Summary
Vi præsenterer her, en protokol for at måle virulens af planktoniske eller overflade-attached bakterier ved hjælp af D. discoideum (amøbe) som vært. Virulens måles over en periode på 1 time og vært dræbe kvantificeres ved hjælp af Fluorescens mikroskopi og billede analyse. Vi demonstrere denne protokol ved hjælp af bakterien P. aeruginosa.
Abstract
Traditionelle bakteriel virulens assays medføre langvarig udsættelse for bakterier i løbet af flere timer til værtsceller. I løbet af denne tid, kan bakterier undergå ændringer i fysiologi på grund af eksponering for værten vækstmiljø og tilstedeværelsen af værtsceller. Vi udviklede en analyse for at hurtigt måle virulens tilstand af bakterier, der minimerer omfanget som bakterier vokse ved tilstedeværelse af værtsceller. Bakterier og amøber blandes sammen og immobiliseret på et enkelt imaging fly ved hjælp af en agar pad. Proceduren, der bruger encellede fluorescens imaging med calcein-acetoxymethyl ester (calcein-AM) som en indikator for værten celle sundhed. Fluorescens i værtsceller analyseres efter 1 h af eksponering af værtsceller bakterier bruger epifluorescensmikroskop mikroskopi. Billede analyse software bruges til at beregne en vært drab indeks. Denne metode har været brugt til at måle virulens inden for planktoniske og overflade-attached Pseudomonas aeruginosa delpopulationer i den indledende fase af Biofilmdannelse og kan tilpasses til andre bakterier og andre faser af biofilm vækst. Denne protokol giver en hurtig og robust metode til måling af virulens og undgår mange af kompleksiteten forbundet med vækst og vedligeholdelse af pattedyr cellelinjer. Virulens fænotyper målt her ved hjælp af amøber er også blevet valideret ved hjælp af musen makrofager. Især blev denne analyse brugt til at etablere denne overflade vedhæftede upregulates virulens i P. aeruginosa.
Introduction
Bakteriel infektion er en af de førende årsager til dødelighed i menneske og dyr,1,2. Evnen til at måle virulens af bakterier i kulturer eller biofilm er vigtigt i sundhedssektoren og forskning indstillinger. Her, beskriver vi en alsidig, hurtig og relativt enkel metode til at kvantificere bakteriel virulens. Den Eukaryote organismer Dictyostelium discoideum (amøbe) bruges som model værtsorganisme. D. discoideum har været brugt som en vært til at identificere virulens faktorer i Pseudomonas aeruginosa (P. aeruginosa)3,4,5 og andre bakterier6,7 ,8 og er modtagelige for stort set de samme virulens faktorer der dræber pattedyrceller herunder type III sekretion9,10. Tidligere virulens assays ved hjælp af D. discoideum har involveret langvarig udsættelse for bakterier med D. discoideum celler i løbet af timer3,4,5. Protokollen, her præsenterer en hurtig metode til bestemmelse af virulens ved hjælp af denne amøbe. Denne protokol (figur 1) beskrives sådan: (1) vokse amøber axenically (i mangel af bakterier), (2) vokse bakterier til analysen, (3) forberede bakterier og værtsceller til mikroskopi, (4) udføre epifluorescensmikroskop mikroskopi, og (5) analysere amøbe fluorescens.
Amøber er i første omgang stribet ud fra frosne bestande og dyrket på en græsplæne af Escherichia coli (E. coli), hvor amøber producerer sporer. Disse sporer er plukket og inokuleres i en beriget medium for axenic vækst. Amøber vedligeholdes gennem axenic vækst i næringsrige forhold, indtil de er klar til at blive blandet med bakterier til vurdering af bakteriel virulens. Overlevelse eller død af amøber er kvantificeret ved måling af fluorescens af calcein-acetoxymethyl (calcein-AM), som er kløvet af intracellulære esteraser, og derved aktiveret for fluorescens11,12. Levende amøber udviser ringe eller ingen fluorescens indskærpe og døende celler fluorescerer intenst. Dette resultat skyldes en lille eller ingen indarbejdelse af calcein-AM i sund amøber og indarbejdelse og spaltning af substrat i stressede amøber13. Denne adfærd er især adskiller sig fra calcein-AM fluorescens i pattedyrceller11,14,15,16.
Bakterier, der vil blive vurderet for virulens dyrkes separat. Her, beskriver vi, hvordan at måle virulens opportunistiske sygdomsbærer P. aeruginosa og detaljer, hvordan at kvantificere virulens planktoniske (svømning) og overflade-attached delpopulationer. Denne protokol kan tilpasses til at teste virulens af andre bakterier. I afsnittet repræsentant resultater vi vise at virulens aktiveres i overflade-attached celler og er lav i planktoniske celler, som blev rapporteret tidligere13. Virulens-aktiveret overflade-attached P. aeruginosa dræber amøber, mens ikke-virulente planktoniske celler forbruges af amøber. Hvis virulens af planktoniske bakterier er udelukkende bliver analyseret, kan bakterier blive kulturperler i almindelige kultur rør i stedet for at bruge petriskåle, som beskrevet i protokollen.
Vækst af amøber og P. aeruginosa kulturer skal koordineres, således at P. aeruginosa kulturer nå den tilsigtede vækstfase, mens amøber voksende på steady state i næringsrige betingelser. Denne betingelse normalt kræver amøber kulturer at være fortyndet mindst 1 dag før, når de er blandet med bakterier. Amøber og bakterier er immobiliseret bruger agar pads, er co rugede for 1t og afbildet ved hjælp af en lav opløsning (10 X, numerisk blænde 0,3) objektive, grønne fluorescens protein (NGL) filtre og en billeddannelse kamera. Analyse kan udføres ved hjælp af frit tilgængelige ImageJ software eller tilpasset billede analyse software. Vores analyse blev udført ved hjælp af vores egen software skrevet ved hjælp af en videnskabelig analyse pakke13. Softwaren skal oprette en maske ved hjælp af fase kontrast billede og uddrag fluorescens værdier fra de Afmaskede områder i fluorescens billede. Fluorescens værdier er gennemsnit over mindst 100 celler, hvilket resulterer i en numerisk vært drab indeks.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle eksperimentelle procedurer blev udført på University of California, Irvine.
1. buffere og løsninger
- Forbered Lysogeny bouillon (LB) i en 1 L glasflaske ved at tilføje 25 g af LB-Miller mix i 1 L dobbeltdestilleret vand (ddH2O). Petriskåle, tilføje en ekstra 20 g af agar. Autoklave til at sterilisere. Hæld 25 mL af smeltet agarsubstratet i 10 cm-diameter petriskåle og lad den størkne ved stuetemperatur. Gemme flydende medier ved stuetemperatur og agar plader ved 4 ° C.
- Forberede glukose gær pepton (GYP) plader i en 1 L glasflaske ved at blande 1 g af D-glucose, 2 g af pepton, 0,25 g gær extract, 4,2 g KH2PO4, 5,1 g Na2HPO47 H2O og 25 g agar i 1 L i ddH2 O. autoklave til at sterilisere. Hæld 25 mL af smeltet agar til 10 cm-diameter petriskåle og lad den størkne ved stuetemperatur. Opbevares ved 4 ° C.
- Forberede pepton Sørensen (PS) medium i et 1 L glasflaske ved at blande 10 g af pepton, 7 g gær extract, 15 g af D-glucose, 0,12 g Na2HPO47 H2O, 1.4 g KH2PO4, 40 µg af vitamin B12 , og 80 µg af folinsyre i 800 mL af Hedeselskabet2O. kalibrere en elektronisk pH-meter med pH 4 og pH 7 standarder anvendes pH-meteret ikke inden for en dag.
- Måle pH i PS medium ved hjælp af pH-meteret. Tilføj enten 5 M KOH eller 5 M H3PO4 for at justere pH-værdien til 6,5. Justere den endelige mængden til 1 L ved hjælp af Hedeselskabet2O. Filter sterilisere ved hjælp af 0,22 µm vakuum filter og opbevares ved 4 ° C.
Bemærk: Gå forsigtigt frem med pH justeringer ved at bære beskyttelsesudstyr, herunder handsker, beskyttelsesdragt, beskyttelse af øjne og ansigt beskyttelse.
- Måle pH i PS medium ved hjælp af pH-meteret. Tilføj enten 5 M KOH eller 5 M H3PO4 for at justere pH-værdien til 6,5. Justere den endelige mængden til 1 L ved hjælp af Hedeselskabet2O. Filter sterilisere ved hjælp af 0,22 µm vakuum filter og opbevares ved 4 ° C.
- Forberede 10 x udvikling Buffer Prime (DB') buffer i et 1 L glasflaske ved at tilføje 3,4 g KH2PO4, 13.4 g Na2HPO4 7 H2O og Hedeselskabet2O til en samlet maengde paa 800 mL. Kalibrere en elektronisk pH-meter med pH 4 og pH 7 standarder anvendes pH-meteret ikke inden for en dag.
- Måle pH buffer ved hjælp af elektroniske pH-meter. Juster pH-værdien til 6,5 ved forsigtigt tilføje enten 5 M KOH eller 5 M H3PO4 efter behov. Justere den endelige rumfang til 1 L ved hjælp af Hedeselskabet2O og steriliseres ved autoklavering. Opbevares ved stuetemperatur.
Bemærk: Gå forsigtigt frem med pH justeringer ved at bære beskyttelsesudstyr, herunder handsker, beskyttelsesdragt, beskyttelse af øjne og ansigt beskyttelse.
- Måle pH buffer ved hjælp af elektroniske pH-meter. Juster pH-værdien til 6,5 ved forsigtigt tilføje enten 5 M KOH eller 5 M H3PO4 efter behov. Justere den endelige rumfang til 1 L ved hjælp af Hedeselskabet2O og steriliseres ved autoklavering. Opbevares ved stuetemperatur.
- Gøre 1 x udvikling buffer (DB) ved blanding af 100 mL 10 x DB' buffer med 1 mL steriliseret 2 M MgCl2, og 1 mL steriliseret 1 M CaCl2. Justere den endelige rumfang til 1 L i et 1 L glasflaske ved hjælp af en autoklaveres steriliseret ddH2O. butik ved stuetemperatur.
- Forberede PS:DB medium i et 1 L glasflaske ved blanding af 100 mL steriliseret PS medium, 100 mL steriliseret 10 x DB' buffer og steriliseret ddH2O til et samlet volumen på 1 L. Supplement med 1 mL steriliseret 2 M MgCl2 og 1 mL steriliseret 1 M CaCl 2. butikken ved 4 ° C.
- Forberede calcein-AM stamopløsningen ved at tilføje 50 µL af DMSO 50 µg af calcein-AM i plast beholder leveret af fabrikanten. Opbevares ved-20 ° C.
2. vækst og vedligeholdelse af amøber
- Vokse E. coli stamme Kamis17 som en fødekilde for amøber i den indledende vækstperiode. Streak E. coli Kamis fra en frossen bestand opbevares ved-80 ° C på en LB-agar plade og inkuberes ved 37 ° C natten over at få enkelt kolonier.
- Podes en enkelt koloni af E. coli Kamis til 2 mL af LB medium og inkuberes i en roller tromle eller en shaker ved 37 ° C natten over.
- Bringe natten E. coli kultur til rumtemperaturen. Bruger en træpind, podes amøber fra en frossen bestand opbevares ved-80 ° C til 750 µL af overnight kultur.
Bemærk: Brug D. discoideum stamme AX3, som er i stand til at axenic vækst18. Dette trin kræver ikke axenic vækst, men efterfølgende trin vil have hans krav. - Straks tilføje 700 µL af amøber -E. coli blandingen på en Glucose gær pepton (GYP) plade. Sprede kultur jævnt på overfladen af pladen ved at vippe det frem-og-tilbage og side til side efter behov. Undgå brug af en sprederen.
- GUF pladen anbringes med agar opad i en boks, der fastholder høj luftfugtighed. Bruge to engangs plastic containere (183 cm x 183 cm x 91 cm) stablet på toppen af hinanden. Udfylde den nederste beholder med ca. 25 mL vand og Placer den øverste container med flere 0,5 cm-diameter huller boret gennem gulvet af beholderen at tillade fugt at flytte fra vandtanken til objektbeholderen top.
- Inkuber guf plade og boks ved 22 ° C i 4-5 dage indtil amøbe sporer er observeret, voksende nær overfladen af pladen (figur 2). Bruge en nedkølet inkubator for at udruge plader i stedet for inkubation ved stuetemperatur.
Bemærk: Når sporerne er vokset, de forbliver levedygtige på plader i flere uger, når den opbevares ved 4 ° C. Gemme pladerne med agar side opad. Efter 3-4 dages inkubation, kan zoner clearing inden for den bakterielle græsplæne observeres, der angiver starten af amoeba sporedannelse.- Observere små amøber sporer over pladen overflade efter 4-5 dages inkubation (figur 2).
Bemærk: Ikke vokse amøber i længere tid end en uge, så kvaliteten af sporerne falder uden for denne periode.
- Observere små amøber sporer over pladen overflade efter 4-5 dages inkubation (figur 2).
- Indsamle amøber sporerne til at forberede den axenic vækst af amøber af fejer en steril 1 mL pipette tip parallelt med overfladen af pladen. Indsamle sporer fra halvdelen af en 10 cm petriskål.
Bemærk: Undgå at røre spidsen på overfladen af agar plade som denne bevægelse vil indsamle store mængder af E. coli. - Resuspend amøber på spidsen af pipetten af nedsænkning spidsen i 1 mL af PS medium og forsigtigt pipettering op og ned.
- Overføre podede blandingen til en 250 mL målekolbe indeholdende 25 mL af PS medium suppleret med antibiotika-antimykotikum løsningen på 0,25 x koncentration.
Bemærk: Gemme antibiotikum-antimykotikum løsningen som 250 µL alikvoter ved-20 ° C. Undgå gentagne cyklusser af optøning og indefrysning af denne løsning, da dette kan mindske dens effektivitet. - Vokse amøber axenically ved 22 ° C i en roterende shaker ved 100 omdrejninger i minuttet. For virulens assay i trin 5, dyrke celler til en optisk tæthed målt på 600 nm (OD600) af 0,2 til 0,5.
Bemærk: Dette trin kræver 3-4 dage af vækst fra tidspunktet for podning (trin 2.7). Hvis celler er vokset til en højere massefylde, fortyndes kultur tilbage i PS medium til en OD600 på 0,05 eller lavere og vokse tilbage til en OD600 af 0,2 til 0,5.
3. vækst af P. aeruginosa
- Vælge en enkelt koloni af P. aeruginosa fra en LB-plade, podes det ind i et 2 mL PS:DB kultur og vokse natten over ved 37 ° C til mætning.
Bemærk: Læg ikke antibiotikum-antimykotikum løsningen PS:DB medier. - Fortynd overnight kultur 1: 100 eller 1:1,000 i en 6 cm-diameter petriskål ved hjælp af PS:DB. Hvis virulens af planktoniske celler er udelukkende at blive analyseret, vokse kulturer ved hjælp af konventionelle kultur rør i stedet. Ryste kulturen på en benchtop rotator sat til 100 rpm ved 37 ° C.
- Høst kulturer på bestemte tidspunkter at sikre reproducerbarhed. Ved 30 min. til 1 time før vurderingen af virulens, udarbejde en agar pad som beskrevet i afsnit 4.
Bemærk: Virulens i P. aeruginosa er foranlediget af ca 8 h vækst på overflader. - For at isolere de overflade-attached celler, fjerne den flydende medium fra petriskålen, skylles straks med 1 mL af DB buffer til at fjerne planktoniske celler og Fortsæt til trin 5.1, straks.
Forsigtig: Ikke vaskes længere end 30 s som dette vil forurolige og løsne overfladen-attached celler og kan påvirke virulens måling. - For at isolere planktoniske celler, overføre 10 µL af kulturen fra petriskålen til en ren petriskål og Fortsæt til trin 5.1, straks.
4. mikroskopi - forberedelse af Agar Pad
- Forberede agar puder ca 30 min til 1 time før amøber er klar til at blive blandet med P. aeruginosa.
- Mikrobølgeovn 50 mL af 1% (w/v) agar i DB buffer i en 250 mL kolbe. Mix hver 20 s indtil klumper af agar forsvinde.
- Afkøle den smeltede agar ved at placere det i forvarmet 55 ° C vandbad i 15 min.
- Tilføj 15 µL af calcein-AM stamopløsningen til 15 mL af den smeltede agar i en konisk slange. Mix af blidt vende røret 4 - 5 gange og gå straks til næste trin.
Bemærk: Udfør dette trin i et polypropylen 15 mL centrifugeglas. Brug ikke en tyk glasbeholder, da dette vil medføre agar størkne for hurtigt. - Hæld smeltet agar blandingen på toppen af en 12 cm x 10 cm glasplade og tillade agar størkne i 10 minutter ved stuetemperatur. Skær størknede agar pad i mindre 1,5 cm x 1,5 cm sektioner ved at placere glasplade over et trykt gitter og skære langs gitteret ved hjælp af en metal lineal.
- Holde gel hydreret i en fugtig kasse, indtil det er klar til brug.
5. mikroskopi - forberedelse af bakterier-amøbe prøven til billedbehandling
- For at assay virulens i overflade-attached bakterieceller, tilføjes 10 µL af amoeba celler fra trin 2.10 overflade-attached bakterier fra trin 3.4.
Bemærk: Dette trin beskriver blanding af amøber med bakterier. - Bland 10 µL af amoeba celler fra trin 2.10 med 10 µL af planktoniske bakterier fra trin 3.5 for at assay virulens af planktoniske celler.
Bemærk: Ikke vaskes axenically vokset amøbe celler (på en OD600 af 0,2 til 0,5) før blanding med bakterier. Ingen E. coli vækst vil observeres i amøbe kultur som følge af brugen af antibiotika-antimykotikum løsningen. - Umiddelbart Placer 1,5 cm x 1,5 cm calcein-AM agar pad fra trin 4.5 på toppen af bakterier-amøbe blandingen på petriskål overflade.
Bemærk: Placer agar puden på toppen af blandingen ved hjælp af en hurtig jævn bevægelse. Sænke ikke pad langsomt ind på blandingen, da denne bevægelse har tendens til at skubbe celler mod periferien og væk fra undersiden af puden. Dette trin sikrer, at bakterier og amøber er jævnt blandet, immobiliserede og at begge celle typer er begrænset til den samme plan. - Fjern overskydende væske ved forsigtigt pipettering ud enhver resterende væske, der omgiver agar pad. Tillad petriskål til tørre i 20 min. ved stuetemperatur.
- Dække med petriskål med et låg og inkuberes immobiliseret amøbe-bakterier blandingen ved stuetemperatur i en yderligere 40 min. Fortsæt til trin 6.1.
Bemærk: Det er vigtigt at udruge alle prøver i det samme tidsrum, som baggrund fluorescens stigninger over tid. En inkubationstiden 1 h anbefales. Inkubationer længere end 1 h er mindre reproducerbare som amøber celler kan begynde at briste.
6. mikroskopi - billedet erhvervelse
- Billede amøber ved hjælp af et fluorescens mikroskop i stand til at erhverve brightfield og grøn fluorescens billeder. Til grønne fluorescens, bruge grønne fluorescens protein (NGL) filtre med 474/27 nm og 525/45 nm for excitation og emission, henholdsvis. Bruge en 10 X (≥0.3 numerisk blænde) mål til at afbilde amøber.
Bemærk: Calcein-AM i agaren vil medføre døende amøber til fluorescens i grønt fluorescens-kanal. Sund amøber er ellers ikke fluorescerende. - Justere erhvervelse gange for fasekontrast, normal god landbrugspraksis kanaler at begrænse fototoksicitet, og optimere det dynamiske område af billedet intensiteter. Erstatte fasekontrast differential interferens kontrast (DIC), hvis det er nødvendigt.
Bemærk: Brug 100-200 ms engagementer for fasekontrast og normal god landbrugspraksis fluorescens hvis det er muligt. Holde de instrument og eksponering indstillinger uændret gennem hele eksperimentet. Dette er kritisk for computing vært drab indeks. - Erhverve billeder for mindst 100 amøbe celler for at opnå gode statistikker for beregning af værten drab indeks.
7. billede analyse og vært drab indeks
- Udføre billedanalyse ved hjælp af ImageJ.
- Åbn filen fase kontrast billede i ImageJ ved at klikke på fil | Åben og vælge billedet. Justere tærsklen ved at klikke på billede | Analyse | Tærskel. Justere den øvre og nedre grænse for at vælge kun intensitet peak (fig. 3A).
- Konvertere billedet til et binært tal ved at klikke på proces | Binære | Gøre binære. Udfylde huller ved at vælge processen | Binære | Udfylde huller.
Bemærk: Ved hjælp af billedet i figur 1 som kilde, vil trin 7.1-7.2 producere et billede, hvor amøber og overflade-attached bakterier vises som mørke regioner (fig. 3B). - Kontroller, at afkrydsningsfelterne område og mener grå værdi er markeret i analyser | Angive mål. Måle den omtrentlige størrelse af amøber ved at vælge værktøjet Ellipse på hovedværktøjslinjen. Klik på analyser | Foranstaltning og Bemærk område af repræsentative amøber.
- Skabe masker for amøber ved at klikke på analyser | Analysere partikler. Angiv det område, der vil omfatte amøber men udelukke bakterier i størrelsesboksen. Vælg masker i dropdown menuen for Vis indstilling. Kontroller, at afkrydsningsfeltet Føj til Manager er markeret.
- Klik på OK og et billede som viser kun amøber og en ROI Manager dialogboks vil vises (figur 3C).
- Åbn fluorescens billedet ved hjælp af fil | Åben og vælge den relevante fil. Vælg alle regioner i ROI Manager ved at holde Skift nede og klikke på hver region på listen (figur 3D).
- Klik på knappen foranstaltning i ROI Manager. Dette vil åbne en resultater vindue, der viser den gennemsnitlige intensitet værdi af hver amøbe.
- Kopiere fluorescens værdier for hver amøbe til et regnearksprogram og beregne værten dræbe indeks ved at tage gennemsnittet af alle fluorescens.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Vi voksede vildtype P. aeruginosa stamme PA1419 eller en ΔlasR stamme20 i den samme PA14 baggrund i 6 cm-diameter petriskåle og analyseres virulens af planktoniske og overflade-attached celler. Kulturer var podes fra single-kolonier i PS:DB kulturer, dyrket natten over i kultur rør i en rulle tromme ved 37 ° C til mætning, fortyndet 1: 100 i PS:DB, dyrket i 8 timer i 6 cm-diameter petriskåle ryster på 100 rpm, og planktoniske og overflade-attached P. aeruginosa delpopulationer blev isoleret som beskrevet i afsnit 3.
Overflade-attached naturen-type P. aeruginosa dræbt amøber, som fremgik af en runde amøbe celle figur og observation af calcein fluorescens (figur 4A, øverst til venstre panel). Dette resulterede i en høj vært drab indeks (fig. 4B). Planktoniske celler blev forbrugt af amøber, som blev anført af amorf amøbe celle figurer og observation af ringe eller ingen calcein fluorescens over baggrunden (figur 4A, top-højre panel). Dette resulterede i en relativt lav vært drab indeks (fig. 4B). Både overflade-attached og planktoniske celler af ΔlasR stamme blev forbrugt af amøber, der blev angivet med lav vært dræbe indeks (fig. 4B, nederste panel). Resultaterne viser således, at virulens er upregulated i overflade-attached befolkninger og LasR er nødvendig for overflade-aktiveret virulens, som blev beskrevet tidligere13. Disse eksperimenter dermed etablere robust positive og negative kontroller for fremtidige eksperimenter.
Figur 1 : Skematisk beskrive overblik over virulens assay. (1) amøbe værtsceller dyrkes, (2) bakteriel kulturer er vokset, og (3) planktoniske eller overflade-attached bakterieceller er blandet med amøber og immobiliseret på samme tænkelig plan ved hjælp af en agar pad. Værtsceller er kvantificeret for sundhed ved hjælp af calcein-AM, Fluorescens mikroskopi og billedanalyse. Skala søjler repræsenterer 50 µm. venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2 : Amøbe sporer på en guf 10 cm-diameter petriskål plade efter 5 dage vækst. Sporer form over petriskål overflade. Indsatsen viser et forstørret billede af et enkelt afsnit af parabol overflade. Overfladen kan indeholde bakterier, der ikke kan skimtes på denne beslutning. Skala barer i hoved- og indsat billeder repræsenterer 1 cm og 2 mm, henholdsvis. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3 : Billede analyse af mikroskopi data ved hjælp af ImageJ. (A) udvalg af peak intensitet ved hjælp af værktøjet tærskel. (B) resulterende billede efter fase kontrast kildebillede fra figur 1 er omdannet til et binært billede. (C) resulterende billede efter at billedet er efterfølgende konverteret til en maske. (D) Screenshots af udvælgelsen af regioner af interesse ved hjælp af ROI Manager. Skala søjler repræsenterer 50 µm. venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4 : Repræsentative resultater af amoeba drab af P. aeruginosa celler. (A) Calcein-AM fluorescens overlejret på fase mikroskopi billeder og (B) vært dræbe indeks af overflade-attached eller planktoniske wild-type eller ΔlasR P. aeruginosa. Wild-type overflade-attached P. aeruginosa dræber amøber, der udviser betydelig calcein fluorescens og dermed en betydelig vært dræbe indeks. Planktoniske celler forbruges af amøber, der udviser lidt calcein fluorescens og producere et lavt vært drab indeks. Både overflade-attached og planktoniske ΔlasR forbruges af amøber og resulterer i en lav vært drab indeks. Skala barer repræsenterer 50 µm. barer angiver gennemsnittet af tre uafhængige forsøg og fejl barer angiver standardafvigelsen. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Denne protokol beskriver en hurtig og kvantitativ metode til analyse virulens i P. aeruginosa. Denne protokol kan testes med andre bakterier. Det er dog vigtigt at huske at vækstmediet bør være forenelig med amøbe vækstbetingelser. Især har vi optimeret protokol bruger PS:DB som bakterievækst medium. Hvis der anvendes en anden kan det være nødvendigt at udføre en vækst medier-kun kontrol, der er ingen til stede for at kontrollere, at mediet er kompatibel med amøber bakterieceller.
Denne metode kan udvides analysen vækst fase afhængighed af virulens. Især kan bakteriel kulturer dyrkes til en bred vifte af gange i stedet for et fast tidspunkt. Vores erfaring er det vigtigt at høste bakteriel kulturer på specifikke tidspunkter som virulens i P. aeruginosa synes at være afhængig af vækstfase. Vi observerede, at virulens i P. aeruginosa blev induceret mellem 6-8 h af vækst i petriskåle.
Mange variabler tilknyttet vækst miljøet påvirker vært sundhed og bakteriel virulens. Det er således vigtigt at bruge passende positive og negative kontroller for hvert forsøg. Vi har brugt wild-type overflade-attached P. aeruginosa som en positiv kontrol og ΔlasR som en negativ kontrol. Vi foreslår, at udfører disse kontroller hver gang virulens analysen udføres. Disse kontrolelementer er vigtige for at kontrollere, at værten celle dødsfald ikke er på grund af eventuelle eksterne faktorer, såsom alder af amøber, variationer i temperatur m.m. Derudover foreslår vi udfører alle eksperimenter i biologiske replikat at etablere reproducerbarhed af virulens fænotyper.
Vi har udført vores eksperimenter med amøber med en optisk tæthed på 0,2 til 0,5 efter en fortynding af på mindst 1:10 og har reguleret temperatur af amøber kultur nøjagtigt til 22 ° C. Uden for disse vækstbetingelser, har vi fundet, at modtageligheden over amøber til virulente bakterier og reproducerbarhed af virulens assay er ændret. Amøbe celler pellet relativt hurtigt. Sikre, at kulturer er genopslemmes af pipettering op og ned umiddelbart før optisk tæthed måling er foretaget. Dyrke ikke amøbe kulturer højere end en OD600 tæthed af 1 som vækst til høje tætheder påvirker reproducerbarhed af eksperimentet. Udbrede axenic kulturer ikke længere end 1 uge. Det er derudover vigtigt at kontrollere, at amøber dyrkes axenically (begyndende i trin 2.7) gennem 20 X eller høj forstørrelse mikroskopi, sådan at andre mikrober er ikke til stede i kulturen. Hvis kulturer er grumset i trin 2.10 efter 2 dage af vækst efter indledende podning, ville dette sandsynligvis indikere tilstedeværelsen af mikrobielle forurenende stof. Hvis der er mistanke om bakteriel forurening, foreslår vi vokser 1 mL af amøber kulturen ved 37 ° C i 4-8 h. Observation af en grumset kultur under disse betingelser ville foreslå bakteriel forurening. Hvis gentagen bakteriel forurening er observeret, skal antibiotikum-antimykotikum løsningen udskiftes.
Værten drab indeks er en pålidelig indikator for, om en bakteriel befolkning er ondartet eller Avirulente. Denne analyse ikke er blevet optimeret til sammenligninger mellem forskellige mellemliggende niveauer af virulens (dvs. lav virulens i forhold til medium-lav virulens) og overfortolkning af resultaterne bør undgås. Mulige metoder til at løse dette problem er en gentagelse af virulens analysen over flere dage ved hjælp af forskellige partier af værtsceller for at etablere tilliden til resultaterne, udfører yderligere Repliker eksperimenter, og udfører passende statistiske analyser.
Mangfoldighed af infektion (MOI) af planktoniske celler kan styres ved at normalisere Ekstinktionen af bakteriekulturen. Denne analyse kontrollerer dog ikke MOI af overflade-attached bakterieceller. Vi har observeret, at bakteriel overflade massefylde stiger med tiden. Således, justere vækst tid i petriskålen kan resultere i en tilsvarende ændring i overfladen tæthed. Desuden afhænger den overflade tæthed materiale af overfladen. P. aeruginosa celler tillægger polystyren overflader i analysen beskrives her. Andre overflader, herunder glas, agar og polyacrylamid kan dog også være analyserede13. Overflade tætheden af enkelt-lags bakteriel befolkninger kan måles ved hjælp af 100 X forstørrelse fase mikroskopi. Hvis overfladen tætheder er multi-lag, kan Konfokal mikroskopi være passende.
Her har vi beskrevet en hurtig og robust metode til at måle bakteriel virulens. Ved at ændre individuelle parametre såsom inkuberingstider, den fluorescerende farvestof, den bakterielle stamme, vært celletype eller vækst medier, kan denne metode forlænges for at kvantificere virulens på tværs af en bred vifte af organismer og vækstbetingelser.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ikke noget at oplyse.
Acknowledgments
KP og som skrev og revideret håndskriftet. KP udført eksperimenter og analyse. Dette arbejde blev støttet af National Institutes of Health (NIH) karriere overgang Award (K22AI112816) til AS.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents | |||
| Bacto agar, dehydrated | BD Difco | 214010 | |
| Antibiotic-Antimycotic (100X) | Life Technologies | 15240062 | Aliquot < 1 mL and store at -20 °C |
| Calcein-acetoxymethyl ester (calcein-AM) | Life Technologies | C34852 | Calcein Acetoxymethyl (AM) |
| Calcium chloride, anhydrous | Sigma-Aldrich | C1016 | |
| D-Glucose | Fisher Chemical | D16500 | Dextrose |
| Dimethyl sulfoxide | Sigma-Aldrich | D5879 | |
| Folic acid | Sigma-Aldrich | F8758 | |
| LB-Miller | BD Difco | 244620 | |
| Magnesium chloride | Sigma-Aldrich | M8266 | |
| Yeast extract | Oxoid | LP0021 | |
| Special peptone | Oxoid | LP0072 | |
| Potassium hyroxide | Fisher Chemical | P250 | |
| Potassium phosphate monobasic | Sigma-Aldrich | P0662 | |
| Sodium phosphate dibasic heptahydrate | Fisher Chemical | S373 | |
| Vitamin B12 | Sigma-Aldrich | V2876 | |
| Strains | |||
| Dictyostelium discoideum | Siryaporn lab | Strain AX318 | |
| Escherichia coli | Siryaporn lab | Strain B/r17 | |
| Pseudomonas aeruginosa | Siryaporn lab | PA14 | PA14 strain19 |
| Pseudomonas aeruginosa ΔlasR | Siryaporn lab | AFS20.1 | PA14-derived strain20 |
| Supplies | |||
| 0.22 µm filter | Millipore | SCGPT01RE | For filter sterilization |
| Conical tube, 15 mL | Corning | 352097 | |
| Glass storage bottles | Pyrex | 13951L | 250 mL, 500 mL, 1000 mL |
| Petri dish, 6 cm diameter | Corning | 351007 | 60 x 15 mm polystyrene plates |
| Petri dish, 10 cm diameter | Fisher | FB0875712 | 100 x 15 mm polystyrene plates |
| Plastic containers with lid | Ziploc | 2.57E+09 | Square 3-cup containers |
| Glass plates | Bio-Rad | 1653308 | For preparing agar pads. Other glass plates may be used with similar dimensions. |
| Wooden sticks | Fisher | 23-400-102 | |
| Equipment | |||
| Eclipse Ti-E microscope | Nikon | MEA53100 | Microscope setup |
| 10X Plan Fluor Ph1 objective 0.3 NA | Nikon | MRH20101 | Microscope setup |
| Fluorescence excitation source | Lumencor | Sola light engine | Microscope setup |
| Fluorescence filter set | Semrock | LED-DA/FI/TX-3X3M-A-000 | Microscope setup |
| Orca Flash 4.0 V2 Camera | Hamamatsu | 77054098 | Microscope setup |
| ImageJ | NIH | v. 1.49 | Software for image analysis |
| MATLAB | Mathworks | R2013 | Software for image analysis |
| Orbital shaker incubator | VWR | 89032-092 | For growth of bacteria at 37 °C |
| Platform shaker | Fisher | 13-687-700 | For growth of amoebae at 22 °C |
| Spectrophotometer | Biochrom | Ultrospec 10 | |
| Undercounter refrigerated incubator | Fisher | 97990E | For growth of amoebae at 22 °C |
| Isotemp waterbath | Fisher | 15-462-21Q | For cooling media to 55 °C |
References
- Rasko, D. A., Sperandio, V. Anti-virulence strategies to combat bacteria-mediated disease. Nature Reviews Drug Discovery. 9 (2), 117-128 (2010).
- Coburn, B., Grassl, G. A., Finlay, B. B. Salmonella, the host and disease: a brief review. Immunology and Cell Biology. 85 (2), 112-118 (2007).
- Alibaud, L., et al. Pseudomonas aeruginosa virulence genes identified in a Dictyostelium host model. Cellular Microbiology. 10 (3), 729-740 (2008).
- Pukatzki, S., Kessin, R. H., Mekalanos, J. J. The human pathogen Pseudomonas aeruginosa utilizes conserved virulence pathways to infect the social amoeba Dictyostelium discoideum. Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 99 (5), 3159-3164 (2002).
- Cosson, P., et al. Pseudomonas aeruginosa Virulence Analyzed in a Dictyostelium discoideum Host System. Journal of Bacteriology. 184 (11), 3027-3033 (2002).
- Pukatzki, S., et al. Identification of a conserved bacterial protein secretion system in Vibrio cholerae using the Dictyostelium host model system. Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 103 (5), 1528-1533 (2006).
- Steinert, M., Heuner, K. Dictyostelium as host model for pathogenesis. Cellular Microbiology. 7 (3), 307-314 (2005).
- Hagele, S., Kohler, R., Merkert, H., Schleicher, M., Hacker, J., Steinert, M. Dictyostelium discoideum: a new host model system for intracellular pathogens of the genus Legionella. Cellular Microbiology. 2 (2), 165-171 (2000).
- Matz, C., et al. Pseudomonas aeruginosa uses type III secretion system to kill biofilm-associated amoebae. ISME Journal. 2 (8), 843-852 (2008).
- Hauser, A. R. The type III secretion system of Pseudomonas aeruginosa: infection by injection. Nature Reviews Microbiology. 7 (9), 654-665 (2009).
- Moore, P. L., MacCoubrey, I. C., Haugland, R. P. A rapid pH insensitive, two color fluorescence viability (cytotoxicity) assay. Journal of Cell Biology. 111, Abstract 304 58 (1990).
- Kaneshiro, E. S., Wyder, M. A., Wu, Y. -P., Cushion, M. T. Reliability of calcein acetoxy methyl ester and ethidium homodimer or propidium iodide for viability assessment of microbes. Journal of Microbiological Methods. 17 (1), 1-16 (1993).
- Siryaporn, A., Kuchma, S. L., O'Toole, G. A., Gitai, Z. Surface attachment induces Pseudomonas aeruginosa virulence. Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 111 (47), 16860-16865 (2014).
- Decherchi, P., Cochard, P., Gauthier, P. Dual staining assessment of Schwann cell viability within whole peripheral nerves using calcein-AM and ethidium homodimer. Journal of Neuroscience Methods. 71 (2), 205-213 (1997).
- Braut-Boucher, F., Pichon, J., Rat, P., Adolphe, M., Aubery, M., Font, J. A non-isotopic, highly sensitive, fluorimetric, cell-cell adhesion microplate assay using calcein AM-labeled lymphocytes. Journal of Immunological Methods. 178 (1), 41-51 (1995).
- Grieshaber, P., Lagrèze, W. A., Noack, C., Boehringer, D., Biermann, J. Staining of fluorogold-prelabeled retinal ganglion cells with calcein-AM: A new method for assessing cell vitality. Journal of Neuroscience Methods. 192 (2), 233-239 (2010).
- Witkin, E. M. Inherited Differences in Sensitivity to Radiation in Escherichia Coli. Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 32 (3), 59-68 (1946).
- Loomis, W. F. Sensitivity of Dictyostelium discoideum to nucleic acid analogues. Experimental Cell Research. 64 (2), 484-486 (1971).
- Rahme, L. G., Stevens, E. J., Wolfort, S. F., Shao, J., Tompkins, R. G., Ausubel, F. M. Common virulence factors for bacterial pathogenicity in plants and animals. Science. 268 (5219), 1899-1902 (1995).
- O'Loughlin, C. T., Miller, L. C., Siryaporn, A., Drescher, K., Semmelhack, M. F., Bassler, B. L. A quorum-sensing inhibitor blocks Pseudomonas aeruginosa virulence and biofilm formation. Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 110 (44), 17981-17986 (2013).
