Summary
Hier präsentieren wir ein Protokoll, um die Virulenz von planktonischen oder Oberfläche befestigt Bakterien mit D. Discoideum (Amöben) als Host zu messen. Virulenz wird gemessen über einen Zeitraum von 1 h und Host töten wird quantifiziert mit Fluoreszenz-Mikroskopie und Bildanalyse. Wir zeigen dieses Protokoll mit dem Bakterium p. Aeruginosa.
Abstract
Traditionelle bakteriellen Virulenz Tests beinhalten über längere Zeit Bakterien im Laufe von mehreren Stunden auf Wirtszellen. Während dieser Zeit können Bakterien in der Physiologie aufgrund der Exposition gegenüber Hostumgebung Wachstum und das Vorhandensein von Wirtszellen verändern. Wir entwickelten einen Test um den Zustand der Virulenz der Bakterien schnell zu messen, die das Ausmaß zu minimieren, um das Bakterien in Gegenwart von Wirtszellen wachsen. Bakterien und Amöben sind miteinander vermischt und auf einen einzigen Abbildungsebene mit einer Agar-Pad immobilisiert. Das Verfahren nutzt einzellige Fluoreszenz-Bildgebung mit Calcein-Acetoxymethyl Ester (Calcein-AM) als Indikator für Host Zellgesundheit. Die Fluoreszenz von Wirtszellen ist nach 1 h von Wirtszellen Bakterien ausgesetzt zu sein mit Epifluoreszenz mikroskopie analysiert. Bildanalyse-Software wird verwendet, um einen Host-Tötung-Index zu berechnen. Diese Methode wurde verwendet, um die Virulenz innerhalb von planktonischen und Oberfläche befestigt Pseudomonas Aeruginosa Messen Sub-Populationen in der Anfangsphase der Biofilmbildung und andere Bakterien und andere Wachstumsstadien Biofilm angepasst werden kann. Dieses Protokoll bietet eine schnelle und robuste Methode zur Messung der Virulenz und vermeidet viele der komplexen Zusammenhang mit Wachstum und Erhalt von Säugetieren Zelllinien. Virulenz Phänotypen mit Amöben hier gemessen wurden auch mit Maus Makrophagen validiert. Insbesondere wurde dieser Assay verwendet, um die Oberfläche Anlage reguliert Virulenz in p. Aeruginosazu etablieren.
Introduction
Bakterielle Infektion gehört zu den führenden Todesursachen in Mensch und Tier1,2. Die Fähigkeit, Virulenz der Bakterien in Kulturen oder Biofilme zu messen ist wichtig in Medizin und Forschung Einstellungen. Hier beschreiben wir eine vielseitige, schnelle und relativ einfache Methode, um bakterielle Virulenz zu quantifizieren. Die Eukaryotische Organismus Dictyostelium Discoideum (Amöben) dient als Modell Wirtsorganismus. D. Discoideum wurde als Host verwendet, um Virulenzfaktoren in Pseudomonas Aeruginosa (p. Aeruginosa)3,4,5 und andere Bakterien6,7 identifizieren ,8 und ist anfällig für weitgehend die gleichen Virulenzfaktoren, die Säugerzellen einschließlich Typ III-Sekretion9,10zu töten. Vorherigen Virulenz-Assays mit D. Discoideum haben im Laufe der Stunden3,4,5über längere Zeit von Bakterien mit D. Discoideum Zellen beteiligt. Hier das Protokoll stellt eine schnelle Methode zur Bestimmung der Virulenz verwenden diese Amöbe. Dieses Protokoll (Abbildung 1) beschreibt wie man: (1) wachsen die Amöben axenically (in Abwesenheit von Bakterien), (2) wachsen Bakterien für den Assay, (3) bereiten Bakterien und Wirtszellen für Mikroskopie, (4) Epifluoreszenz mikroskopie durchzuführen, und (5) analysieren Sie Amöbe Fluoreszenz.
Amöben sind zunächst gestreift von gefrorenen Vorräte und auf eine Rasenfläche von Escherichia coli (E. Coli), angebaut, wo die Amöben Sporen produzieren. Diese Sporen sind abgeholt und in eine angereicherte Medium für axenic Wachstum geimpft. Die Amöben sind durch axenic Wachstum in nährstoffreichen Bedingungen beibehalten, bis sie bereit sind, mit Bakterien für die Beurteilung der bakteriellen Virulenz gemischt werden. Das Überleben oder den Tod der Amöben wird durch die Messung der Fluoreszenz von Calcein-Acetoxymethyl (Calcein-AM), die durch intrazelluläre Esterasen abgespalten und, dadurch aktiviert für Fluoreszenz11,12quantifiziert. Live Amöben zeigen wenig oder gar keine Fluoreszenz betont, und sterbende Zellen intensiv fluoreszieren. Dieses Ergebnis ist durch eine kleine oder gar keine Einarbeitung von Calcein-AM gesunden Amöben und Einbeziehung und Spaltung des Substrats im gestressten Amöben13. Dieses Verhalten unterscheidet sich vor allem von Calcein-AM Fluoreszenz in Säugerzellen11,14,15,16.
Bakterien, die für die Virulenz beurteilt werden separat angebaut. Hier beschreiben wir wie Sie messen die Virulenz von opportunistischen Erreger p. Aeruginosa und ausführlich, wie man die Virulenz von planktonischen (Schwimmen) und Oberfläche befestigt Sub-Populationen zu quantifizieren. Dieses Protokoll möglicherweise angepasst, die Virulenz von anderen Bakterien zu testen. Im Abschnitt Vertreter Ergebnisse wir zeigen, dass die Virulenz in Oberfläche angebracht Zellen aktiviert und ist niedrig im planktonischen Zellen, die hieß zuvor13. Virulenz-aktivierte Oberfläche angebracht p. Aeruginosa tötet Amöben, während nicht virulente planktonischen Zellen von den Amöben konsumiert werden. Wenn die Virulenz von planktonischen Bakterien ausschließlich untersucht wird ist, können Bakterien in gewöhnlichen Kultur Röhren anstatt Petrischalen zu verwenden, wie im Protokoll beschrieben kultiviert werden.
Das Wachstum der Amöben und p. Aeruginosa Kulturen muss koordiniert werden, so dass p. Aeruginosa Kulturen die beabsichtigten Wachstumsphase erreichen, während die Amöben im Steady-State in nährstoffreichen Bedingungen wachsen. Dieser Zustand erfordert in der Regel Amöben Kulturen mindestens 1 Tag vor dem verdünnt werden, wenn sie mit Bakterien vermischt werden. Amöben und Bakterien sind immobilisiert mit Agar-Pads sind für 1 h Co inkubierten und abgebildet, mit einer niedrigen Auflösung (10 X, numerische Apertur 0,3) Objektive, grüne Fluoreszenz-Protein (GFP) filtert und eine Wärmebildkamera. Analyse mit frei verfügbare ImageJ-Software ausgeführt werden kann oder Bildanalyse-Software angepasst. Unsere Analyse erfolgte mittels eigener Software mit einer wissenschaftlichen Analyse Paket13geschrieben. Die Software sollte erstellen Sie eine Maske mit dem Phase Kontrast Bild und die maskierten Bereiche in der fluoreszenzbild Fluoreszenz Werte extrahieren. Fluoreszenz-Werte sind über mindestens 100 Zellen, was zu einer numerischen Host Tötung Index gemittelt.
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Protocol
Alle experimentelle Verfahren erfolgten an der University of California, Irvine.
1. Puffer und Lösungen
- Bereiten Sie Lysogeny Brühe (LB) in einer 1 L Glasflasche durch Zugabe von LB-Miller-Mischung 25 g in 1 L bidestilliertem Wasser (DdH2O vor). Fügen Sie für Petrischalen eine zusätzliche 20 g Agar. Autoklav zu sterilisieren. Gießen Sie 25 mL des flüssigen Agar Medium in 10 cm-Durchmesser-Petrischalen und bei Zimmertemperatur erstarren lassen. Speichern von flüssigen Medien bei Raumtemperatur und Agarplatten bei 4 ° C.
- Bereiten Sie Glukose Hefe Pepton (Gips) Platten in eine 1 L-Glas-Flasche durch das Mischen von 1 g D-Glucose, 2 g Pepton, 0,25 g Hefe-Extrakt, 4,2 g KH2PO4, 5,1 g Na2HPO47 H2O und 25 g Agar in 1 L DdH2 O. Autoklav zu sterilisieren. Gießen Sie 25 mL des geschmolzenen Nährbodens in 10 cm-Durchmesser-Petrischalen und bei Zimmertemperatur erstarren lassen. Shop bei 4 ° C.
- Bereiten Sie Pepton S (PS) Medium in eine 1 L-Glas-Flasche durch das Mischen von 10 g Pepton, 7 g Hefe-Extrakt, 15 g D-Glucose, 0,12 g Na2HPO47 H2O, 1,4 g KH2PO4, 40 µg Vitamin B12 , und 80 µg Folsäure in 800 mL DdH2O. kalibrieren eine elektronischen pH-Meter pH 4 und pH 7 Standards verwenden, wenn der pH-Meter nicht innerhalb eines Tages verwendet worden ist.
- Messen Sie den pH-Wert des Mediums PS mit dem pH-Meter. Fügen Sie entweder 5 M KOH oder 5 M H3PO4 zur Einstellung des pH-Wertes auf 6,5. Die letzte Lautstärke bis 1 L mit DdH2O. Filter sterilisieren mit 0,22 µm Vakuumfilter und Lagerung bei 4 ° C.
Hinweis: Gehen Sie vorsichtig mit den pH-Wert Anpassungen durch das Tragen von Schutzausrüstung einschließlich Schutzkleidung, Handschuhe, Augenschutz und stellen Sie Schutz zu.
- Messen Sie den pH-Wert des Mediums PS mit dem pH-Meter. Fügen Sie entweder 5 M KOH oder 5 M H3PO4 zur Einstellung des pH-Wertes auf 6,5. Die letzte Lautstärke bis 1 L mit DdH2O. Filter sterilisieren mit 0,22 µm Vakuumfilter und Lagerung bei 4 ° C.
- 10 x Entwicklung Puffer Prime vorzubereiten (DB ") Puffer in einer 1 L Glasflasche durch Zugabe von 3,4 g KH2PO4, 13,4 g Na2HPO4 7 H2O und DdH2O auf ein Gesamtvolumen von 800 mL. Kalibrieren einer elektronischen pH-Meter pH 4 und pH 7 Standards verwenden, wenn der pH-Meter nicht innerhalb eines Tages verwendet worden ist.
- Messen Sie den pH-Wert des Puffers mit dem elektronischen pH-Meter. Passen Sie den pH-Wert 6,5 indem sanft entweder 5 M KOH oder 5 M H3PO4 nach Bedarf an. Die letzte Lautstärke bis 1 L mit DdH2O und durch Autoklavieren zu sterilisieren. Bei Raumtemperatur lagern.
Hinweis: Gehen Sie vorsichtig mit den pH-Wert Anpassungen durch das Tragen von Schutzausrüstung einschließlich Schutzkleidung, Handschuhe, Augenschutz und stellen Sie Schutz zu.
- Messen Sie den pH-Wert des Puffers mit dem elektronischen pH-Meter. Passen Sie den pH-Wert 6,5 indem sanft entweder 5 M KOH oder 5 M H3PO4 nach Bedarf an. Die letzte Lautstärke bis 1 L mit DdH2O und durch Autoklavieren zu sterilisieren. Bei Raumtemperatur lagern.
- 1 x Entwicklung Puffer (DB) zu machen, durch Mischen 100 mL 10 x DB "Puffer mit 1 mL sterilisiert 2 M MgCl2und 1 mL 1 M CaCl2sterilisiert. Die letzte Lautstärke zu 1 L in einer 1 L Glasflasche mit einem Autoklaven sterilisiert DdH2O. Store bei Raumtemperatur.
- Bereiten Sie PS:DB Medium in einer 1 L Glasflasche durch Mischen 100 mL sterilisiert PS Medium, 100 mL sterilisiert 10 x DB "Puffer und sterilisierte DdH2O auf ein Gesamtvolumen von 1 L. Ergänzung mit 1 mL sterilisiert 2 M MgCl2 und 1 mL sterilisiert 1 M CaCl 2. Store bei 4 ° C.
- Bereiten Sie die Calcein-AM Lager Lösung durch Zugabe von 50 µL von DMSO auf 50 µg von Calcein-AM in der vom Hersteller gelieferten Kunststoffbehälter. Shop bei-20 ° C.
(2) Wachstum und Erhaltung der Amöben
- Wachsen Sie E. Coli -Stamm B/r17 als Nahrungsquelle für die Amöben in der ersten Wachstumsphase. Streak E. Coli B/r aus einem gefrorenen bestand bei-80 ° C auf eine LB-Agar-Platte gespeichert und Inkubation bei 37 ° C über Nacht um einzelne Kolonien zu erhalten.
- Eine einzige Kolonie von E. Coli B/r in 2 mL LB-Medium zu impfen und über Nacht in einer Bandage oder einem Shaker bei 37 ° C inkubieren.
- Bringen Sie die Übernachtung E. Coli Kultur auf die Raumtemperatur. Mit einem Holzstab, impfen Sie Amöben aus einem gefrorenen bestand in 750 µL der Übernacht-Kultur bei-80 ° C gehalten.
Hinweis: Verwendung D. Discoideum Stamm AX3, axenic Wachstum18dar. Dieser Schritt erfordert keine axenic Wachstum, aber nachfolgende Schritte habe seine Verpflichtung. - Fügen Sie sofort 700 µL der Amöben -E. Coli -Mischung auf einen Teller Glukose Hefe Pepton (Gips). Verbreitung der Kultur gleichmäßig auf der Oberfläche der Platte durch Kippen es hin und her und Seite-an-Seite nach Bedarf. Vermeiden Sie die Verwendung von einem Spreader.
- Platzieren Sie die GYP-Platte mit Agar nach oben in eine Box, die hohen Luftfeuchtigkeit führt. Verwenden Sie zwei Einweg-Kunststoff-Behälter (183 x 183 cm x 91 cm) oben auf einander gestapelt. Füllen Sie den unteren Behälter mit ca. 25 mL Wasser und stellen Sie den oberen Behälter mit mehreren 0,5 cm Durchmesser Löcher gebohrt, durch den Boden des Behälters, um Feuchtigkeit aus dem Wasserreservoir in den oberen Behälter verschieben kann.
- 4-5 Tage bis Amöbe Sporen beobachtet sind nahe der Oberfläche der Platte (Abbildung 2) wächst inkubieren Sie die GYP Platte und Box bei 22 ° C. Verwenden Sie einen gekühlten Inkubator, um Platten anstatt Inkubation bei Raumtemperatur inkubieren.
Hinweis: Nachdem Sporen gewachsen sind, bleiben sie auf Platten für mehrere Wochen lebensfähig, wenn bei 4 ° c gelagert Speichern Sie die Platten mit Agar Seite nach oben. Nach 3-4 Tagen Inkubation können Zonen Clearing innerhalb des bakteriellen Rasens beobachtet werden, die zeigen des Beginn der Amöbe Sporenbildung.- Beobachten Sie kleine Amöben Sporen über die Plattenoberfläche nach 4-5 Tagen Inkubationszeit (Abbildung 2).
Hinweis: Wachsen Sie nicht die Amöben für länger als eine Woche, da die Qualität der Sporen nach Ablaufen dieser Frist abnimmt.
- Beobachten Sie kleine Amöben Sporen über die Plattenoberfläche nach 4-5 Tagen Inkubationszeit (Abbildung 2).
- Sammeln Sie Amöben Sporen vorzubereiten für das axenic Wachstum der Amöben durch eine sterile 1 mL PIPETTENSPITZE parallel zur Oberfläche der Platte zu fegen. Sporen aus der Hälfte einer 10 cm Petrischale zu sammeln.
Hinweis: Berühren Sie die Spitze an die Oberfläche der Agar-Platte wie diese Bewegung große Zahlen von E. Colisammeln wird. - Aufschwemmen der Amöben an der Spitze der Pipette durch Eintauchen der Spitze in 1 mL PS Medium und sanft auf und ab pipettieren.
- Übertragen Sie die beimpfte Mischung in einen 250-mL-Flasche mit 25 mL des Mediums PS ergänzt mit der Antibiotikum-antimykotische Lösung bei 0,25 X Konzentration.
Hinweis: Bewahren Sie die Antibiotikum-antimykotische Lösung als 250 µL-Aliquots bei-20 ° C. Vermeiden Sie wiederholte Zyklen der Auftauen und Einfrieren dieser Lösung, da dadurch seine Wirksamkeit verringern kann. - Amöben axenically bei 22 ° C in einem rotierenden Shaker bei 100 u/min zu wachsen. Für die Virulenz-Assay in Schritt 5 Zellen wachsen zu einer optischen Dichte, gemessen bei 600 nm (OD600) von 0,2 bis 0,5.
Hinweis: Dieser Schritt erfordert ca. 3-4 Tage Wachstum ab dem Zeitpunkt der Impfung (Schritt 2.7). Wenn Zellen zu einer höheren Dichte gewachsen sind, verdünnen die Kultur zurück in PS Medium zu einem OD-600 von 0,05 oder niedriger und wachsen wieder zu einem OD-600 von 0,2 bis 0,5.
(3) das Wachstum von p. aeruginosa
- Wählen Sie eine einzelne Kolonie von p. Aeruginosa von eine LB-Platte, in ein 2 mL PS:DB Kultur zu impfen und wachsen über Nacht bei 37 ° C, Sättigung.
Hinweis: Fügen Sie die Antibiotikum antimykotische Lösung nicht zu den PS:DB Medien. - Verdünnen Sie Nacht Kultur 1: 100 oder 1:1,000 in eine 6 cm-Durchmesser Petrischale mit PS:DB. Wenn die Virulenz von planktonischen Zellen ausschließlich untersucht wird ist, wachsen Sie die Kulturen mit herkömmlichen Kultur Röhren statt. Schütteln Sie die Kultur auf ein Benchtop-Rotator bei 100 u/min bei 37 ° c eingestellt
- Ernte-Kulturen zu bestimmten Zeitpunkten auf Reproduzierbarkeit zu gewährleisten. Bereiten Sie bei 30 min bis 1 h vor der Beurteilung der Virulenz eine Agar-Pad, wie in Abschnitt 4 beschrieben.
Hinweis: Virulenz in p. Aeruginosa wird durch ca. 8 h des Wachstums auf Oberflächen induziert. - Um die Oberfläche angebracht Zellen zu isolieren, entfernen Sie das flüssige Medium aus der Petrischale, waschen Sie sofort mit 1 mL der DB-Puffer, planktonischen Zellen zu entfernen und gehen Sie sofort zum Schritt 5.1.
Achtung: Waschen Sie nicht länger als 30 s da dies durcheinanderbringen und Oberfläche angebracht Zellen zu lösen und die Virulenz Messung beeinträchtigen. - Um planktonischen Zellen zu isolieren, übertragen Sie 10 µL der Kultur von der Petrischale auf einer sauberen Petrischale und gehen Sie sofort zu Schritt 5.1.
(4) Mikroskopie - Vorbereitung der Agar-Pad
- Bereiten Sie Agar Pads ca. 30 min bis 1 h bis Amöben mit p. Aeruginosamischbar sind.
- Mikrowelle 50 mL von 1 % (w/V) Agar in DB-Puffer in einem 250 mL-Kolben. Mix alle 20 s bis Klumpen von Agar verschwinden.
- Kühlen Sie die geschmolzene Agar indem man sie in vorgeheizten 55 ° C Wasserbad für 15 min.
- 15 mL des geschmolzenen Nährbodens in einem konischen Rohr 15 µL der Stammlösung Calcein-AM hinzufügen. Mischen Sie durch sanft das Rohr 4 - 5 mal umdrehen und sofort mit dem nächsten Schritt fortfahren.
Hinweis: Führen Sie diesen Schritt in einem Polypropylen 15 mL Zentrifugenröhrchen. Verwenden Sie einen dickes Glas-Container nicht, als dadurch der Agar, vorschnell zu festigen. - Gießen Sie die flüssigen Agar Mischung auf einer 12 cm x 10 cm Glasplatte und erlauben Sie den Nährboden für 10 Minuten bei Raumtemperatur zu festigen. Schneiden Sie indem du die Glasplatte über einem gedruckten Raster und schneiden entlang des Rasters ein Metall-Lineal mit erstarrtem Agar-Pad in kleinere Abschnitte von 1,5 x 1,5 cm.
- Halten Sie das Gel in einer feuchten Box hydratisiert, bis es betriebsbereit ist.
(5) Mikroskopie - Vorbereitung der Bakterien-Amöbe Probe für die Bildgebung
- Um die Virulenz der Oberfläche befestigt Bakterienzellen assay, fügen Sie 10 µL der Amöbe Zellen aus Schritt 2.10 Oberfläche befestigt Bakterien aus Schritt 3.4 hinzu.
Hinweis: Diese Schritt beschreibt das Mischen von Amöben mit Bakterien. - Um die Virulenz von planktonischen Zellen assay, mischen Sie 10 µL der Amöbe Zellen aus Schritt 2.10 mit 10 µL der planktonischen Bakterien aus Schritt 3.5.
Hinweis: Waschen Sie die axenically gewachsen Amöbe Zellen (bei einer OD600 von 0,2 bis 0,5) vor dem Mischen mit den Bakterien nicht. Kein Wachstum von E. Coli wird in die Amöbe Kultur durch den Einsatz von Antibiotika-antimykotische Lösung beobachtet werden. - Legen Sie sofort das 1,5 x 1,5 cm Calcein-AM Agar Pad ab Schritt 4.5 auf die Bakterien-Amöben-Mischung auf der Petrischale Oberfläche.
Hinweis: Legen Sie das Agar-Pad auf der Mischung mit einer schnellen reibungslosen Bewegung. Senken Sie das Pad langsam auf die Mischung nicht, da diese Bewegung dazu neigt, Zellen in Richtung der Peripherie und Weg von der Unterseite des Pads schieben. Diese Schritt wird sichergestellt, dass Bakterien und Amöben gleichmäßig sind gemischt, immobilisiert und, dass beide Arten Zelle sind auf der gleichen Ebene beschränkt. - Sanft pipettieren Sie alle verbleibenden Flüssigkeit umgibt das Agar-Pad, um überschüssige Flüssigkeit zu entfernen. Lassen Sie die Petrischale für 20 min bei Raumtemperatur trocknen.
- Mit der Petrischale mit einem Deckel decken Sie ab und inkubieren Sie die immobilisierten Amöben-Bakterien-Mischung bei Raumtemperatur für eine zusätzliche 40 min. gehen Sie zu Schritt 6.1.
Hinweis: Es ist wichtig, alle Proben für die gleiche Menge an Zeit, wenn der Hintergrund Fluoreszenz erhöht im Laufe der Zeit zu inkubieren. Es empfiehlt sich eine Inkubationszeit von 1 h. Inkubationen länger als 1 h sind weniger reproduzierbar wie Amöben Zellen zu platzen beginnen können.
(6) Mikroskopie - Bilderfassung
- Bild Amöben mit einem Fluoreszenzmikroskop Hellfeld und grün Fluoreszenzbilder erwerben. Verwenden Sie für grüne Fluoreszenz, grüne Fluoreszenz Protein (GFP) Filter mit 474/27 nm und 525/45 nm für Anregung und Emission, beziehungsweise. Verwenden Sie ein 10 X (≥0.3 numerische Apertur) Ziel der Amöben Image.
Hinweis: Die Calcein-AM im Agar bewirkt sterbende Amöben, Fluoreszenz in den grünen Fluoreszenz-Kanal. Gesunde Amöben sind sonst nicht fluoreszierend. - Einstellen Sie Erfassungszeiten für Phasenkontrast, GFP-Kanäle zu begrenzen Phototoxizität und optimiert den Dynamikumfang des Bildes Intensitäten. Das differential Interferenz Kontrast (DIC) Phasenkontrast zu ersetzen, wenn nötig.
Hinweis: Verwenden Sie wenn möglich 100-200 ms Belichtungen für Phasenkontrast und GFP Fluoreszenz. Halten Sie die Einstellungen für Belichtung und Instrument unverändert während des gesamten Experiments. Dies ist entscheidend für die Berechnung des Host-Tötung-Indexes. - Bilder für mindestens 100 Amöbe Zellen zu erwerben, um gute Statistiken zur Berechnung des Hosts Tötung Index zu erhalten.
7. Bild-Analyse und Host-Tötung-Index
- Durchführen Sie Bildanalyse mit ImageJ.
- Die Phase Kontrast-Image-Datei in ImageJ durch Anklicken Datei öffnen | Offene und das Bild auswählen. Passen Sie den Schwellenwert durch Bild anklicken | Analyse | Schwelle. Passen Sie den unteren und oberen Schwellenwert wählen Sie nur die Intensität Peak(Abbildung 3).
- Konvertieren Sie das Bild in Binary, indem Sie auf Prozess | Binäre | Stellen binäre. Löcher füllen, indem Sie Prozess auswählen | Binäre | Löcher füllen.
Hinweis: Mit dem Bild in Abbildung 1 als Quelle, werden Schritte 7.1-7.2 ein Bild erzeugen, in denen die Amöben und Bakterien Oberfläche angebracht als dunkle Bereiche (Abbildung 3B) vorkommen. - Sicherzustellen, dass die Felder Bereich und bedeutet Grauwert in Analyze geprüft werden | Legen Sie Messungen. Messen Sie die ungefähre Größe der Amöben durch Auswahl des ovalen Tools auf der Hauptsymbolleiste. Klicken Sie auf analysieren | Maßnahme und beachten Sie den Bereich der repräsentativen Amöben.
- Erstellen von Masken für die Amöben durch Klicken auf analysieren | Analysieren Sie Partikel. Geben Sie im Größenfeld des Bereichs, der wird die Amöben unter anderem die Bakterien ausschließen. Wählen Sie Masken im Dropdown-Menü die Option "anzeigen". Stellen Sie sicher, dass das Kontrollkästchen Manager hinzufügen aktiviert ist.
- Klicken Sie auf "OK" und ein Bild zeigt nur die Amöben und ein ROI-Manager Dialogfeld wird angezeigt (Abbildung 3C).
- Die fluoreszenzbild mit Datei öffnen | Offene und die entsprechende Datei auswählen. Wählen Sie alle Regionen im ROI Manager durch Gedrückthalten der Shift-Taste und einem Klick auf jede Region in der Liste (Abbildung 3D).
- Klicken Sie auf Messen , im ROI-Manager. Dadurch öffnet sich ein Ergebnisfenster zeigt den mittleren Intensitätswert jede Amöbe.
- Die Fluoreszenz-Werte für jede Amöbe in einem Tabellenkalkulations-Programm kopieren und die Host Index zu töten, indem man den Durchschnitt aller Fluoreszenz-Werte zu berechnen.
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Representative Results
Wir wuchsen Wild-Art p. Aeruginosa Belastung PA1419 oder eine ΔLasR 20 im gleichen PA14 Hintergrund in 6 cm Durchmesser-Petrischalen belasten und die Virulenz von planktonischen und Oberfläche angebracht Zellen untersucht. Kulturen wurden aus einzelnen Kolonien in PS:DB Kulturen, gewachsen über Nacht in Kultur Röhren in eine Bandage bei 37 ° C, Sättigung geimpft, verdünnt 1: 100 in PS:DB, für 8 h in 6 cm Durchmesser Petrischalen schütteln bei 100 u/min, angebaut und planktischen und Oberfläche angebracht P. Aeruginosa Sub-Populationen wurden isoliert, wie in Abschnitt 3 beschrieben.
Oberfläche-attached Wildtyp p. Aeruginosa getötet Amöben, gekennzeichnet durch eine Runde Amöbe Zellform und die Beobachtung von Calcein Fluoreszenz (Abbildung 4A, oben links). Dies führte zu einer hohen Host Tötung Index (Abbildung 4B). Planktonischen Zellen verbraucht wurden, von den Amöben, die durch amorphe Amöbe Zelle Formen und die Beobachtung von wenig oder gar keine Calcein Fluoreszenz über Hintergrund (Abbildung 4A, oben rechts Panel) angegeben wurde. Dies führte zu einer relativ geringen Host Tötung Index (Abbildung 4B). Sowohl Oberfläche befestigt und planktischen Zellen der ΔLasR Belastung durch Amöben, gekennzeichnet durch niedrige Host töten Indizes (Abbildung 4B, Bodenplatte) verbraucht wurden. Die Ergebnisse damit zeigen, dass Virulenz hochreguliert in Populationen Oberfläche befestigt und die LasR erforderlich für die Virulenz Oberfläche aktiviert ist, die zuvor beschriebenen13. Diese Experimente etablieren so robuste positive und negative Kontrollen für zukünftige Experimente.
Abbildung 1 : Schaltplan beschreibt einen Überblick über die Virulenz Assay. (1) Amöbe Wirtszellen sind gewachsen, (2) bakterielle Kulturen angebaut werden, und (3) planktonischen oder Oberfläche befestigt Bakterienzellen sind gemischt mit Amöben und unbeweglich auf dem gleichen Abbildungsebene mit einer Agar-Pad. Wirtszellen sind für die Gesundheit, die Verwendung von Calcein-AM, Fluoreszenz-Mikroskopie und Bildanalyse quantifiziert. Maßstabsleisten repräsentieren 50 µm. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 2 : Amoeba Sporen auf einem GYP 10 cm-Durchmesser Petrischale Platte nach 5 Tagen des Wachstums. Sporen-Form über die Petrischale Oberfläche. Der Inset zeigt eine vergrößerte Ansicht eines einzelnen Abschnitts der Schüssel Oberfläche. Die Oberfläche kann Bakterien enthalten, die bei dieser Auflösung erkannt werden können. Maßstabsbalken in Haupt- und Nebenkarten Bilder repräsentieren 1 cm und 2 mm. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 3 : Bildanalyse Mikroskopie-Daten mithilfe von ImageJ. (A) Auswahl an der Peak-Intensität mit dem Schwellenwert-Tool. (B) resultierende Bild nach der Phase Kontrast Quellbild aus Abbildung 1 in ein binäres Bild umgewandelt wird. (C) resultierende Bild, nachdem das Bild anschließend in eine Maske umgewandelt wird. (D) -Screenshots von der Auswahl der Regionen von Interesse, die mit dem ROI-Manager. Maßstabsleisten repräsentieren 50 µm. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 4 : Repräsentative Ergebnisse der Amöbe durch p. Aeruginosa Zellen zu töten. (A) Calcein-AM-Fluoreszenz-Mikroskopie Phasenbilder und (B) Host töten Indizes der Oberfläche befestigt oder planktonischen Wildtyp oder ΔLasR p. Aeruginosaüberlagert. Wildtyp Oberfläche angebracht p. Aeruginosa tötet Amöben, die erhebliche Calcein Fluoreszenz aufweisen und somit ein erheblicher Host töten Index. Planktonischen Zellen sind durch Amöben, verbraucht, was wenig Calcein Fluoreszenz ausstellen und produzieren einen niedrigen Host Tötung Index. Sowohl Oberfläche befestigt und planktonischen ΔLasR durch Amöben und führen zu einer niedrigen Host Tötung Index verbraucht werden. Skala Bars stellen 50 µm. Balken zeigen den Durchschnitt der drei unabhängigen Experimenten und Fehler Balken zeigen die Standardabweichung. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
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Discussion
Dieses Protokoll beschreibt eine rasche und quantitative Methode zur Virulenz in p. Aeruginosaassay. Dieses Protokoll kann mit anderen Bakterien getestet werden. Es ist jedoch wichtig zu beachten, dass das Wachstumsmedium mit der Amöbe Wachstumsbedingungen kompatibel sein sollten. Insbesondere haben wir das Protokoll mit PS:DB als das Bakterienwachstum Medium optimiert. Wenn andere Medien verwendet werden, ist es möglicherweise erforderlich, Wachstumskontrolle Medien nur durchzuführen, bei denen gibt es keine bakterielle Zellen anwesend, um sicherzustellen, dass das Medium mit der Amöben kompatibel ist.
Diese Methode kann erweitert werden, um die Wachstums-Phase-Abhängigkeit der Virulenz assay. Insbesondere können Bakterienkulturen für ein breites Spektrum von Zeiten statt einen festen Zeitpunkt angebaut werden. Nach unserer Erfahrung ist es wichtig, Bakterienkulturen zu bestimmten Zeitpunkten zu ernten, wie Virulenz in p. Aeruginosa zu abhängig von der Wachstumsphase zu sein scheint. Wir beobachteten, dass Virulenz in p. Aeruginosa zwischen 6-8 h des Wachstums in Petrischalen induziert wurde.
Viele Variablen im Zusammenhang mit dem Wachstum Umfeld beeinflussen Host Gesundheit und bakteriellen Virulenz. Daher ist es wichtig, die richtige positive und negative Kontrollen für jedes Experiment zu verwenden. Wir haben als eine positive Kontrolle und ΔLasR als Negativkontrolle Wildtyp Oberfläche angebracht p. Aeruginosa verwendet. Wir empfehlen die Durchführung dieser Kontrollen jedes Mal, wenn der Virulenz-Test durchgeführt wird. Diese Kontrollen sind wichtig für die Überprüfung, dass Host Zelle Tod nicht durch externe Faktoren wie das Alter der Amöben, Schwankungen der Temperatur usw. alle experimentieren in biologischen Wiederholung zu schaffen darüber hinaus empfehlen wir die Reproduzierbarkeit der Virulenz Phänotypen.
Wir haben unsere Experimente mit Amöben bei einer optischen Dichte von 0,2 bis 0,5 nach einer Verwässerung des am wenigsten 01:10 durchgeführt und haben reguliert die Temperatur der Amöben Kultur genau auf 22 ° C. Außerhalb dieser Wachstumsbedingungen haben wir festgestellt, dass die Anfälligkeit der Amöben zu virulenten Bakterien und die Reproduzierbarkeit der Virulenz Assay verändert. Amöbe Zellen pellet relativ schnell. Stellen Sie sicher, dass Kulturen Nukleinsäuretablette sind, von oben und unten pipettieren, unmittelbar vor der Messung der optischen Dichte erfolgt. Wachsen Sie die Amöbe Kulturen höher als eine OD600 Dichte von 1 nicht, wie Wachstum, hohe dichten die Reproduzierbarkeit des Experiments beeinflusst. Axenic Kulturen nicht länger als 1 Woche zu propagieren. Darüber hinaus ist es wichtig sicherzustellen, dass die Amöben axenically angebaut werden (ab Schritt 2.7) durch 20 X oder hoher Vergrößerung Mikroskopieren so, dass andere Mikroben sind nicht in der Kultur. Wenn Kulturen nach 2 Tagen des Wachstums nach der ersten Impfung im Schritt 2.10 trübe sind, würde dies wahrscheinlich die Anwesenheit von mikrobiellen Verunreinigung hinweisen. Bei auf bakterielle Kontamination Verdacht empfiehlt es sich, immer 1 mL der Amöben-Kultur bei 37 ° C für 4-8 h. Die Beobachtung einer trüben Kultur unter diesen Bedingungen würde vorschlagen, dass bakterielle Kontamination. Wenn wiederholte bakterielle Kontamination beobachtet wird, sollte die Antibiotikum antimykotische Lösung ersetzt werden.
Der Host-Tötung-Index ist ein zuverlässiger Indikator für eine Bakterienpopulation virulent oder avirulent sei. Dieser Test ist nicht für Vergleiche zwischen verschiedenen Zwischenstufen der Virulenz (d.h. geringer Virulenz verglichen mit geringer bis mittlerer Virulenz) optimiert und Überinterpretation der Ergebnisse sollte vermieden werden. Mögliche Methoden zur Behebung dieses Problems sind die Wiederholung des Virulenz Tests über mehrere Tage mit verschiedenen Chargen von Wirtszellen herzustellen das Vertrauen in die Ergebnisse, weitere wiederholte Experimente durchführen und Durchführung geeigneter statistische Analysen.
Die Multiplizität der Infektion (MOI) von planktonischen Zellen kann durch die Normalisierung der optischen Dichte der Bakterienkultur gesteuert werden. Dieser Assay steuert jedoch nicht die MOI Oberfläche befestigt Bakterienzellen. Wir haben beobachtet, dass bakterielle Oberflächendichte mit der Zeit zunimmt. So kann Anpassung Wachstumszeit in der Petrischale in eine entsprechende Änderung Oberflächendichte führen. Darüber hinaus hängt die Oberflächendichte vom Material der Oberfläche. P. Aeruginosa Zellen legen auf Polystyrol Oberflächen in der hier beschriebenen Test. Jedoch möglicherweise andere Oberflächen wie Glas, Agar und Polyacrylamid auch vermutlich13. Die Flächendichte einschichtig Bakterienpopulationen kann mit 100 X Vergrößerung Phase Mikroskopie gemessen werden. Wenn Oberfläche dichten vielschichtig sind, möglicherweise konfokalen Mikroskopie geeignet.
Hier haben wir eine schnelle und robuste Methode zur Messung der bakteriellen Virulenz beschrieben. Durch Änderung einzelner Parameter wie Inkubationszeiten, fluoreszierender Farbstoff, der Bakterienstamm, der Host Zelltyp oder Wachstumsmedien, kann diese Methode zur Quantifizierung der Virulenz in einer Vielzahl von Organismen und Wachstumsbedingungen verlängert werden.
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Disclosures
Die Autoren haben nichts preisgeben.
Acknowledgments
KP und AS schrieb und das Manuskript überarbeitet. KP durchgeführt die Experimente und die Analyse. Diese Arbeit wurde von den National Institutes of Health (NIH) Career Transition Award (K22AI112816), as unterstützt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents | |||
| Bacto agar, dehydrated | BD Difco | 214010 | |
| Antibiotic-Antimycotic (100X) | Life Technologies | 15240062 | Aliquot < 1 mL and store at -20 °C |
| Calcein-acetoxymethyl ester (calcein-AM) | Life Technologies | C34852 | Calcein Acetoxymethyl (AM) |
| Calcium chloride, anhydrous | Sigma-Aldrich | C1016 | |
| D-Glucose | Fisher Chemical | D16500 | Dextrose |
| Dimethyl sulfoxide | Sigma-Aldrich | D5879 | |
| Folic acid | Sigma-Aldrich | F8758 | |
| LB-Miller | BD Difco | 244620 | |
| Magnesium chloride | Sigma-Aldrich | M8266 | |
| Yeast extract | Oxoid | LP0021 | |
| Special peptone | Oxoid | LP0072 | |
| Potassium hyroxide | Fisher Chemical | P250 | |
| Potassium phosphate monobasic | Sigma-Aldrich | P0662 | |
| Sodium phosphate dibasic heptahydrate | Fisher Chemical | S373 | |
| Vitamin B12 | Sigma-Aldrich | V2876 | |
| Strains | |||
| Dictyostelium discoideum | Siryaporn lab | Strain AX318 | |
| Escherichia coli | Siryaporn lab | Strain B/r17 | |
| Pseudomonas aeruginosa | Siryaporn lab | PA14 | PA14 strain19 |
| Pseudomonas aeruginosa ΔlasR | Siryaporn lab | AFS20.1 | PA14-derived strain20 |
| Supplies | |||
| 0.22 µm filter | Millipore | SCGPT01RE | For filter sterilization |
| Conical tube, 15 mL | Corning | 352097 | |
| Glass storage bottles | Pyrex | 13951L | 250 mL, 500 mL, 1000 mL |
| Petri dish, 6 cm diameter | Corning | 351007 | 60 x 15 mm polystyrene plates |
| Petri dish, 10 cm diameter | Fisher | FB0875712 | 100 x 15 mm polystyrene plates |
| Plastic containers with lid | Ziploc | 2.57E+09 | Square 3-cup containers |
| Glass plates | Bio-Rad | 1653308 | For preparing agar pads. Other glass plates may be used with similar dimensions. |
| Wooden sticks | Fisher | 23-400-102 | |
| Equipment | |||
| Eclipse Ti-E microscope | Nikon | MEA53100 | Microscope setup |
| 10X Plan Fluor Ph1 objective 0.3 NA | Nikon | MRH20101 | Microscope setup |
| Fluorescence excitation source | Lumencor | Sola light engine | Microscope setup |
| Fluorescence filter set | Semrock | LED-DA/FI/TX-3X3M-A-000 | Microscope setup |
| Orca Flash 4.0 V2 Camera | Hamamatsu | 77054098 | Microscope setup |
| ImageJ | NIH | v. 1.49 | Software for image analysis |
| MATLAB | Mathworks | R2013 | Software for image analysis |
| Orbital shaker incubator | VWR | 89032-092 | For growth of bacteria at 37 °C |
| Platform shaker | Fisher | 13-687-700 | For growth of amoebae at 22 °C |
| Spectrophotometer | Biochrom | Ultrospec 10 | |
| Undercounter refrigerated incubator | Fisher | 97990E | For growth of amoebae at 22 °C |
| Isotemp waterbath | Fisher | 15-462-21Q | For cooling media to 55 °C |
References
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