Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

Быстрое на основе образа бактериальных вирулентности Assay, используя амебы

Published: June 27, 2018 doi: 10.3791/57844
Automatic Translation
1, 1,2
1Department of Physics and Astronomy, University of California, 2Department of Molecular Biology and Biochemistry, University of California

Summary

Здесь мы представляем протокол для оценки вирулентности планктонные или придает поверхности бактерий, используя D. discoideum (амебы) в качестве хоста. Вирулентность измеряется в течение 1 ч и принимающих убийство количественно с помощью флуоресцентной микроскопии и изображения анализа. Мы демонстрируем это протокол, с помощью бактерий P. aeruginosa.

Abstract

Традиционные вирулентности бактерий анализы включают длительное воздействие бактерий в течение нескольких часов, чтобы клетки хозяина. В это время бактерии могут претерпеть изменения в физиологии вследствие воздействия среды размещения роста и наличие клеток хозяина. Мы разработали assay быстро оценить состояние вирулентности бактерий, которые сводят к минимуму степень которой бактерий расти в присутствии клетки хозяина. Бактерии и амебы смешиваются и иммобилизованные на одной плоскости изображения с помощью площадку агар. В процедуре используется одноклеточных флуоресценции изображений с Флуорексон acetoxymethyl эфира (Флуорексон ам) в качестве показателя здоровья принимающей ячейки. Флуоресценции клеток хозяина анализируется после 1 h воздействия клеток хозяина бактерии с помощью эпифлуоресцентного. Программное обеспечение для анализа изображений используется для вычисления индекса убийство хоста. Этот метод был использован для измерения вирулентность в течение планктонных и придает поверхности синегнойной палочки подгрупп населения на начальном этапе биопленки и могут быть адаптированы для других бактерий и других стадий роста биопленки. Этот протокол обеспечивает быстрый и надежный метод измерения вирулентности и позволяет избежать многих сложностей, связанных с ростом и обслуживание линий клеток млекопитающих. Вирулентности фенотипов измеряется здесь, с помощью амёбы также были проверены с помощью мыши макрофагов. В частности создать что вирулентности upregulates поверхности насадку в P. aeruginosaбыл использован этот assay.

Introduction

Бактериальная инфекция является одной из ведущих причин смертности в человека и животных1,2. Возможность измерения вирулентности бактерий в культурах или биоплёнки имеет важное значение в настройки здравоохранение и исследований. Здесь мы описываем универсальный, быстрое и относительно простой метод количественной оценки вирулентности бактерий. Эукариотические организм сапротрофные discoideum (амебы) используется в качестве модели организм хозяина. D. discoideum используется в качестве узла для определения факторов вирулентности синегнойной палочки (P. aeruginosa)3,,45 и другие бактерии6,7 ,8 и подвержены значительной же факторы вирулентности, которые убивают mammalian клеток, включая тип III секрецию9,10. Предыдущих анализов вирулентности, используя D. discoideum участвовали длительного воздействия бактерий с D. discoideum клетки в течение часа3,4,5. Протокол, здесь, представляет быстрый метод определения вирулентности, используя этот амебы. Этот протокол (рис. 1) описывает как: (1) растут амёбы axenically (в отсутствие бактерий), (2) растут бактерий для assay, (3) подготовить бактерий и клеток хозяина для микроскопии, (4) выполняют эпифлуоресцентного и (5) анализировать амебы флуоресцирование.

Амёб первоначально прожилками из замороженных запасов и выращенных на лужайке Escherichia coli (E. coli), где амёбы производят споры. Эти споры взял и прививку в обогащенных среду для стерильных роста. Амебы поддерживаются через стерильных роста в условиях питательн-богатые люди, пока они не готовы быть смешанной с бактерий для оценки вирулентности бактерий. Выживание или смерть амёбы количественно измеряя флуоресценции Флуорексон acetoxymethyl (Флуорексон AM), который расщепляется на внутриклеточную эстераз и, таким образом, активированный для флуоресценции11,12. Живой амёбы проявляют мало или вообще не флуоресценции в то время, как подчеркнул и умирающие клетки флуоресцировать интенсивно. Этот результат обусловлен немного или не включение Флуорексон-ам в здоровых амеб и включения и расщепления субстрата в подчеркнул амёбы13. Это поведение особенно отличается от Флуорексон ам флуоресценции в mammalian клетках11,14,,1516.

Бактерии, которые будут оцениваться для вирулентности выращивается отдельно. Здесь мы опишем, как измерить вирулентности оппортунистических патогенов P. aeruginosa и подробно, как количественной оценки вирулентности планктонных (плавание) и придает поверхности подгрупп населения. Этот протокол может быть адаптирована для проверки вирулентности других бактерий. В разделе представитель результаты, мы показывают, что вирулентности активируется в придает поверхности клетки и низка в планктонных клеток, который было сообщено ранее,13. Придает поверхности активированного вирулентности P. aeruginosa убивает амёбы пока не вирулентные планктонных клетки потребляются амёбы. Если является исключительно быть assayed вирулентности бактерий, планктонные, бактерии могут быть культивировали в обычных культуры трубы, а не с помощью Петри, как описано в протоколе.

Рост амеб и P. aeruginosa культур должна координироваться таким образом, что P. aeruginosa культур достичь этапа предполагаемого роста, в то время как амёбы растут в устойчивом состоянии в условиях питательн-богатые люди. Это условие обычно требует амёбы культур быть разведен по крайней мере за 1 день до, когда они смешиваются с бактериями. Амебы и бактерий карданной передачи были заблокированы с помощью агар колодки, совместно инкубирован за 1 ч и образы, используя низкое разрешение (10 X, числовая апертура 0,3), объективной, зеленый флуоресценции белков (ГПУП) фильтры и тепловизионной камеры. Анализ может быть выполнена с использованием свободно доступных ImageJ программного обеспечения или настроить программное обеспечение для анализа изображения. Наш анализ проводился с использованием собственного программного обеспечения, написанные с использованием научного анализа пакета13. Программное обеспечение должно создать маску с использованием фазы контраст изображения и извлекать значения флуоресценции из замаскированные области в изображении флуоресценции. Флуоресценции значения усредняются над по крайней мере 100 клетки, в результате в индексе убийство численные хоста.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Все экспериментальные процедуры проводились в университете Калифорнии в Ирвине.

1. буферов и решения

  1. Подготовка бульон Lysogeny (LB) в стеклянной бутылке 1 Л, добавив 25 g LB-Миллер смеси в 1 Л двойного дистиллированной воды (ddH2O). Для чашек Петри добавьте дополнительные 20 г агара. Автоклав для стерилизации. Налейте в 10 см диаметр Петри 25 мл расплавленный агар среды и позволяют укрепить при комнатной температуре. Хранилище жидких сред при комнатной температуре и плиты агара при 4 ° C.
  2. Подготовить Пептон дрожжи глюкозы (мошенник) пластины в стеклянной бутылке 1 Л, смешивая 1 g D-глюкозы, 2 g Пептон, 0,25 г дрожжей экстракт, 4.2 g KH2PO4, 5.1 g Na2HPO47 H2O и 25 г агара в 1 Л ddH2 O. автоклав для стерилизации. Налейте в 10 см диаметр Петри 25 мл расплавленный агар и позволяют укрепить при комнатной температуре. Хранить при 4 ° C.
  3. Подготовка среднего Пептон S (PS) в стеклянной бутылке 1л путем смешивания 10 g Пептон, 7 г дрожжей экстракт, 15 g D-глюкозы, 0,12 г Na2HPO47 H2O, 1.4 g KH2PO4, 40 мкг витамин B12 , и 80 мкг фолиевой кислоты в 800 мл ddH2O. калибровки электронных pH-метр, с помощью рН 4 и рН 7 стандартов, если pH метр не был использован в течение дня.
    1. Измерение pH среды PS с помощью рН метр. Добавьте 5 M Кох или 5 М H3PO4 для регулировки рН 6,5. Окончательного громкость до 1 L с помощью ddH2O. фильтр стерилизации с помощью вакуумного фильтра 0.22 мкм и хранить при 4 ° C.
      Примечание: Осторожно приступить корректировки рН, надевая защитное оборудование включая перчатки, Спецодежда, средства защиты глаз и защита лица.
  4. Подготовка 10 x буфер премьер развития (DB') буфера в стеклянной бутылке 1 Л, добавив 3.4 g KH2PO4, 13.4 g Na2HPO4 7 H2O и ddH O2общий объем 800 мл. Калибровка электронных pH-метр, с помощью рН 4 и рН 7 стандартов, если pH метр не был использован в течение дня.
    1. Измерение pH буфера с помощью электронных pH метр. Регулировка рН 6,5, осторожно добавив 5 M Кох или 5 М H3PO4 при необходимости. Измените конечный объем до 1 Л, с использованием ddH2O и стерилизация автоклавированием. Хранить при комнатной температуре.
      Примечание: Осторожно приступить корректировки рН, надевая защитное оборудование включая перчатки, Спецодежда, средства защиты глаз и защита лица.
  5. Сделать 1 x развития буфера (DB), смешивая 100 мл 10 x DB' буфер с 1 мл раствора стерилизованное MgCl 2 M2, и 1 мл стерилизованные CaCl 1 М2. Отрегулируйте окончательный объем до 1 Л в стеклянной бутылке 1 Л с помощью газобетона стерилизованные ddH2O. хранить при комнатной температуре.
  6. Подготовка среднего PS:DB в стеклянной бутылке 1 Л, смешивая 100 мл стерилизовать среды PS, стерилизованные 100 мл 10 x DB' буфер и стерилизовать ddH2O к общим объемом 1 л дополнения с 1 мл стерилизованное MgCl 2 M2 и 1 мл стерилизованные 1 M CaCl 2. хранить при 4 ° C.
  7. Подготовьте раствор Флуорексон ам, добавляя 50 мкл ДМСО 50 мкг Флуорексон-ам в пластиковый контейнер, поставляемые производителем. Хранить при температуре от-20 ° C.

2. роста и поддержания амёб

  1. Расти штамм E. coli B/r17 как источника пищи для амёб в период начального роста. Полоска E. coli от замороженных складе B/r температуре-80 ° C на плиту LB агар и инкубировать при 37 ° C ночь для получения единого колоний.
  2. Прививок одной колонии E. coli B/r в 2 мл среды LB и инкубировать в барабан ролика или шейкер при 37 ° C на ночь.
  3. Принесите на ночь культуры е. coli до комнатной температуры. С помощью деревянной палочкой, прививать амёбы из замороженных запас хранится при температуре-80 ° C в 750 мкл ночь культуры.
    Примечание: Использование D. discoideum штамм AX3, который способен стерильных роста18. Этот шаг не требуется стерильных роста, но последующие шаги будут иметь его требование.
  4. Сразу же 700 мкл смесикишечной амёбы - на тарелку Пептон дрожжи глюкозы (мошенник). Распространение культуры равномерно на поверхности пластины, наклоняя его назад и вперед и стороны в сторону при необходимости. Избегайте использования разбрасывателя.
  5. Место пластину мошенник с агар вверх в поле, которое поддерживает высокой влажности. Используйте два одноразовые пластиковые контейнеры (183 x 183 см x 91 см) укладываются на вершине друг друга. Заполните контейнер с приблизительно в 25 мл воды и поместите верхний контейнер с несколькими 0,5 см диаметр отверстия, просверленные через пол контейнера чтобы влага переехать из водохранилища в верхнем контейнере.
  6. Инкубируйте мошенник пластина и коробка при 22 ° C для 4-5 дней до тех пор, пока спор амебы наблюдаются, растущих вблизи поверхности пластины (рис. 2). Используйте Охлаждаемые инкубаторы для инкубации пластины, вместо того, чтобы инкубации при комнатной температуре.
    Примечание: После того, как спор выросли, они остаются жизнеспособными на пластины на несколько недель при температуре 4 ° C. Храните пластины с агар стороной вверх. После 3-4 дней инкубации может наблюдаться зон очистки в пределах бактериальных газон, которые указывают начала заспорение амебы.
    1. Наблюдать за небольшой амёбы споры над поверхностью пластины после 4-5 дней инкубации (рис. 2).
      Примечание: Не растут амёбы дольше, чем неделю, как качество споры уменьшается за этот период времени.
  7. Собирайте амеб споры подготовить для стерильных роста амёб, потрясающим кончик 1 мл стерильной пипеткой параллельно поверхности пластины. Соберите споры от половины 10 см Петри.
    Примечание: Не прикасайтесь кончик на поверхности агара пластины, как это движение будет собирать большое количество кишечной палочки.
  8. Ресуспензируйте амёбы на кончике пипеткой, погружая кончик в 1 мл среды PS и аккуратно закупорить вверх и вниз.
  9. Передача смеси привитых в 250 мл флакон, содержащий 25 мл среды PS, дополнена антибиотик противогрибковое решения на 0,25 x концентрации.
    Примечание: Сохранить антибиотик противогрибковое решение как 250 мкл аликвоты при-20 ° C. Избегайте повторяющихся циклов оттаивания и замораживание данного решения, как это может снизить ее эффективность.
  10. Растут амёбы axenically при 22 ° C в шейкере вращающийся при 100 об/мин. Для assay вирулентности в шаге 5, растут клетки оптической плотности, измеренная на 600 Нм (600OD) 0.2 до 0.5.
    Примечание: Этот шаг требуется 3-4 дней роста с момента прививки (шаг 2.7). Если клетки выросли до более высокой плотности, разбавленных в культуре обратно в PS средне-ОД600 0,05 или ниже и расти обратно к ОД600 0.2 до 0.5.

3. рост P. aeruginosa

  1. Выбрать одного Колония P. aeruginosa от пластины LB, прививать в 2 мл PS:DB культуры и расти на ночь при 37 ° C до насыщения.
    Примечание: Не добавляйте антибиотик противогрибковое решения к PS:DB средствам массовой информации.
  2. Разбавьте ночь культуры 1: 100 или 1:1,000 в чашке Петри 6 см в диаметре, с помощью PS:DB. Если вирулентности планктонных клеток является исключительно быть assayed, расти культур с использованием обычных культуры трубы вместо. Встряхнуть культуры на benchtop вращателе установлен на 100 об/мин при температуре 37 ° C.
  3. Урожая культур в определенное время точках для обеспечения воспроизводимости. В 30 мин до 1 часа до оценки вирулентности Подготовьте площадку агар, как описано в разделе 4.
    Примечание: Вирулентности в P. aeruginosa индуцируется примерно в 8 ч роста на поверхностях.
  4. Изолировать придает поверхности клетки, удалите жидкой среды из Петри, немедленно промыть 1 мл DB буфера для удаления планктонных клеток и переходите сразу к шагу 5.1.
    Предупреждение: Не мойте дольше, чем 30 s, как это будет возмущают и отсоединение придает поверхности клетки и могут повлиять на измерение вирулентности.
  5. Чтобы изолировать планктонных клетки, передать чистый Петри 10 мкл культуры от Петри блюдо и сразу перейти к шагу 5.1.

4. микроскопия - подготовка агар Pad

  1. Перед амёбы готовы быть смешанной с P. aeruginosa, подготовите агар колодки около 30 мин до 1 часа.
  2. Микроволновая печь 50 мл 1% (w/v) агар в буфере DB в 250 мл флакон. Mix каждые 20 s до скопления агар исчезают.
  3. Охладите расплавленный агар, поместив его в разогретой до 55 ° C водяной бане 15 мин.
  4. 15 мкл Стоковый раствор Флуорексон ам, по 15 мл расплавленный агар в коническую пробирку. Смешайте нежно инвертирование трубка 4 - 5 раз и немедленно приступить к следующему шагу.
    Примечание: Выполните этот шаг в полипропиленовые 15 мл пластиковых пробирок. Не используйте контейнер толстого стекла, как это вызовет агар закрепить слишком быстро.
  5. Залить расплавленный агар смесь на вершине стеклянной пластины 12 x 10 см и позволяют агар затвердеть в течение 10 минут при комнатной температуре. Вырежьте затвердевших агар pad на более мелкие разделы 1,5 x 1,5 см, поместив стеклянную пластину над печатной сетки и резки по сетке с помощью металлической линейки.
  6. Держите гель гидратированных в коробке влажный, до тех пор, пока он будет готов к использованию.

5. микроскопия - Подготовка образца бактерии амебы для изображений

  1. Для анализа вирулентности придает поверхности бактериальной клетки, мкл 10 амебы клеток из шага 2.10 придает поверхности бактерии из шага 3.4.
    Примечание: Этот шаг описывает смешивания амёб с бактериями.
  2. Для анализа вирулентности планктонных клеток, Смешайте 10 мкл амебы клеток из шага 2.10 с 10 мкл планктонных бактерий из шаг 3.5.
    Примечание: Не мойте axenically выросли амебы клетки (на од600 от 0,2 до 0,5) перед смешиванием с бактериями. E. coli рост будет наблюдаться в амеба культуры за счет использования антибиотиков противогрибковое решения.
  3. Немедленно Поместите панель агар Флуорексон AM 1,5 x 1,5 см от шага 4.5 поверх смесь бактерий амебы на поверхности Петри.
    Примечание: Место агар pad на верхней части смеси, используя быстрый плавного движения. Не ниже площадку медленно на смеси, как это движение, как правило, нажимаем клетки к периферии и от нижней площадки. Этот шаг обеспечит бактерий и амебы равномерно смешанные, иммобилизованных и что оба ячейка типы ограничиваются той же плоскости.
  4. Удалите лишнюю жидкость, нежно закупорить, любые оставшиеся жидкость, окружающих агар pad. Разрешить Петри для просушки на 20 мин при комнатной температуре.
  5. Обложка с Петри блюдо с крышкой и инкубировать иммобилизованных амебы бактерии смесь при комнатной температуре для дополнительных 40 мин переходите к шагу 6.1.
    Примечание: Важно для инкубации все образцы для одинаковое количество времени, как фон флуоресценции увеличивается с течением времени. Рекомендуется время инкубации 1 ч. Инкубаций более чем на 1 час меньше воспроизводимость как амёбы клетки могут начать лопнуть.

6. микроскопия - получение изображения

  1. Амебы изображения с помощью микроскопа флуоресценции способны получения brightfield и зеленая Флуоресценция изображений. Для зеленой флуоресценцией, используйте зеленый флуоресценции белков (ГПУП) фильтры с 474/27 Нм и 525/45 Нм для возбуждения и выбросов, соответственно. Используйте объектив (≥0.3 числовая апертура) 10 X для изображения амебы.
    Примечание: Флуорексон ам в агар приведет к умирающей амёб к флуоресценции в канале зеленой флуоресценцией. Здоровые амёбы иначе не флуоресцентные.
  2. Отрегулируйте время приобретения для фазового контраста, GFP каналы ограничить Фототоксичность, и оптимизировать динамический диапазон изображения света. При необходимости замените Фазовый контраст контрастность (DIC) дифференциальной помехи.
    Примечание: Используйте 100-200 мс воздействия для фазового контраста и флуоресценции GFP, если это возможно. Сохранить параметры экспозиции и инструмента, без изменений на протяжении всего эксперимента. Это критически важно для вычисления индекса убийство хост.
  3. Приобрести изображений для по крайней мере 100 амебы клеток для получения качественных статистических данных для расчета принимающей убийство индекс.

7. анализ и принимающих убийство индекс изображений

  1. Выполните анализ изображений с помощью ImageJ.
  2. Откройте файл изображения контрастность фазы в ImageJ, нажав на файл | Открыть и выбор образа. Отрегулировать порог, нажав на изображения | Анализ | Порог. Отрегулируйте нижний и верхний порог для выбора только интенсивность пик (рисA).
  3. Преобразовать изображение в двоичный файл, нажав кнопку процесс | Двоичные | Сделать бинарный. Заполнить дыры, выбрав процесс | Двоичные | Заполнить отверстия.
    Примечание: Использование изображения на рисунке 1 в качестве источника, шаги 7,1-7.2 будет производить изображение, в котором амеб и придает поверхности бактерии появляются как темные области (Рисунок 3B).
  4. Убедитесь, что поля область и означает значение серого проверяются в анализ | Задать размеры. Измерьте приблизительный размер амёб, выбрав инструмент Овал на главной панели инструментов. Нажмите кнопку анализ | Мера и отмечаем области представитель амебы.
  5. Создание маски для амёб, нажав анализ | Анализ частиц. В поле Размер введите область, которая будет включать амёб, но исключить бактерии. Выбор маски в раскрывающемся меню для параметра Показывать. Убедитесь, что установлен флажок добавить диспетчер .
  6. Нажмите кнопку OK и изображения показаны только амеб и ROI менеджер, что появится диалоговое окно (рис. 3C).
  7. Откройте изображение флуоресценции, с помощью файла | Открыть и выбрав соответствующий файл. Выберите все регионы в ROI менеджер , удерживая нажатой клавишу Shift и нажатие на каждый регион в списке (рис. 3D).
  8. Нажмите кнопку измерения в ROI менеджер. Это откроет окно результатов значение средней интенсивности каждого амебы.
  9. Скопируйте значения флуоресценции для каждого амеба в программу электронных таблиц и рассчитать принимающей убийство индекс, принимая среднее всех значений флуоресценции.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Мы росли одичал тип P. aeruginosa штамм PA1419 или ΔlasR напряжение20 в же фон PA14 в 6 см в диаметре Петри и assayed вирулентности планктонных и придает поверхности клеток. Культур были привиты от одного колоний в PS:DB культур, выращенных на ночь в культуры трубы в ролик барабан при 37 ° C насыщения, разбавленный масштаба 1: 100 в PS:DB, выросли за 8 ч в 6 см в диаметре Петри тряску при 100 об/мин и планктонные и придает поверхности P. aeruginosa субпопуляциях были изолированы, как описано в разделе 3.

Придает поверхности одичал тип P. aeruginosa убил амёб, которое было указано как форма клеток круглой амебы и наблюдения Флуорексон флуоресценции (рис. 4A, top левой панели). Это привело к индекс убийство высокой хост (Рисунок 4B). Планктонных клетки были израсходованы амёб, которых было указано как аморфный амебы клеток формы и наблюдения мало или вообще не Флуорексон флуоресценции выше фона (рис. 4A, верхней правой панели). Это привело к сравнительно низкий хост убийство индекс (Рисунок 4B). Придает поверхности и планктонные клеток штаммаlasR Δ были израсходованы амёб, которых было указано узлом низкая убийство индексы (Рисунок 4B, Нижняя панель). Таким образом результаты показывают, что вирулентности upregulated популяции, придает поверхности и LasR требуется для активации поверхности вирулентности, который был описан ранее13. Эти эксперименты таким образом устанавливают надежные положительной и отрицательной контроля для дальнейших экспериментов.

Figure 1
Рисунок 1 : Схемы, описывающий обзор вирулентности пробирного. (1) клетки хозяина амебы выращиваются, (2) бактериальных культур выращиваются и смешиваются с амеб и иммобилизованные на плоскости же изображений, используя площадку агар (3) планктонные или придает поверхности бактериальной клетки. Клетки хозяина количественно для здоровья с использованием Флуорексон ам, флуоресцентной микроскопии и анализа изображений. Масштаб бары представляют 50 мкм. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 2
Рисунок 2 : Амебы споры на мошенник 10 см диаметр Петри пластины после 5 дней роста. Споры формы над поверхностью Петри. Врезные показано увеличенное представление одного раздела блюдо поверхности. Поверхности могут содержать бактерии, которые нельзя усмотреть в этой резолюции. Масштаб баров в основной и инкрустация изображения представляют 1 см и 2 мм, соответственно. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 3
Рисунок 3 : Изображение анализ данных микроскопии с помощью ImageJ. (A) выбор пика интенсивности, используя инструмент порога. (B) результирующий образ после фазы контраст исходное изображение из рисунка 1 преобразуется в двоичное изображение. (C) результирующий образ после изображения впоследствии преобразуется в маске. (D) скриншоты отбора областей интереса, с помощью диспетчера ROI. Масштаб бары представляют 50 мкм. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 4
Рисунок 4 : Представитель результаты амеба, убийство P. aeruginosa клетками. (A) Флуорексон-ам флуоресценции накладывается на этапе микроскопии изображений и (B) хост убийство индексы придает поверхности или планктонных одичал типа или ΔlasR P. aeruginosa. Одичал тип поверхности придает P. aeruginosa убивает амёб, которые exhibit флуоресценцией значительных Флуорексон и следовательно значительное множество убийство индекс. Планктонных клетки потребляются амёб, которые проявляют мало Флуорексон флуоресценции и производят индекс убийство низкие хост. Придает поверхности и планктонных ΔlasR потребляются амеб и результат в индексе убийство низкой хоста. Масштаб представляет 50 µm. бары указывают среднее трех независимых экспериментов и ошибки бары указывают стандартное отклонение. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Этот протокол описывает быстрое и количественный метод для анализа вирулентности в P. aeruginosa. Этот протокол может испытываться с другими бактериями. Однако важно иметь в виду, что средство роста должны быть совместимы с условиями роста амебы. В частности мы оптимизировали протокол, с помощью PS:DB как средство роста бактерий. Если используются другие средства массовой информации, это может быть необходимо выполнить рост только для средств массовой информации управления, в котором есть нет бактериальной клетки присутствуют чтобы убедиться, что средство совместимо с амёбы.

Этот метод может быть расширена до пробирного зависимость фазы роста вирулентности. В частности бактериальных культур могут быть выращены для широкого круга раз вместо точки фиксированное время. По нашему опыту важно собрать бактериальных культур в определенное время точках, как вирулентность в P. aeruginosa , как представляется, зависит от фазы роста. Мы наблюдали, что вирулентности в P. aeruginosa вызывали между 6-8 ч роста в чашках Петри.

Многие переменные, связанные с окружающей средой роста влияют на здоровье хост и вирулентности бактерий. Таким образом важно использовать надлежащие позитивные и негативные элементы управления для каждого эксперимента. Мы использовали одичал тип поверхности придает P. aeruginosa как позитивный элемент управления и ΔlasR , как отрицательный контроль. Мы предлагаем выполнение этих элементов каждый раз, когда генотипирования вирулентности. Эти элементы управления имеют важное значение для проверки, что принимающей ячейки смертей вызваны не каких-либо внешних факторов таких, как возраст амёб, колебания температуры и т.д. Кроме того, мы предлагаем, выполняя все эксперименты в биологических реплицировать установить воспроизводимость фенотипов вирулентности.

Мы выполнили наши эксперименты с использованием амеб в оптической плотности от 0,2 до 0,5 после разбавления в наименее 1:10 и регулируется температура амёбы культуры точно до 22 ° C. За пределами этих условий роста мы нашли, изменены восприимчивость амёбы вирулентные бактерии и воспроизводимость вирулентности assay. Амеба клетки окатышей относительно быстро. Убедитесь, что культуры являются высокомобильна, закупорить вверх и вниз, непосредственно перед производится измерение оптической плотности. Не расти культур амеба, выше, чем плотность600 OD 1 как роста для высокой плотности влияет на воспроизводимость результатов эксперимента. Распространение стерильных культурах для не более чем на 1 неделю. Кроме того, важно, чтобы убедиться, что амёбы выращиваются axenically (начало в шаге 2.7) через 20 X или высокое увеличение микроскопии такие что другие микробы не присутствуют в культуре. Если после 2 дней роста после первоначального прививка мутная в шаге 2.10 культур, это будет скорее всего указывают на наличие микробного загрязнения. Если подозревается бактериального загрязнения, мы предлагаем выращивания 1 мл амёбы культуры при 37 ° C для 4-8 ч. Наблюдение за мутным культуры в этих условиях предлагаю бактериального загрязнения. Если повторные бактериального загрязнения наблюдается, антибиотик противогрибковое решение следует заменить.

Индекс убийство хоста является надежным показателем того, является ли бактериальная популяция вирулентные или avirulent. Этот assay не был оптимизирован для сравнения между различными промежуточными уровнями вирулентности (т.е. низкой по сравнению с среднего низкого вирулентности вирулентности), и следует избегать чрезмерной интерпретации результатов. Потенциальные методы для решения этой проблемы являются повторением вирулентности пробирного над несколько дней, с использованием различных пакетов клеток хозяина создать уверенность в результатах, выполняя дополнительные реплицировать эксперименты и выполняет соответствующие Статистический анализ.

Обилие инфекции (МВД) планктонных клеток можно управлять путем нормализации оптической плотности бактериальной культуры. Однако этот assay не контролирует MOI придает поверхности бактерий клеток. Мы заметили, что бактериальные поверхностная плотность увеличивается с течением времени. Таким образом регулируя время роста в чашке Петри может привести к соответствующего изменения в поверхностной плотности. Кроме того поверхностная плотность зависит от материала поверхности. P. aeruginosa клетки придают полистирол поверхности в assay, описанных здесь. Однако другие поверхности, включая стекло, агар и полиакриламида могут также быть Оксиметрический анализ13. Поверхностная плотность однослойные бактериальных популяций может быть измерена с помощью 100 X увеличение фазы микроскопии. Если поверхностной плотностью многослойно, конфокальная микроскопия может быть целесообразным.

Здесь мы описали быстрый и надежный метод измерения вирулентности бактерий. Путем изменения отдельных параметров, таких как инкубации раз, Люминесцентную краску, бактериальный штамм, принимающей тип ячейки или роста средств массовой информации, этот метод может быть продлен для количественной оценки вирулентности в широком спектре условий роста и организмов.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Авторы не имеют ничего сообщать.

Acknowledgments

КП и как писал и пересмотренный рукописи. КП провели эксперименты и анализа. Эта работа была поддержана премии Переход карьеры национальных институтов здравоохранения (НИЗ) (K22AI112816) на AS.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Reagents
Bacto agar, dehydrated BD Difco 214010
Antibiotic-Antimycotic (100X) Life Technologies 15240062 Aliquot < 1 mL and store at -20 °C
Calcein-acetoxymethyl ester (calcein-AM) Life Technologies C34852 Calcein Acetoxymethyl (AM)
Calcium chloride, anhydrous Sigma-Aldrich C1016
D-Glucose Fisher Chemical D16500 Dextrose
Dimethyl sulfoxide Sigma-Aldrich D5879
Folic acid Sigma-Aldrich F8758
LB-Miller BD Difco 244620
Magnesium chloride Sigma-Aldrich M8266
Yeast extract Oxoid LP0021
Special peptone Oxoid LP0072
Potassium hyroxide Fisher Chemical P250
Potassium phosphate monobasic  Sigma-Aldrich P0662
Sodium phosphate dibasic heptahydrate Fisher Chemical S373
Vitamin B12 Sigma-Aldrich V2876
Strains
Dictyostelium discoideum Siryaporn lab Strain AX318
Escherichia coli Siryaporn lab Strain B/r17
Pseudomonas aeruginosa Siryaporn lab PA14 PA14 strain19
Pseudomonas aeruginosa ΔlasR Siryaporn lab AFS20.1 PA14-derived strain20
Supplies
0.22 µm filter  Millipore SCGPT01RE For filter sterilization
Conical tube, 15 mL Corning 352097
Glass storage bottles Pyrex 13951L 250 mL, 500 mL, 1000 mL
Petri dish, 6 cm diameter Corning 351007 60 x 15 mm polystyrene plates
Petri dish, 10 cm diameter Fisher FB0875712 100 x 15 mm polystyrene plates
Plastic containers with lid Ziploc 2.57E+09 Square 3-cup containers
Glass plates Bio-Rad 1653308 For preparing agar pads. Other glass plates may be used with similar dimensions.
Wooden sticks Fisher 23-400-102 
Equipment
Eclipse Ti-E microscope  Nikon MEA53100 Microscope setup
10X Plan Fluor Ph1 objective  0.3 NA Nikon MRH20101 Microscope setup
Fluorescence excitation source Lumencor Sola light engine Microscope setup
Fluorescence filter set Semrock LED-DA/FI/TX-3X3M-A-000  Microscope setup
Orca Flash 4.0 V2 Camera Hamamatsu 77054098 Microscope setup
ImageJ NIH v. 1.49 Software for image analysis
MATLAB Mathworks R2013 Software for image analysis
Orbital shaker incubator VWR 89032-092 For growth of bacteria at 37 °C
Platform shaker Fisher 13-687-700 For growth of amoebae at 22 °C
Spectrophotometer Biochrom Ultrospec 10
Undercounter refrigerated incubator Fisher 97990E For growth of amoebae at 22 °C
Isotemp waterbath  Fisher 15-462-21Q For cooling media to 55 °C

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Rasko, D. A., Sperandio, V. Anti-virulence strategies to combat bacteria-mediated disease. Nature Reviews Drug Discovery. 9 (2), 117-128 (2010).
  2. Coburn, B., Grassl, G. A., Finlay, B. B. Salmonella, the host and disease: a brief review. Immunology and Cell Biology. 85 (2), 112-118 (2007).
  3. Alibaud, L., et al. Pseudomonas aeruginosa virulence genes identified in a Dictyostelium host model. Cellular Microbiology. 10 (3), 729-740 (2008).
  4. Pukatzki, S., Kessin, R. H., Mekalanos, J. J. The human pathogen Pseudomonas aeruginosa utilizes conserved virulence pathways to infect the social amoeba Dictyostelium discoideum. Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 99 (5), 3159-3164 (2002).
  5. Cosson, P., et al. Pseudomonas aeruginosa Virulence Analyzed in a Dictyostelium discoideum Host System. Journal of Bacteriology. 184 (11), 3027-3033 (2002).
  6. Pukatzki, S., et al. Identification of a conserved bacterial protein secretion system in Vibrio cholerae using the Dictyostelium host model system. Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 103 (5), 1528-1533 (2006).
  7. Steinert, M., Heuner, K. Dictyostelium as host model for pathogenesis. Cellular Microbiology. 7 (3), 307-314 (2005).
  8. Hagele, S., Kohler, R., Merkert, H., Schleicher, M., Hacker, J., Steinert, M. Dictyostelium discoideum: a new host model system for intracellular pathogens of the genus Legionella. Cellular Microbiology. 2 (2), 165-171 (2000).
  9. Matz, C., et al. Pseudomonas aeruginosa uses type III secretion system to kill biofilm-associated amoebae. ISME Journal. 2 (8), 843-852 (2008).
  10. Hauser, A. R. The type III secretion system of Pseudomonas aeruginosa: infection by injection. Nature Reviews Microbiology. 7 (9), 654-665 (2009).
  11. Moore, P. L., MacCoubrey, I. C., Haugland, R. P. A rapid pH insensitive, two color fluorescence viability (cytotoxicity) assay. Journal of Cell Biology. 111, Abstract 304 58 (1990).
  12. Kaneshiro, E. S., Wyder, M. A., Wu, Y. -P., Cushion, M. T. Reliability of calcein acetoxy methyl ester and ethidium homodimer or propidium iodide for viability assessment of microbes. Journal of Microbiological Methods. 17 (1), 1-16 (1993).
  13. Siryaporn, A., Kuchma, S. L., O'Toole, G. A., Gitai, Z. Surface attachment induces Pseudomonas aeruginosa virulence. Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 111 (47), 16860-16865 (2014).
  14. Decherchi, P., Cochard, P., Gauthier, P. Dual staining assessment of Schwann cell viability within whole peripheral nerves using calcein-AM and ethidium homodimer. Journal of Neuroscience Methods. 71 (2), 205-213 (1997).
  15. Braut-Boucher, F., Pichon, J., Rat, P., Adolphe, M., Aubery, M., Font, J. A non-isotopic, highly sensitive, fluorimetric, cell-cell adhesion microplate assay using calcein AM-labeled lymphocytes. Journal of Immunological Methods. 178 (1), 41-51 (1995).
  16. Grieshaber, P., Lagrèze, W. A., Noack, C., Boehringer, D., Biermann, J. Staining of fluorogold-prelabeled retinal ganglion cells with calcein-AM: A new method for assessing cell vitality. Journal of Neuroscience Methods. 192 (2), 233-239 (2010).
  17. Witkin, E. M. Inherited Differences in Sensitivity to Radiation in Escherichia Coli. Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 32 (3), 59-68 (1946).
  18. Loomis, W. F. Sensitivity of Dictyostelium discoideum to nucleic acid analogues. Experimental Cell Research. 64 (2), 484-486 (1971).
  19. Rahme, L. G., Stevens, E. J., Wolfort, S. F., Shao, J., Tompkins, R. G., Ausubel, F. M. Common virulence factors for bacterial pathogenicity in plants and animals. Science. 268 (5219), 1899-1902 (1995).
  20. O'Loughlin, C. T., Miller, L. C., Siryaporn, A., Drescher, K., Semmelhack, M. F., Bassler, B. L. A quorum-sensing inhibitor blocks Pseudomonas aeruginosa virulence and biofilm formation. Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 110 (44), 17981-17986 (2013).

Tags

Биоинженерия выпуск 136 синегнойной палочки придает поверхности Planktonic сапротрофные discoideum пробирного быстрого вирулентности вирулентности в биопленки
Быстрое на основе образа бактериальных вирулентности Assay, используя амебы
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Perinbam, K., Siryaporn, A. A Rapid… More

Perinbam, K., Siryaporn, A. A Rapid Image-based Bacterial Virulence Assay Using Amoeba. J. Vis. Exp. (136), e57844, doi:10.3791/57844 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter