Summary
Her presenterer vi en protokoll for å måle virulens planktoniske eller overflate-vedlagt bakterier bruker D. discoideum (amoeba) som vert. Virulens måles over en periode på 1 time og vert drepe er kvantifisert fluorescens mikroskopi og bilde analyse. Vi viser denne bakterien P. aeruginosa-protokoll.
Abstract
Tradisjonelle bakteriell virulens analyser innebære langvarig eksponering av bakterier i løpet av flere timer til verten cellene. Samtidig kan bakterier gjennomgå endringer i fysiologi eksponering vertsmiljøet vekst og tilstedeværelse av verten cellene. Vi utviklet en analysen for å raskt måle virulens delstaten bakterier som minimerer omfanget som bakterier vokse i nærvær av verten cellene. Bakterier og amoebae er blandet sammen og immobilisert på et enkelt tenkelig plan med en agar pad. Fremgangsmåten bruker encellede fluorescens bildebehandling med calcein-acetoxymethyl ester (calcein-AM) som en indikator på verten cell helse. Fluorescens vert celler analyseres etter 1 h eksponering av verten cellene til bakterier bruker epifluorescence mikroskopi. Image analysis software brukes til å beregne en vert drapet indeks. Denne metoden er brukt til å måle virulens innen planktoniske og overflaten tilknyttet Pseudomonas aeruginosa undergrupper under den innledende fasen av biofilm formasjon og kan tilpasses andre bakterier og andre stadier av biofilm vekst. Denne protokollen gir en rask og robust metode for å måle virulens og unngår mange av kompleksiteten knyttet til vekst og vedlikehold av pattedyr linjer. Virulens fenotyper målt her bruker amoebae har også validert ved hjelp av musen makrofager. Spesielt ble denne analysen brukt til å etablere at overflaten vedlegg upregulates virulens i P. aeruginosa.
Introduction
Bakteriell infeksjon er en av de viktigste årsakene til dødelighet i menneske og dyr1,2. Muligheten til å måle virulens bakterier i kulturer eller biofilm er viktig i helse-og forskning. Her beskriver vi en allsidig, rask og relativt enkel metode for å kvantifisere bakteriell virulens. Eukaryote organismen Dictyostelium discoideum (amoeba) brukes som modell verten organisme. D. discoideum har blitt brukt som en vert for å identifisere virulens faktorer Pseudomonas aeruginosa (P. aeruginosa)3,4,5 og andre bakterier6,7 ,8 og er utsatt for i hovedsak de samme virulens faktorene som dreper pattedyrceller inkludert III sekresjon9,10. Tidligere virulens analyser bruker D. discoideum har involvert langvarig eksponering av bakterier med D. discoideum celler i løpet av timer3,4,5. Protokollen, her presenterer en rask metode for å bestemme virulens bruker denne amoeba. Denne protokollen (figur 1) beskriver hvordan: (1) vokse amoebae axenically (i fravær av bakterier), (2) vokse bakterier for analysen, (3) forberede bakterier og vert for mikroskopi, (4) utfører epifluorescence mikroskopi og (5) analysere amoeba fluorescens.
Amoebae er utgangspunktet stripete ut fra frosne aksjer og dyrket på en plen av Escherichia coli (E. coli), hvor amoebae produserer sporer. Disse sporene er plukket og inokulert i en beriket medium for axenic vekst. Amoebae opprettholdes gjennom axenic vekst i næringsrike forhold til de er klare til å bli blandet med bakterier for vurdering av bakteriell virulens. Overlevelse eller død av amoebae er kvantifisert ved å måle fluorescens av calcein-acetoxymethyl (calcein-AM), som er kløyvde av intracellulær esterases, og dermed aktivert for fluorescens11,12. Live amoebae exhibit liten eller ingen fluorescens mens stresset og døende celler fluoresce intenst. Dette resultatet er en liten eller ingen innlemmelse av calcein-AM i sunn amoebae og innlemmelse og cleavage av underlaget i stresset amoebae13. Dette er særlig forskjellig fra calcein-AM fluorescens i pattedyrceller11,14,15,16.
Bakterier som vil bli vurdert for virulens dyrkes separat. Her beskriver vi hvordan å måle virulens av opportunistiske patogene P. aeruginosa og detalj hvordan kvantifisere virulens planktoniske (svømming) og overflate tilknyttet undergrupper. Denne protokollen kan tilpasses til å teste virulens andre bakterier. I delen representant resultater vi viser at virulens aktiveres i overflaten-tilkoblede cellene er lav i planktoniske celler, som ble rapportert tidligere13. Virulens-aktivert overflaten tilknyttet P. aeruginosa dreper amoebae mens ikke-ondartet planktoniske celler er fortært av amoebae. Hvis virulens planktoniske bakterier er utelukkende som assayed, kan bakterier være kulturperler i ordinære kultur rør i stedet for å bruke Petri retter som beskrevet i protokollen.
Veksten av amoebae og P. aeruginosa kulturer koordineres slik at P. aeruginosa kulturer nå den tiltenkte vekstfase mens amoebae vokser på steady state næringsrike forhold. Dette krever vanligvis amoebae kulturer fortynnes minst 1 dag før når de er blandet med bakterier. Amoebae og bakterier er immobilized benytter agar pads er co inkubert 1t, og fotografert med en lav oppløsning (10 X, numerisk blenderåpning 0,3) objektiv, grønne fluorescens protein (GFP) filtre og en imaging kamera. Analyse utføres med fritt tilgjengelige ImageJ programvare eller tilpasset analyseprogramvare. Vår analyse var utført ved hjelp av vår egen programvare skrevet med en vitenskapelig analyse pakken13. Programvaren skal opprette en maske med fase kontrast bildet og trekke ut fluorescens verdier fra de maskerte områdene fluorescens. Fluorescens verdier er gjennomsnitt over minst 100 celler, som resulterer i en numerisk vert drapet indeks.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle eksperimentelle prosedyrer ble utført ved University of California, Irvine.
1. buffere og løsninger
- Forberede Lysogeny kjøttkraft (LB) i en 1 L glassflaske ved å legge til 25 g LB-Miller Mix 1 L dobbel-destillert vann (ddH2O). Legge til en ekstra 20 g agar Petri retter. Autoclave å sterilisere. Hell 25 mL av smeltet agar medium i 10 cm diameter Petri retter og la stivne ved romtemperatur. Lagre flytende media ved romtemperatur og agar plater på 4 ° C.
- Forberede glukose gjær pepton (GYP) plater i en 1 L glassflaske ved å blande 1 g D-glukose, 2 g pepton 0,25 g gjær ekstrakt, 4,2 g KH2PO4, 5.1 g av Na2HPO47 H2O og 25 g agar i 1 L ddH2 O. Autoclave å sterilisere. Hell 25 mL av smeltet agar i 10 cm diameter Petri retter og la stivne ved romtemperatur. Butikken på 4 ° C.
- Forberede pepton S (PS) medium i en 1 L glassflaske ved å blande 10 g pepton, 7 g gjær ekstrakt, 15 g D-glukose, 0,12 g Na2HPO47 H2O, 1,4 g KH2PO4, 40 µg vitamin B12 , og 80 µg av folsyre i 800 mL av ddH2O. kalibrere en elektronisk pH-meter, med pH 4 og pH 7 standarder hvis pH-meter ikke er brukt i en dag.
- Måle pH i PS mediet bruker pH-meter. Legger til 5 M KOH eller 5 M H3PO4 justerer pH verdien til 6.5. Juster endelige volumet til 1 L bruker ddH2O. Filter sterilisere bruker 0.22 µm vakuum filter og lagre på 4 ° C.
Merk: Fortsetter forsiktig med pH justeringer av Bruk verneutstyr inkludert hansker, verneklær, vernebriller, og møte beskyttelse.
- Måle pH i PS mediet bruker pH-meter. Legger til 5 M KOH eller 5 M H3PO4 justerer pH verdien til 6.5. Juster endelige volumet til 1 L bruker ddH2O. Filter sterilisere bruker 0.22 µm vakuum filter og lagre på 4 ° C.
- Forberede 10 x utvikling Buffer Prime (DB') buffer i en 1 L glassflaske ved å legge 3.4 g KH2PO4, 13,4 g Na2HPO4 7 H2O og ddH2O til et totalt volum på 800 mL. Kalibrere en elektronisk pH-meter, med pH 4 og pH 7 standarder hvis pH-meter ikke er brukt i en dag.
- Måle pH i bufferen ved hjelp av elektronisk pH-meter. Justere pH til 6.5 ved forsiktig å legge 5 M KOH eller 5 H M3PO4 etter behov. Juster det endelige volumet til 1 L bruker ddH2O og sterilisere av autoklavering. Lagre ved romtemperatur.
Merk: Fortsetter forsiktig med pH justeringer av Bruk verneutstyr inkludert hansker, verneklær, vernebriller, og møte beskyttelse.
- Måle pH i bufferen ved hjelp av elektronisk pH-meter. Justere pH til 6.5 ved forsiktig å legge 5 M KOH eller 5 H M3PO4 etter behov. Juster det endelige volumet til 1 L bruker ddH2O og sterilisere av autoklavering. Lagre ved romtemperatur.
- Gjøre 1 x utvikling buffer (DB) ved å blande 100 mL 10 x DB' buffer med 1 mL av sterilitet 2 M MgCl2, og 1 mL av sterilisert 1 M CaCl2. Juster endelige volumet til 1 L i en 1 L glassflaske bruker en autoklaveres sterilisert ddH2O. butikken ved romtemperatur.
- Forberede PS:DB medium i en 1 L glassflaske ved å blande 100 mL sterilisert PS medium, 100 mL sterilisert 10 x DB' buffer og sterilisert ddH2O til et totalt volum på 1 L. Supplement med 1 mL sterilisert 2 M MgCl2 og 1 mL av sterilisert 1 M CaCl 2. butikken på 4 ° C.
- Forberede calcein-AM lager løsningen ved å legge til 50 µL av DMSO 50 µg av calcein-AM i plast beholderen leveres av produsenten. Butikken på 20 ° C.
2. vekst og vedlikehold av Amoebae
- Vokse E. coli belastning B/r17 som matkilde for amoebae i den opprinnelige vekstperioden. Strek E. coli B/r fra en frossen lager lagret ved-80 ° C på en LB agar plate og ruge på 37 ° C over natten å få enkelt kolonier.
- Vaksinere en enkelt koloni av E. coli B/r i 2 mL av LB medium og Inkuber en berg trommel eller en shaker på 37 ° C over natten.
- Bringe overnatting E. coli kultur til romtemperatur. Bruker en trestav, vaksinere amoebae fra en frossen lager holdt ved-80 ° C i 750 µL av natten kultur.
Merk: Bruk D. discoideum belastning AX3, som kan axenic vekst18. Dette trinnet krever ikke axenic vekst, men fremgangsmåten vil ha hans. - Straks legge 700 µL av amoebae -E. coli blandingen på en glukose gjær pepton (GYP) plate. Spre kultur jevnt på overflaten av platen ved å vippe den frem og tilbake og til siden etter behov. Unngå bruk av en sprederen.
- Plassere GYP platen med agar vendt opp i en boks som opprettholder høy luftfuktighet. Bruk to engangs plast beholdere (183 cm x 183 cm x 91 cm) stablet på hverandre. Nedre beholderen fylles med ca 25 mL vann og plasser øverste beholderen med flere 0,5 cm diameter hull boret gjennom gulvet av beholderen å gi fuktighet til å flytte fra vann reservoaret øverste beholderen.
- Inkuber GYP plate og boksen 22 ° C i 4-5 dager før amoeba sporer er observert vokser nær overflaten av platen (figur 2). Bruk en nedkjølt inkubatoren for å ruge plater i stedet for inkubasjon ved romtemperatur.
Merk: Etter sporer har vokst, de fortsatt levedyktig på plater for flere uker når lagret på 4 ° C. Lagre platene med agar siden vendt. Etter 3-4 dager med inkubering, kan sone av clearing innen bakteriell plenen observeres, og som angir starten på amoeba sporulation.- Observere små amoebae sporer over tallerken overflaten etter 4-5 dager med inkubering (figur 2).
Merk: Vokse ikke amoebae lenger enn en uke, som kvaliteten på spores senker utover denne tidsperioden.
- Observere små amoebae sporer over tallerken overflaten etter 4-5 dager med inkubering (figur 2).
- Samle amoebae sporer å forberede axenic veksten av amoebae ved å feie et sterilt 1 mL pipette tips parallelt på overflaten av platen. Samle sporer fra halvparten av en 10 cm Petriskål.
Merk: Unngå å berøre tuppen på overflaten av agar plate som denne bevegelsen vil samle mange E. coli. - Resuspend amoebae på spissen av pipette fordyper spissen i 1 mL av PS medium og pipettering forsiktig opp og ned.
- Overføre inokulerte blandingen i en 250-mL kolbe inneholder 25 mL av PS mediet med antibiotika-antimycotic løsningen på 0,25 x konsentrasjonen.
Merk: Lagre antibiotika-antimycotic løsningen som 250 µL dele på 20 ° C. Unngå gjentatte sykluser av tining og frysing av denne løsningen som dette kan redusere effekt. - Vokse amoebae axenically på 22 ° C i en roterende shaker 100 RPM. For virulens analysen i trinn 5, vokse cellene til en optisk tetthet målt på 600 nm (OD600) på 0,2 til 0,5.
Merk: Dette trinnet krever 3-4 dager vekst fra tidspunktet for vaksinering (trinn 2.7). Hvis celler har vokst til en høyere tetthet, fortynne kulturen i PS medium til et OD600 på 0,05 eller lavere og vokse tilbake til et OD600 på 0,2 til 0,5.
3. veksten av P. aeruginosa
- Velge en enkelt koloni av P. aeruginosa fra en LB plate vaksinere det inn i en 2 mL PS:DB kultur og vokse over natten på 37 ° C til metning.
Merk: Ikke Legg antibiotika-antimycotic løsningen til PS:DB media. - Fortynne den natten kultur 1: 100 eller 1:1,000 i en 6 cm diameter Petriskål bruker PS:DB. Hvis virulens planktoniske celler er utelukkende å være assayed, vokse kulturer bruke konvensjonelle kultur rør i stedet. Riste kultur på et Borstemmaskin rotator satt på 100 rpm på 37 ° C.
- Høste kulturer på bestemte tidspunkt å sikre reproduserbarhet. Ved 30 minutter til 1 time før vurdere virulens, utarbeide en agar pad som beskrevet i Seksjon 4.
Merk: Virulens i P. aeruginosa er indusert av ca 8 h vekst på overflater. - For å isolere overflaten-tilkoblede cellene, fjerne det flytende mediet fra Petriskål, vaskes straks med 1 mL av DB buffer å fjerne planktoniske celler og videre umiddelbart til trinn 5.1.
FORSIKTIG: Ikke vask lengre enn 30 s som dette vil forurolige koble overflaten tilknyttet celler og kan påvirke virulens målingen. - For å isolere planktoniske celler, overføre 10 µL av kulturen fra Petriskål til en ren Petriskål og videre umiddelbart til trinn 5.1.
4. mikroskopi - utarbeidelse av Agar puten
- Forberede agar pads ca 30 minutter til 1 time før amoebae er klare til å bli blandet med P. aeruginosa.
- Mikrobølgeovn 50 mL 1% (w/v) agar i DB buffer i en 250 mL kolbe. Bland alle 20 s til klumper av agar forsvinner.
- Avkjøle den smeltede agar ved å plassere den i forvarmet 55 ° C vannbad i 15 min.
- Legge til 15 µL av calcein-AM lager løsningen 15 mL av smeltet agar i et konisk rør. Bland ved å forsiktig snu røret 4 - 5 ganger og umiddelbart videre til neste trinn.
Merk: Utføre dette trinnet i et polypropylen 15 mL sentrifuge rør. Ikke bruk en tykk glass container som dette får agar å stivne for fort. - Hell den smeltede agar blandingen på toppen av en 12 cm x 10 cm glassplate og la agar å stivne i 10 minutter ved romtemperatur. Skjær befestet agar puten i mindre 1,5 cm x 1,5 cm deler ved å plassere glassplaten over et trykt rutenett og kutte langs rutenettet med en metall hersker.
- Holde gel hydrert i en fuktig før det er klart for bruk.
5. mikroskopi - utarbeidelse av bakterier-amoeba prøven for Imaging
- For å analysen virulens overflaten tilknyttet bakterielle celler, legge til 10 µL av amoeba celler fra trinn 2.10 overflaten tilknyttet bakterier fra trinn 3.4.
Merk: Dette trinnet beskriver blanding av amoebae med bakterier. - For å analysen virulens planktoniske celler, bland 10 µL av amoeba celler fra trinn 2.10 med 10 µL av planktoniske bakterier fra trinn 3.5.
Merk: Ikke vask axenically dyrket amoeba cellene (på et OD600 av 0,2 til 0.5) før blande med bakterier. Ingen E. coli vekst vil bli observert i amoeba kultur på grunn av bruk av antibiotika-antimycotic løsning. - Umiddelbart plassere 1,5 cm x 1,5 cm calcein-AM agar puten fra trinn 4.5 over bakterier-amoeba blandingen på Petriskål.
Merknad: Plassere agar puten på blandingen med en rask jevn bevegelse. Ikke lavere puten langsomt til blandingen som denne bevegelsen pleier å presse celler mot periferien og fra undersiden av puten. Dette trinnet sikrer at bakterier og amoebae er jevnt blandet, immobilisert og at begge typer er begrenset på samme planet. - Fjern overflødig væske ved forsiktig pipettering ut resterende væske rundt agar puten. Tillate Petriskål tørke 20 min ved romtemperatur.
- Dekk med Petriskål med lokk og ruge immobilisert amoeba-bakterier blandingen ved romtemperatur for en ytterligere 40 minutters Fortsett til trinn 6.1.
Merk: Det er viktig å ruge alle prøver for samme mengde tid, som bakgrunn fluorescens øker over tid. En inkubasjon tid med 1t anbefales. Incubations lenger enn 1 h er mindre reproduserbare som amoebae celler kanskje begynne å briste.
6. mikroskopi - bildeopptak
- Bilde amoebae bruker fluorescens mikroskop kan anskaffe brightfield og grønt fluorescens bilder. Bruke grønn fluorescens protein (GFP) filtre med 474/27 grønne fluorescens, nm og 525/45 nm for eksitasjon og utslipp, henholdsvis. Bruk et 10 X (≥0.3 numerisk blenderåpning) mål for å image i amoebae.
Merk: Calcein-AM i agar føre døende amoebae til fluorescens i grønne fluorescens kanalen. Sunn amoebae er ellers ikke fluorescerende. - Justere oppkjøpet ganger fase kontrast, GFP kanaler å begrense Phototoksisitet, og optimalisere bildet intensiteten dynamiske område. Erstatte differensial forstyrrelser kontrast (DIC) kontrast hvis nødvendig.
Merk: Bruke 100-200 ms eksponeringer for kontrast og GFP fluorescens hvis mulig. Holde eksponering og instrument innstillingene uforandret gjennom hele eksperimentet. Dette er avgjørende for databehandling vert drapet indeksen. - Hente bilder for minst 100 amoeba celler for å få god statistikk for beregning av verten drapet indeks.
7. image analyse og vert drapet indeks
- Utføre bildeanalyser med ImageJ.
- Åpne fase kontrast bildefilen i ImageJ ved å klikke på filen | Åpne og velge bildet. Justere terskelen ved å klikke bilde | Analyse | Terskelen. Juster nedre og øvre terskelen for å velge bare intensitet toppen (Figur 3A).
- Konverter bildet til binær ved prosess | Binær | Gjøre binære. Fylle hull ved å velge prosess | Binær | Fylle hull.
Merk: Ved hjelp av bilde i figur 1 som kilde, vil trinn 7.1 7,2 produsere et bilde som amoebae og overflaten tilknyttet bakterier vises som mørke områder (Figur 3B). - Sikre at boksene området og mener grå verdi sjekkes inn analyser | Angi mål. Måle omtrentlig størrelsen på amoebae ved å velge verktøyet ellipse på hovedverktøylinjen. Klikk analysere | Tiltak og Merk området representant amoebae.
- Opprette masker på amoebae ved å klikke analyser | Analysere partikler. Angi området som inkluderer amoebae men utelate bakterier i størrelse-boksen. Velg masker i dropdown menyen for Vis alternativet. Kontroller at det er merket av for boksen Legg til Manager .
- Klikk OK og et bilde som viser bare amoebae og en avkastning Manager dialogboks (Figur 3C).
- Åpne fluorescens bildet med fil | Åpne og velge den aktuelle filen. Velg alle regioner i Avkastningen Manager ved å holde nede SKIFT og klikke på hvert område i listen (Figur 3D).
- Klikk måle Avkastningen Manager. Dette åpner et resultater-vindu som viser gjennomsnittlig intensitetsverdien av hver amoeba.
- Kopier fluorescens verdiene for hver amoeba i et regnearkprogram og beregne verten drepe indeks ved å ta gjennomsnittet av alle fluorescens verdier.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Vi vokste vill-type P. aeruginosa belastning PA1419 eller en ΔlasR belastning20 i samme PA14 bakgrunnen i 6 cm diameter Petri retter og assayed virulens planktoniske og overflaten tilknyttet celler. Kulturer ble inokulert fra single-koloniene i PS:DB kulturer, vokst over natten kultur rør i en berg tromme på 37 ° C til metning, utvannet 1: 100 i PS:DB, vokst 8 h i 6 cm diameter Petri retter rister på 100 rpm, og planktoniske og overflaten-vedlagt P. aeruginosa undergrupper ble isolert som beskrevet i del 3.
Overflate-vedlagt vill-type P. aeruginosa drept amoebae, som ble angitt med en runde amoeba celle form og observasjon av calcein fluorescens (Figur 4A, øverst til venstre panel). Dette resulterte i en høy vert drapet indeks (Figur 4B). Planktoniske celler ble brukt av amoebae, som ble angitt med amorfe amoeba celle figurer og observasjon av liten eller ingen calcein fluorescens over bakgrunnen (Figur 4A, øverst i høyre panel). Dette resulterte i en relativt lav vert drapet indeks (Figur 4B). Både overflaten-vedlagt og planktoniske celler med ΔlasR belastningen ble brukt av amoebae, som ble angitt med lav vert drepe indekser (Figur 4B, nedre panelet). Resultatene viser dermed at virulens er upregulated overflaten tilknyttet bestander og LasR kreves for overflate-aktivert virulente, som ble beskrevet tidligere13. Disse eksperimentene dermed etablere robuste positive og negative kontroller for senere eksperimenter.
Figur 1 : Skjematisk beskriver en oversikt over virulens analysen. (1) amoeba verten cellene dyrkes, (2) bakteriekulturer dyrkes, og (3) planktoniske eller overflate-vedlagt bakterielle celler er blandet med amoebae og immobilisert på samme tenkelig plan bruker en agar pad. Verten cellene er kvantifisert for helse calcein-AM, fluorescens mikroskopi og bildeanalyse. Skala stolper representerer 50 µm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2 : Amoeba sporer på GYP 10 cm-diameter Petriskål platen etter 5 dager med vekst. Sporer skjemaet over Petriskål overflaten. Rammemargen viser en forstørret visning av ett enkelt avsnitt av parabolen overflaten. Overflaten kan inneholde bakterier som ikke kan skjelnes på denne oppløsningen. Skala barer i hoved-og innfelt representerer 1 cm og 2 mm, henholdsvis. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3 : Bildeanalyse mikroskopi data bruker ImageJ. (A) utvalg av topp intensiteten ved hjelp av verktøyet terskel. (B) noe som resulterte bilde etter fase kontrast kildebildet fra figur 1 er konvertert til et binært bilde. (C) noe som resulterte bilde etter bildet senere konverteres til en maske. (D) skjermbilder av valg av regioner av interesse ved hjelp av Avkastningen Manager. Skala stolper representerer 50 µm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4 : Representant resultatene av amoeba drepe av P. aeruginosa celler. (A) Calcein-AM fluorescens over fase mikroskopi bilder og (B) vert drepe indeksene av overflaten-vedlagt eller planktoniske vill-type eller ΔlasR P. aeruginosa. Vill-type overflate-vedlagt P. aeruginosa dreper amoebae, som viser betydelige calcein fluorescens og dermed en betydelig vert drepe indeks. Planktoniske celler brukes av amoebae, som viser litt calcein fluorescens og produsere en lav vert drapet indeks. Både overflaten-vedlagt og planktoniske ΔlasR brukes av amoebae og resultere i en lav vert drapet indeks. Skala barer representerer 50 µm. barer angir gjennomsnittlig tre uavhengige eksperimenter og feil barer angir standardavvik. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Denne protokollen beskriver en rask og kvantitativ metode å analysen virulens i P. aeruginosa. Denne protokollen kan testes med andre bakterier. Det er imidlertid viktig å huske på at vekstmediet skal være kompatibelt med amoeba vekst vilkår. Vi har spesielt optimalisert protokollen bruker PS:DB som bakteriell vekst medium. Hvis andre medier, kan det være nødvendig å utføre en vekst medier bare kontroll der det er ingen bakterielle celler å kontrollere at mediet er kompatibel med amoebae.
Denne metoden kan expanded for å analysen vekst fase avhengigheten av virulens. Spesielt kan bakteriekulturer dyrkes for en rekke ganger i stedet for et fast punkt. I vår erfaring er det viktig å høste bakteriekulturer på bestemte tidspunkt som virulens i P. aeruginosa synes å være avhengig av vekstfase. Vi observerte at virulens i P. aeruginosa ble indusert mellom 6-8 h vekst i Petri retter.
Mange variabler knyttet til miljø påvirke vert helse og bakteriell virulens. Derfor er det viktig å bruke riktig positive og negative kontroller for hvert eksperiment. Vi har brukt vill-type overflate-vedlagt P. aeruginosa som en positiv kontroll og ΔlasR som en negativ kontroll. Du bør utføre disse kontrollene hver gang virulens analysen utføres. Disse kontrollene er viktig for å bekrefte at verten celle dødsfall ikke er grunn til noen ytre faktorer som alder av amoebae, variasjoner i temperatur, etc. videre foreslår vi utfører alle eksperimenter i biologiske replikere å etablere reproduserbarhet av virulens fenotyper.
Vi har utført vårt eksperimenter med amoebae på en optisk tetthet av 0,2 til 0.5 etter en fortynning av på minst 1:10 og har regulert temperaturen på amoebae kultur til 22 ° C. Utenfor disse vekst forholdene, har vi funnet at mottakelighet av amoebae til virulente bakterier og reproduserbarhet til virulens analysen er endret. Amoeba celler pellets relativt raskt. Kontroller at kulturer er resuspended av pipettering opp og ned umiddelbart før optisk densitet målingen. Vokse ikke amoeba kulturer høyere enn en OD600 tetthet 1 som veksten til høye tettheter påvirker reproduserbarhet av eksperimentet. Overføre axenic kulturer lenger enn en uke. I tillegg er det viktig å kontrollere at amoebae er dyrket axenically (begynnelsen i trinn 2.7) gjennom 20 X eller forstørring mikroskopi slik at andre mikrober, ikke finnes i kulturen. Hvis kulturer grumset i trinn 2.10 etter 2 dager med vekst etter første vaksinasjon, vil dette trolig indikere tilstedeværelse av en mikrobiell miljøgifter. Hvis bakteriell forurensning er mistenkt, anbefaler vi vokser 1 mL av amoebae kulturen på 37 ° C 4-8 h. Observasjon av en grumset kultur under disse forholdene ville foreslå bakteriell forurensning. Hvis gjentatt bakteriell forurensning er observert, bør den antibiotika-antimycotic løsningen erstattes.
Verten drapet indeksen er en pålitelig indikator om bakteriell innbyggere er ondartet eller avirulent. Denne analysen ikke er optimalisert for sammenligninger mellom forskjellige mellomliggende virulens (dvs. lav virulens sammenlignet med middels lav virulens) og over tolkning av resultatene bør unngås. Mulige metoder for å løse dette problemet er repetisjon av virulens analysen over flere bruke ulike grupper med verten cellene for å etablere tillit i resultatene, utføre flere Repliker eksperimenter, og utføre riktig statistiske analyser.
Mangfoldet av infeksjon (MOI) planktoniske celler kan kontrolleres ved å normalisere den optiske densitet for bakteriell kultur. Denne analysen kontrollerer imidlertid ikke MOI overflaten tilknyttet bakterier celler. Vi har observert at bakteriell overflaten tetthet øker med tiden. Dermed kan justere vekst tid i Petriskål føre en tilsvarende endring i overflaten tetthet. I tillegg er overflaten tetthet avhengig av materialet i overflaten. P. aeruginosa celler knytte polystyren overflater i analysen beskrevet her. Andre overflater, inkludert glass, agar og polyakrylamid kan imidlertid også være assayed13. Overflaten tettheten av ett lag bakteriell befolkninger kan måles med 100 X forstørrelse fase mikroskopi. Hvis overflaten tettheter flerlags, kan AC confocal mikroskopi være hensiktsmessig.
Her har vi beskrev en rask og robust metode for å måle bakteriell virulens. Ved å endre individuelle parametre som inkubasjon ganger, fluorescerende fargestoff, bakterielle belastningen, verten celle type eller vekst medier, kan denne metoden utvides for å kvantifisere virulens over et bredt spekter av organismer vekst.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne ikke avsløre.
Acknowledgments
KP og som skrev og revidert manuskriptet. KP utført eksperimenter og analyse. Dette arbeidet ble støttet av National Institutes of Health (NIH) karriere overgangen prisen (K22AI112816) til AS.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents | |||
| Bacto agar, dehydrated | BD Difco | 214010 | |
| Antibiotic-Antimycotic (100X) | Life Technologies | 15240062 | Aliquot < 1 mL and store at -20 °C |
| Calcein-acetoxymethyl ester (calcein-AM) | Life Technologies | C34852 | Calcein Acetoxymethyl (AM) |
| Calcium chloride, anhydrous | Sigma-Aldrich | C1016 | |
| D-Glucose | Fisher Chemical | D16500 | Dextrose |
| Dimethyl sulfoxide | Sigma-Aldrich | D5879 | |
| Folic acid | Sigma-Aldrich | F8758 | |
| LB-Miller | BD Difco | 244620 | |
| Magnesium chloride | Sigma-Aldrich | M8266 | |
| Yeast extract | Oxoid | LP0021 | |
| Special peptone | Oxoid | LP0072 | |
| Potassium hyroxide | Fisher Chemical | P250 | |
| Potassium phosphate monobasic | Sigma-Aldrich | P0662 | |
| Sodium phosphate dibasic heptahydrate | Fisher Chemical | S373 | |
| Vitamin B12 | Sigma-Aldrich | V2876 | |
| Strains | |||
| Dictyostelium discoideum | Siryaporn lab | Strain AX318 | |
| Escherichia coli | Siryaporn lab | Strain B/r17 | |
| Pseudomonas aeruginosa | Siryaporn lab | PA14 | PA14 strain19 |
| Pseudomonas aeruginosa ΔlasR | Siryaporn lab | AFS20.1 | PA14-derived strain20 |
| Supplies | |||
| 0.22 µm filter | Millipore | SCGPT01RE | For filter sterilization |
| Conical tube, 15 mL | Corning | 352097 | |
| Glass storage bottles | Pyrex | 13951L | 250 mL, 500 mL, 1000 mL |
| Petri dish, 6 cm diameter | Corning | 351007 | 60 x 15 mm polystyrene plates |
| Petri dish, 10 cm diameter | Fisher | FB0875712 | 100 x 15 mm polystyrene plates |
| Plastic containers with lid | Ziploc | 2.57E+09 | Square 3-cup containers |
| Glass plates | Bio-Rad | 1653308 | For preparing agar pads. Other glass plates may be used with similar dimensions. |
| Wooden sticks | Fisher | 23-400-102 | |
| Equipment | |||
| Eclipse Ti-E microscope | Nikon | MEA53100 | Microscope setup |
| 10X Plan Fluor Ph1 objective 0.3 NA | Nikon | MRH20101 | Microscope setup |
| Fluorescence excitation source | Lumencor | Sola light engine | Microscope setup |
| Fluorescence filter set | Semrock | LED-DA/FI/TX-3X3M-A-000 | Microscope setup |
| Orca Flash 4.0 V2 Camera | Hamamatsu | 77054098 | Microscope setup |
| ImageJ | NIH | v. 1.49 | Software for image analysis |
| MATLAB | Mathworks | R2013 | Software for image analysis |
| Orbital shaker incubator | VWR | 89032-092 | For growth of bacteria at 37 °C |
| Platform shaker | Fisher | 13-687-700 | For growth of amoebae at 22 °C |
| Spectrophotometer | Biochrom | Ultrospec 10 | |
| Undercounter refrigerated incubator | Fisher | 97990E | For growth of amoebae at 22 °C |
| Isotemp waterbath | Fisher | 15-462-21Q | For cooling media to 55 °C |
References
- Rasko, D. A., Sperandio, V. Anti-virulence strategies to combat bacteria-mediated disease. Nature Reviews Drug Discovery. 9 (2), 117-128 (2010).
- Coburn, B., Grassl, G. A., Finlay, B. B. Salmonella, the host and disease: a brief review. Immunology and Cell Biology. 85 (2), 112-118 (2007).
- Alibaud, L., et al. Pseudomonas aeruginosa virulence genes identified in a Dictyostelium host model. Cellular Microbiology. 10 (3), 729-740 (2008).
- Pukatzki, S., Kessin, R. H., Mekalanos, J. J. The human pathogen Pseudomonas aeruginosa utilizes conserved virulence pathways to infect the social amoeba Dictyostelium discoideum. Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 99 (5), 3159-3164 (2002).
- Cosson, P., et al. Pseudomonas aeruginosa Virulence Analyzed in a Dictyostelium discoideum Host System. Journal of Bacteriology. 184 (11), 3027-3033 (2002).
- Pukatzki, S., et al. Identification of a conserved bacterial protein secretion system in Vibrio cholerae using the Dictyostelium host model system. Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 103 (5), 1528-1533 (2006).
- Steinert, M., Heuner, K. Dictyostelium as host model for pathogenesis. Cellular Microbiology. 7 (3), 307-314 (2005).
- Hagele, S., Kohler, R., Merkert, H., Schleicher, M., Hacker, J., Steinert, M. Dictyostelium discoideum: a new host model system for intracellular pathogens of the genus Legionella. Cellular Microbiology. 2 (2), 165-171 (2000).
- Matz, C., et al. Pseudomonas aeruginosa uses type III secretion system to kill biofilm-associated amoebae. ISME Journal. 2 (8), 843-852 (2008).
- Hauser, A. R. The type III secretion system of Pseudomonas aeruginosa: infection by injection. Nature Reviews Microbiology. 7 (9), 654-665 (2009).
- Moore, P. L., MacCoubrey, I. C., Haugland, R. P. A rapid pH insensitive, two color fluorescence viability (cytotoxicity) assay. Journal of Cell Biology. 111, Abstract 304 58 (1990).
- Kaneshiro, E. S., Wyder, M. A., Wu, Y. -P., Cushion, M. T. Reliability of calcein acetoxy methyl ester and ethidium homodimer or propidium iodide for viability assessment of microbes. Journal of Microbiological Methods. 17 (1), 1-16 (1993).
- Siryaporn, A., Kuchma, S. L., O'Toole, G. A., Gitai, Z. Surface attachment induces Pseudomonas aeruginosa virulence. Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 111 (47), 16860-16865 (2014).
- Decherchi, P., Cochard, P., Gauthier, P. Dual staining assessment of Schwann cell viability within whole peripheral nerves using calcein-AM and ethidium homodimer. Journal of Neuroscience Methods. 71 (2), 205-213 (1997).
- Braut-Boucher, F., Pichon, J., Rat, P., Adolphe, M., Aubery, M., Font, J. A non-isotopic, highly sensitive, fluorimetric, cell-cell adhesion microplate assay using calcein AM-labeled lymphocytes. Journal of Immunological Methods. 178 (1), 41-51 (1995).
- Grieshaber, P., Lagrèze, W. A., Noack, C., Boehringer, D., Biermann, J. Staining of fluorogold-prelabeled retinal ganglion cells with calcein-AM: A new method for assessing cell vitality. Journal of Neuroscience Methods. 192 (2), 233-239 (2010).
- Witkin, E. M. Inherited Differences in Sensitivity to Radiation in Escherichia Coli. Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 32 (3), 59-68 (1946).
- Loomis, W. F. Sensitivity of Dictyostelium discoideum to nucleic acid analogues. Experimental Cell Research. 64 (2), 484-486 (1971).
- Rahme, L. G., Stevens, E. J., Wolfort, S. F., Shao, J., Tompkins, R. G., Ausubel, F. M. Common virulence factors for bacterial pathogenicity in plants and animals. Science. 268 (5219), 1899-1902 (1995).
- O'Loughlin, C. T., Miller, L. C., Siryaporn, A., Drescher, K., Semmelhack, M. F., Bassler, B. L. A quorum-sensing inhibitor blocks Pseudomonas aeruginosa virulence and biofilm formation. Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 110 (44), 17981-17986 (2013).
