגדל את amoebae axenically (בהיעדרו של חיידקים), (2) לגדול חיידקים על וזמינותו, (3) להכין חיידקים, התאים המארחים עבור מיקרוסקופ, (4) לבצע epifluorescence מיקרוסקופ, ולנתח (5) אמבה קרינה פלואורסצנטית.
Amoebae בתחילה קווצות שער החוצה מן המלאי קפוא, גדל על מדשאה של Escherichia coli (e. coli), שבו amoebae מייצרים נבגים. הנבגים האלו הם הרים, מחוסן לתוך בינוני מועשר לצמיחה axenic. Amoebae מתוחזקים באמצעות צמיחה axenic בתנאים עשירות עד שהם יהיו מוכנים להיות מעורב עם חיידקים להערכה של התקפה אלימה חיידקי. ההישרדות או מותו של amoebae זה לכמת על ידי מדידה של זריחה של calcein-acetoxymethyl (calcein-AM), אשר הוא ביקע מאת תאיים esterases, ובכך, מופעל על ידי קרינה פלואורסצנטית11,12. Amoebae חיה להפגין מעט או ללא קרינה פלואורסצנטית ואילו הדגיש, תאים הגוסס לזרוח באופן אינטנסיבי. תוצאה זו נובעת תיאגוד מעט או ללא calcein-אם amoebae בריאה, התאגדות, המחשוף של המצע לחוץ amoebae13. התנהגות זו היא בעיקר נבדלת זריחה calcein-אם תאים בתרבית של11,14,15,16.
חיידקים ייבחנו על התקפה אלימה גדלים בנפרד. כאן, אנו נתאר כיצד למדוד את התקפה אלימה של המחלה הזדמנותית aeruginosa פ וכן פירוט איך לכמת את התקפה אלימה של יצורי (שחייה), צמוד-פני אוכלוסיות משנה. פרוטוקול זה עשוי להיות מותאם כדי לבדוק את התקפה אלימה של חיידקים אחרים. במקטע תוצאות נציג, אנו מראים כי התקפה אלימה מופעלת בצמוד-משטח תאים והוא נמוך פלנקטוניים תאים, אשר דווחה בעבר13. מופעל התקפה אלימה צמוד-משטח aeruginosa פ הורג amoebae ואילו-מידבק תאים פלנקטוניים שנצרכים על ידי amoebae. אם אך ורק הוא להיות לבדיקה של התקפה אלימה של יצורי חיידקים, חיידקים יכולים להיות בתרבית צינורות רגילים תרבות יותר מאשר באמצעות צלחות פטרי כמפורט בפרוטוקול.
הצמיחה של amoebae ותרבויות aeruginosa פ חייבים להיות מתואמים כך aeruginosa פ תרבויות להגיע שלב הצמיחה המיועד ואילו amoebae גדלים על מצב יציב בתנאים עשירות. מצב זה מחייב בדרך כלל amoebae תרבויות אלקליניים לפחות יום אחד לפני כאשר הם מעורבבים עם חיידקים. Amoebae וחיידקים הם מתאושש באמצעות רפידות אגר, שיתוף incubated לשעה, עם תמונה ברזולוציה נמוכה (10 X, מפתח נומרי 0.3) חלבון פלורסצנטיות אובייקטיבי, ירוק (GFP) מסננים באמצעות מצלמה הדמיה. הניתוח יכול להתבצע באמצעות תוכנת ImageJ זמינה בחופשיות או אישית התמונה ניתוח תוכנה. הניתוח שלנו בוצעה באמצעות התוכנה שלנו שנכתבו באמצעות חבילת13ניתוח מדעי. התוכנה צריכה ליצור מסיכה באמצעות שלב חדות התמונה, לחלץ ערכים זריחה האזורים עם מסיכה בתמונה זריחה. קרינה פלואורסצנטית ערכים הם בממוצע לפחות מאה תאים, וכתוצאה מכך אינדקס הרג מארח מספריים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
כל ההליכים ניסיוני בוצעו ב אוניברסיטת קליפורניה, אירווין.
1. מאגרי ופתרונות
- להכין מרק Lysogeny (LB) בבקבוק זכוכית 1 ליטר על-ידי הוספת 25 גרם מיקס LB-מילר 1 ליטר של מים מזוקק פעמיים (ddH2O). צלחות פטרי, הוסיפו של 20 גרם נוספים של אגר. אוטוקלב לחטא. יוצקים 25 מ של אגר מותכת בינוני 10 ס מ קוטר פטרי ולאפשר שבמהלכו בטמפרטורת החדר. לאחסן מדיה נוזלי בטמפרטורת החדר, פלטות אגר ב 4 º C.
- הכנת לוחות Peptone שמרים גלוקוז (באסה) בבקבוק זכוכית 1 ליטר על ידי ערבוב 1g של D-גלוקוז, 2 גר' peptone, 0.25 g של שמרים לחלץ, 4.2 גר'2פו ח'4, g 5.1 של נה2HPO47 שעות2O ו- 25 גרם אגר ב- 1 ליטר של ddH2 או אוטוקלב לחטא. שופכים 25 מ של אגר מותכת לתוך צלחות פטרי בקוטר ס מ 10 ולאפשר שבמהלכו בטמפרטורת החדר. חנות ב 4 º C.
- הכנת Peptone S (PS) בינוני בבקבוק זכוכית 1 ליטר על ידי ערבוב 10 גרם של peptone, 7 גר' שמרים לחלץ, 15 גרם של D-גלוקוז, 0.12 גר' נה2HPO47 שעות2O, 1.4 גר'2פו ח'4, 40 µg של ויטמין B12 , ו- 80 µg חומצה פולית 800 מיליליטר ddH2O. לכייל מד pH אלקטרוני באמצעות pH 4 ותקנים pH 7 אם לא נעשה שימוש מד pH תוך יום.
- למדוד את רמת החומציות של המדיום PS באמצעות מד pH. להוסיף 5 מ' קו או 5 מ' H3פו4 כדי להתאים את ה-pH ל 6.5. לכוון את עוצמת הקול הסופי כדי 1 ליטר באמצעות ddH2O. מסנן לחטא באמצעות מסנן ואקום מיקרומטר 0.22 ולאחסן ב 4 º C.
הערה: להמשיך בזהירות ההתאמות pH מאת ללבוש ציוד מגן כולל כפפות, ביגוד מגן, הגנה העין, ופונים הגנה.
- למדוד את רמת החומציות של המדיום PS באמצעות מד pH. להוסיף 5 מ' קו או 5 מ' H3פו4 כדי להתאים את ה-pH ל 6.5. לכוון את עוצמת הקול הסופי כדי 1 ליטר באמצעות ddH2O. מסנן לחטא באמצעות מסנן ואקום מיקרומטר 0.22 ולאחסן ב 4 º C.
- הכינו 10 x פיתוח מאגר ראשוני (DB') מאגר בבקבוק זכוכית 1 ליטר על-ידי הוספת 3.4 גרם2פו ח'4, 13.4 גר' נה2HPO4 7 שעות2O ו- ddH2O הנפח הכולל של 800 מ ל. לכייל מד pH אלקטרוני באמצעות pH 4 ותקנים pH 7 אם לא נעשה שימוש מד pH תוך יום.
- למדוד את רמת החומציות של המאגר באמצעות מד pH אלקטרוני. להתאים את ה-pH ל 6.5 על-ידי הוספת בעדינות 5 מ' קו או 5 מ' H3פו4 לפי הצורך. לכוון את עוצמת הקול הסופי כדי 1 ליטר באמצעות ddH2O ולחטא על-ידי autoclaving. לאחסן בטמפרטורת החדר.
הערה: להמשיך בזהירות ההתאמות pH מאת ללבוש ציוד מגן כולל כפפות, ביגוד מגן, הגנה העין, ופונים הגנה.
- למדוד את רמת החומציות של המאגר באמצעות מד pH אלקטרוני. להתאים את ה-pH ל 6.5 על-ידי הוספת בעדינות 5 מ' קו או 5 מ' H3פו4 לפי הצורך. לכוון את עוצמת הקול הסופי כדי 1 ליטר באמצעות ddH2O ולחטא על-ידי autoclaving. לאחסן בטמפרטורת החדר.
- להפוך 1 x פיתוח מאגר (DB) על-ידי ערבוב 100 מ של 10 x DB' מאגר עם 1 מ"ל של עיקור MgCl 2 מ'2, 1 מ"ל של עיקור CaCl 1 מ'2. לכוון את עוצמת הקול הסופי כדי 1 ליטר בתוך בקבוק זכוכית 1 ליטר באמצעות ddH סטיריליים בלוק של2O. חנות בטמפרטורת החדר.
- הכנת PS:DB בינוני בבקבוק זכוכית 1 ליטר על ידי ערבוב 100 מ של מדיום PS מעוקר, 100 מ של עיקור 10 x DB' מאגר, ו- ddH סטיריליים2O כדי הנפח הכולל של 1 ל' השלמה עם 1 מ"ל של עיקור 2 מ' MgCl2 ו 1 מ"ל של עיקור מ' 1 CaCl 2-חנות ב 4 º C.
- להכין את הפתרון מניות calcein-אם על-ידי הוספת µL 50 של דימתיל סולפוקסיד 50 µg של calcein-אם במכל פלסטיק המסופקים על ידי היצרן. חנות ב-20 ° C.
2. צמיחה ותחזוקה של Amoebae
- לגדל זן e. coli B/r17 כמקור מזון עבור amoebae במהלך תקופת הגידול הראשוני. רצף של e. coli B/r של מניה קפוא המאוחסנים ב-80 מעלות צלזיוס על גבי צלחת אגר ליברות, דגירה ב 37 מעלות צלזיוס למשך הלילה כדי להשיג אחת המושבות.
- לחסן מושבה בודדת של e. coli B/r לתוך 2 מ ל LB בינוני, דגירה תוף רולר או מטרף ב 37 מעלות צלזיוס למשך הלילה.
- להביא e. coli תרבות הלילה טמפרטורת החדר. באמצעות מקל עץ, לחסן amoebae של מניה קפוא שמרו ב-80 מעלות צלזיוס לתוך µL 750 של התרבות בין לילה.
הערה: שימוש discoideum ד זן AX3, בעל יכולת של צמיחה axenic18. שלב זה אינו מחייב צמיחה axenic, אבל והשלבים יהיה הדרישה שלו. - מיד להוסיף 700 µL של amoebae -e. coli התערובת לצלחת Peptone שמרים גלוקוז (ג'יפ). להפיץ את התרבות באופן שווה על פני השטח של הצלחת בהטיית גב וושוב גם הוא צד אל צד כנדרש. הימנע משימוש מפזר.
- מקם את הצלחת ללמוד עם אגר פונה כלפי מעלה בתוך קופסה השומר על לחות גבוהה. שימוש שני מיכלי פלסטיק חד פעמיות (183 ס"מ על 183 ס"מ x 91 ס מ) נערמו בראש אחד את השני. למלא את המיכל התחתון כ 25 מ ל מים ומניחים את המיכל העליון עם כמה פתחים 0.5 ס מ קוטר קדח דרך הריצוף של המיכל כדי לאפשר לחות להעביר המים הקרים המיכל העליון.
- תקופת דגירה של ג'יפ צלחת ותיבת ב 22 ° C של 4-5 ימים עד אמבה נבגים הם נצפו גדל קרוב לפני השטח של הצלחת (איור 2). השתמש חממה בקירור כדי דגירה צלחות ולא הדגירה בטמפרטורת החדר.
הערה: לאחר נבגים גדלו, הם נשארים קיימא על צלחות למשך מספר שבועות כאשר הוא מאוחסן ב 4 º C. חנות את הלוחיות עם אגר צד פונה כלפי מעלה. לאחר 3-4 ימי דגירה, אזורי, אגף בתוך הדשא חיידקי יכול להיות שנצפו, מעידות על תחילת הנבגה אמבה.- שימו לב amoebae קטן נבגים מעל פני השטח צלחת אחרי 4-5 ימי דגירה (איור 2).
הערה: לא גדלים על amoebae במשך יותר משבוע, ככל שאיכות הנבגים הקטנת מעבר פרק זמן זה.
- שימו לב amoebae קטן נבגים מעל פני השטח צלחת אחרי 4-5 ימי דגירה (איור 2).
- איסוף amoebae נבגים כדי להתכונן הגידול axenic של amoebae מאד טיפ פיפטה עקר 1 מ"ל מקביל פני השטח של הצלחת. לאסוף חצי של 10 ס מ פטרי נבגים.
הערה: להימנע מלגעת בקצה השטח של צלחת אגר תנועה זו לאסוף מספר רב של e. coli. - Resuspend את amoebae על קצה פיפטה על ידי הטבעית הטיפ לתוך 1 מ"ל של PS בינוני בעדינות pipetting למעלה ולמטה.
- להעביר את התערובת חוסנו לתוך בקבוקון 250-mL המכיל 25 מ של המדיום PS בתוספת הפתרון אנטיביוטיקה-antimycotic-0.25 x ריכוז.
הערה: אחסן את הפתרון אנטיביוטיקה-antimycotic כמו aliquots µL 250 ב-20 ° C. הימנע מחזורים חוזרים ונשנים של מפשיר, הקפאה של פתרון זה כמו זו עלולה להפחית את יעילותה. - לגדול amoebae axenically ב 22 ° C ב שייקר מסתובב ב 100 סל"ד. עבור וזמינותו התקפה אלימה בשלב 5, מגדלים תאים צפיפות אופטית הנמדד על 600 nm (OD600) של 0.2 עד 0.5.
הערה: שלב זה דורש 3-4 ימים של גידול מימי חיסון (שלב 2.7). אם התאים גדלו צפיפות גבוהה יותר, לדלל את התרבות בחזרה ב- PS בינוניים יתר600 של 0.05 או נמוך, לגדול חזרה יתר600 של 0.2-0.5.
3. צמיחת aeruginosa פ
- לבחור מושבה בודדת של aeruginosa פ מ צלחת LB לחסן אותו לתוך 2 מ ל PS:DB תרבות, לגדול בין לילה ב 37 ° C כדי רוויה.
הערה: לא להוסיף את הפתרון אנטיביוטיקה-antimycotic לתקשורת PS:DB. - לדלל את בטחונות תרבות לילה או 1:1,000 לתוך צלחת פטרי בקוטר 6 ס מ באמצעות PS:DB. אם אך ורק הוא להיות לבדיקה של התקפה אלימה של תאים פלנקטוניים, לגדול תרבויות באמצעות צינורות תרבות המקובלת במקום. נתנער התרבות rotator benchtop שוכן בגובה 100 סל"ד ב 37 º C.
- קציר תרבויות בנקודות זמן מסוים כדי להבטיח הפארמצבטית. ב- 30 דקות עד h 1 לפני הערכת התקפה אלימה, להכין את רכיב pad אגר כמתואר בסעיף 4.
הערה: התקפה אלימה ב פ aeruginosa הנגרמת על ידי כ 8 שעות של צמיחה על משטחים. - כדי לבודד את תאי השטח-attached, להסיר את המדיום הנוזלי הפטרי לשטוף מיד עם 1 מ ל DB המאגר כדי להסיר תאים פלנקטוניים, פנה/י מיד לשלב 5.1.
התראה: אנחנו לא שוטפים יותר מ 30 s כמו זה perturb, ניתוק צמוד-משטח תאים, עשוי להשפיע על המדידה התקפה אלימה. - בידוד תאי פלנקטוניים, להעביר 10 µL של התרבות צלחת פטרי צלחת פטרי נקי, פנה/י מיד לשלב 5.1.
4. מיקרוסקופ - הכנת משטח אגר
- להכין רפידות אגר בערך 30 דקות ל- 1 h לפני amoebae מוכנים להיות מעורב עם aeruginosa פ.
- מיקרוגל 50 מ של 1% (w/v) אגר במאגר DB בבקבוקון 250 מ. לערבב כל 20 s עד גושים של אגר נעלמים.
- מגניב של אגר מותכת על-ידי הצבתו באמבט מים טרופה 55 ° צלזיוס למשך 15 דקות.
- להוסיף µL 15 של הפתרון מניות calcein-אם-15 מיליליטר אגר מותכת צינור חרוטי. לערבב על-ידי היפוך בעדינות את הצינור 4 - 5 פעמים, פנה/י מיד לשלב הבא.
הערה: לבצע שלב זה בשפופרת צנטרפוגה פוליפרופילן 15 מ"ל. אל תשתמש/י מיכל זכוכית עבה כמו זה יגרום את אגר שבמהלכו מהר מדי. - שופכים את התערובת אגר מותכת על גבי צלחת זכוכית 12 ס"מ x 10 ס"מ ולאפשר את אגר שבמהלכו במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר. לחתוך משטח אגר הקרושה למקטעים קטנים יותר של 1.5 ס מ x 1.5 ס מ על ידי הצבת לוח הזכוכית על רשת מודפסת חיתוך לאורך הרשת בעזרת סרגל מתכת.
- שמור את הג'ל להתייבש בתוך קופסה לחים עד שזה מוכן לשימוש.
5. מיקרוסקופ - הכנת המדגם חיידקים-אמבה עבור הדמיה
- כדי assay של התקפה אלימה של צמוד-משטח תאים חיידקיים, להוסיף 10 µL של תאים אמבה מהשלב 2.10 צמוד-השטח חיידקים מהשלב 3.4.
הערה: שלב זה מתאר את ערבוב של amoebae עם חיידקים. - כדי assay של התקפה אלימה של תאים פלנקטוניים, מערבבים µL 10 תאים אמבה מהשלב 2.10 עם 10 µL של חיידקים פלנקטוניים מהשלב 3.5.
הערה: לא רחץ את התאים אמבה תוצרת axenically (-יתר600 של 0.2 עד 0.5) לפני ערבוב עם החיידקים. אין התפתחות החיידק יתקיימו בתרבות אמבה עקב השימוש של הפתרון אנטיביוטיקה-antimycotic. - מיד במקום משטח אגר calcein-אם 1.5 ס מ x 1.5 ס מ שלב 4.5 מעל תערובת חיידקים-אמבה על פני צלחת פטרי.
הערה: מקום משטח אגר מעל התערובת באמצעות תנועה חלקה מהירה. אל תסירו משטח לאט לתוך התערובת כמו תנועה זו נוטה לקדם תאים לעבר הפריפריה, מן החלק התחתון של משטח. שלב זה יבטיח כי חיידקים, amoebae הם אחיד מעורב, ללא יכולת תנועה וסלולרי כי שני סוגי מוגבלים על אותו מישור. - להסיר עודפי נוזלים על-ידי pipetting בעדינות את כל הנוזל הנותר סביב משטח אגר. לאפשר הפטרי לייבוש למשך 20 דקות בטמפרטורת החדר.
- מכסה עם הפטרי עם מכסה, דגירה התערובת אמבה קיבוע-חיידקים בטמפרטורת החדר במשך נוספים 40 דקות להמשיך לשלב 6.1.
הערה: חשוב דגירה כל דוגמאות עבור אותה כמות של זמן, כמו עליות פלורסצנטיות רקע לאורך זמן. זמן הדגירה של 1 h מומלץ. Incubations יותר מ 1 h הם פחות לשחזור כפי amoebae תאים עשויים להתחיל פרץ.
6. מיקרוסקופ - ייבוא תמונות
- Amoebae תמונה באמצעות מיקרוסקופ פלורסצנטיות מסוגל לרכוש תמונות זריחה brightfield וירוק. עבור ירוק פלורסצנטיות, השתמש במסננים חלבון (GFP) זריחה ירוק עם 474/27 nm ו 525/45 ננומטר עירור, פליטה, בהתאמה. השתמש מטרה (≥0.3 מפתח נומרי) X 10 כדי amoebae את התמונה.
הערה: calcein-AM באגר תגרום amoebae גוסס על ידי קרינה פלואורסצנטית בערוץ פלורסצנטיות ירוק. Amoebae בריא אינם אחרת פלורסנט. - להתאים את רכישת פעמים לניגודיות שלב, ערוצי ה-GFP כדי להגביל את phototoxicity, ולמטב את הטווח הדינמי של התמונה עוצמות. החלף את הניגוד שלב ניגודיות (DIC) התערבות דיפרנציאלית במידת הצורך.
הערה: השתמש חשיפות 100-200 ms עבור שלב חדות, זריחה GFP במידת האפשר. שמור את הגדרות החשיפה, מכשיר ללא שינוי לאורך כל הניסוי כולו. . זה קריטי עבור מחשוב מדד הרג המארח. - לרכוש תמונות עבור תאים אמבה לפחות 100 על מנת לקבל נתונים סטטיסטיים טוב לחישוב המארח הרג אינדקס.
7. תמונה ניתוח ואינדקס הרג מארח
- לבצע ניתוח התמונה באמצעות ImageJ.
- לפתוח את קובץ התמונה של ניגודיות שלב ב ImageJ על ידי לחיצה על קובץ | פתוח ובחירת התמונה. התאם את הסף על ידי לחיצה על תמונה | ניתוח | סף. התאם את הסף העליון והתחתון כדי לבחור רק את עוצמת שיא (איור 3א).
- המירו את התמונה לערך בינארי על ידי לחיצה תהליך | בינארית | להפוך בינארי. למלא חורים על-ידי בחירה תהליך | בינארית | למלא חורים.
הערה: שימוש בדמותו באיור 1 כמקור, צעדים 7.1-7.2 יפיק תמונה שבה amoebae וחיידקים צמוד-משטח מופיעים אזורים כהים (איור 3ב'). - להבטיח כי תיבות אזור ו מתכוון וערך אפור מוכנסים נתח | לקבוע מידות. למדוד את גודל משוער amoebae על-ידי בחירת הכלי אליפסה בסרגל הכלים הראשי. לחץ על ניתוח | מדד ושים לב האזור של נציג amoebae.
- ליצור מסכות amoebae על ידי לחיצה נתח | לנתח חלקיקים. בתיבה גודל, הזן את האזור כוללים את amoebae אבל לא לכלול את החיידקים. בחר מסכות בשורת התפריט הנפתח של הצג את האפשרות. ודא כי התיבה להוסיף מנהל מסומנת.
- לחץ על OK תמונה המציגה רק את amoebae ואת מנהל רועי הדו-שיח תופיע (איור 3ג').
- פתחו את התמונה פלורסצנטיות באמצעות קובץ | פתוח ובחירה את הקובץ המתאים. בחר את כל האזורים של רועי מנהל על-ידי החזקת מקש shift לחוץ ולאחר לחיצה על כל אזור ברשימה (איור 3ד').
- לחץ על לחצן למדוד רועי מנהל. פעולה זו תפתח חלון תוצאות הצגת בערך כלומר העוצמה של כל אמבה.
- להעתיק את הערכים פלורסצנטיות עבור כל אמבה לתוכנית של גליון נתונים ולחשב המארח הורג אינדקס על ידי לקיחת הממוצע של כל הערכים זריחה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
גדלנו פראי-סוג aeruginosa פ זן PA1419 או ΔlasR זן20 ברקע PA14 אותו ב- 6 ס מ קוטר פטרי, לבדיקה של התקפה אלימה של תאים פלנקטוניים וצמוד-פני השטח. תרבויות חוסנו של יחיד-המושבות לתוך תרבויות PS:DB, גדל בין לילה תרבות צינורות תוף רולר ב 37 ° C כדי הרוויה, מדולל מטריים PS:DB, בוגר עבור 8 שעות ב- 6 צלחות פטרי בקוטר ס מ, רועדת-100 סל"ד, ואת פלנקטוניים צמוד-השטח פ aeruginosa תת אוכלוסיות היו מבודדים כמתואר בסעיף 3.
צמוד-משטח פראי-סוג aeruginosa פ נהרג amoebae, אשר צוינה על-ידי צורת תא אמבה עגול התבוננות calcein קרינה פלואורסצנטית (איור 4א, החלונית השמאלית העליונה). כתוצאה מכך מאינדקס הרג מארח גבוהה (איור 4B). תאים פלנקטוניים נאכלו על-ידי amoebae, אשר צוינה על-ידי צורות תא אמבה אמורפי של התבוננות מעט או ללא calcein זריחה מעל הרקע (איור 4א, החלונית הימנית העליונה). כתוצאה מכך מאינדקס הרג מארח נמוכה יחסית (איור 4B). צמוד-השטח והן תאים פלנקטוניים של המתחlasR Δ נאכלו על-ידי amoebae, אשר צוינה על-ידי מארח נמוך הורג אינדקסים (איור 4B, החלונית התחתונה). התוצאות ובכך להציג התקפה אלימה נמצא upregulated באוכלוסיות צמוד-משטח LasR נדרש עבור התקפה אלימה לפעיל על-פני השטח אשר תוארה בעבר13. ניסויים אלה ובכך ליצור פקדים חיוביים ושליליים חזקים לניסויים עתידיים.
איור 1 : מפרטים טכניים המתארים סקירה כללית של וזמינותו התקפה אלימה. (1) התאים המארחים אמבה הם מגדלים, תרביות חיידקים (2) בוגר, (3) פלנקטוניים או צמוד-משטח תאים חיידקיים מעורבב עם amoebae, ותשמרו על אותו מישור הדמיה באמצעות רכיב pad אגר. התאים המארחים הם לכמת לבריאות באמצעות calcein-אם, מיקרוסקופיה פלורסצנטיות, וניתוח התמונה. סולם העמודות מייצגות 50 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 2 : אמבה נבגים על ג'יפ 10 ס מקוטר צלחת פטרי לאחר 5 ימים של צמיחה. טופס נבגים מעל פני השטח פטרי. שיבוץ מראה תצוגה מוגדלת של מקטע אחד של המשטח מאכל. המשטח עשוי להכיל חיידקים אשר לא ניתן להבחין ברזולוציה זו. סולם ברים בתמונות הראשי, כניסה מייצגים 1 ס מ ו- 2 מ"מ, בהתאמה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 3 : ניתוח של מיקרוסקופיית נתונים באמצעות ImageJ תמונה. (א) הבחירה של עוצמת שיא באמצעות הכלי הסף. (B) Resulting תמונה לאחר שלב ניגודיות בתמונת המקור של איור 1 מומר תמונה בינארית. (ג) Resulting תמונה לאחר התמונה ולאחר מכן המרת מסיכה. צילומי מסך של הבחירה של אזורים מעניינים ב'מנהל ROI (D) . סולם העמודות מייצגות 50 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 4 : תוצאות נציג של אמבה להרוג על ידי תאים aeruginosa פ . (א) Calcein-אם זריחה על המארח (B) הורג אינדקסים של השטח-attached או פלנקטוניים פראי-סוג או Δaeruginosa פ lasRותמונות מיקרוסקופיה של שלב. פראי-סוג משטח-attached aeruginosa פ הורג amoebae, אשר מוצג calcein משמעותית קרינה פלואורסצנטית ומכאן מארח משמעותי הורג אינדקס. תאים פלנקטוניים שנצרכים על ידי amoebae, אשר מוצג זריחה calcein הקטן ולייצר מאינדקס הרג מארח נמוך. צמוד-השטח והן Δ פלנקטונייםlasR שנצרכים על ידי amoebae והתוצאה באינדקס הרג מארח נמוכה. סולם ברים מייצגים 50 מיקרומטר. מציינות את הממוצע של 3 ניסויים עצמאית, שגיאות מציינות סטיית תקן. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
פרוטוקול זה מתאר שיטה מהירה כמותיים כדי assay התקפה אלימה ב aeruginosa פ. פרוטוקול זה עשוי להיבדק עם חיידקים אחרים. עם זאת, חשוב לזכור כי מדיום הגידול צריך להיות תואם תנאי הגידול של אמבה. בפרט, אנו יש אופטימיזציה הפרוטוקול באמצעות PS:DB כמו מדיום הגידול חיידקי. אם נעשה שימוש מדיה אחרת, ייתכן צורך לבצע צמיחה התקשורת בלבד פקד שבו ישנם תאים חיידקיים לא נוכח כדי לאמת כי המדיום תואמת amoebae.
בשיטה זו ניתן להרחיב assay התלות שלב הצמיחה של התקפה אלימה. בפרט, ניתן לגדל תרביות חיידקים למגוון רחב של פעמים במקום נקודת זמן קבוע. מניסיוננו, חשוב לקצור תרביות חיידקים בנקודות זמן מסוים כפי התקפה אלימה ב פ aeruginosa מופיע להיות תלויים שלב הצמיחה. הבחנו כי התקפה אלימה ב aeruginosa פ היה המושרה בין 6-8 h של צמיחה צלחות פטרי.
משתנים רבים הקשורים עם הסביבה צמיחה להשפיע על בריאות המארח, התקפה אלימה חיידקי. לכן, חשוב להשתמש נכונה פקדים חיוביים ושליליים עבור ניסוי. השתמשנו פראי-סוג משטח-attached aeruginosa פ כמו חיובי Δ ובקרהlasR כפקד שלילי. אנו ממליצים ביצוע בקרות אלה בכל פעם שוזמינותו התקפה אלימה מבוצעת. פקדים אלה חשובים עבור אימות כי מקרי מוות התא המארח הן לא בשל גורמים חיצוניים כלשהם כגון העידן של amoebae, וריאציות של טמפרטורה, וכו '. יתר על כן, אנו מציעים מבצע ניסויים כל שכפול ביולוגי להקים הפארמצבטית של הפנוטיפים התקפה אלימה.
לנו יש ביצע ניסויים שלנו באמצעות amoebae צפיפות אופטית של 0.2 עד 0.5 לאחר לדילול ב 1:10 לפחות ומוסדרת הטמפרטורה של תרבות amoebae בדיוק 22 מעלות צלזיוס. מחוץ אלה תנאי הגידול, מצאנו כי את הרגישות של amoebae חיידקים מידבק, את הפארמצבטית של התקפה אלימה וזמינותו הם שינו. אמבה תאים הצניפה במהירות יחסית. ודא כי תרבויות הם resuspended על ידי pipetting למעלה ולמטה מיד לפני המדידה צפיפות אופטית מורכב. לא צומחים התרבויות אמבה גבוה יותר צפיפות יתר600 1 כפי צמיחה גבוהה משפיעה על הפארמצבטית של הניסוי. הפצת תרבויות axenic לא יותר משבוע. בנוסף, חשוב לוודא כי amoebae גדלים axenically (מתחיל בשלב 2.7) באמצעות 20 X או בהגדלה מיקרוסקופית כזה חיידקים אחרים אינם קיימים בתרבות. אם תרבויות עכורים בשלב 2.10 לאחר יומיים של צמיחה בעקבות חיסון ראשוני, זה סביר מצביע על הנוכחות של חיידקים מזהם. אם יש חשד לזיהום חיידקי, אנו מציעים גדל 1 מ"ל של התרבות amoebae ב 37 מעלות צלזיוס במשך 4-8 h. התצפית של תרבות עכורים בתנאים האלה הייתי מציע זיהום חיידקי. אם חוזרים עליו זיהום חיידקי הוא ציין, יש להחליף את הפתרון אנטיביוטיקה-antimycotic.
מדד הרג המארח הוא מחוון אמין של אוכלוסיה חיידקי הוא מידבק או avirulent. זה וזמינותו לא הותאם להשוואות בין רמות ביניים שונות של התקפה אלימה (כלומר, נמוך התקפה אלימה לעומת התקפה אלימה בינונית-נמוכה), להימנע פרשנות יתר של התוצאות. שיטות אפשריות כדי לטפל בבעיה זו הן החזרה על וזמינותו התקפה אלימה על פני ימים מרובים באמצעות קבוצות שונות של התאים המארחים כדי לבסס את הביטחון בתוצאות, ביצוע ניסויים שכפל נוספים וביצוע המתאים ניתוחים סטטיסטיים.
הריבוי של זיהום (MOI) של תאים פלנקטוניים יכול להיות נשלט על ידי נרמול הצפיפות האופטית של התרבות חיידקי. עם זאת, וזמינותו הזה אינו שולט למשרד הפנים של חיידקים צמוד-משטח תאים. הבחנו כי חיידקי צפיפות המשטח גדל עם הזמן. לכן, התאמת זמן הגידול בצלוחית הפטרי עלול לגרום שינוי המתאימים בצפיפות המשטח. בנוסף, צפיפות פני השטח תלוי החומר של פני השטח. תאים aeruginosa פ לצרף פוליסטירן משטחים ב וזמינותו המתוארים כאן. עם זאת, משטחים אחרים, כולל זכוכית, אגר לזיהוי עשוי גם להיות לבדיקה13. צפיפות המשטח של אוכלוסיות חיידקים הכוללים שכבה אחת ניתן למדוד באמצעות 100 X הגדלה שלב מיקרוסקופ. אם צפיפות משטח רב שכבתית, מיקרוסקופיה קונפוקלית עשוי להיות מתאים.
. הנה, תארנו שיטה מהירה חזקים כדי למדוד התקפה אלימה חיידקי. על-ידי שינוי פרמטרים בודדים כגון פעמים דגירה של הפלורסנט, המתח חיידקי, סוג התא המארח מדיה, או צמיחה, שיטה זו יורחב כדי לכמת התקפה אלימה על פני מגוון רחב של אורגניזמים, תנאי הגידול.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
המחברים אין לחשוף.
Acknowledgments
KP ככל כתב, כתב היד המתוקן. KP לבצע הניסויים וניתוח. עבודה זו נתמך על ידי פרס מעבר קריירה הלאומית המכונים לבריאות (NIH) (K22AI112816) כדי בשם
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents | |||
| Bacto agar, dehydrated | BD Difco | 214010 | |
| Antibiotic-Antimycotic (100X) | Life Technologies | 15240062 | Aliquot < 1 mL and store at -20 °C |
| Calcein-acetoxymethyl ester (calcein-AM) | Life Technologies | C34852 | Calcein Acetoxymethyl (AM) |
| Calcium chloride, anhydrous | Sigma-Aldrich | C1016 | |
| D-Glucose | Fisher Chemical | D16500 | Dextrose |
| Dimethyl sulfoxide | Sigma-Aldrich | D5879 | |
| Folic acid | Sigma-Aldrich | F8758 | |
| LB-Miller | BD Difco | 244620 | |
| Magnesium chloride | Sigma-Aldrich | M8266 | |
| Yeast extract | Oxoid | LP0021 | |
| Special peptone | Oxoid | LP0072 | |
| Potassium hyroxide | Fisher Chemical | P250 | |
| Potassium phosphate monobasic | Sigma-Aldrich | P0662 | |
| Sodium phosphate dibasic heptahydrate | Fisher Chemical | S373 | |
| Vitamin B12 | Sigma-Aldrich | V2876 | |
| Strains | |||
| Dictyostelium discoideum | Siryaporn lab | Strain AX318 | |
| Escherichia coli | Siryaporn lab | Strain B/r17 | |
| Pseudomonas aeruginosa | Siryaporn lab | PA14 | PA14 strain19 |
| Pseudomonas aeruginosa ΔlasR | Siryaporn lab | AFS20.1 | PA14-derived strain20 |
| Supplies | |||
| 0.22 µm filter | Millipore | SCGPT01RE | For filter sterilization |
| Conical tube, 15 mL | Corning | 352097 | |
| Glass storage bottles | Pyrex | 13951L | 250 mL, 500 mL, 1000 mL |
| Petri dish, 6 cm diameter | Corning | 351007 | 60 x 15 mm polystyrene plates |
| Petri dish, 10 cm diameter | Fisher | FB0875712 | 100 x 15 mm polystyrene plates |
| Plastic containers with lid | Ziploc | 2.57E+09 | Square 3-cup containers |
| Glass plates | Bio-Rad | 1653308 | For preparing agar pads. Other glass plates may be used with similar dimensions. |
| Wooden sticks | Fisher | 23-400-102 | |
| Equipment | |||
| Eclipse Ti-E microscope | Nikon | MEA53100 | Microscope setup |
| 10X Plan Fluor Ph1 objective 0.3 NA | Nikon | MRH20101 | Microscope setup |
| Fluorescence excitation source | Lumencor | Sola light engine | Microscope setup |
| Fluorescence filter set | Semrock | LED-DA/FI/TX-3X3M-A-000 | Microscope setup |
| Orca Flash 4.0 V2 Camera | Hamamatsu | 77054098 | Microscope setup |
| ImageJ | NIH | v. 1.49 | Software for image analysis |
| MATLAB | Mathworks | R2013 | Software for image analysis |
| Orbital shaker incubator | VWR | 89032-092 | For growth of bacteria at 37 °C |
| Platform shaker | Fisher | 13-687-700 | For growth of amoebae at 22 °C |
| Spectrophotometer | Biochrom | Ultrospec 10 | |
| Undercounter refrigerated incubator | Fisher | 97990E | For growth of amoebae at 22 °C |
| Isotemp waterbath | Fisher | 15-462-21Q | For cooling media to 55 °C |
References
- Rasko, D. A., Sperandio, V. Anti-virulence strategies to combat bacteria-mediated disease. Nature Reviews Drug Discovery. 9 (2), 117-128 (2010).
- Coburn, B., Grassl, G. A., Finlay, B. B. Salmonella, the host and disease: a brief review. Immunology and Cell Biology. 85 (2), 112-118 (2007).
- Alibaud, L., et al. Pseudomonas aeruginosa virulence genes identified in a Dictyostelium host model. Cellular Microbiology. 10 (3), 729-740 (2008).
- Pukatzki, S., Kessin, R. H., Mekalanos, J. J. The human pathogen Pseudomonas aeruginosa utilizes conserved virulence pathways to infect the social amoeba Dictyostelium discoideum. Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 99 (5), 3159-3164 (2002).
- Cosson, P., et al. Pseudomonas aeruginosa Virulence Analyzed in a Dictyostelium discoideum Host System. Journal of Bacteriology. 184 (11), 3027-3033 (2002).
- Pukatzki, S., et al. Identification of a conserved bacterial protein secretion system in Vibrio cholerae using the Dictyostelium host model system. Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 103 (5), 1528-1533 (2006).
- Steinert, M., Heuner, K. Dictyostelium as host model for pathogenesis. Cellular Microbiology. 7 (3), 307-314 (2005).
- Hagele, S., Kohler, R., Merkert, H., Schleicher, M., Hacker, J., Steinert, M. Dictyostelium discoideum: a new host model system for intracellular pathogens of the genus Legionella. Cellular Microbiology. 2 (2), 165-171 (2000).
- Matz, C., et al. Pseudomonas aeruginosa uses type III secretion system to kill biofilm-associated amoebae. ISME Journal. 2 (8), 843-852 (2008).
- Hauser, A. R. The type III secretion system of Pseudomonas aeruginosa: infection by injection. Nature Reviews Microbiology. 7 (9), 654-665 (2009).
- Moore, P. L., MacCoubrey, I. C., Haugland, R. P. A rapid pH insensitive, two color fluorescence viability (cytotoxicity) assay. Journal of Cell Biology. 111, Abstract 304 58 (1990).
- Kaneshiro, E. S., Wyder, M. A., Wu, Y. -P., Cushion, M. T. Reliability of calcein acetoxy methyl ester and ethidium homodimer or propidium iodide for viability assessment of microbes. Journal of Microbiological Methods. 17 (1), 1-16 (1993).
- Siryaporn, A., Kuchma, S. L., O'Toole, G. A., Gitai, Z. Surface attachment induces Pseudomonas aeruginosa virulence. Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 111 (47), 16860-16865 (2014).
- Decherchi, P., Cochard, P., Gauthier, P. Dual staining assessment of Schwann cell viability within whole peripheral nerves using calcein-AM and ethidium homodimer. Journal of Neuroscience Methods. 71 (2), 205-213 (1997).
- Braut-Boucher, F., Pichon, J., Rat, P., Adolphe, M., Aubery, M., Font, J. A non-isotopic, highly sensitive, fluorimetric, cell-cell adhesion microplate assay using calcein AM-labeled lymphocytes. Journal of Immunological Methods. 178 (1), 41-51 (1995).
- Grieshaber, P., Lagrèze, W. A., Noack, C., Boehringer, D., Biermann, J. Staining of fluorogold-prelabeled retinal ganglion cells with calcein-AM: A new method for assessing cell vitality. Journal of Neuroscience Methods. 192 (2), 233-239 (2010).
- Witkin, E. M. Inherited Differences in Sensitivity to Radiation in Escherichia Coli. Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 32 (3), 59-68 (1946).
- Loomis, W. F. Sensitivity of Dictyostelium discoideum to nucleic acid analogues. Experimental Cell Research. 64 (2), 484-486 (1971).
- Rahme, L. G., Stevens, E. J., Wolfort, S. F., Shao, J., Tompkins, R. G., Ausubel, F. M. Common virulence factors for bacterial pathogenicity in plants and animals. Science. 268 (5219), 1899-1902 (1995).
- O'Loughlin, C. T., Miller, L. C., Siryaporn, A., Drescher, K., Semmelhack, M. F., Bassler, B. L. A quorum-sensing inhibitor blocks Pseudomonas aeruginosa virulence and biofilm formation. Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 110 (44), 17981-17986 (2013).
