Summary
نقدم هنا، بروتوكولا لقياس ضراوة البكتيريا العوالق أو المرفقة بالسطح باستخدام ديسكويديوم دال (الاميبا) كمضيف. فوعة يقاس مدى ح 1 والمضيف مما أسفر عن مصرع هو كمياً باستخدام التحليل المجهري والصورة الفلورية. علينا أن نظهر هذا البروتوكول باستخدام بكتيريا P. الزّنجاريّة.
Abstract
فحوصات الفوعة الجرثومية التقليدية تنطوي على التعرض لفترة طويلة للبكتيريا على مدى عدة ساعات للخلايا المضيفة. وخلال هذا الوقت، يمكن أن البكتيريا تغيرات في الفسيولوجيا بسبب التعرض لبيئة النمو المضيف ووجود خلايا المضيف. لقد طورنا فحص لقياس سرعة حالة ضراوة من البكتيريا التي تقلل من مدى التي تنمو فيها البكتيريا حضور الخلايا المضيفة. البكتيريا الزحارية مختلطة معا ومعطلة على متن طائرة واحدة تصوير باستخدام جهاز pad أجار. يستخدم الإجراء تصوير fluorescence خلية واحدة مع إستر كالسين-أسيتوكسيميثيل (كالسين-ص) كمؤشر على صحة الخلية المضيفة. ويتم تحليل الأسفار الخلايا المضيفة بعد ح 1 من التعرض للخلايا المضيفة للبكتيريا باستخدام الفحص المجهري ابيفلوريسسينسي. صورة تحليل البرمجيات المستخدمة لحساب مؤشر قتل مضيف. وقد استخدمت هذا الأسلوب لقياس ضراوة داخل العوالق والمرفقة بالسطحية الزائفة الزّنجاريّة السكان الفرعية خلال المرحلة الأولى من تشكيل بيوفيلم ويمكن تكييفها للبكتيريا الأخرى والمراحل الأخرى من النمو بيوفيلم. هذا البروتوكول يوفر طريقة سريعة وقوية من قياس ضراوة ويتجنب العديد من التعقيدات المرتبطة بالنمو والحفاظ على خطوط خلايا الثدييات. تعمل الفوعة تقاس هنا باستخدام الزحارية قد صودق باستخدام الماوس الضامة. على وجه الخصوص، هذا التحليل كانت تستخدم لإنشاء ذلك فوعة أوبريجولاتيس مرفق السطحية P. الزّنجاريّة.
Introduction
العدوى البكتيرية واحدة من الأسباب الرئيسية للوفيات في الإنسان والحيوانات1،2. القدرة على قياس ضراوة البكتيريا في ثقافات أو الأغشية الحيوية مهم في إعدادات الرعاية الصحية والبحوث. هنا، يمكننا وصف أسلوب تنوعاً وسريعة وبسيطة نسبيا لقياس الفوعة الجرثومية. وتستخدم الكائنات الحية حقيقية النواة ديسكويديوم ديكتيوستيليوم (الاميبا) كنموذج الكائن المضيف. دال-ديسكويديوم قد استخدمت كمضيف لتحديد عوامل الفوعة في الزائفة الزّنجاريّة (P. الزّنجاريّة)3،،من45 والأخرى البكتيريا6،7 ،8 وهو عرضه لالي حد كبير عوامل الفوعة ذاتها التي تقتل خلايا الثدييات بما في ذلك النوع الثالث إفراز9،10. وأشركت فحوصات الفوعة السابقة باستخدام ديسكويديوم دال- التعرض المطول للبكتيريا مع الخلايا ديسكويديوم دال- على مدى ساعات3،،من45. ويقدم البروتوكول، هنا، طريقة سريعة لتحديد ضراوة استخدام هذا الاميبا. هذا البروتوكول (الشكل 1) ويصف كيفية: (1) تنمو الزحارية أكسينيكالي (في عدم وجود البكتيريا)، (2) تنمو البكتيريا للمقايسة، (3) إعداد البكتيريا والخلايا المضيفة للفحص المجهري، (4) إجراء الفحص المجهري ابيفلوريسسينسي، و (5) تحليل أميبا الأسفار.
في البداية الزحارية السنة اللهب أثناء الخروج من الأرصدة المجمدة وتزرع في حديقة من الإشريكيّة القولونية (كولاي)، حيث تنتج الزحارية الجراثيم. التقطت هذه الجراثيم وتلقيح إلى وسيلة إثراء لنمو أكسينيك. يتم الاحتفاظ في الزحارية من خلال النمو أكسينيك في ظروف الغنية بالمغذيات حتى أنهم على استعداد لتكون مختلطة مع البكتيريا لتقييم الفوعة الجرثومية. البقاء أو موت الزحارية هو كمياً عن طريق قياس الأسفار من كالسين-أسيتوكسيميثيل (كالسين-ص)، وهو المشقوق من استيراسيس داخل الخلايا، وبالتالي تنشيط للأسفار11،12. الزحارية لايف يحمل الأسفار القليل أو لا بينما أكد وخلايا الموت فلوريس مكثف. هذه النتيجة بسبب إدراج قليلاً أو لا كالسين-صباحا إلى الزحارية صحية والتأسيس والانقسام من الركازة في الزحارية أكد13. يعتبر هذا السلوك خاصة متميزة من الأسفار كالسين-صباحا في خلايا الثدييات11،14،،من1516.
وتزرع البكتيريا التي سيجري تقييم لضراوة كل على حدة. هنا، نحن تصف كيفية قياس ضراوة من مسببات الأمراض الانتهازية الزّنجاريّة P. وتفاصيل كيفية تحديدها كمياً ضراوة من العوالق (سباحة) والسكان الفرعية المرفقة بالسطح. هذا البروتوكول يمكن تكييفها لاختبار ضراوة البكتيريا الأخرى. في مقطع النتائج الممثل، نظهر أن ضراوة تنشيط في الخلايا المرفقة بالسطح ومنخفضة في الخلايا العوالق، التي ذكرت سابقا13. تنشيط الفوعة المرفقة بسطح P. الزّنجاريّة يقتل الزحارية بينما الخلايا العوالق غير الخبيثة يتم استهلاكها بواسطة الزحارية. إذا كان هو فقط يجري جزيئي ضراوة البكتيريا العوالق، يمكن أن تكون البكتيريا المستزرعة في أنابيب الثقافة عادية بدلاً من استخدام أطباق بيتري كما هو مبين في البروتوكول.
يجب أن يكون نمو الزحارية والثقافات P. الزّنجاريّة منسقة مثل الثقافات P. الزّنجاريّة التوصل إلى مرحلة النمو المقصود في حين تتزايد الزحارية في حالة مستقرة في ظروف الغنية بالمغذيات. ويتطلب هذا الشرط عادة الثقافات الزحارية أن تضعف قبل 1 يوم على الأقل عندما كانت مختلطة مع البكتيريا. الزحارية والبكتيريا هي معطلة باستخدام منصات أجار، وهي شاركت المحتضنة ح 1، وتصويرها باستخدام دقة منخفضة (10 X، الفتحة العددية 0.3) بتصفية البروتينات الفلورية الخضراء، وموضوعية (التجارة والنقل)، وكاميرا تصوير. تحليل يمكن أن يؤديها باستخدام برمجيات ImageJ متاحة بحرية، أو تخصيص برنامج تحليل الصور. تم إجراء تحليلنا باستخدام البرمجيات الخاصة بنا مكتوبة باستخدام حزمة تحليل علمي13. ينبغي إنشاء قناع باستخدام الصورة التباين المرحلة البرنامج واستخراج القيم الأسفار من مجالات الملثمين في الصورة الفلورية. يتم حساب متوسط القيم الأسفار عبر خلايا على الأقل 100، أسفر عن مؤشر قتل مضيف عددي.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
وأجريت جميع الإجراءات التجريبية في جامعة كاليفورنيا في إيرفين.
1-المخازن المؤقتة والحلول
- إعداد مرق ليسوجيني (رطل) في زجاجة زجاج 1 لتر بإضافة 25 غراما مزيج رطل-ميلر في 1 لتر الماء المقطر مزدوجة (ddH2س). لاطباق بيتري، إضافة 20 غراما إضافية من أجار. اﻷوتوكﻻف لتعقيم. صب 25 مل متوسطة أجار المنصهر في أطباق بتري سم قطرها 10 والسماح لترسيخ في درجة حرارة الغرفة. تخزين وسائل الإعلام السائلة في درجة حرارة الغرفة ولوحات أجار في 4 درجات مئوية.
- إعداد لوحات ببتون الخميرة جلوكوز (جيب) في زجاجة زجاج 1 لتر من خلط ز 1 د-الجلوكوز، وانتزاع ز 2 من ببتون، 0.25 غرام خميرة، 4.2 ز خ2ص4، ز 5.1 غ2هبو47 ح2س، و 25 جرام من أجار في 1 لتر من ddH2 سين اﻷوتوكﻻف لتعقيم. صب 25 مل أجار المنصهر في أطباق بتري سم قطرها 10 والسماح لترسيخ في درجة حرارة الغرفة. مخزن في 4 درجات مئوية.
- إعداد متوسطة ببتون S (PS) في زجاجة زجاج 1 لتر بمزج 10 جرام ببتون، واستخراج 7 غرام خميرة، ز 15 د-الجلوكوز، ز 0.12 Na2هبو47 ح2س، ز 1.4 من خ2ص4، 40 ميكروغرام من فيتامين ب12 ، و 80 ميكروغرام من حمض الفوليك في 800 مل ddH2سين معايرة مقياس الأس الهيدروجيني إلكترونية استخدام الأس الهيدروجيني 4 ودرجة الحموضة 7 المعايير إذا لم يستخدم مقياس الأس الهيدروجيني خلال يوم واحد.
- قياس درجة الحموضة PS المتوسطة باستخدام مقياس الأس الهيدروجيني. إضافة 5 م كوه أو م 5 ح3ص4 لضبط درجة الحموضة إلى 6.5. ضبط الحجم النهائي إلى 1 لتر باستخدام عامل تصفية O. ddH2تعقيم 0.22 ميكرومتر فراغ تصفية باستخدام وتخزين في 4 درجات مئوية.
ملاحظة: الحذر مع التعديلات الأس الهيدروجيني بارتداء المعدات الواقية، بما في ذلك القفازات والملابس الواقية، وحماية العين، وتواجه الحماية.
- قياس درجة الحموضة PS المتوسطة باستخدام مقياس الأس الهيدروجيني. إضافة 5 م كوه أو م 5 ح3ص4 لضبط درجة الحموضة إلى 6.5. ضبط الحجم النهائي إلى 1 لتر باستخدام عامل تصفية O. ddH2تعقيم 0.22 ميكرومتر فراغ تصفية باستخدام وتخزين في 4 درجات مئوية.
- إعداد 10 × التنمية المخزن المؤقت لرئيس الوزراء (DB ') مخزن في زجاجة زجاج 1 لتر بإضافة 3.4 ز خ2ص4، ز 13.4 غ2هبو4 7 ح2س، و ddH2س إلى إجمالي حجم 800 مل. معايرة مقياس الأس الهيدروجيني إلكترونية استخدام الأس الهيدروجيني 4 ودرجة الحموضة 7 المعايير إذا لم يستخدم مقياس الأس الهيدروجيني خلال يوم واحد.
- قياس درجة الحموضة من المخزن المؤقت باستخدام مقياس الأس الهيدروجيني الإلكترونية. قم بضبط درجة الحموضة إلى 6.5 بلطف إضافة 5 م كوه أو م 5 ح3ص4 حسب الحاجة. ضبط الحجم النهائي إلى 1 لتر باستخدام ddH2س وتعقيمها قبل التعقيم. تخزين في درجة حرارة الغرفة.
ملاحظة: الحذر مع التعديلات الأس الهيدروجيني بارتداء المعدات الواقية، بما في ذلك القفازات والملابس الواقية، وحماية العين، وتواجه الحماية.
- قياس درجة الحموضة من المخزن المؤقت باستخدام مقياس الأس الهيدروجيني الإلكترونية. قم بضبط درجة الحموضة إلى 6.5 بلطف إضافة 5 م كوه أو م 5 ح3ص4 حسب الحاجة. ضبط الحجم النهائي إلى 1 لتر باستخدام ddH2س وتعقيمها قبل التعقيم. تخزين في درجة حرارة الغرفة.
- جعل 1 × التنمية المخزن المؤقت (DB) بخلط 100 مل 10 × DB ' المخزن المؤقت مع 1 مل من تعقيم مجكل م 22، و 1 مل من تعقيم كاكل 1 م2. ضبط الحجم النهائي إلى 1 لتر في زجاجة 1 لتر باستخدام ddH معقم يعقم2"مخزن سين" في درجة حرارة الغرفة.
- إعداد متوسطة PS:DB في زجاجة زجاج 1 لتر بخلط 100 مل من تعقيم PS المتوسطة، وتعقيم 100 مل من 10 × DB ' المخزن المؤقت، وتعقيم ddH2س إلى إجمالي حجم 1 ل. الملحق مع 1 مل من تعقيم مجكل م 22 و 1 مل من تعقيم 1 م كاكل 2-مخزن في 4 درجات مئوية.
- إعداد الحل الأسهم صباحا كالسين بإضافة 50 ميليلتر من [دمس] إلى 50 ميكروغرام من كالسين-صباحا في حاوية بلاستيكية تم توفيره بواسطة الشركة المصنعة. مخزن في-20 درجة مئوية.
2-النمو والحفاظ على الزحارية
- تنمو سلالة كولاي B/r17 كمصدر لغذاء الزحارية خلال فترة النمو الأولى. الانتصارات كولاي B/r من أسهم مجمدة مخزنة في-80 درجة مئوية على صفيحة أجار رطل واحتضان في 37 درجة مئوية بين عشية وضحاها للحصول على مستعمرات واحدة.
- تطعيم مستعمرة واحدة من كولاي B/r إلى 2 مل متوسطة رطل واحتضان في طبل اسطوانة أو شاكر على 37 درجة مئوية بين عشية وضحاها.
- تجلب بين عشية وضحاها كولاي الثقافة إلى درجة حرارة الغرفة. باستخدام عصا خشبية، تطعيم الزحارية من أسهم مجمدة تحفظ في-80 درجة مئوية إلى 750 ميليلتر للثقافة بين عشية وضحاها.
ملاحظة: استخدام ديسكويديوم دال- سلالة AX3، وقادرة على النمو أكسينيك18. لا تتطلب هذه الخطوة النمو أكسينيك، ولكن الخطوات اللاحقة له الشرط. - فور إضافة 700 ميليلتر الزحارية-كولاي الخليط على صفيحة ببتون خميرة جلوكوز (جيب). نشر ثقافة بالتساوي على سطح اللوحة عن إمالة ذهابا وإيابا، وجنبا إلى جنب حسب الحاجة. تجنب استخدام الناشرة.
- ضع لوحة جيب مع أجار مواجها لأعلى في مربع الذي يحافظ على رطوبة عالية. استخدام الحاويات البلاستيكية المتاح اثنين (183 سم × 183 سم × 91 سم) مكدسة أعلى بعضها البعض. ملء حاوية أسفل مع حوالي 25 مل من الماء ومكان أعلى الحاوية مع حفر من خلال الأرضيات الحاوية للسماح للرطوبة للانتقال من خزان المياه إلى أعلى الحاوية عدة ثقوب قطرها سم 0.5.
- احتضان لوحة جيب ومربع عند 22 درجة مئوية لمدة 4-5 أيام حتى تحترم جراثيم أميبا المتنامية بالقرب من سطح اللوحة (الشكل 2). استخدام حاضنة مبردة لاحتضان لوحات بدلاً من حضانة في درجة حرارة الغرفة.
ملاحظة: بعد أن نمت جراثيم، تظل قابلة للتطبيق على لوحات لعدة أسابيع عند تخزينها في 4 درجات مئوية. تخزين اللوحات مع الجانب أجار مواجها لأعلى. بعد 3-4 أيام للحضانة، يمكن ملاحظة مناطق لتطهير داخل الحديقة البكتيرية، التي تشير إلى بدء تبوغ أميبا.- مراقبة الزحارية الصغيرة جراثيم فوق سطح اللوحة بعد 4-5 أيام للحضانة (الشكل 2).
ملاحظة: لا تنمو الزحارية لمدة أطول من أسبوع، كما يقلل من نوعية الجراثيم خارج هذه الفترة الزمنية.
- مراقبة الزحارية الصغيرة جراثيم فوق سطح اللوحة بعد 4-5 أيام للحضانة (الشكل 2).
- جمع الجراثيم الزحارية للتحضير لنمو أكسينيك الزحارية التي تجتاح تلميح ماصة معقمة 1 مل موازية لسطح اللوحة. جمع الجراثيم من نصف 10 سم طبق بيتري.
ملاحظة: تجنب ملامسة تلميح إلى سطح لوحة أجار كهذا الاقتراح سيتم جمع أعدادا كبيرة من كولاي. - ريسوسبيند الزحارية في تلميح الماصة أغرق في التلميح إلى 1 مل من PS المتوسطة ولطف بيبيتينج صعودا وهبوطاً.
- نقل الخليط الملقحين في قارورة 250 مل التي تحتوي على 25 مل PS المتوسطة وتستكمل مع الحل مضاد حيوي فطري 0.25 x تركيز.
ملاحظة: تخزين الحل مضاد حيوي فطري ك 250 ميليلتر مختبرين في-20 درجة مئوية. تجنب دورات متكررة من ذوبان الجليد وتجميد هذا الحل، وهذا قد يقلل من فعاليته. - تنمو الزحارية أكسينيكالي عند 22 درجة مئوية في شاكر الدورية 100 لفة في الدقيقة. للمقايسة الفوعة في الخطوة 5، تنمو خلايا لكثافة بصرية قياس 600 نانومتر (OD600) من 0.2 إلى 0.5.
ملاحظة: تتطلب هذه الخطوة 3-4 أيام نمو من وقت التطعيم (الخطوة 2.7). إذا كانت الخلايا نمت بكثافة أعلى، تضعف ثقافة العودة في المتوسطة PS OD600 0.05 أو أقل وتنمو مرة أخرى ل التطوير التنظيمي600 من 0.2 إلى 0.5.
3-نمو P. الزّنجاريّة
- اختيار مستعمرة واحدة من P. الزّنجاريّة من صفيحة رطل وتطعيم أنه في 2 مل الثقافة PS:DB، وتنمو بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية للتشبع.
ملاحظة: لا إضافة الحل مضاد حيوي فطري لوسائل الإعلام PS:DB. - تمييع بين عشية وضحاها الثقافة 1: 100 أو 1:1,000 في طبق بتري قطرها 6 سم باستخدام PS:DB. إذا كان هو فقط يجري جزيئي الفوعة الخلايا العوالق، تنمو الثقافات بدلاً من ذلك باستخدام أنابيب الثقافة التقليدية. اهتز الثقافة على محور دوار benchtop تعيين 100 لفة في الدقيقة عند 37 درجة مئوية.
- حصاد الثقافات في نقطة زمنية معينة لضمان إمكانية تكرار نتائج. في 30 دقيقة إلى 1 ساعة قبل تقييم الفوعة، إعداد جهاز pad أجار كما هو موضح في القسم 4.
ملاحظة: هو الناجم عن ضراوة في P. الزّنجاريّة حوالي 8 ح النمو على السطوح. - لعزل الخلايا المرفقة بالسطح، إزالة المتوسطة السائل من طبق بيتري وتغسل فورا مع 1 مل من المخزن المؤقت DB لإزالة الخلايا العوالق، والشروع فورا في الخطوة 5، 1.
تنبيه: لا تغسل أطول من 30 ثانية كهذا سوف التشويش وفصل الخلايا المرفقة بالسطح وقد تؤثر على قياس ضراوة. - لعزل الخلايا العوالق، نقل 10 ميليلتر للثقافة من طبق بيتري إلى طبق بتري نظيفة والشروع فورا في الخطوة 5، 1.
4-الفحص المجهري-إعداد لوحة المفاتيح أجار
- إعداد منصات أجار حوالي 30 دقيقة إلى 1 ساعة قبل الزحارية على استعداد لتكون مختلطة مع P. الزّنجاريّة.
- الموجات الدقيقة 50 مل أجار 1% (w/v) في المخزن المؤقت DB في قارورة 250 مل. مزيج كل 20 ثانية حتى كتل من أجار تختفي.
- بارد أجار المنصهر بوضعه في حوض ماء مسخن 55 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة.
- إضافة 15 ميليلتر من الحل الأسهم كالسين-صباحا إلى 15 مل أجار المنصهر في أنبوب مخروطي. المزيج بلطف عكس الأنبوب 4-5 مرات والشروع فورا في الخطوة التالية.
ملاحظة: إجراء هذه الخطوة في أنبوب الطرد مركزي البوليبروبيلين 15 مل. عدم استخدام حاوية زجاج سميك كما سيؤدي هذا أجار يصلب بسرعة كبيرة جداً. - صب الخليط المنصهر أجار على رأس لوحة زجاج 12 × 10 سم وتسمح أجار يصلب لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة. قطع لوح أجار طدت إلى مقاطع أصغر 1.5 × 1.5 سم بوضع لوحة زجاج عبر شبكة مطبوعة وقطع على طول الشبكة باستخدام مسطرة معدنية.
- تبقى هلام رطب في مربع رطبة حتى يكون جاهزاً للاستخدام.
5-الفحص المجهري-إعداد نموذج الاميبا البكتيريا للتصوير
- للاعتداء ضراوة المرفقة بسطح الخلايا البكتيرية، إضافة 10 ميليلتر من خلايا الاميبا من الخطوة 2.10 إلى البكتيريا التي تعلق على سطح من الخطوة 3، 4.
ملاحظة: هذه الخطوة وصف اختلاط الزحارية مع البكتيريا. - للاعتداء ضراوة الخلايا العوالق، يخلط 10 ميليلتر من خلايا الاميبا من الخطوة 2.10 10 ميليلتر من البكتيريا العوالق من الخطوة 3، 5.
ملاحظة: لا تغسل الخلايا أميبا نابعة من أكسينيكالي (في OD600 من 0.2 إلى 0.5) قبل الاختلاط مع البكتيريا. أي نمو كولاي سيتبع في ثقافة أميبا نتيجة لاستخدام الحل مضاد حيوي فطري. - فورا وضع لوحة أجار كالسين-ص 1.5 × 1.5 سم من الخطوة 4، 5 أعلى الخليط أميبا البكتيريا على سطح طبق بيتري.
ملاحظة: وضع لوحة أجار على رأس المخلوط حركة سلسة سريعة باستخدام. لن تقلل لوحة المفاتيح ببطء على الخليط من هذه الحركة تميل إلى دفع الخلايا نحو المحيط وبعيدا عن الجانب السفلي من لوحة المفاتيح. هذه الخطوة سيتم التأكد من وجود البكتيريا والزحاريه بالتساوي مختلطة، معطلة وأن كليهما الخلية أنواع تقتصر على متن نفس الطائرة. - إزالة السائل الزائد بلطف بيبيتينج بها أي سائل المتبقية المحيطة بلوحة أجار. تسمح طبق بيتري لتجف لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
- تغطي بطبق بيتري مع غطاء واحتضان البكتيريا أميبا المعطل تداولها الخليط في درجة حرارة الغرفة لدقيقة 40 إضافية المضي قدما إلى الخطوة 6، 1.
ملاحظة: من المهم لاحتضان جميع العينات لنفس المقدار من الوقت، كما يزيد fluorescence الخلفية مع مرور الوقت. ويوصي بفترة حضانة من ح 1. إينكوبيشنز لمدة أطول من ح 1 أقل استنساخه كما قد تبدأ الخلايا الزحارية إلى انفجار.
6-الفحص المجهري--الحصول على الصور
- الزحارية الصورة باستخدام مجهر الأسفار قادرة على جلب الصور الفلورية برايتفيلد والأخضر. الفلورية الخضراء، استخدام مرشحات البروتين (بروتينات فلورية خضراء) الفلورية الخضراء مع 474/27 نانومتر و 525/45 نانومتر للإثارة والانبعاثات، على التوالي. استخدم هدفا (≥0.3 فتحه عددية) X 10 للصورة في الزحارية.
ملاحظة: سيؤدي كالسين-صباحا في أجار الزحارية الموت للأسفار في قناة الفلورية الخضراء. خلاف ذلك، لا تكون الزحارية صحية الفلورسنت. - ضبط أوقات اكتساب للتباين المرحلة، قنوات التجارة والنقل الحد من الضيائية، وتحسين النطاق الديناميكي لكثافة الصورة. تحل محل التباين مرحلة التباين (DIC) فرق التدخل إذا لزم الأمر.
ملاحظة: استخدام ms 100-200 التعرض لمرحلة التباين والأسفار بروتينات فلورية خضراء إذا كان ذلك ممكناً. الاحتفاظ بإعدادات التعرض والصك دون تغيير طوال هذه التجربة كاملة. هذا أمر بالغ الأهمية للحوسبة في فهرس قتل المضيف. - الحصول على الصور لخلايا الاميبا على الأقل 100 بغية الحصول على إحصاءات جيدة لحساب المضيف فهرس القتل.
7-صورة مؤشر قتل المضيف والتحليل
- أداء تحليل الصور باستخدام إيماجيج.
- فتح ملف الصورة التباين المرحلة في إيماجيج عن طريق النقر على الملف | فتح وتحديد الصورة. ضبط العتبة بالنقر فوق صورة | تحليل | عتبة. ضبط العتبة السفلي والعلوي لتحديد ذروة شدتها فقط (الشكل 3أ).
- تحويل الصورة إلى ثنائي بالنقر فوق عملية | ثنائي | جعل ثنائي. ملء الثغرات عن طريق تحديد عملية | ثنائي | ملء الثقوب.
ملاحظة: باستخدام الصورة في الشكل 1 كالمصدر، ستنتج الخطوات 7.1 7.2 صورة تظهر فيها الزحارية والمرفقة بسطح البكتيريا كمناطق مظلمة (الشكل 3ب). - ضمان أن يتم التحقق من المربعات المنطقة و يعني قيمة الرمادي في تحليل | تعيين قياسات. قياس الحجم التقريبي الزحارية بتحديد أداة البيضاوي على شريط الأدوات الرئيسي. انقر فوق تحليل | قياس وملاحظة منطقة الزحارية الممثل.
- إنشاء أقنعة الزحارية عن طريق النقر فوق تحليل | تحليل الجزيئات. في مربع الحجم، قم بإدخال المنطقة التي سوف تدرج في الزحارية لكن استبعاد البكتيريا. حدد أقنعة في شريط القوائم المنسدلة إظهار الخيار. تأكد من أن يتم التحقق من المربع إضافة إلى مدير .
- انقر فوق موافق وصورة تظهر فقط في الزحارية وهو مدير العائد على الاستثمار سوف يظهر مربع حوار (الشكل 3ج).
- فتح الصورة الفلورية باستخدام الملف | فتح واختيار الملف المناسب. تحديد جميع المناطق في إدارة العائد على الاستثمار بالضغط باستمرار على المفتاح Shift والنقر على كل منطقة في القائمة (الشكل 3د).
- انقر فوق زر الإجراء في إدارة العائد على الاستثمار. سيؤدي هذا إلى فتح إطار نتائج عرض قيمة كثافة يعني كل أميبا.
- نسخ قيم الأسفار كل أميبا في برنامج جدول بيانات وحساب المضيف قتل المؤشر بأخذ متوسط جميع الأسفار القيم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
ونحن نمت البرية من نوع P. الزّنجاريّة سلالة PA1419 أو Δﻷسر سلالة20 في نفس الخلفية PA14 في أطباق بتري سم قطرها 6 وجزيئي الفوعة من العوالق والمرفقة بسطح الخلايا. الثقافات تم تلقيح من مستعمرات واحدة في الثقافات PS:DB، نمت بين عشية وضحاها في أنابيب الثقافة في طبل اسطوانة في 37 درجة مئوية للتشبع، والمخفف 1: 100 في PS:DB، نمت عن ح 8 في 6 أطباق بيتري قطره سم الهز 100 لفة في الدقيقة، والعوالق والمرفقة بالسطح السكان الفرعي P. الزّنجاريّة كانت معزولة كما هو موضح في القسم 3.
المرفقة بسطح البرية من نوع P. الزّنجاريّة قتل الزحارية، التي أشارت بشكل خلية أميبا جولة، ومراقبة كالسين الفلورية (الشكل 4أ، لوحة أعلى اليسار). وادي هذا إلى مؤشر قتل مضيف عالية (الشكل 4ب). كانت تستهلك الخلايا العوالق الزحارية، التي أشارت بالأشكال خلية الاميبا غير متبلور، ومراقبة قليلاً أو لا كالسين fluorescence أعلاه الخلفية (الشكل 4أ، لوحة أعلى اليمين). وادي هذا إلى مؤشر قتل مضيف منخفضة نسبيا (الشكل 4ب). سواء تعلق السطح وكانت تستهلك العوالق خلايا من سلالةﻷسر Δ الزحارية، التي أشارت بالمضيف منخفضة مما أسفر عن مصرع الفهارس (الشكل 4ب، اللوحة السفلية). وهكذا تظهر النتائج أن ضراوة أوبريجولاتيد في السطح تعلق السكان ولاسر مطلوب لضراوة المنشط السطح، التي وصفت سابقا13. وهكذا وضع هذه التجارب عناصر إيجابية وسلبية قوية للتجارب المقبلة.
الشكل 1 : التخطيطي تصف لمحة عامة عن مقايسة الفوعة. (1) وتزرع في الخلايا المضيفة أميبا والثقافات (2) البكتيرية وتزرع، وتمتزج مع الزحارية الخلايا البكتيرية (3) العوالق أو المرفقة بالسطح ومعطلة على نفس الطائرة التصوير باستخدام جهاز pad أجار. الخلايا المضيفة كمياً للصحة باستخدام كالسين-صباحا والأسفار مجهرية وتحليل الصور. تمثل أشرطة مقياس 50 ميكرومتر. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 2 : أميبا الجراثيم في جيب 10 سم-قطر لوحة طبق بيتري بعد 5 أيام نمو- شكل جراثيم فوق سطح طبق بيتري. يظهر اقحم عرض مكبرة من مقطع واحد من سطح الطبق. قد تحتوي على السطح البكتيريا التي لا يمكن أن يستشف في هذا القرار. تمثل نطاق الأشرطة في الصور الرئيسية ومحفور 1 سم و 2 ملم، على التوالي. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 3 : صورة تحليل بيانات الفحص المجهري باستخدام إيماجيج. (أ) مختارة كثافة الذروة باستخدام أداة العتبة. (ب) الصورة الناتجة بعد مرحلة تباين مصدر الصورة من الرقم 1 يتم تحويلها إلى صورة ثنائية. (ج) الصورة الناتجة بعد أن يتم تحويل الصورة في وقت لاحق إلى قناع. (د) لقطات الشاشة لاختيار المناطق ذات الاهتمام باستخدام إدارة العائد على الاستثمار. تمثل أشرطة مقياس 50 ميكرومتر. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 4 : نتائج تمثيلية لأميبا قتل خلايا P. الزّنجاريّة . (أ) كالسين-ص الأسفار مضافين في مرحلة الفحص المجهري الصور والمضيفة (ب) مما أسفر عن مصرع فهارس ليعلق على السطح أو العوالق البرية من نوع أو Δﻷسر P. الزّنجاريّة. المرفقة بسطح البرية من نوع P. الزّنجاريّة يقتل الزحارية، الذي يحمل الأسفار كالسين كبيرة ومن ثم قتل مجموعة كبيرة الفهرس. يتم استهلاك الخلايا العوالق الزحارية، الذي يحمل قليلاً كالسين الأسفار وإنتاج مؤشر قتل مضيف منخفضة. سواء المرفقة بالسطح والعوالق Δﻷسر يتم استهلاكها بواسطة الزحارية والنتيجة في فهرس قتل مضيف منخفضة. مقياس أشرطة تمثل 50 ميكرومتر. أشرطة تبين متوسط ثلاث تجارب مستقلة وأشرطة الأخطاء تشير إلى الانحراف المعياري. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
هذا البروتوكول وصف أسلوب سريع والكمية الاعتداء الفوعة في P. الزّنجاريّة. ويمكن اختبار هذا البروتوكول مع البكتيريا الأخرى. ومع ذلك، من المهم أن نأخذ في الاعتبار أن متوسط النمو ينبغي أن تكون متوافقة مع ظروف النمو أميبا. على وجه الخصوص، نحن الأمثل البروتوكول باستخدام PS:DB كوسيلة النمو الجرثومي. إذا كان يتم استخدام وسائل الإعلام الأخرى، قد يكون ضروريا لتنفيذ عنصر تحكم وسائل الإعلام فقط نمو التي توجد فيها أي من الخلايا البكتيرية الحالية للتحقق من أن المتوسط متوافق مع الزحارية.
ويمكن توسيع هذا الأسلوب الاعتداء الاعتماد على مرحلة النمو من ضراوة. على وجه الخصوص، يمكن زراعتها الثقافات البكتيرية لمجموعة واسعة من أوقات بدلاً من نقطة زمنية محددة. في تجربتنا، من المهم أن حصاد الثقافات البكتيرية عند نقطة زمنية محددة كما يبدو أن ضراوة في P. الزّنجاريّة يعتمد على مرحلة النمو. ولاحظنا أن ضراوة في P. الزّنجاريّة حملت بين ح 6-8 من النمو في أطباق بتري.
هناك العديد من المتغيرات المرتبطة بالبيئة النمو تؤثر على صحة المضيف والبكتيرية ضراوة. وبالتالي، من المهم أن استخدام الضوابط السليمة الإيجابية والسلبية لكل تجربة. أننا استخدمنا المرفقة بسطح البرية من نوع P. الزّنجاريّة إيجابية السيطرة و Δﻷسر كعنصر سلبي. ونحن نقترح تنفيذ عناصر التحكم هذه في كل مرة يتم إجراء المقايسة ضراوة. عناصر التحكم هذه هامة للتحقق من أن موت الخلية المضيفة ليست نتيجة لأي عوامل خارجية مثل سن الزحارية، والتغيرات في درجات الحرارة، إلخ وعلاوة على ذلك، نقترح إجراء جميع التجارب في تكرار البيولوجية إنشاء إمكانية تكرار نتائج لتعمل ضراوة.
ونحن قد أجرى تجارب لنا استخدام الزحارية كثافة بصرية من 0.2 إلى 0.5 بعد إضعاف على الأقل 01:10 وقد ينظم درجة حرارة الثقافة الزحارية تحديداً إلى 22 درجة مئوية. خارج هذه الشروط النمو، نجد أن قابلية الزحارية للبكتيريا ضراوة وإمكانية تكرار نتائج للمقايسة الفوعة تتغير. خلايا الاميبا بيليه بسرعة نسبيا. ضمان أن الثقافات هي حراكه من بيبيتينج صعودا وهبوطاً فورا قبل أن يتم إجراء قياس الكثافة الضوئية. لا تنمو الثقافات أميبا أعلى بكثافة OD600 1 كما يؤثر النمو بكثافة عالية في إمكانية تكرار نتائج التجربة. نشر الثقافات أكسينيك لمدة لا تزيد على أسبوع واحد. وبالإضافة إلى ذلك، من المهم التحقق من أن تزرع الزحارية أكسينيكالي (ابتداء من الخطوة 2.7) عن طريق 20 X أو عالية التكبير المجهري هذه الميكروبات الأخرى ليست موجودة في الثقافة. إذا كانت الثقافات عكر في خطوة 2.10 بعد يومين نمو عقب التطعيم الأولى، هذا أن المرجح أن تشير إلى وجود الملوثات الميكروبية. إذا كان يشتبه بالتلوث البكتيري، نقترح زراعة 1 مل ثقافة الزحارية في 37 درجة مئوية ح 4-8. ملاحظة ثقافة عكر في ظل هذه الظروف أن اقترح التلوث البكتيري. إذا تكررت يتم ملاحظة التلوث البكتيري، ينبغي الاستعاضة عن حل مضاد حيوي فطري.
فهرس قتل المضيف مؤشر موثوق به ما إذا كان عدد سكان جرثومي هو ضراوة أو أفيرولينت. هذا الفحص قد لا الأمثل لإجراء مقارنات بين مختلف المستويات المتوسطة من الفوعة (أي فوعة منخفضة مقارنة بضراوة منخفضة ومتوسطة)، وينبغي تجنب مبالغة في تفسير النتائج. الطرق الممكنة لمعالجة هذه المسألة هي التكرار للمقايسة ضراوة على مدى عدة أيام باستخدام مجموعات مختلفة من الخلايا المضيفة لإرساء الثقة في النتائج، إجراء المزيد من التجارب نسخ متماثل، وأداء مناسب التحليلات الإحصائية.
يمكن التحكم بتعدد الإصابة (وزارة الداخلية) من الخلايا العوالق بتطبيع الكثافة البصرية لثقافة البكتيرية. إلا أن هذا التحليل لا تتحكم في وزارة الداخلية خلايا البكتيريا التي تعلق على سطح. وقد لاحظنا أن الكثافة السطحية البكتيرية يزيد مع مرور الوقت. وهكذا، ضبط الوقت النمو في طبق بتري قد ينتج تغيير المطابق في الكثافة السطحية. وبالإضافة إلى ذلك، يعتمد الكثافة السطحية على مادة السطح. خلايا P. الزّنجاريّة نعلق على السطوح البوليستيرين في مقايسة الموصوفة هنا. ومع ذلك، قد تكون الأسطح الأخرى بما في ذلك الزجاج واجار polyacrylamide أيضا جزيئي13. يمكن قياس الكثافة السطحية للطبقات واحد سكان الجرثومي استخدام 100 × التكبير مرحلة الفحص المجهري. إذا كانت كثافة سطحية متعددة الطبقات، قد يكون من المناسب [كنفوكل] مجهرية.
هنا، لقد قمنا بوصف طريقة سريعة وقوية لقياس الفوعة الجرثومية. بتعديل معلمات الفردية مثل أوقات الاحتضان، صبغة الفلورسنت، السلالة البكتيرية، ونوع الخلية المضيفة، أو وسائط النمو، ويجوز تمديد هذا الأسلوب لقياس ضراوة عبر طائفة واسعة من الكائنات الحية وظروف النمو.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.
Acknowledgments
KP وكما كتب وتنقيح هذه المخطوطة. KP إجراء التجارب والتحليل. وأيده هذا العمل على "جائزة الانتقال الوظيفي المعاهد الوطنية للصحة" (NIH) (K22AI112816) إلى as.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents | |||
| Bacto agar, dehydrated | BD Difco | 214010 | |
| Antibiotic-Antimycotic (100X) | Life Technologies | 15240062 | Aliquot < 1 mL and store at -20 °C |
| Calcein-acetoxymethyl ester (calcein-AM) | Life Technologies | C34852 | Calcein Acetoxymethyl (AM) |
| Calcium chloride, anhydrous | Sigma-Aldrich | C1016 | |
| D-Glucose | Fisher Chemical | D16500 | Dextrose |
| Dimethyl sulfoxide | Sigma-Aldrich | D5879 | |
| Folic acid | Sigma-Aldrich | F8758 | |
| LB-Miller | BD Difco | 244620 | |
| Magnesium chloride | Sigma-Aldrich | M8266 | |
| Yeast extract | Oxoid | LP0021 | |
| Special peptone | Oxoid | LP0072 | |
| Potassium hyroxide | Fisher Chemical | P250 | |
| Potassium phosphate monobasic | Sigma-Aldrich | P0662 | |
| Sodium phosphate dibasic heptahydrate | Fisher Chemical | S373 | |
| Vitamin B12 | Sigma-Aldrich | V2876 | |
| Strains | |||
| Dictyostelium discoideum | Siryaporn lab | Strain AX318 | |
| Escherichia coli | Siryaporn lab | Strain B/r17 | |
| Pseudomonas aeruginosa | Siryaporn lab | PA14 | PA14 strain19 |
| Pseudomonas aeruginosa ΔlasR | Siryaporn lab | AFS20.1 | PA14-derived strain20 |
| Supplies | |||
| 0.22 µm filter | Millipore | SCGPT01RE | For filter sterilization |
| Conical tube, 15 mL | Corning | 352097 | |
| Glass storage bottles | Pyrex | 13951L | 250 mL, 500 mL, 1000 mL |
| Petri dish, 6 cm diameter | Corning | 351007 | 60 x 15 mm polystyrene plates |
| Petri dish, 10 cm diameter | Fisher | FB0875712 | 100 x 15 mm polystyrene plates |
| Plastic containers with lid | Ziploc | 2.57E+09 | Square 3-cup containers |
| Glass plates | Bio-Rad | 1653308 | For preparing agar pads. Other glass plates may be used with similar dimensions. |
| Wooden sticks | Fisher | 23-400-102 | |
| Equipment | |||
| Eclipse Ti-E microscope | Nikon | MEA53100 | Microscope setup |
| 10X Plan Fluor Ph1 objective 0.3 NA | Nikon | MRH20101 | Microscope setup |
| Fluorescence excitation source | Lumencor | Sola light engine | Microscope setup |
| Fluorescence filter set | Semrock | LED-DA/FI/TX-3X3M-A-000 | Microscope setup |
| Orca Flash 4.0 V2 Camera | Hamamatsu | 77054098 | Microscope setup |
| ImageJ | NIH | v. 1.49 | Software for image analysis |
| MATLAB | Mathworks | R2013 | Software for image analysis |
| Orbital shaker incubator | VWR | 89032-092 | For growth of bacteria at 37 °C |
| Platform shaker | Fisher | 13-687-700 | For growth of amoebae at 22 °C |
| Spectrophotometer | Biochrom | Ultrospec 10 | |
| Undercounter refrigerated incubator | Fisher | 97990E | For growth of amoebae at 22 °C |
| Isotemp waterbath | Fisher | 15-462-21Q | For cooling media to 55 °C |
References
- Rasko, D. A., Sperandio, V. Anti-virulence strategies to combat bacteria-mediated disease. Nature Reviews Drug Discovery. 9 (2), 117-128 (2010).
- Coburn, B., Grassl, G. A., Finlay, B. B. Salmonella, the host and disease: a brief review. Immunology and Cell Biology. 85 (2), 112-118 (2007).
- Alibaud, L., et al. Pseudomonas aeruginosa virulence genes identified in a Dictyostelium host model. Cellular Microbiology. 10 (3), 729-740 (2008).
- Pukatzki, S., Kessin, R. H., Mekalanos, J. J. The human pathogen Pseudomonas aeruginosa utilizes conserved virulence pathways to infect the social amoeba Dictyostelium discoideum. Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 99 (5), 3159-3164 (2002).
- Cosson, P., et al. Pseudomonas aeruginosa Virulence Analyzed in a Dictyostelium discoideum Host System. Journal of Bacteriology. 184 (11), 3027-3033 (2002).
- Pukatzki, S., et al. Identification of a conserved bacterial protein secretion system in Vibrio cholerae using the Dictyostelium host model system. Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 103 (5), 1528-1533 (2006).
- Steinert, M., Heuner, K. Dictyostelium as host model for pathogenesis. Cellular Microbiology. 7 (3), 307-314 (2005).
- Hagele, S., Kohler, R., Merkert, H., Schleicher, M., Hacker, J., Steinert, M. Dictyostelium discoideum: a new host model system for intracellular pathogens of the genus Legionella. Cellular Microbiology. 2 (2), 165-171 (2000).
- Matz, C., et al. Pseudomonas aeruginosa uses type III secretion system to kill biofilm-associated amoebae. ISME Journal. 2 (8), 843-852 (2008).
- Hauser, A. R. The type III secretion system of Pseudomonas aeruginosa: infection by injection. Nature Reviews Microbiology. 7 (9), 654-665 (2009).
- Moore, P. L., MacCoubrey, I. C., Haugland, R. P. A rapid pH insensitive, two color fluorescence viability (cytotoxicity) assay. Journal of Cell Biology. 111, Abstract 304 58 (1990).
- Kaneshiro, E. S., Wyder, M. A., Wu, Y. -P., Cushion, M. T. Reliability of calcein acetoxy methyl ester and ethidium homodimer or propidium iodide for viability assessment of microbes. Journal of Microbiological Methods. 17 (1), 1-16 (1993).
- Siryaporn, A., Kuchma, S. L., O'Toole, G. A., Gitai, Z. Surface attachment induces Pseudomonas aeruginosa virulence. Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 111 (47), 16860-16865 (2014).
- Decherchi, P., Cochard, P., Gauthier, P. Dual staining assessment of Schwann cell viability within whole peripheral nerves using calcein-AM and ethidium homodimer. Journal of Neuroscience Methods. 71 (2), 205-213 (1997).
- Braut-Boucher, F., Pichon, J., Rat, P., Adolphe, M., Aubery, M., Font, J. A non-isotopic, highly sensitive, fluorimetric, cell-cell adhesion microplate assay using calcein AM-labeled lymphocytes. Journal of Immunological Methods. 178 (1), 41-51 (1995).
- Grieshaber, P., Lagrèze, W. A., Noack, C., Boehringer, D., Biermann, J. Staining of fluorogold-prelabeled retinal ganglion cells with calcein-AM: A new method for assessing cell vitality. Journal of Neuroscience Methods. 192 (2), 233-239 (2010).
- Witkin, E. M. Inherited Differences in Sensitivity to Radiation in Escherichia Coli. Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 32 (3), 59-68 (1946).
- Loomis, W. F. Sensitivity of Dictyostelium discoideum to nucleic acid analogues. Experimental Cell Research. 64 (2), 484-486 (1971).
- Rahme, L. G., Stevens, E. J., Wolfort, S. F., Shao, J., Tompkins, R. G., Ausubel, F. M. Common virulence factors for bacterial pathogenicity in plants and animals. Science. 268 (5219), 1899-1902 (1995).
- O'Loughlin, C. T., Miller, L. C., Siryaporn, A., Drescher, K., Semmelhack, M. F., Bassler, B. L. A quorum-sensing inhibitor blocks Pseudomonas aeruginosa virulence and biofilm formation. Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 110 (44), 17981-17986 (2013).
