Summary
Här presenterar vi ett protokoll för att mäta virulens hos plankton eller surface-anslutna bakterier använda D. discoideum (amöba) som värd. Virulens mäts över en period på 1 h och värd döda kvantifieras med hjälp av fluorescence mikroskopi och bild analys. Vi visar detta protokoll som använder bakterien P. aeruginosa.
Abstract
Traditionella bakteriell virulens analyser innebär långvarig exponering av bakterier under loppet av flera timmar till värdceller. Under denna tid, kan bakterier genomgå förändringar i fysiologi på grund av exponering för tillväxt värdmiljön och förekomsten av vara värdcellerna. Vi utvecklat ett test för att snabbt mäta tillståndet virulens av bakterier som minimerar den utsträckning som bakterier växa i närvaro av värdceller. Bakterier och endoparasiterna blandas ihop och orörlig på en enda bildplanen använder en agar-pad. Proceduren använder encelliga fluorescens imaging med calcein-acetoximetyl ester (calcein-AM) som en indikator på värden cell hälsa. Fluorescensen av värdceller analyseras efter 1 h exponering av värdceller att bakterierna med epifluorescence mikroskopi. Bild analys programvara används för att beräkna en värd dödande index. Denna metod har använts för att mäta virulens inom plankton och surface-anslutna Pseudomonas aeruginosa delpopulationer under det inledande skedet av biofilm bildning och kan anpassas till andra bakterier och andra stadier av biofilm tillväxt. Detta protokoll ger en snabb och robust metod att mäta virulens och undviker många av svårigheterna som förknippas med tillväxt och underhåll av däggdjursceller linjer. Virulens fenotyper mätt här med endoparasiterna har också validerats med hjälp av musen makrofager. I synnerhet för denna analys att fastställa att ytan fastsättning uppreglerar virulens i P. aeruginosa.
Introduction
Bakteriell infektion är en av de ledande dödsorsakerna i människa och djur1,2. Förmågan att mäta virulens av bakterier i kulturer eller biofilmer är viktigt i sjukvård och forskning inställningar. Här beskriver vi en mångsidig, snabb och relativt enkel metod för att kvantifiera bakteriell virulens. Den eukaryota organismen Dictyostelium discoideum (amöba) används som modell värd organismen. D. discoideum har använts som en värd för att identifiera virulensfaktorer i Pseudomonas aeruginosa (P. aeruginosa)3,4,5 och andra bakterier6,7 ,8 och är mottagliga för i stort sett de samma virulensfaktorer som döda däggdjursceller inklusive typ III sekretion9,10. Tidigare virulens analyser med hjälp av D. discoideum har involverat långvarig exponering av bakterier med D. discoideum celler under loppet av timmar3,4,5. Protokollet, här presenterar en snabb metod för att bestämma virulens använder denna amöba. Detta protokoll (figur 1) beskriver hur du: (1) växer endoparasiterna axenically (i avsaknad av bakterier), (2) växa bakterier för analysen, (3) förbereda bakterier och värdceller för mikroskopi, (4) utföra epifluorescence mikroskopi och (5) analysera amoeba fluorescens.
Endoparasiterna är initialt stryks ut från fryst lager och odlas på en gräsmatta av Escherichia coli (E. coli), där endoparasiterna producera sporer. Dessa sporer plockas och inokuleras i ett berikat medium för axenic tillväxt. Endoparasiterna underhålls genom axenic tillväxt i näringsrika förhållanden tills de är redo att blandas med bakterier för bedömning av bakteriell virulens. Överlevnad eller döden av endoparasiterna kvantifieras genom mätning av fluorescensen av calcein-acetoximetyl (calcein-AM), som klyvs av intracellulära esteraser och, därmed, aktiverad för fluorescens11,12. Levande endoparasiterna uppvisar liten eller ingen fluorescens betonade och döende celler fluorescerar intensivt. Detta resultat beror på en liten eller ingen införlivandet av calcein-AM i friska endoparasiterna och införlivande och klyvning av substratet i stressade endoparasiterna13. Detta är särskilt skild från calcein-AM fluorescens i däggdjursceller11,14,15,16.
Bakterier som kommer att bedömas för virulens odlas separat. Här, beskriver vi hur man mäter virulens opportunistisk patogen P. aeruginosa och detalj hur att kvantifiera virulens plankton (simning) och surface-anslutna delpopulationer. Detta protokoll kan anpassas att testa virulens hos andra bakterier. I avsnittet representativa resultat visar vi att virulens är aktiverad i celler yta-sitter och är låg i plankton celler, som rapporterades tidigare13. Virulens-aktiverade surface-anslutna P. aeruginosa dödar endoparasiterna medan icke-virulent plankton celler förbrukas av endoparasiterna. Om är enbart att analyseras virulens hos plankton bakterier, kan bakterier vara odlade i vanliga kultur rör i stället för att använda petriskålar som beskrivs i protokollet.
Tillväxten av endoparasiterna och P. aeruginosa kulturer måste samordnas så att P. aeruginosa kulturer nå den avsedda tillväxtfasen medan endoparasiterna växer vid steady state i näringsrika förhållanden. Detta tillstånd kräver vanligtvis endoparasiterna kulturer spädas minst 1 dag före när de blandas med bakterier. Endoparasiterna och bakterier är orörlig använder agar kuddar, är samtidig ruvade för 1 h och avbildas med hjälp av en låg upplösning (10 X, numeriska bländaröppningen 0,3) objektiva, grönt fluorescerande protein (GFP) filter och en tänkbar kamera. Analys kan utföras med hjälp av fritt tillgängliga ImageJ programvara eller anpassad bild analys programvara. Vår analys utfördes med hjälp av vår egen programvara som skrivs med hjälp av en vetenskaplig analys paketet13. Programvaran bör skapa en mask som använder fas kontrast bilden och extrahera fluorescens värden från de maskerade områdena i bilden fluorescens. Fluorescens är medelvärdet över minst 100 celler, vilket resulterar i ett index för dödandet av numeriska värden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alla experimentella rutiner som genomfördes på University of California, Irvine.
1. buffertar och lösningar
- Förbered Lysogeny buljong (LB) i en 1 L glasflaska genom att lägga till 25 g av LB-Miller mix i 1 L dubbeldestillerat vatten (ddH2O). För petriskålar, lägga till en ytterligare 20 g agar. Autoklav att sterilisera. Häll 25 mL av smält agarsubstrat i 10 cm-diameter petriskålar och låt stelna i rumstemperatur. Lagra flytande media vid rumstemperatur och agarplattor vid 4 ° C.
- Förbered glukos jäst pepton (GYP) plattor i en 1 L glasflaska genom att blanda 1 g av D-glukos, 2 g av pepton, 0,25 g jäst extrakt, 4,2 g KH2PO4och 5.1 g Na2HPO47 H2O 25 g agar i 1 L ddH2 O. autoklav att sterilisera. Häll 25 mL av smält agar i 10 cm-diameter petriskålar och låt stelna i rumstemperatur. Förvaras vid 4 ° C.
- Förbered pepton S (PS) medium i en 1 L glasflaska genom att blanda 10 g pepton, 7 g jäst extrakt, 15 g D-glukos, 0,12 g Na2HPO47 H2O, 1.4 g KH2PO4, 40 µg vitamin B12 , och 80 µg folsyra i 800 mL ddH2O. kalibrera en elektronisk pH-mätare med pH 4 och pH 7 normer om pH-mätaren inte har använts inom en dag.
- Mäta pH-värdet i PS mediet med hjälp av pH-mätaren. Lägga till antingen 5 M KOH eller 5 M H3PO4 för att justera pH till 6,5. Anpassa den slutliga volymen till 1 L med ddH2O. Filter sterilisera med 0,22 µm vakuum filter och förvaras vid 4 ° C.
Obs: Gå försiktigt fram med pH justeringar genom att bära skyddsutrustning inklusive handskar, skyddskläder, ögonskydd och ansiktsskydd.
- Mäta pH-värdet i PS mediet med hjälp av pH-mätaren. Lägga till antingen 5 M KOH eller 5 M H3PO4 för att justera pH till 6,5. Anpassa den slutliga volymen till 1 L med ddH2O. Filter sterilisera med 0,22 µm vakuum filter och förvaras vid 4 ° C.
- Förbereda 10 x utveckling buffert Prime (DB') buffert i en 1 L glasflaska genom att lägga till 3,4 g KH2PO4, 13,4 g Na2HPO4 7 H2O och ddH2O en total volym på 800 mL. Kalibrera en elektronisk pH-mätare med pH 4 och pH 7 normer om pH-mätaren inte har använts inom en dag.
- Mäta pH-värdet på den buffert som använder elektronisk pH-mätaren. Justera pH till 6,5 genom att försiktigt lägga antingen 5 M KOH eller 5 M H3PO4 som behövs. Anpassa den slutliga volymen till 1 L med ddH2O och sterilisera i autoklav. Förvara i rumstemperatur.
Obs: Gå försiktigt fram med pH justeringar genom att bära skyddsutrustning inklusive handskar, skyddskläder, ögonskydd och ansiktsskydd.
- Mäta pH-värdet på den buffert som använder elektronisk pH-mätaren. Justera pH till 6,5 genom att försiktigt lägga antingen 5 M KOH eller 5 M H3PO4 som behövs. Anpassa den slutliga volymen till 1 L med ddH2O och sterilisera i autoklav. Förvara i rumstemperatur.
- Gör 1 x utveckling buffert (DB) genom att blanda 100 mL 10 x DB' buffert med 1 mL steriliserat 2 M MgCl2och 1 mL steriliserat 1 M CaCl2. Anpassa den slutliga volymen till 1 L i glasflaska 1 L med en Ånghärdad steriliserad ddH2O. Store vid rumstemperatur.
- Förbered PS:DB medium i en 1 L glasflaska genom att blanda 100 mL steriliserat PS medium, 100 mL steriliserat 10 x DB' buffert och steriliserad ddH2O till en total volym av 1 L. komplettera med 1 mL steriliserat 2 M MgCl2 och 1 mL steriliseras 1 M CaCl 2. förvaras vid 4 ° C.
- Förbereda calcein-AM stamlösning genom att lägga till 50 µL av DMSO 50 µg calcein-AM i den plastbehållare som tillhandahålls av tillverkaren. Förvaras vid-20 ° C.
2. tillväxt och underhåll av endoparasiterna
- Växa E. coli stam nazars17 som en näringskälla för endoparasiterna under initial tillväxtperioden. Strimma E. coli nazars från en fryst lager lagras vid-80 ° C på en LB agarplattan och inkubera vid 37 ° C under natten att få enstaka kolonier.
- Inokulera en enda koloni av E. coli nazars i 2 mL LB medium och inkubera i en rulle trumma eller en shaker vid 37 ° C under natten.
- Ta övernattnings E. coli kultur till rumstemperaturen. Med hjälp av en träpinne, Inokulera endoparasiterna från en fryst lager som hålls vid-80 ° C till 750 µL av övernattning kultur.
Obs: Använd D. discoideum -stam AX3, som kan axenic tillväxt18. Detta steg kräver inte axenic tillväxt, men efterföljande steg måste hans krav. - Tillsätt omedelbart 700 µL av endoparasiterna -E. coli blandningen på glukos jäst pepton (GYP) plåt. Sprida kulturen jämnt på ytan av plattan genom att luta och tillbaka och sida till sida som behövs. Undvika användning av en spridare.
- Placera GYP plattan med agar uppåt i en låda som håller hög luftfuktighet. Använda två disponibel plast behållarna (183 cm x 183 cm x 91 cm) staplas ovanpå varandra. Fyll behållaren botten med cirka 25 mL vatten och placera den övre behållaren med flera 0,5 cm-diameter hål borras genom golv i behållaren så att fukt att flytta från vattenbehållaren till den översta behållaren.
- Inkubera i GYP plattan och fält vid 22 ° C i 4-5 dagar tills amöba Sporerna observeras växer nära ytan av plattan (figur 2). Använd en kyld inkubator Inkubera plattorna i stället för inkubation vid rumstemperatur.
Obs: Efter sporer har vuxit, de förblir livskraftig på plåtar i flera veckor om den förvaras vid 4 ° C. Förvara plattorna med agar uppåt. Efter 3-4 dagars inkubation, kan zoner clearing inom bakteriell gräsmattan observeras, som tyda på att uppkomsten av amöba sporulering.- Observera små endoparasiterna sporer ovanför plattan efter 4-5 dagars inkubation (figur 2).
Obs: Växer inte endoparasiterna längre än en vecka, eftersom kvaliteten på sporer minskar bortom denna tidsperiod.
- Observera små endoparasiterna sporer ovanför plattan efter 4-5 dagars inkubation (figur 2).
- Samla endoparasiterna sporer att förbereda för endoparasiterna axenic tillväxt genom svepande en steril 1 mL pipettspetsen parallell med ytan av plattan. Samla sporer från hälften av en 10 cm petriskål.
Obs: Undvik att röra spetsen på ytan av agarplattan som denna motion kommer att samla ett stort antal E. coli. - Återsuspendera endoparasiterna på spetsen på pipetten genom nedsänkning spetsen i 1 mL av PS medium och pipettering försiktigt upp och ner.
- Överföra inokulerade blandningen i en 250 mL mätkolv som innehåller 25 mL av PS medium kompletteras med antibiotikum-antimycotic lösningen vid 0,25 x koncentration.
Obs: Lagra antibiotikum-antimycotic lösningen som 250 µL portioner vid-20 ° C. Undvik upprepade cykler av upptining och frysning av denna lösning eftersom detta kan minska dess effektivitet. - Växa endoparasiterna axenically vid 22 ° C i en roterande skak vid 100 rpm. För virulens analysen i steg 5, odla cellerna till en optisk densitet mäts på 600 nm (OD600) av 0,2 till 0,5.
Obs: Detta steg kräver 3-4 dagar av tillväxt från tiden av inympningen (steg 2,7). Om cellerna har vuxit till en högre densitet, späd kulturen tillbaka i PS medium till en OD600 0,05 eller lägre och växa tillbaka till en OD600 av 0,2 till 0,5.
3. tillväxt av P. aeruginosa
- Plocka en enda koloni av P. aeruginosa från en LB-plattan, Inokulera det till en 2 mL PS:DB kultur och växa över natten vid 37 ° C till mättnad.
Obs: Lägg inte antibiotika-antimycotic lösningen PS:DB media. - Späd den natten kultur 1: 100 eller 1:1,000 i en 6 cm-diameter petriskål med PS:DB. Om virulens hos plankton celler är enbart att analyseras, växa de kulturer som använder konventionella kultur rör istället. Skaka kulturen på en bänkmonterade rotator vid 100 rpm vid 37 ° C.
- Skörda kulturer vid specifika tidpunkter att säkerställa reproducerbarhet. På 30 min till 1 h före bedömningen av virulens, förbereda en agar-pad som beskrivs i avsnitt 4.
Obs: Virulens i P. aeruginosa framkallas av ca 8 h tillväxt på ytor. - För att isolera ytan-anslutna cellerna, bort det flytande mediet från petriskål, tvätta genast med 1 mL av DB buffert att ta bort plankton celler och omedelbart gå vidare till steg 5.1.
FÖRSIKTIGHET: Tvätta inte längre än 30 s eftersom detta stör och lossa yta-anslutna celler och kan påverka virulens mätningen. - För att isolera plankton celler, överföra 10 µL av kulturen från petriskål till en ren petriskål och omedelbart gå vidare till steg 5.1.
4. mikroskopi - beredning av Agar Pad
- Förbereda agar kuddar ca 30 min till 1 h innan endoparasiterna är redo att blandas med P. aeruginosa.
- Mikrovågsugn 50 mL 1% (w/v) agar i DB buffert i en 250 mL mätkolv. Blanda varje 20 s tills klumpar av agar försvinner.
- Cool smält ägarn genom att placera det i förvärmd 55 ° C vattenbad i 15 min.
- Tillsätt 15 µL av calcein-AM stamlösning till 15 mL av smält agar i ett koniskt rör. Blanda genom att försiktigt vända tuben 4 - 5 gånger och omedelbart gå vidare till nästa steg.
Obs: Utföra det här steget i en polypropylen 15 mL centrifugrör. Använd inte en tjock glasbehållare som detta kommer att orsaka agar stelnar för snabbt. - Häll smält agar blandningen ovanpå en 12 x 10 cm glasskiva och låt ägarn stelna i rumstemperatur i 10 minuter. Skär den stelnad agar pad i mindre 1,5 x 1,5 cm sektioner genom att placera glasplattan över en utskrivna rutmönstret och skära längs rutnätet använder en metall linjal.
- Gelet hydrerad i en fuktig låda tills den är klar för användning.
5. mikroskopi - prepareringen av bakterier-amoeba för avbildning
- För att assay virulens yta-anslutna bakterieceller, Lägg till 10 µL av amöba celler från steg 2.10 till ytan-anslutna bakterier från steg 3,4.
Obs: Detta steg beskriver blandning av endoparasiterna med bakterier. - För att analysen virulens hos plankton celler, blanda 10 µL av amöba celler från steg 2.10 med 10 µL av plankton bakterier från steg 3.5.
Obs: Tvätta inte axenically odlade amöba cellerna (vid en OD600 av 0,2 till 0,5) innan blandas med bakterier. Ingen E. coli tillväxt kommer att iakttas i den amöba kulturen på grund av användningen av antibiotika-antimycotic lösningen. - Placera omedelbart 1,5 x 1,5 cm calcein-AM agar pad från steg 4,5 ovanpå bakterier-amoeba blandningen på petriskål ytan.
Obs: Placera agar pad ovanpå blandningen med en snabb smidig rörelse. Inte sänka pad långsamt på blandningen som denna motion tenderar att driva celler mot periferin och bort från undersidan av pad. Detta steg kommer att säkerställa att bakterier och endoparasiterna jämnt blandade, orörlig och att både cell typer är begränsade till samma plan. - Ta bort överflödig vätska genom försiktigt pipettering ut eventuella kvarvarande vätska som omger den agar pad. Låt Petri skålen torka i 20 min i rumstemperatur.
- Täck med petriskål med lock och inkubera immobiliserade amöba-bakterier blandningen i rumstemperatur i en ytterligare 40 min. Fortsätt till steg 6.1.
Obs: Det är viktigt att Inkubera alla prover i samma belopp av tid, eftersom bakgrunden fluorescens ökar över tid. En inkubationstid på 1 h rekommenderas. Inkubationer längre än 1 h är mindre reproducerbara som endoparasiterna celler kan börja att brista.
6. mikroskopi - bild förvärv
- Bild endoparasiterna med fluorescens Mikroskop kan förvärva brightfield och grön fluorescens bilder. För grön fluorescens, använda grönt fluorescerande protein (GFP) filter med 474/27 nm och 525/45 nm för magnetisering och utsläpp, respektive. Använd ett 10 X (≥0.3 numerisk bländare) mål för att bilden i endoparasiterna.
Obs: Calcein-AM i ägarn kommer att orsaka döende endoparasiterna till fluorescens i kanalen grön fluorescens. Frisk endoparasiterna är annars inte fluorescerande. - Justera anskaffningstid för faskontrast, GFP kanaler begränsa fototoxicitet och optimerar det dynamiska omfånget av stödnivåerna som bild. Ersätta den differentiella störningar kontrast (DIC) faskontrast vid behov.
Obs: Använd 100-200 ms exponeringar för faskontrast och god Jordbrukarsed fluorescens om möjligt. Hålla de inställningar för exponering och instrument som oförändrad under hela försöket. Detta är avgörande för computing värd dödande index. - Hämta bilder för minst 100 amöba celler för att få bra statistik för att beräkna värden dödande index.
7. bild analys och värd dödande Index
- Utföra bildanalys med ImageJ.
- Öppna filen fas kontrast bild i ImageJ genom att klicka på fil | Öppna och välja bilden. Justera tröskeln genom att klicka på bild | Analys | Tröskelvärde för. Justera nedre och övre tröskeln markerar endast intensitet topp (figur 3A).
- Konvertera bilden till ett binärt genom att klicka Process | Binärt | Gör binära. Fyll hålen genom att välja Process | Binärt | Fyll hål.
Obs: Använder bilden i figur 1 som källa, kommer att steg 7.1-7.2 producera en bild som den endoparasiterna och surface-anslutna bakterier visas som mörka områden (figur 3B). - Säkerställa att rutorna område och grå medelvärde kontrolleras i analysera | Ange mått. Mäta den ungefärliga storleken på endoparasiterna genom att välja verktyget oval på huvudverktygsfältet. Klicka på analysera | Åtgärd och observera området av representativa endoparasiterna.
- Skapa masker för endoparasiterna genom att klicka analysera | Analysera partiklar. Ange det område som kommer att omfatta endoparasiterna men utesluta bakterier i storleksrutan. Välj masker i dropdown menyn bomma för alternativet Visa. Se till att lägga till Manager rutan är markerad.
- Klicka på OK och en bild som visar endast endoparasiterna och en ROI Manager dialogruta visas (figur 3C).
- Öppna fluorescens bilden med fil | Öppna och välja lämplig fil. Välj alla regioner i ROI Manager genom att hålla ned SKIFT-tangenten och klicka på respektive region i listan (figur 3D).
- Klicka på knappen åtgärd i ROI Manager. Detta kommer att öppna ett resultatfönster visar genomsnittliga intensitetsvärdet för varje amöba.
- Kopiera fluorescens värdena för varje amöba till ett kalkylprogram och beräkna värden dödar index genom att ta medelvärdet av alla fluorescens.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Vi växte vildtyp P. aeruginosa stam PA1419 eller en ΔlasR stam20 i samma PA14 bakgrund i 6 cm-diameter petriskålar och analyseras virulens hos plankton och surface-anslutna celler. Kulturer var inokuleras från singel-kolonier i PS:DB kulturer, vuxit över natten i kultur rör i en rulle trumma vid 37 ° C till mättnad, spädd 1: 100 i PS:DB, odlas för 8 h i 6 cm-diameter petriskålar skakar vid 100 rpm, och plankton och surface-anslutna P. aeruginosa delpopulationer isolerades som beskrivs i avsnitt 3.
Surface-anslutna vildtyp P. aeruginosa dödade endoparasiterna, som antyddes av en runda amöba cell form och observation av calcein fluorescens (figur 4A, övre vänstra panelen). Detta resulterade i en hög värd dödande index (figur 4B). Plankton celler konsumerades av de endoparasiterna, som indikerades av amorft amöba cell former och observation av liten eller ingen calcein fluorescens över bakgrunden (figur 4A, övre högra panelen). Detta resulterade i en relativt låg värd dödande index (figur 4B). Både yta-anslutna och plankton celler ΔlasR stam konsumerades av de endoparasiterna, som indikerades av låga värd döda index (figur 4B, nedre panelen). Resultaten visar således att virulens är uppreglerad i ytan-anslutna populationer och i LasR krävs för surface-aktiverat virulens, vilket beskrevs tidigare13. Dessa experiment fastställa således robusta positiva och negativa kontroller för framtida experiment.
Figur 1 : Schematiskt beskriva en översikt av virulens analysens. (1) amoeba värdceller odlas, (2) bakteriekulturer odlas och (3) plankton eller surface-anslutna bakterieceller blandas med endoparasiterna och orörlig på samma avbildning plan använder en agar-pad. Värdceller kvantifieras för hälsa med calcein-AM, fluorescensmikroskopi och bildanalys. Skala staplarna representerar 50 µm. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.
Figur 2 : Amoeba sporer på en GYP 10 cm-diameter petriskål plattan efter 5 dagars tillväxt. Sporer formuläret ovanför petriskål. Infällt visar en förstorad bild av ett enda avsnitt av skålen ytan. Ytan kan innehålla bakterier som inte kan urskiljas på denna resolution. Skala staplarna i huvud- och infällda bilder representerar 1 cm och 2 mm, respektive. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3 : Bildanalys av mikroskopi data med hjälp av ImageJ. (A) urval av peak intensiteten med verktyget tröskel. (B) resulterande bild efter fas kontrast källbilden från figur 1 omvandlas till en binär bild. (C) resulterande bilden efter att bilden är därefter omvandlats till en mask. (D) skärmdumpar av urvalet av regioner av intresse med hjälp av ROI Manager. Skala staplarna representerar 50 µm. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.
Figur 4 : Representativa resultat av amöba dödande av P. aeruginosa celler. (A) Calcein-AM fluorescens överlagras på fas mikroskopi bilder och (B) värd döda index av surface-anslutna eller plankton vildtyp eller ΔlasR P. aeruginosa. Vildtyp yta-anslutna P. aeruginosa dödar endoparasiterna, som uppvisar betydande calcein fluorescens och därmed en betydande värd döda index. Plankton celler förbrukas av endoparasiterna, som uppvisar lite calcein fluorescens och producera ett lågt mottagande dödande index. Både yta-anslutna och plankton ΔlasR konsumeras av endoparasiterna och resultatet i en låg värd dödande index. Skala barer representera 50 µm. staplarna visar medelvärdet av tre oberoende experiment och fel staplarna anger standardavvikelsen. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Det här protokollet beskriver en snabb och kvantitativ metod för att assay virulens i P. aeruginosa. Detta protokoll kan testas med andra bakterier. Det är dock viktigt att komma ihåg att odlingsmedium bör vara förenliga med amoeba tillväxten villkorar. Vi i synnerhet har optimerat det protokoll använder PS:DB som bakterietillväxt medium. Om andra medier används, kan det nödvändigt att utföra en tillväxt endast media-kontroll där det finns ingen bakterieceller som är närvarande för att kontrollera att mediet är kompatibelt med endoparasiterna.
Denna metod kan utökas assay tillväxt fas beroendet av virulens. I synnerhet kan bakteriekulturer odlas för ett stort antal gånger istället för en fast tidpunkt. Vår erfarenhet är det viktigt att skörda bakteriekulturer vid specifika tidpunkter virulens i P. aeruginosa verkar vara beroende av tillväxtfasen. Vi observerade att virulens i P. aeruginosa förmåddes mellan 6-8 h av tillväxt i petriskålar.
Många variabler som är associerade med tillväxt miljön påverka värd hälsa och bakteriell virulens. Därför är det viktigt att använda lämpliga positiva och negativa kontroller för varje experiment. Vi har använt vildtyp yta-anslutna P. aeruginosa som en positiv kontroll och ΔlasR som en negativ kontroll. Vi föreslår att utföra dessa kontroller varje gång virulens analysen utförs. Dessa kontroller är viktiga för att verifiera att värd cell dödsfall inte beror på någon yttre faktorer såsom ålder av endoparasiterna, variationer i temperatur, etc. Dessutom föreslår vi utför alla experiment i biologiska replikera att upprätta reproducerbarheten av virulens fenotyper.
Vi har utfört våra experiment med endoparasiterna på en optisk densitet på 0,2 till 0,5 efter en utspädning på minst 1:10 och har reglerade temperaturen av endoparasiterna kultur just till 22 ° C. Utanför dessa tillväxt villkorar, har vi funnit att känsligheten för endoparasiterna virulenta bakterier och reproducerbarhet virulens analysens ändras. Amoeba celler pellet relativt snabbt. Se till att kulturer är resuspended genom pipettering upp och ner omedelbart innan optisk densitet mätningen görs. Växer inte amoeba kulturerna högre än en OD600 täthet av 1 tillväxt att höga tätheter påverkar reproducerbarheten av experimentet. Sprida axenic kulturer längre än 1 vecka. Dessutom är det viktigt att kontrollera att endoparasiterna odlas axenically (början i steg 2,7) genom 20 X eller hög förstoring mikroskopi sådan att andra mikrober inte är närvarande i kulturen. Om kulturer är grumligt i steg 2.10 efter 2 dagar av tillväxten efter inledande ympning, skulle detta sannolikt indikera närvaron av en Mikrobiell förorening. Om bakteriell kontaminering misstänks, föreslår vi växer 1 mL av den endoparasiterna kulturen vid 37 ° C i 4-8 h. Observation av en grumlig kultur under dessa förhållanden skulle föreslå bakteriell kontamination. Om upprepad bakteriell kontamination observeras, bör antibiotika-antimycotic lösningen ersättas.
Värd dödande index är en tillförlitlig indikator på huruvida en bakteriepopulation är virulent eller Avirulenta. Denna analys har inte optimerats för jämförelser mellan olika mellanliggande nivåer av virulens (dvs låg virulens jämfört med medium-låg virulens) och överdriven tolkning av resultaten bör undvikas. Potentiella metoder att lösa detta problem är en upprepning av virulens analysen över flera dagar med olika partier av värdceller för att etablera förtroende i resultaten, utför ytterligare replikera experiment och utföra lämpliga statistiska analyser.
Multiplicityen av infektion (MOI) av plankton celler kan styras genom att normalisera den optiska densiteten av den bakteriella kulturen. Denna analys kontrollerar dock inte MOI av surface-anslutna bakterieceller. Vi har observerat att bakteriella surface densitet ökar med tiden. Således, justera tillväxt tid i petriskål kan leda till en motsvarande förändring i Ytors. Dessutom beror Ytors på materialet i ytan. P. aeruginosa celler fäster polystyren ytor i analysen beskrivs här. Dock kan även andra ytor inklusive glas, agar och polyakrylamid analyseras13. Ytors av singel-skiktad bakteriell populationer kan mätas med 100 X förstoring fas mikroskopi. Om surface tätheter är flerdimensionell, kan konfokalmikroskopi vara lämpligt.
Här har vi beskrivit en snabb och robust metod för att mäta bakteriell virulens. Genom att ändra enskilda parametrar såsom inkubationstider, den fluorescerande färgämnen, bakteriestam, värd celltyp eller tillväxt medier, kan denna metod utvidgas till att kvantifiera virulens inom ett brett spektrum av organismer och tillväxt villkorar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har något att avslöja.
Acknowledgments
KP och som skrev och reviderade manuskriptet. KP utfört experimenten och analys. Detta arbete stöds av National Institutes of Health (NIH) karriär övergång tilldelning (K22AI112816) till AS.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents | |||
| Bacto agar, dehydrated | BD Difco | 214010 | |
| Antibiotic-Antimycotic (100X) | Life Technologies | 15240062 | Aliquot < 1 mL and store at -20 °C |
| Calcein-acetoxymethyl ester (calcein-AM) | Life Technologies | C34852 | Calcein Acetoxymethyl (AM) |
| Calcium chloride, anhydrous | Sigma-Aldrich | C1016 | |
| D-Glucose | Fisher Chemical | D16500 | Dextrose |
| Dimethyl sulfoxide | Sigma-Aldrich | D5879 | |
| Folic acid | Sigma-Aldrich | F8758 | |
| LB-Miller | BD Difco | 244620 | |
| Magnesium chloride | Sigma-Aldrich | M8266 | |
| Yeast extract | Oxoid | LP0021 | |
| Special peptone | Oxoid | LP0072 | |
| Potassium hyroxide | Fisher Chemical | P250 | |
| Potassium phosphate monobasic | Sigma-Aldrich | P0662 | |
| Sodium phosphate dibasic heptahydrate | Fisher Chemical | S373 | |
| Vitamin B12 | Sigma-Aldrich | V2876 | |
| Strains | |||
| Dictyostelium discoideum | Siryaporn lab | Strain AX318 | |
| Escherichia coli | Siryaporn lab | Strain B/r17 | |
| Pseudomonas aeruginosa | Siryaporn lab | PA14 | PA14 strain19 |
| Pseudomonas aeruginosa ΔlasR | Siryaporn lab | AFS20.1 | PA14-derived strain20 |
| Supplies | |||
| 0.22 µm filter | Millipore | SCGPT01RE | For filter sterilization |
| Conical tube, 15 mL | Corning | 352097 | |
| Glass storage bottles | Pyrex | 13951L | 250 mL, 500 mL, 1000 mL |
| Petri dish, 6 cm diameter | Corning | 351007 | 60 x 15 mm polystyrene plates |
| Petri dish, 10 cm diameter | Fisher | FB0875712 | 100 x 15 mm polystyrene plates |
| Plastic containers with lid | Ziploc | 2.57E+09 | Square 3-cup containers |
| Glass plates | Bio-Rad | 1653308 | For preparing agar pads. Other glass plates may be used with similar dimensions. |
| Wooden sticks | Fisher | 23-400-102 | |
| Equipment | |||
| Eclipse Ti-E microscope | Nikon | MEA53100 | Microscope setup |
| 10X Plan Fluor Ph1 objective 0.3 NA | Nikon | MRH20101 | Microscope setup |
| Fluorescence excitation source | Lumencor | Sola light engine | Microscope setup |
| Fluorescence filter set | Semrock | LED-DA/FI/TX-3X3M-A-000 | Microscope setup |
| Orca Flash 4.0 V2 Camera | Hamamatsu | 77054098 | Microscope setup |
| ImageJ | NIH | v. 1.49 | Software for image analysis |
| MATLAB | Mathworks | R2013 | Software for image analysis |
| Orbital shaker incubator | VWR | 89032-092 | For growth of bacteria at 37 °C |
| Platform shaker | Fisher | 13-687-700 | For growth of amoebae at 22 °C |
| Spectrophotometer | Biochrom | Ultrospec 10 | |
| Undercounter refrigerated incubator | Fisher | 97990E | For growth of amoebae at 22 °C |
| Isotemp waterbath | Fisher | 15-462-21Q | For cooling media to 55 °C |
References
- Rasko, D. A., Sperandio, V. Anti-virulence strategies to combat bacteria-mediated disease. Nature Reviews Drug Discovery. 9 (2), 117-128 (2010).
- Coburn, B., Grassl, G. A., Finlay, B. B. Salmonella, the host and disease: a brief review. Immunology and Cell Biology. 85 (2), 112-118 (2007).
- Alibaud, L., et al. Pseudomonas aeruginosa virulence genes identified in a Dictyostelium host model. Cellular Microbiology. 10 (3), 729-740 (2008).
- Pukatzki, S., Kessin, R. H., Mekalanos, J. J. The human pathogen Pseudomonas aeruginosa utilizes conserved virulence pathways to infect the social amoeba Dictyostelium discoideum. Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 99 (5), 3159-3164 (2002).
- Cosson, P., et al. Pseudomonas aeruginosa Virulence Analyzed in a Dictyostelium discoideum Host System. Journal of Bacteriology. 184 (11), 3027-3033 (2002).
- Pukatzki, S., et al. Identification of a conserved bacterial protein secretion system in Vibrio cholerae using the Dictyostelium host model system. Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 103 (5), 1528-1533 (2006).
- Steinert, M., Heuner, K. Dictyostelium as host model for pathogenesis. Cellular Microbiology. 7 (3), 307-314 (2005).
- Hagele, S., Kohler, R., Merkert, H., Schleicher, M., Hacker, J., Steinert, M. Dictyostelium discoideum: a new host model system for intracellular pathogens of the genus Legionella. Cellular Microbiology. 2 (2), 165-171 (2000).
- Matz, C., et al. Pseudomonas aeruginosa uses type III secretion system to kill biofilm-associated amoebae. ISME Journal. 2 (8), 843-852 (2008).
- Hauser, A. R. The type III secretion system of Pseudomonas aeruginosa: infection by injection. Nature Reviews Microbiology. 7 (9), 654-665 (2009).
- Moore, P. L., MacCoubrey, I. C., Haugland, R. P. A rapid pH insensitive, two color fluorescence viability (cytotoxicity) assay. Journal of Cell Biology. 111, Abstract 304 58 (1990).
- Kaneshiro, E. S., Wyder, M. A., Wu, Y. -P., Cushion, M. T. Reliability of calcein acetoxy methyl ester and ethidium homodimer or propidium iodide for viability assessment of microbes. Journal of Microbiological Methods. 17 (1), 1-16 (1993).
- Siryaporn, A., Kuchma, S. L., O'Toole, G. A., Gitai, Z. Surface attachment induces Pseudomonas aeruginosa virulence. Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 111 (47), 16860-16865 (2014).
- Decherchi, P., Cochard, P., Gauthier, P. Dual staining assessment of Schwann cell viability within whole peripheral nerves using calcein-AM and ethidium homodimer. Journal of Neuroscience Methods. 71 (2), 205-213 (1997).
- Braut-Boucher, F., Pichon, J., Rat, P., Adolphe, M., Aubery, M., Font, J. A non-isotopic, highly sensitive, fluorimetric, cell-cell adhesion microplate assay using calcein AM-labeled lymphocytes. Journal of Immunological Methods. 178 (1), 41-51 (1995).
- Grieshaber, P., Lagrèze, W. A., Noack, C., Boehringer, D., Biermann, J. Staining of fluorogold-prelabeled retinal ganglion cells with calcein-AM: A new method for assessing cell vitality. Journal of Neuroscience Methods. 192 (2), 233-239 (2010).
- Witkin, E. M. Inherited Differences in Sensitivity to Radiation in Escherichia Coli. Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 32 (3), 59-68 (1946).
- Loomis, W. F. Sensitivity of Dictyostelium discoideum to nucleic acid analogues. Experimental Cell Research. 64 (2), 484-486 (1971).
- Rahme, L. G., Stevens, E. J., Wolfort, S. F., Shao, J., Tompkins, R. G., Ausubel, F. M. Common virulence factors for bacterial pathogenicity in plants and animals. Science. 268 (5219), 1899-1902 (1995).
- O'Loughlin, C. T., Miller, L. C., Siryaporn, A., Drescher, K., Semmelhack, M. F., Bassler, B. L. A quorum-sensing inhibitor blocks Pseudomonas aeruginosa virulence and biofilm formation. Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 110 (44), 17981-17986 (2013).
