Summary
Burada, D. discoideum (amip) ana bilgisayar olarak kullanarak planktonik veya yüzey bağlı bakterilerin virülans ölçmek için bir iletişim kuralı mevcut. Virülans bir 1 saat boyunca ölçülür ve öldürme ana bilgisayar floresans mikroskobu ve görüntü analizi ile sayılabilir. Biz bakteri P. aeruginosabu iletişim kuralı'nı göstermek.
Abstract
Geleneksel bakteriyel virülans deneyleri konak hücreleri için birkaç saat boyunca uzun süre maruz bakteri içerir. Bu süre içinde bakteri fizyolojisi ana büyüme ortamı maruz ve konak hücreleri varlığı nedeniyle değişiklikleri uygulayabilir. Biz hızla hangi bakteri varlığında konak hücreleri büyümek ölçüde en aza indirmek bakteri virülans durumunu ölçmek için bir tahlil geliştirilmiştir. Bakteri ve amip birlikte karışık ve agar panelini kullanma tek bir görüntüleme uçağı üzerinde immobilize. Yordam tek hücreli floresans görüntüleme (calcein-AM) calcein-acetoxymethyl ester ile konak hücre sağlık bir göstergesi olarak kullanır. Konak hücreleri floresan 1s epifluorescence mikroskobu kullanılarak bakteri konak hücre maruz sonra analiz edilir. Görüntü analiz yazılımı bir ana bilgisayar öldürme Dizin hesaplamak için kullanılır. Bu yöntem virülans planktonik ve yüzey bağlı Pseudomonas aeruginosa içinde ölçmek için kullanılan ilk aşamasında alt nüfus biyofilm oluşumu ve diğer bakteri ve diğer aşamaları biyofilm büyüme için adapte edilebilir. Bu iletişim kuralı virülans ölçmenin hızlı ve sağlam bir yöntem sağlar ve büyüme ve bakım memeli hücre hatları ile ilgili karmaşıklığı çoğunu önler. Burada amip kullanarak ölçülen virülans fenotipleri da fare makrofajlar kullanarak doğrulanmış. Özellikle, bu tahlil bu yüzey ek upregulates virülans P. aeruginosaiçinde kurmak için kullanıldı.
Introduction
Bakteriyel enfeksiyon, insan ve hayvan1,2' deki ölümlerin önde gelen nedenlerinden biridir. Sağlık ve araştırma ayarlarında önemli virülans bakteri kültürleri veya biyofilmler ölçmek için yeteneğidir. Burada, bakteriyel virülans ölçmek için çok yönlü, hızlı ve nispeten basit bir yöntem açıklanmaktadır. Ökaryotik organizma Dictyostelium discoideum (amip) modeli ana bilgisayar organizma olarak kullanılır. D. discoideum virülans faktörleri Pseudomonas aeruginosa (P. aeruginosa)3,4,5 ve diğer bakteriler6,7 tanımlamak için ana bilgisayar olarak kullanılmıştır ,8 ve tip III salgı9,10da dahil olmak üzere memeli hücreleri öldürmek büyük ölçüde aynı virülans faktörleri için açıktır. D. discoideum kullanarak önceki virülans deneyleri bakteri D. discoideum hücreleri ile uzun süre maruz saat3,4,5boyunca işe. İletişim kuralı, burada, bu amip kullanarak virülans belirleme hızlı bir yöntem sunuyor. Bu iletişim kuralı (Şekil 1) açıklar nasıl yapılır: (1) axenically (içinde bakteri yokluğu) amip büyümek, (2) bakteri tahlil için büyümek, (3) bakteri hazırlamak ve konak hücreleri mikroskobu, (4) için epifluorescence mikroskobu gerçekleştirmek ve analiz (5) amip Floresan.
Amip başlangıçta donmuş stokları çizgili ve nerede amip Sporlar üretmek Escherichia coli (e.coli), çim üzerinde büyüdü. Bu sporlar aldı ve axenic büyüme için zenginleştirilmiş bir orta içine aşılandı. Bakteriyel virülans değerlendirilmesi için bakteri ile karışık olması hazır olana amip besin açısından zengin koşullarında axenic büyüme ile korunur. Hayatta kalma ya da amip ölümü, calcein-acetoxymethyl (calcein-AM), hücre içi esterazlar tarafından i ciddi ve, böylece, floresans11,12için aktif floresans ölçerek sayılabilir. Canlı amip vurguladı ise az veya hiç floresans sergi ve yoğun bir şekilde ölen hücreleri bulabilsem. Calcein-AM sağlıklı amip ve birleşme içine çok az veya hiç birleşme ve stresli amip13' te substrat bölünme nedeniyle sonucudur. Bu davranış özellikle calcein-AM floresans memeli hücreleri11,14,15,16ayrıdır.
Virülans için değerlendirilecektir bakteri ayrı olarak yetiştirilmektedir. Burada, P. aeruginosa fırsatçı patojen virülans ölçmek ve ayrıntılı nasıl virülans planktonik (yüzme) ve yüzey bağlı alt nüfus ölçmek için nasıl açıklar. Bu iletişim kuralı diğer bakteri virülans sınamak için adapte olabilir. Temsilcisi sonuçları bölümünde gösterdiğimiz virülans yüzey bağlı hücrelerde aktif ve planktonik hücrelerde, düşük olduğu daha önce13bildirdi. Öldürücü olmayan planktonik hücreleri amip tarafından tüketilen iken yüzey bağlı P. aeruginosa virülans-harekete geçirmek amipler öldürür. Planktonik bakteri virülans yalnızca denetlesinler, bakteri Petri yemekler iletişim kuralında açıklandığı gibi kullanarak yerine sıradan Kültür tüpleri kültürlü olabilir.
Öyle ki kararlı duruma besin açısından zengin koşullarında, amip büyümeye ederken P. aeruginosa kültürler ve hedeflenen büyüme aşamasında ulaşmak, amip ve P. aeruginosa kültürler koordine edilmelidir. Bu durum genellikle amip kültürler bakterilerle karışınca en az 1 gün önce seyreltilmiş gerekir. Amip ve bakteri agar pedleri kullanarak immobilize, Co için 1 saat inkübe ve düşük çözünürlüklü (10 X, sayısal diyafram 0,3) objektif, yeşil floresans protein (GFP) filtre uygular ve görüntüleme bir kamera kullanarak yansıma. Analizi serbestçe kullanılabilir ImageJ yazılım kullanılarak gerçekleştirilebilir veya görüntü analiz yazılımı özelleştirilebilir. Bizim analiz bilimsel analiz paketi13kullanılarak yazılmış kendi yazılımını kullanarak gerçekleştirildi. Yazılım faz kontrast görüntü kullanarak maske oluşturmak ve floresan görüntünün maskelenmiş alanlar floresans değerleri ayıklamak gerekir. Floresans değerler bir sayısal ana bilgisayar öldürme dizininde kaynaklanan en az 100 hücreleri üzerinde ortalama.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Tüm deneysel prosedürler University of California, Irvine gerçekleştirilmiştir.
1. arabellekleri ve çözümleri
- Lysogeny suyu (LB) 1 L cam şişede 1 litre çift distile su (GKD2O) 25 g LB-Miller karışımı ekleyerek hazırlayın. Petri yemekler için agar bir ek 20 g ekleyin. Sterilize etmek için basınçlı kap. Erimiş agar orta 25 mL 10 cm-çap Petri yemekleri dökün ve oda sıcaklığında kuvvetlendirmek için izin verir. Oda sıcaklığında sıvı medya ve ağar kaplamalar 4 ° C'de depolayın
- D-glikoz 1 gr karıştırılarak bir 1 L cam şişe glikoz Maya pepton (saçma) levha hazırlamak, pepton, Maya 0, 25 g, 2 g özü, KH2PO44.2 g, Na2HPO47 H2O 5,1 g ve agar GKD2 1 L 25 g O. otoklav sterilize etmek için. Erimiş agar 25 mL 10 cm-çap Petri yemekleri dökün ve oda sıcaklığında kuvvetlendirmek için izin verir. 4 ° C'de mağaza
- 10 g pepton karıştırarak 1 L cam şişe pepton S (PS) ortamda hazırlamak, 7 gr maya ekstresi, 15 g D-glikoz, 0,12 g Na2HPO47 H2O, KH2PO41.4 g, vitamin B12 40 µg , ve 80 µg GKD2O. 800 mL folik asit pH metre bir gün içinde kullanılmamış olan pH 4 ve pH 7 standartları kullanarak bir elektronik pH metre kalibre.
- PH metre kullanarak PS orta pH ölçmek. 5 M KOH ya 5 M H3PO4 pH 6.5 ayarlamak için ekleyin. 1 m'ye son ses seviyesini GKD2O. filtre kullanarak 0,22 µm vakum filtre kullanılarak sterilize ve depolamak 4 ° C'de
Not: koruyucu ekipman eldiven, koruyucu giysiler, göz koruma da dahil olmak üzere giyerek pH ayarlamaları ile dikkatli bir şekilde sürdürmek ve koruma yüz.
- PH metre kullanarak PS orta pH ölçmek. 5 M KOH ya 5 M H3PO4 pH 6.5 ayarlamak için ekleyin. 1 m'ye son ses seviyesini GKD2O. filtre kullanarak 0,22 µm vakum filtre kullanılarak sterilize ve depolamak 4 ° C'de
- 10 x geliştirme arabellek Prime hazırlamak (DB') arabellek KH2PO4, 13.4 g Na2HPO4 7 H2O, GKD2O 3.4 g 800 mL toplam bir birime ekleyerek bir 1 L cam şişede. PH metre bir gün içinde kullanılmamış olan pH 4 ve pH 7 standartları kullanarak bir elektronik pH metre kalibre.
- Elektronik pH metre kullanarak arabellek pH ölçmek. PH 6.5 yavaşça 5 M KOH veya gerektiği gibi 5 M H3PO4 ekleyerek ayarlayın. 1 GKD2O kullanarak L için son ses seviyesini ve ısıyla tarafından sterilize. Oda sıcaklığında saklayın.
Not: koruyucu ekipman eldiven, koruyucu giysiler, göz koruma da dahil olmak üzere giyerek pH ayarlamaları ile dikkatli bir şekilde sürdürmek ve koruma yüz.
- Elektronik pH metre kullanarak arabellek pH ölçmek. PH 6.5 yavaşça 5 M KOH veya gerektiği gibi 5 M H3PO4 ekleyerek ayarlayın. 1 GKD2O kullanarak L için son ses seviyesini ve ısıyla tarafından sterilize. Oda sıcaklığında saklayın.
- 1 x geliştirme arabellek (DB) 100 mL 10 karıştırılarak olun DB x' arabellek ile 1 mL steril 2 M MgCl2ve 1 mL steril 1 M CaCl2. Bir autoclaved sterilize GKD2O. mağaza oda sıcaklığında kullanarak 1 L cam şişede 1 m'ye son ses düzeyini ayarlayın.
- PS:DB orta bir 1 L cam şişe 100 mL steril PS orta karıştırılarak hazır ol, 100 mL steril 10 DB x' tampon ve steril GKD2O birime bir toplam 1 L. ek ile 1 mL steril 2 M MgCl2 ve 1 mL steril 1 M CaCl 2. 4 ° C'de mağaza
- Calcein-AM hisse senedi çözüm calcein-AM üretici tarafından sağlanan plastik kap içinde 50 µg DMSO 50 µL ekleyerek hazırlayın. -20 ° C'de mağaza
2. büyüme ve amip Bakımı
- E. coli zorlanma B/r17 amip için bir besin kaynağı olarak ilk büyüme döneminde büyümek. Çizgi E. coli B/r donmuş bir stoktan bir LB agar plaka üzerine-80 ° C'de depolanan ve 37 ° tek kolonileri elde etmek için C bir gecede kuluçkaya.
- E. coli B/r bir koloni 2 mL LB orta içine aşılamak ve bir rulo davul veya bir shaker 37 ° C'de gecede kuluçkaya.
- Gecede E. coli kültür oda sıcaklığına getirmek. Tahta bir sopa kullanarak, amip gecede kültür 750 µL-80 ° C'de tutulan bir donmuş stoktan aşılamak.
Not: axenic büyüme18yeteneğine sahip olan kullanım D. discoideum gerilme AX3. Axenic büyüme bu adım gerekli değildir, ancak sonraki adımları onun gereksinimi olacaktır. - Hemen 700 µL amip -E. coli karışımdan bir glikoz Maya pepton (saçma) plaka üzerine ekleyin. Kültür plaka yüzeyine eşit olarak ileri geri ve yan-yan gerektiği gibi eğerek yayıldı. Bir dağıtıcı kullanmaktan kaçının.
- DOLANDIRMAK plaka agar yüksek nem korur bir kutu içinde yukarı dönük olacak şekilde yerleştirin. İki tek kullanımlık plastik kaplar kullanın (183 cm x 183 cm x 91 cm) birbiri üstüne yığılmış. Alt kapsayıcı yaklaşık 25 mL su doldurun ve nem su deposu üst kapsayıcıya taşımak izin vermek için kapsayıcı döşeme ile delinmiş birkaç 0.5 cm çapında delik top konteyner yerleştirin.
- Kuluçkaya DOLANDIRMAK plaka ve kutusu 22 ° c 4-5 gün kadar amip Sporlar (Şekil 2) plaka yüzey büyüyen gözlenir. Soğutmalı inkübatör kuluçka oda sıcaklığında yerine tabak kuluçkaya için kullanın.
Not: Sporlar büyüdü sonra 4 ° C'de saklandığında uygun birkaç hafta plakalar üzerinde kalırlar Tabakları agar yüzü yukarı bakacak şekilde depolar. 3-4 gün sonra kuluçka, bölgelerini Temizleme bakteriyel çim içinde da amip sporulation başlangıcı gösteriyor görülebilmektedir.- Küçük amip Sporlar plaka yüzeyi yukarıda kuluçka (Şekil 2) 4-5 gün sonra gözlemlemek.
Not: Bu süre Sporlar kalitesini düşürür gibi amip bir haftadan uzun büyümek değil.
- Küçük amip Sporlar plaka yüzeyi yukarıda kuluçka (Şekil 2) 4-5 gün sonra gözlemlemek.
- Amip Sporlar steril 1 mL pipet ucu plaka yüzeyine paralel süpürme tarafından amip axenic büyümesi için hazırlamak için toplamak. Sporlar 10 cm Petri kabına yarısı toplamak.
Not: Bu hareket çok sayıda E. colitopladıkça ucunu agar plaka yüzeyine dokunmaktan kaçının. - Amip pipet ucu ucunu PS orta 1 mL çeker ve hafifçe yukarı ve aşağı pipetting resuspend.
- İnoculated karışımı 0,25 x konsantrasyon, antibiyotik antimycotic çözüm ile takıma PS orta 25 mL içeren bir 250 mL şişe içine aktarın.
Not:-20 ° C'de 250 µL aliquots olarak antibiyotik antimycotic çözüm saklamak Bu onun etkinliğini azaltabilir gibi bu çözümü dondurma ve çözme yinelenen döngüleri kaçının. - Amip axenically 22 ° C'de 100 rpm'de dönen bir shaker büyümek. Adım 5'te virülans tahlil için 600 ölçülen bir optik yoğunluk için hücrelerin büyümesine nm (OD600) 0,2-0,5.
Not: 3-4 gün büyüme aşılama (adım 2.7) zaman bu adımı gerektirir. Hücreler için yüksek yoğunluklu büyüdü Eğer PS orta bir OD600 0,05 veya daha düşük olarak geri kültüründe sulandırmak ve geri bir OD600 0,2-0,5 için büyür.
3. P. aeruginosa büyüme
- P. aeruginosa bir koloni bir LB plaka almak, 2 mL PS:DB kültür aşılamak ve 37 ° C'de doygunluk için bir gecede büyümek.
Not: antibiyotik antimycotic çözüm PS:DB ortama eklemeyin. - 1 gecede kültür: 100 veya 1:1,000 6 cm-çap Petri kabına PS:DB kullanarak oranında seyreltin. Planktonik hücre virülans yalnızca denetlesinler Eğer geleneksel Kültür tüpleri yerine kullanmayı kültürler büyümek. 37 ° C'de 100 RPM ayarla benchtop rotator Tarih kültür sallamak
- Hasat kültürleri tekrarlanabilirlik emin olmak için zaman belirli noktalarda. Virülans değerlendirilmesi önce 1 saat 30 dk 4 bölümünde açıklandığı gibi bir agar pad hazırlayın.
Not: P. aeruginosa virülans yaklaşık 8 h büyüme yüzeylerde tarafından indüklenen. - Yüzey bağlı hücreleri izole etmek için sıvı orta Petri kabına kaldırmak, hemen DB arabellek planktonik hücreleri kaldırmak için 1 mL ile yıkayın ve hemen 5.1 adıma geçin.
Dikkat: 30'dan daha uzun yıkama yok s olarak bu huzursuz ve hücre yüzey bağlı bağlantısını kesin ve virülans ölçüm etkileyebilir. - Planktonik hücreleri izole etmek için kültür 10 µL Petri kabına temiz bir Petri kabına aktarmak ve hemen 5.1 adıma geçin.
4. mikroskobu - Agar Pad hazırlanması
- Amip P. aeruginosaile karışık olması hazır önce agar yastıkları yaklaşık 30 dk 1 h için hazır olun.
- Mikrodalga bir 250 mL şişe arabellekte DB %1 (w/v) agar 50 mL. Mix her 20 s agar kümeleri kadar yok.
- Erimiş agar 15 dakika önceden ısıtılmış 55 ° C su banyosunda yerleştirerek serin.
- Calcein-AM hisse senedi çözüm 15 µL 15 mL konik tüp içinde erimiş agar ekleyin. Yavaşça tüp 4 - 5 kez ters çevirme tarafından karıştırın ve hemen sonraki adıma geçin.
Not: bir polipropilen 15 mL santrifüj tüpü bu adımı gerçekleştirin. Bu çok hızlı bir şekilde katılaşmaya agar neden olur kalın cam kaba kullanmayın. - 12 cm x 10 cm cam levha üzerine erimiş agar karışımı dökün ve oda sıcaklığında 10 dakika katılaşmaya agar sağlar. Katılaşmış agar yastık daha küçük 1,5 cm x 1,5 cm bölümlere cam levha Yazdırılan kılavuz yerleştirme ve kesme metal cetvel kullanarak kılavuzu boyunca kesilmiş.
- Kullanıma hazır olması ne kadar nemli bir kutu içinde sulu jel tutmak.
5. mikroskobu - bakteri-amip örnek hazırlanması için görüntüleme
- Bakteri hücreleri yüzeye bağlı virülans tahlil için amip hücre 10 µL 2.10 adımından yüzey bağlı bakterilerden adım 3.4 ekleyin.
Not: Amip bakteri ile karıştırma bu adımı açıklamaktadır. - Planktonik hücre virülans tahlil için adım 3.5 planktonik bakterilerin 10 µL adım 2.10 amip hücre 10 µL karıştırın.
Not: bakteri ile karıştırma önce axenically yetiştirilen amip hücreleri (adlı bir OD600 0,2-0,5) yıkama yok. Antibiyotik antimycotic çözüm kullanımı nedeniyle amip kültüründe yok E. coli büyüme gözlenir. - Derhal 1,5 cm x 1,5 cm calcein-AM agar pad adım 4.5 bakteri-amip karışımı üzerine Petri kabına zemine yerleştirin.
Not: agar pad hızlı bir yumuşak hareket kullanarak karışımı üzerine yerleştirin. Panelindeki karışım üzerine yavaş yavaş olarak bu hareket çevre doğru ve uzak alt Pad hücreleri itmek eğilimi daha düşük değil. Bu adımı bakteri ve amip eşit olduğundan emin olun karışık, immobilize ve her iki tip hücre aynı uçağa sınırlı. - Aşırı sıvı yavaşça agar pad çevreleyen kalan herhangi bir sıvı pipetting tarafından kaldırın. Petri kabına oda sıcaklığında 20 dakika kurumasını sağlar.
- Bir kapak ile Petri dish ile kapak ve immobilize amip-bakteri karışımı bir ek 40 dk. Proceed adım 6.1 için oda sıcaklığında kuluçkaya.
Not: Tüm örneklerini zaman içinde arka plan floresans arttıkça aynı süre için kuluçkaya önemlidir. 1 h bir kuluçka süresi önerilir. İncubations 1 saat daha uzun süre amip hücreleri patlamaya başlayabilir daha az tekrarlanabilir.
6. mikroskobu - resim alma
- Aydınlık alan ve yeşil floresans görüntüleri alma yeteneğine sahip bir floresan mikroskop kullanarak görüntü amipler. Yeşil floresan için yeşil floresans protein (GFP) filtreleri 474/27 ile nm ve 525/45 nm uyarma ve emisyon, anılan sıraya göre. Amip görüntü için bir 10 X (≥0.3 sayısal diyafram) hedefi kullanın.
Not: Calcein-AM agar yeşil floresans kanalda floresan için ölen amip neden olur. Sağlıklı amip Aksi takdirde floresan değildir. - Edinme kez GFP kanalları fototoksisite sınırlamak ve dinamik alan görüntü yoğunluklarını optimize faz kontrast için ayarlayın. Fark girişim kontrast (DIC) faz kontrast yerine.
Not: 100-200 ms Etkilenmeler faz kontrast ve GFP floresan için mümkünse kullanın. Tüm deney boyunca değişmeden pozlama ve enstrüman ayarlarını almak. Bu ana bilgisayar öldürme dizin bilgi işlem için önemlidir. - Öldürme Dizin ana hesaplamak için iyi istatistikler elde etmek için en az 100 amip hücreler için görüntüleri elde.
7. görüntü analizi ve ana bilgisayar öldürme Dizin
- ImageJ kullanarak görüntü analizi gerçekleştirin.
- Faz kontrast görüntü dosyası içinde ImageJ Dosya açmak | Açık ve görüntüsü seçin. Görüntü tıklayarak eşik ayarlamak | Analiz | Eşik. Sadece yoğunluğu tepe (Şekil 3A) seçmek için alt ve üst eşik ayarlayın.
- İşlemi tıklatarak görüntü ikiliye dönüştürme | İkili | İkili yapmak. İşlemi seçerek delikleri | İkili | Delikleri.
Not: görüntü kaynağı olarak Şekil 1 ' de kullanarak adımları 7.1-7,2 amip ve bakteri yüzey bağlı karanlık bölgeleri (Şekil 3B) görünür bir resim üretecek. - Analiz alan ve gri değeri demek kutularını işaretli olduğundan emin olun | Ayarla ölçümleri. Ana araç çubuğunda oval aracını seçerek amip yaklaşık boyutunu ölçmek. Tıklayın analiz | Ölçü ve temsilcisi amip alanını not edin.
- Analiz tıklatarak amip için maske oluşturun | Parçacıklar analiz. Boyut kutusunda, amip içerir ancak bakterileri dışarıda alanı girin. Maskeler aşağı açılan menü çubuğunda göster seçeneğiiçin'i seçin. Yöneticisine Ekle kutusunun işaretli olduğundan emin olun.
- Tıkırtı OK ve sadece amip ve bir yatırım getirisi Yöneticisi iletişim kutusu (Şekil 3C) gözükür gösteren bir resim.
- Floresan görüntü kullanarak dosyasını açın | Açık ve uygun dosyayı seçerek. Tüm bölgelerin üst karakter tuşunu basılı tutarak ve tıklamak (Şekil 3D) listesindeki her bölgesindeki ROI Yöneticisi'ni seçin.
- ROI Yöneticisi ölçü birimi düğmesini tıklatın. Bu-ecek açık her amip ortalama yoğunluk değerini görüntüleyen bir sonuçlar pencere.
- Floresans değerleri her amip için bir elektronik tablo programına kopyalama ve dizin tüm floresans değerlerin ortalamasını alarak öldürmek ana hesaplar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Vahşi-türü büyüdük ya da P. aeruginosa süzün PA1419 ΔlasR 20 6 cm çapında Petri yemeklerinde aynı PA14 planda strain ve virülans planktonik ve yüzey bağlı hücre denetlesinler. Kültürler tek-kolonileri PS:DB kültürleri, gecede bir rulo davul 37 ° C'de tüplerde kültür ile doygunluğu yetiştirilen içine aşılanmış, 1: 100 PS:DB, 6 cm çapında Petri yemeklerinde 100 devir / dakikada sallayarak 8 h için yetiştirilen ve planktonik ve yüzey bağlı seyreltilmiş P. aeruginosa alt nüfus 3 bölümde açıklandığı gibi izole edildi.
Yüzey bağlı vahşi tipi P. aeruginosa amip, bir yuvarlak amip hücre şekil ve calcein Floresan (Şekil 4A, sol üst paneli) gözlem tarafından gösterilen öldürdü. Bu bir yüksek ana öldürme dizininde (Şekil 4B) yol açmıştır. Planktonik hücreleri amorf amip hücre şekil ve az ya da hiç calcein floresan arka plan (Şekil 4A, sağ üst paneli) yukarıda gözlenmesi ile gösterilen amip tarafından tüketilen edildi. Bu nispeten düşük ana bilgisayar öldürme dizinde (Şekil 4B) yol açmıştır. Hem yüzey bağlı ve ΔlasR baskı planktonik hücreleri dizinler (Şekil 4B, alt paneli) öldürme düşük ana bilgisayar tarafından belirtilen olduğunu amip tarafından tüketilen edildi. Virülans upregulated yüzey bağlı nüfus ve LasR yüzey aktif virülans için gereklidir böylece sonuçlar gösterir hangi oldu daha önce açıklanan13. Bu deneyler böylece sunan güçlü pozitif ve negatif denetimleri gelecekteki deneyler için kurmak.
Resim 1 : Virülans tahlil bakış açıklayan şematik. (1) amip konak hücreleri yetiştirilen, (2) bakteri kültürleri yetiştirilen ve (3) planktonik veya yüzey bağlı bakteriyel hücre amip ile karışık ve agar panelini kullanma aynı görüntüleme uçak immobilize. Konak hücreleri calcein-AM, floresans mikroskobu ve görüntü analizi kullanarak sağlık için sayılabilir. Ölçek çubukları temsil 50 µm. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Resim 2 : Amip sporlar bir DOLANDIRMAK 10 cm-çap üzerinde Petri kabına plaka 5 gün sonra büyüme. Sporlar formu Petri kabına yüzey yukarıda. İlave çanak yüzeyi tek bir bölümünü büyütülmüş bir görünümünü gösterir. Yüzey bu çözünürlükte ayırt bakteriler içerebilir. Ana ve böcek görüntüleri barlarda ölçek 1 cm 2 mm, sırasıyla temsil eder. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 3 : Resim ImageJ kullanarak mikroskobu veri analizi. (A) eşik aracını kullanarak en yüksek yoğunluk seçimi. (B) Şekil 1 faz kontrast kaynak görüntüden ikili bir resme dönüştürüldükten sonra Resulting görüntü. (C) görüntü daha sonra bir maske için dönüştürüldükten sonra Resulting görüntü. Seçim bölgelerinin ROI Yöneticisi'ni kullanarak ilgi (D) ekran. Ölçek çubukları temsil 50 µm. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 4 : P. aeruginosa hücreleri tarafından öldürmek amip temsilcisi sonuçları. (A) Calcein-AM floresans faz mikroskobu görüntüleri ve dizinler veya yüzey bağlı planktonik vahşi-türü veya ΔlasR P. aeruginosa, öldürme (B) ana bilgisayar üzerinde overlaid. Vahşi tipi yüzey bağlı P. aeruginosa öldürür önemli calcein floresan sergi amip ve bu nedenle önemli bir ana dizin öldürüyor. Planktonik hücreleri küçük calcein floresan sergi ve düşük ana bilgisayar öldürme dizin üretmek amip tarafından tüketilir. Hem yüzey bağlı ve planktonik ΔlasR amip ve sonuç bir düşük ana bilgisayar öldürme dizin tarafından tüketilir. Ölçek çubukları temsil 50 µm. çubuklar üç bağımsız deneyler ortalamasını gösterir ve hataları çubuklar standart sapma gösterir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bu iletişim kuralı virülans P. aeruginosaiçinde tahlil hızlı ve nicel yöntemi açıklanır. Bu iletişim kuralı ile diğer bakteri test edilebilir. Ancak, büyüme orta amip büyüme koşulları ile uyumlu olması gerektiğini akılda tutmak önemlidir. Özellikle, PS:DB bakteriyel büyüme aracı olarak kullanan Protokolü optimize. Diğer medya kullanılması halinde, hiçbir bakteri hücreleri orta amip ile uyumlu olduğunu doğrulamak için mevcut olan bir büyüme sadece medya denetimi gerçekleştirmek gerekli olabilir.
Bu yöntem-ebilmek var olmak genişlemek virülans büyüme aşaması bağımlılığının tahlil için. Özellikle bakteriyel kültürlerde kez bir sabit zaman noktası yerine geniş bir aralığı için yetiştirilen olabilir. Deneyim, P. aeruginosa virülans büyüme aşaması üzerinde bağımlı olmak göründüğü zaman belirli noktalarda bakteriyel kültürlerde hasat önemlidir. Biz virülans P. aeruginosa içinde 6-8 h Petri yemeklerinde büyüme arasında akımıdır gözlenen.
Fazla değişken büyüme ortamı ile ilişkili ana bilgisayar sağlığı ve bakteriyel virülans etkiler. Böylece, her deneme için uygun pozitif ve negatif denetimleri kullanmak önemlidir. Bir pozitif kontrol ve ΔlasR bir negatif kontrol olarak olarak vahşi tipi yüzey bağlı P. aeruginosa kullandık. Biz bu denetimlerin her sefer virülans tahlil gerçekleştirilen performans öneririz. Bu denetimler amip, sıcaklık vb. değişimler yaşın Ayrıca, öneririz tüm deneylerin biyolojik çoğaltma kurmak için gerçekleştirme gibi konak hücre ölüm nedeniyle herhangi bir dış etken olmadığını doğrulamak için önemlidir virülans fenotipleri tekrarlanabilirlik.
Biz amip 0,2-0,5 optik bir yoğunluk kullanma seyreltme sonra en az 1:10 bizim deneyler gerçekleştirdik ve amip kültür tam ile 22 ° c sıcaklık düzenlenmiş Bu büyüme durumlar dışında bulduk amip Virülan bakteriler için duyarlılık ve virülans tahlil tekrarlanabilirlik değişmiş. Amip hücreleri nispeten hızlı bir şekilde cips. Kültürler tarafından pipetting optik yoğunluk ölçüm yapılmadan hemen önce yukarı ve aşağı resuspended emin olun. Deneme tekrarlanabilirlik yüksek yoğunlukları için büyümeyi etkiler gibi 1 daha bir OD600 yoğunluğu yüksek amip kültürler büyümek değil. Axenic kültürler artık 1 hafta daha yaymak. Buna ek olarak, amip axenically yetiştirilen doğrulamak önemlidir (2,7 adımda başlayan) 20 X veya yüksek büyütme mikroskobu böyle aracılığıyla diğer mikroplar kültüründe mevcut değildir. Kültürler ilk aşı takip büyüme 2 gün sonra adım 2.10 bulanık iseniz, bu büyük olasılıkla bir mikrobiyal kirletici varlığı gösterir. Bakteriyel kontaminasyon şüphesi varsa, amip kültür için 4-8 h 37 ° C'de 1 mL büyüyor öneririz. Bu koşullar altında bulanık bir kültürün gözlem bakteriyel kontaminasyon öneririz. Bakteriyel kirlenme görülmektedir tekrarlanan, antibiyotik antimycotic çözüm değiştirilmelidir.
Ana bilgisayar öldürme Dizin bakteriyel bir nüfus öldürücü olmayan olup, güvenilir bir göstergedir. Bu tahlil virülans (orta-düşük virülans için karşılaştırıldığındaYani, düşük virülans) farklı ara düzeyleri arasında karşılaştırmalar için optimize edilmiş değil ve aşırı sonuçların yorumlanması kaçınılmalıdır. Bu sorunu gidermek için potansiyel virülans tahlil ek Çoğalt deneyler yapmak ve uygun performans sonuçlarında güven kurmak için ana hücrelerinin farklı toplu işlemleri kullanma birden fazla gün içinde tekrarı metodlar istatistiksel analizler.
Enfeksiyon (MOI) planktonik hücre çokluğu bakteriyel kültürünün optik yoğunluk normalleştirme tarafından kontrol edilebilir. Ancak, bu tahlil yüzey bağlı bakteri hücreleri MOI denetlemez. Bakteriyel yüzey yoğunluğu zamanla arttığını gözlemledik. Böylece, Petri kabına zamanında büyüme ayarlamak karşılık gelen bir değişiklik yüzey yoğunluğu neden olabilir. Ayrıca, yüzey yoğunluğu yüzey malzeme üzerinde bağlıdır. Burada açıklanan tahlil polistren yüzeyler P. aeruginosa hücreleri iliştirin. Ancak, cam, agar ve polyacrylamide de dahil olmak üzere diğer yüzeyler de bölümü13kullanabilirsiniz. Bakteriyel nüfus tek katmanlı yüzey yoğunluğu 100 X büyütme faz mikroskobu kullanılarak ölçülebilir. Yüzey yoğunluğu çok katmanlı, confocal mikroskobu uygun olabilir.
Burada, hızlı ve sağlam bir yöntem bakteriyel virülans ölçmek için anlatmıştık. Kuluçka kez, floresan boya, bakteriyel zorlanma, konak hücre tipi veya büyüme medya gibi bağımsız parametreleri değiştirerek, bu yöntem virülans organizmalar ve büyüme koşulları geniş aralığında ölçmek için uzatılabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar ifşa gerek yok.
Acknowledgments
KP ve AS yazdı ve el yazması yeniden düzenlendi. KP deneyler ve analizi yapılır. Bu eser as için Ulusal Enstitüsü Sağlık (NIH) kariyer geçiş Ödülü (K22AI112816) tarafından desteklenmiştir
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents | |||
| Bacto agar, dehydrated | BD Difco | 214010 | |
| Antibiotic-Antimycotic (100X) | Life Technologies | 15240062 | Aliquot < 1 mL and store at -20 °C |
| Calcein-acetoxymethyl ester (calcein-AM) | Life Technologies | C34852 | Calcein Acetoxymethyl (AM) |
| Calcium chloride, anhydrous | Sigma-Aldrich | C1016 | |
| D-Glucose | Fisher Chemical | D16500 | Dextrose |
| Dimethyl sulfoxide | Sigma-Aldrich | D5879 | |
| Folic acid | Sigma-Aldrich | F8758 | |
| LB-Miller | BD Difco | 244620 | |
| Magnesium chloride | Sigma-Aldrich | M8266 | |
| Yeast extract | Oxoid | LP0021 | |
| Special peptone | Oxoid | LP0072 | |
| Potassium hyroxide | Fisher Chemical | P250 | |
| Potassium phosphate monobasic | Sigma-Aldrich | P0662 | |
| Sodium phosphate dibasic heptahydrate | Fisher Chemical | S373 | |
| Vitamin B12 | Sigma-Aldrich | V2876 | |
| Strains | |||
| Dictyostelium discoideum | Siryaporn lab | Strain AX318 | |
| Escherichia coli | Siryaporn lab | Strain B/r17 | |
| Pseudomonas aeruginosa | Siryaporn lab | PA14 | PA14 strain19 |
| Pseudomonas aeruginosa ΔlasR | Siryaporn lab | AFS20.1 | PA14-derived strain20 |
| Supplies | |||
| 0.22 µm filter | Millipore | SCGPT01RE | For filter sterilization |
| Conical tube, 15 mL | Corning | 352097 | |
| Glass storage bottles | Pyrex | 13951L | 250 mL, 500 mL, 1000 mL |
| Petri dish, 6 cm diameter | Corning | 351007 | 60 x 15 mm polystyrene plates |
| Petri dish, 10 cm diameter | Fisher | FB0875712 | 100 x 15 mm polystyrene plates |
| Plastic containers with lid | Ziploc | 2.57E+09 | Square 3-cup containers |
| Glass plates | Bio-Rad | 1653308 | For preparing agar pads. Other glass plates may be used with similar dimensions. |
| Wooden sticks | Fisher | 23-400-102 | |
| Equipment | |||
| Eclipse Ti-E microscope | Nikon | MEA53100 | Microscope setup |
| 10X Plan Fluor Ph1 objective 0.3 NA | Nikon | MRH20101 | Microscope setup |
| Fluorescence excitation source | Lumencor | Sola light engine | Microscope setup |
| Fluorescence filter set | Semrock | LED-DA/FI/TX-3X3M-A-000 | Microscope setup |
| Orca Flash 4.0 V2 Camera | Hamamatsu | 77054098 | Microscope setup |
| ImageJ | NIH | v. 1.49 | Software for image analysis |
| MATLAB | Mathworks | R2013 | Software for image analysis |
| Orbital shaker incubator | VWR | 89032-092 | For growth of bacteria at 37 °C |
| Platform shaker | Fisher | 13-687-700 | For growth of amoebae at 22 °C |
| Spectrophotometer | Biochrom | Ultrospec 10 | |
| Undercounter refrigerated incubator | Fisher | 97990E | For growth of amoebae at 22 °C |
| Isotemp waterbath | Fisher | 15-462-21Q | For cooling media to 55 °C |
References
- Rasko, D. A., Sperandio, V. Anti-virulence strategies to combat bacteria-mediated disease. Nature Reviews Drug Discovery. 9 (2), 117-128 (2010).
- Coburn, B., Grassl, G. A., Finlay, B. B. Salmonella, the host and disease: a brief review. Immunology and Cell Biology. 85 (2), 112-118 (2007).
- Alibaud, L., et al. Pseudomonas aeruginosa virulence genes identified in a Dictyostelium host model. Cellular Microbiology. 10 (3), 729-740 (2008).
- Pukatzki, S., Kessin, R. H., Mekalanos, J. J. The human pathogen Pseudomonas aeruginosa utilizes conserved virulence pathways to infect the social amoeba Dictyostelium discoideum. Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 99 (5), 3159-3164 (2002).
- Cosson, P., et al. Pseudomonas aeruginosa Virulence Analyzed in a Dictyostelium discoideum Host System. Journal of Bacteriology. 184 (11), 3027-3033 (2002).
- Pukatzki, S., et al. Identification of a conserved bacterial protein secretion system in Vibrio cholerae using the Dictyostelium host model system. Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 103 (5), 1528-1533 (2006).
- Steinert, M., Heuner, K. Dictyostelium as host model for pathogenesis. Cellular Microbiology. 7 (3), 307-314 (2005).
- Hagele, S., Kohler, R., Merkert, H., Schleicher, M., Hacker, J., Steinert, M. Dictyostelium discoideum: a new host model system for intracellular pathogens of the genus Legionella. Cellular Microbiology. 2 (2), 165-171 (2000).
- Matz, C., et al. Pseudomonas aeruginosa uses type III secretion system to kill biofilm-associated amoebae. ISME Journal. 2 (8), 843-852 (2008).
- Hauser, A. R. The type III secretion system of Pseudomonas aeruginosa: infection by injection. Nature Reviews Microbiology. 7 (9), 654-665 (2009).
- Moore, P. L., MacCoubrey, I. C., Haugland, R. P. A rapid pH insensitive, two color fluorescence viability (cytotoxicity) assay. Journal of Cell Biology. 111, Abstract 304 58 (1990).
- Kaneshiro, E. S., Wyder, M. A., Wu, Y. -P., Cushion, M. T. Reliability of calcein acetoxy methyl ester and ethidium homodimer or propidium iodide for viability assessment of microbes. Journal of Microbiological Methods. 17 (1), 1-16 (1993).
- Siryaporn, A., Kuchma, S. L., O'Toole, G. A., Gitai, Z. Surface attachment induces Pseudomonas aeruginosa virulence. Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 111 (47), 16860-16865 (2014).
- Decherchi, P., Cochard, P., Gauthier, P. Dual staining assessment of Schwann cell viability within whole peripheral nerves using calcein-AM and ethidium homodimer. Journal of Neuroscience Methods. 71 (2), 205-213 (1997).
- Braut-Boucher, F., Pichon, J., Rat, P., Adolphe, M., Aubery, M., Font, J. A non-isotopic, highly sensitive, fluorimetric, cell-cell adhesion microplate assay using calcein AM-labeled lymphocytes. Journal of Immunological Methods. 178 (1), 41-51 (1995).
- Grieshaber, P., Lagrèze, W. A., Noack, C., Boehringer, D., Biermann, J. Staining of fluorogold-prelabeled retinal ganglion cells with calcein-AM: A new method for assessing cell vitality. Journal of Neuroscience Methods. 192 (2), 233-239 (2010).
- Witkin, E. M. Inherited Differences in Sensitivity to Radiation in Escherichia Coli. Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 32 (3), 59-68 (1946).
- Loomis, W. F. Sensitivity of Dictyostelium discoideum to nucleic acid analogues. Experimental Cell Research. 64 (2), 484-486 (1971).
- Rahme, L. G., Stevens, E. J., Wolfort, S. F., Shao, J., Tompkins, R. G., Ausubel, F. M. Common virulence factors for bacterial pathogenicity in plants and animals. Science. 268 (5219), 1899-1902 (1995).
- O'Loughlin, C. T., Miller, L. C., Siryaporn, A., Drescher, K., Semmelhack, M. F., Bassler, B. L. A quorum-sensing inhibitor blocks Pseudomonas aeruginosa virulence and biofilm formation. Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 110 (44), 17981-17986 (2013).
