Summary
Qui, presentiamo un protocollo per misurare la virulenza dei batteri planctonici o collegata alla superficie mediante d. discoideum (ameba) come un ospite. Virulenza viene misurato su un periodo di 1 h e host uccidendo è quantificata mediante analisi di immagine e microscopia di fluorescenza. Dimostriamo questo protocollo utilizzando il batterio p. aeruginosa.
Abstract
Saggi di virulenza batterica tradizionale coinvolgono l'esposizione prolungata dei batteri nel corso di diverse ore per le celle. Durante questo periodo, i batteri possono subire cambiamenti nella fisiologia a causa dell'esposizione all'ambiente di crescita di host e la presenza di cellule dell'ospite. Abbiamo sviluppato un test per misurare rapidamente lo stato di virulenza dei batteri che riducono al minimo l'entità a cui i batteri crescono in presenza di cellule dell'ospite. Batteri e amebe sono mescolate insieme e immobilizzate su un unico piano di formazione immagine usando un tampone di agar. La procedura utilizza l'imaging di fluorescenza di cella singola con calceina-acetossimetil estere (calceina-AM) come indicatore di salute della cellula ospite. La fluorescenza delle cellule dell'ospite viene analizzata dopo 1 h di esposizione delle cellule dell'ospite ai batteri utilizzando epifluorescenza. Software di analisi di immagine viene utilizzato per calcolare un indice di abbattimento di host. Questo metodo è stato utilizzato per misurare la virulenza all'interno planctonici e collegata alla superficie Pseudomonas aeruginosa sottopopolazioni durante la fase iniziale di formazione del biofilm e può essere adattato ad altri batteri e altre fasi di crescita di biofilm. Questo protocollo fornisce un metodo rapido e robusto di virulenza di misura ed evita molte delle complessità associati alla crescita e la manutenzione di linee cellulari di mammifero. Fenotipi di virulenza qui misurati utilizzando le amebe sono stati convalidati anche utilizzando i macrofagi del topo. In particolare, questa analisi è stata usata per stabilire tale virulenza sopraregola collegamento di superficie in p. aeruginosa.
Introduction
Infezione batterica è una delle principali cause di mortalità in umani e animali1,2. La capacità di misurare la virulenza dei batteri in culture o biofilm è importante nelle impostazioni di ricerca e assistenza sanitaria. Qui, descriviamo un metodo versatile, veloce e relativamente semplice per quantificare la virulenza batterica. L'organismo eucariote Dictyostelium discoideum (ameba) viene utilizzato come organismo modello ospite. D. discoideum è stato utilizzato come un host di identificare i fattori di virulenza di Pseudomonas aeruginosa (p. aeruginosa)3,4,5 e altri batteri6,7 ,8 ed è suscettibile in gran parte gli stessi fattori di virulenza che uccidono le cellule di mammiferi tra cui tipo III secrezione9,10. Le analisi precedenti di virulenza usando d. discoideum hanno coinvolto l'esposizione prolungata dei batteri con d. discoideum cellule nel corso di ore3,4,5. Il protocollo, qui, presenta un metodo rapido per determinare virulenza utilizzando questa ameba. Questo protocollo (Figura 1) descrive come: (1) crescere le amebe axenically (in assenza di batteri), (2) crescere batteri per il dosaggio, (3) preparare i batteri e cellule dell'ospite per la microscopia, (4) eseguire epifluorescenza e (5) analizzare l'ameba fluorescenza.
Amebe sono inizialmente striate fuori dalle scorte congelate e cresciute su un prato di Escherichia coli (Escherichia coli), dove le amebe producono spore. Queste spore sono raccolte e inoculate in un terreno arricchito per la crescita axenica. Le amebe sono mantenute attraverso axenica crescita in condizioni di sostanza-ricco finché non sono pronti per essere mescolato con i batteri per la valutazione della virulenza batterica. La sopravvivenza o la morte delle amebe è quantificata misurando la fluorescenza della calceina-acetossimetil (calceina-AM), che è spaccati dalle esterasi intracellulari e, quindi, attivato per fluorescenza11,12. Amebe Live presentano poca o nessuna fluorescenza considerando che ha sottolineato e le cellule morte reagiscono intensamente. Questo risultato è dovuto un piccolo o nessun incorporazione di calceina-AM nel sane amebe e incorporazione e scissione del substrato in amebe stressato13. Questo comportamento è in particolare distinto dalla fluorescenza di calceina-AM in cellule di mammifero11,14,15,16.
Batteri che saranno valutati per la virulenza sono coltivati separatamente. Qui, descriviamo come misurare la virulenza dell'agente patogeno opportunista p. aeruginosa e come quantificare la virulenza di planctonico (nuoto) e collegata alla superficie sotto-popolazioni di dettaglio. Questo protocollo può essere adattato per testare la virulenza di altri batteri. Nella sezione risultati rappresentante, indichiamo che la virulenza è attivato in cellule collegata alla superficie ed è basso in cellule planctoniche, che è stato segnalato precedentemente13. Virulenza-attivato collegata alla superficie p. aeruginosa uccide amebe mentre non virulento cellule planctoniche sono consumate da amebe. Se la virulenza dei batteri planctonici è esclusivamente essere dosata, i batteri possono essere coltivati in provette di coltura ordinaria anziché utilizzare capsule di Petri, come descritto nel protocollo.
La crescita di amebe e p. aeruginosa culture deve essere coordinata, tali che p. aeruginosa culture raggiungono la fase di crescita previsto mentre le amebe crescono allo stato stazionario in condizioni di ricco di sostanze nutritive. Questa condizione richiede in genere culture amebe da diluire con almeno 1 giorno prima di quando sono mescolati con i batteri. Amebe e batteri sono immobilizzati utilizzando pastiglie agar, sono co-incubati per 1 h e imaging utilizzando una risoluzione bassa (10 X, apertura numerica 0.3) proteina fluorescenza oggettiva, verde (GFP) filtri e una termocamera. Analisi possono essere eseguite utilizzando software liberamente disponibile di ImageJ o software di analisi di immagine personalizzato. La nostra analisi è stata effettuata usando il nostro software scritto utilizzando un pacchetto di analisi scientifica13. Il software dovrebbe creare una maschera utilizzando l'immagine di contrasto di fase ed estrarre valori di fluorescenza dalle aree mascherate nell'immagine di fluorescenza. Valori di fluorescenza sono media almeno 100 cellule, con conseguente un indice di uccisione di host numerici.
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Protocol
Tutte le procedure sperimentali sono state effettuate presso la University of California, Irvine.
1. tamponi e soluzioni
- Preparare Lisogenesi brodo (LB) in una bottiglia di vetro 1L aggiungendo 25 g di mix LB-Miller in 1 L di acqua bidistillata (ddH2O). Per piastre di Petri, aggiungere un ulteriore 20 g di agar. Autoclave per sterilizzare. Versare 25 mL di terreno agar fuso in 10 cm-Diametro piastre di Petri e lasciare solidificare a temperatura ambiente. Archivio media liquidi a temperatura ambiente e piastre di agar a 4 ° C.
- Preparare piatti di glucosio lievito Peptone (GYP) in una bottiglia di vetro 1L mescolando 1 g di D-glucosio, Estratto di 2 g di peptone, 0,25 g di lievito, 4,2 g di KH2PO4, 5,1 g di Na2HPO47 H2O e 25 g di agar-agar in 1 L di ddH2 O. Autoclave per sterilizzare. Versare 25 mL di agar fuso in 10 cm-Diametro piastre di Petri e lasciare solidificare a temperatura ambiente. Conservare a 4 ° C.
- Preparare il supporto di Peptone S (PS) in una bottiglia di vetro 1L mescolando 10 g di peptone, Estratto di 7 g di lievito, 15 g di D-glucosio, 0,12 g di Na2HPO47 H2O, 1,4 g di KH2PO4, 40 µ g di vitamina B12 , e 80 µ g di acido folico in 800 mL di ddH2O. calibrare un phmetro elettronico utilizzando pH 4 e pH 7 standard se il pH-metro non è stato utilizzato entro un giorno.
- Misurare il pH del mezzo PS utilizzando il pH-metro. Aggiungere 5 M KOH o 5m H3PO4 per regolare il pH a 6.5. Regolare il volume finale di 1L con ddH2filtro O. sterilizzare utilizzando filtro vuoto di 0,22 µm e conservare a 4 ° C.
Nota: Procedere con cautela con le regolazioni di pH di indossare protezioni tra cui guanti, indumenti protettivi, occhiali di protezione e protezione viso.
- Misurare il pH del mezzo PS utilizzando il pH-metro. Aggiungere 5 M KOH o 5m H3PO4 per regolare il pH a 6.5. Regolare il volume finale di 1L con ddH2filtro O. sterilizzare utilizzando filtro vuoto di 0,22 µm e conservare a 4 ° C.
- Preparare 10 x sviluppo Buffer Prime (DB') buffer in una bottiglia di vetro 1L aggiungendo 3,4 g di KH2PO4, 13,4 g di Na2HPO4 7 H2O e ddH2O ad un volume totale di 800 mL. Calibrare un phmetro elettronico utilizzando pH 4 e pH 7 standard se il pH-metro non è stato utilizzato entro un giorno.
- Misurare il pH del buffer utilizzando il phmetro elettronico. Aggiustare il pH a 6.5 aggiungendo delicatamente 5m KOH o 5m H3PO4 come necessario. Regolare il volume finale di 1L utilizzando ddH2O e sterilizzare in autoclave. Conservare a temperatura ambiente.
Nota: Procedere con cautela con le regolazioni di pH di indossare protezioni tra cui guanti, indumenti protettivi, occhiali di protezione e protezione viso.
- Misurare il pH del buffer utilizzando il phmetro elettronico. Aggiustare il pH a 6.5 aggiungendo delicatamente 5m KOH o 5m H3PO4 come necessario. Regolare il volume finale di 1L utilizzando ddH2O e sterilizzare in autoclave. Conservare a temperatura ambiente.
- Fare 1 x sviluppo tampone (DB) mescolando 100 mL di 10 x DB' buffer con 1 mL di sterilizzato 2 M MgCl2, e 1 mL di sterilizzato 1m CaCl2. Regolare il volume finale di 1 L in bottiglia di vetro 1L utilizzando un ddH sterilizzati in autoclave2O. Store a temperatura ambiente.
- Preparare il supporto di PS:DB in bottiglia di vetro 1L mescolando 100 mL di terreno di PS sterilizzato, 100 mL di sterilizzato 10 x DB' buffer e sterilizzato ddH2O ad un volume totale di 1 L. supplemento con 1 mL di sterilizzato 2 M MgCl2 e 1 mL di sterilizzato 1 M CaCl 2. Conservare a 4 ° C.
- Preparare la soluzione di riserva di calceina-AM aggiungendo 50 µ l di DMSO a 50 µ g di calceina-AM in contenitore di plastica fornito dal produttore. Conservare a-20 ° C.
2. crescita e il mantenimento delle amebe
- Crescere e. coli ceppo b/r17 come una fonte di cibo per amebe durante il periodo iniziale di crescita. Striscia e. coli b/r da uno stock congelato conservati a-80 ° C su una piastra di agar LB e incubare a 37 ° C durante la notte per ottenere singole colonie.
- Inoculare una singola colonia di e. coli b/r in 2 mL di terreno LB e incubare in un tamburo di rullo o uno shaker a 37 ° C per una notte.
- Portare il pernottamento cultura di Escherichia coli alla temperatura ambiente. Utilizzando un bastone di legno, inoculare amebe da uno stock congelato conservati a-80 ° C in 750 µ l della coltura durante la notte.
Nota: Uso d. discoideum lo sforzo AX3, che è capace di crescita axeniche18. Questo passaggio non richiede crescita axenica, ma i passaggi successivi avrà il suo requisito. - Immediatamente aggiungere 700 µ l della miscela die. coli amebe - su un piatto di glucosio lievito Peptone (GYP). Diffondere la cultura in modo uniforme sulla superficie della piastra di inclinarlo in avanti e indietro e side-to-side come necessario. Evitare l'uso di una spatola.
- Posizionare la piastra GYP con agar rivolto verso l'alto in una scatola che mantiene l'umidità alta. Utilizzare due contenitori di plastica usa e getta (183 x 183 cm x 91 cm) impilate sulla cima di ogni altro. Riempire il cestello inferiore con circa 25 mL di acqua e posizionare il recipiente superiore con diversi fori di diametro di cm 0,5 forati attraverso il pavimento del contenitore per permettere all'umidità di spostare dal serbatoio dell'acqua nel contenitore superiore.
- Incubare la piastra di GYP e casella a 22 ° C per 4-5 giorni fino a quando le spore ameba si osservano crescita vicino alla superficie della piastra (Figura 2). Utilizzare un incubatore refrigerato per incubare le piastre invece di incubazione a temperatura ambiente.
Nota: Dopo che le spore sono cresciuti, rimangono valide sulle piastre per diverse settimane se conservato a 4 ° C. Conservare le lastre con il lato agar rivolto verso l'alto. Dopo 3-4 giorni di incubazione, zone di schiarimento entro il prato batterico possono essere osservati, che indicano l'inizio della sporulazione ameba.- Osservare piccole amebe spore sopra la superficie della piastra dopo 4-5 giorni di incubazione (Figura 2).
Nota: Non si sviluppano le amebe per più di una settimana, come la qualità delle spore diminuisce di là di questo periodo di tempo.
- Osservare piccole amebe spore sopra la superficie della piastra dopo 4-5 giorni di incubazione (Figura 2).
- Raccogliere le spore di amebe a preparare per la crescita axenica delle amebe da spazzare la punta di una pipetta sterile da 1 mL parallela alla superficie della piastra. Raccogliere le spore da metà di una capsula di Petri di 10 cm.
Nota: Evitare di toccare la punta alla superficie della piastra agar come questo movimento raccoglierà grandi numeri di e. coli. - Risospendere le amebe sulla punta della pipetta immergendo la punta in 1 mL di terreno di PS e pipettare delicatamente su e giù.
- Trasferire il composto inoculato in una beuta da 250 mL contenente 25 mL di terreno PS completato con l'antibiotico antimicotico soluzione a concentrazione x 0,25.
Nota: Conservare la soluzione di antibiotico antimicotico come 250 aliquote di µ l a-20 ° C. Evitare ripetuti cicli di scongelamento e congelamento di questa soluzione in quanto questo può ridurre la sua efficacia. - Crescere amebe axenically a 22 ° C in un agitatore rotante a 100 giri/min. Per il dosaggio di virulenza nel passaggio 5, far crescere cellule ad una densità ottica misurata a 600 nm (OD600) di 0,2-0,5.
Nota: Questo passaggio richiede 3-4 giorni di crescita dal momento dell'inoculazione (punto 2.7). Se le cellule sono cresciute a una maggiore densità, diluire la cultura torna in PS medium a un OD600 minore o uguale a 0,05 e crescere torna a un OD600 di 0,2-0,5.
3. la crescita di p. aeruginosa
- Scegliete una singola colonia di p. aeruginosa da una piastra LB, inoculare esso in un mL 2 PS:DB cultura e crescere durante la notte a 37 ° C per saturazione.
Nota: Non aggiungere la soluzione di antibiotico antimicotico ai media PS:DB. - Diluire il pernottamento cultura 1: 100 o 1:1,000 in una capsula Petri 6 cm di diametro utilizzando PS:DB. Se la virulenza delle cellule planctoniche è esclusivamente essere dosata, crescono le culture utilizzando provette di coltura convenzionale invece. Agitare la cultura in un rotatore di benchtop impostato a 100 giri/min a 37 ° C.
- Culture di raccolto a intervalli di tempo specifici per garantire la riproducibilità. A 30 min a 1 h prima di valutare la virulenza, preparare un tampone di agar come descritto nella sezione 4.
Nota: La virulenza di p. aeruginosa è indotta da circa 8 h di crescita sulle superfici. - Per isolare le cellule di superficie-collegata, rimuovere il mezzo liquido da di Petri, lavare immediatamente con 1 mL di tampone di DB per rimuovere le cellule planctoniche e passa direttamente al punto 5.1.
Attenzione: Non lavare più di 30 s come questa volontà perturbare e staccare le cellule attaccate in superficie e possono influenzare la misurazione di virulenza. - Per isolare le cellule planctoniche, trasferire 10 µ l della coltura da di Petri per un piatto di Petri pulito e passa direttamente al punto 5.1.
4. microscopia - preparazione del Pad Agar
- Preparare pastiglie agar circa 30 min a 1 h prima di amebe sono pronte essere miscelato con p. aeruginosa.
- Forno a microonde 50 mL di agar di 1% (p/v) in buffer di DB in un pallone da 250 mL. Mix ogni 20 s fino a ciuffi di agar scompaiono.
- Raffreddare l'agar fuso collocandolo in bagno d'acqua preriscaldata 55 ° C per 15 min.
- Aggiungere 15 µ l di soluzione madre calceina-AM a 15 mL di agar fuso in una provetta conica. Mescolare capovolgendo delicatamente la provetta 4 - 5 volte e procedere immediatamente al passaggio successivo.
Nota: Eseguire questo passaggio in una provetta da centrifuga da 15 mL in polipropilene. Non utilizzare un contenitore di vetro di spessore come questo farà sì che l'agar solidificare troppo in fretta. - Versare il composto di agar fuso sopra una lastra di vetro di 12 x 10 cm e consentire l'agar solidificare per 10 minuti a temperatura ambiente. Tagliare il pad di agar solidificato in sezioni più piccole di 1,5 x 1,5 cm posizionando la lastra di vetro sopra una griglia stampata e taglio lungo la griglia utilizzando un righello di metallo.
- Mantenere il gel idratato in una scatola di umida fino a quando è pronto per l'uso.
5. microscopia - preparazione del campione da batteri-ameba per l'Imaging
- Per analizzare la virulenza delle cellule batteriche collegata alla superficie, aggiungere 10 µ l di cellule ameba dal passaggio 2.10 ai batteri collegata alla superficie da punto 3.4.
Nota: Questo passaggio descrive la miscelazione delle amebe con batteri. - Per analizzare la virulenza delle cellule planctoniche, mescolare 10 µ l di cellule di ameba dal punto 2.10 con 10 µ l di batteri planctonici dal punto 3.5.
Nota: Non lavare le cellule coltivate axenically ameba (presso un OD600 di 0,2-0,5) prima della miscelazione con i batteri. Nessuna crescita di e. coli sarà osservata nella cultura ameba a causa dell'utilizzo della soluzione antibiotico antimicotico. - Immediatamente è possibile posizionare la piastra di agar di calceina-AM 1,5 x 1,5 cm dal passaggio 4.5 sopra la miscela di batteri-ameba sulla superficie di Petri.
Nota: Inserire il cuscinetto di agar sopra il composto con un movimento rapido e regolare. Non abbassare il tampone lentamente sulla miscela come questo movimento tende a spingere le cellule verso la periferia e dalla parte inferiore del pad. Questa operazione garantirà che i batteri e le amebe sono uniformemente mescolato, immobilizzato e che entrambi tipi di cella sono circoscritti allo stesso piano. - Rimuovere il liquido in eccesso pipettando delicatamente fuori qualsiasi liquido restante che circonda il pad di agar. Consentire di Petri ad asciugare per 20 min a temperatura ambiente.
- Coprire con la capsula di Petri con un coperchio e incubare la miscela immobilizzato ameba-batteri a temperatura ambiente per un ulteriore 40 min. procedi al punto 6.1.
Nota: È importante incubare tutti i campioni per la stessa quantità di tempo, come la priorità bassa fluorescenza aumenta nel tempo. Si raccomanda un tempo di incubazione di 1 h. Le incubazioni per più di 1 h sono meno riproducibile come cellule di amebe possono cominciare a scoppiare.
6. microscopia - acquisizione di immagini
- Amebe di immagine utilizzando un microscopio a fluorescenza in grado di acquisire immagini di fluorescenza campo chiaro e verde. Per fluorescenza verde, utilizzare filtri di fluorescenza verde protein (GFP) con 27/474 nm e 525/45 nm per l'eccitazione e di emissione, rispettivamente. Utilizzare un obiettivo 10x (apertura numerica ≥0.3) all'immagine le amebe.
Nota: La calceina-AM nell'agar causerà morente amebe a fluorescenza nel canale di fluorescenza verde. Amebe sane altrimenti non sono fluorescenti. - Regolare i tempi di acquisizione per il contrasto di fase, canali GFP per limitare la fototossicità e ottimizzare la gamma dinamica delle intensità immagine. Se necessario, sostituire il contrasto differenziale di interferenza (DIC) di fase.
Nota: Utilizzare se possibile le esposizioni di 100-200 ms per contrasto di fase e la fluorescenza di GFP. Mantenere le impostazioni di esposizione e strumento invariate durante tutto l'intero esperimento. Questo è fondamentale per il calcolo dell'indice di uccisione di host. - Acquisizione di immagini per almeno 100 cellule ameba al fine di ottenere buone statistiche per il calcolo dell'host indice di uccisione.
7. analisi dell'immagine e Host uccisione indice
- Effettuare l'analisi di immagine usando ImageJ.
- Aprire il file di immagine del contrasto di fase in ImageJ cliccando sul File | Aperto e selezionando l'immagine. Regolare la soglia cliccando su immagine | Analisi | Soglia. Regolare la soglia superiore e inferiore per selezionare solo il picco di intensità (Figura 3A).
- Convertire l'immagine in binario cliccando processo | Binario | Fare binario. Riempire i fori selezionando processo | Binario | Riempire i fori.
Nota: Utilizzando l'immagine in Figura 1 come origine, punti 7.1-7.2 produrrà un'immagine in cui le amebe e batteri collegata alla superficie appaiono come regioni scure (Figura 3B). - Assicurati che le caselle di zona e valore grigio medio sono selezionate nel Analyze | Impostare misure. Misurare le dimensioni approssimative delle amebe selezionando lo strumento ovale sulla barra degli strumenti principale. Fare clic su analisi | Misura e prendere nota della zona di amebe rappresentative.
- Creare maschere per le amebe cliccando Analyze | Analizzare le particelle. Nella casella dimensione, entrare nell'area che includono le amebe ma escludere i batteri. Selezionare maschere nella barra dei menu a discesa per l' opzione Visualizza. Accertarsi che sia selezionata la casella Aggiungi al Manager .
- Fare clic su OK e un'immagine che mostra solo le amebe e un Manager di ROI apparirà la finestra di dialogo (Figura 3C).
- Aprire l'immagine di fluorescenza usando File | Aperto e selezionando il file appropriato. Selezionare tutte le regioni nel ROI Manager tenendo premuto il tasto MAIUSC e cliccando su ogni regione nell'elenco (Figura 3D).
- Fare clic sul pulsante misura il ROI Manager. Verrà aperta una finestra di risultati visualizzazione del valore di intensità media di ogni ameba.
- Copiare i valori di fluorescenza per ogni ameba in un programma di foglio di calcolo e calcolare l'host uccidendo Indice considerando la media di tutti i valori di fluorescenza.
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Representative Results
Siamo cresciuti selvaggio-tipo p. aeruginosa ceppo PA1419 o un Δieri ceppo20 allo stesso sfondo PA14 in capsule di 6 Petri cm di diametro e analizzato la virulenza delle cellule planctoniche e collegata alla superficie. Culture sono stati inoculati da single-colonie nel PS:DB culture, cresciute durante la notte in provette di coltura in un rullo di tamburo a 37 ° C alla saturazione, diluito 1: 100 in PS:DB, coltivate per 8 h a 6 capsule di Petri cm-diametro agitazione a 100 giri/min e planctonici e collegata alla superficie P. aeruginosa sub-popolazioni sono state isolate come descritto nella sezione 3.
Collegata alla superficie del selvaggio-tipo p. aeruginosa ucciso amebe, che è stato indicato da una forma di cellula rotonda ameba e l'osservazione della fluorescenza calceina (Figura 4A, pannello in alto a sinistra). Ciò ha provocato un indice di abbattimento di alta host (Figura 4B). Le cellule planctoniche sono state consumate dalle amebe, che è stato indicato da ameba amorfo cella forme e l'osservazione della fluorescenza di calceina poco o nessun sopra priorità bassa (Figura 4A, pannello in alto a destra). Ciò ha provocato un indice di abbattimento di host relativamente basso (Figura 4B). Sia le cellule planctoniche del ceppo Δieri sono state consumate dalle amebe, che è stato indicato dall'host basso uccidendo gli indici (Figura 4B, pannello inferiore) e collegato alla superficie. I risultati mostrano dunque che virulenza è aumentata nelle popolazioni collegata alla superficie e l'ieri sono richiesto per la virulenza di superficie-attivato, che è stato descritto in precedenza13. Questi esperimenti così stabiliscono solidi controlli positivi e negativi per gli esperimenti futuri.
Figura 1 : Disegno schematico che descrive una panoramica del dosaggio virulenza. (1) cellule dell'ospite ameba vengono coltivate, colture (2) batteriche sono cresciute, e (3) planctoniche o collegata alla superficie delle cellule batteriche sono mescolate con amebe e immobilizzate sullo stesso piano di imaging utilizzando un pad di agar. Cellule dell'ospite sono quantificate per la salute utilizzando calceina-AM, microscopia a fluorescenza e analisi delle immagini. Barre della scala rappresentano 50 µm. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2 : Ameba spore su un GYP 10 cm-diametro piastra di Petri dopo 5 giorni di crescita. Forma di spore sopra la superficie della piastra di Petri. L'inserto mostra una vista ingrandita di una singola sezione della superficie del piatto. La superficie può contenere batteri che non possono essere individuati a questa risoluzione. Barre di scala nelle immagini principale e semincassate rappresentano 1 cm e 2 mm, rispettivamente. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3 : Analisi dei dati di microscopia usando ImageJ dell'immagine. (A) selezione dell'intensità di picco utilizzando lo strumento soglia. (B) risultante immagine dopo l'immagine di origine del contrasto di fase dalla Figura 1 viene convertito in un'immagine binaria. (C) l'immagine risultante dopo l'immagine viene successivamente convertito in una maschera. (D) screenshot per la selezione delle regioni di interesse utilizzando il gestore di ROI. Barre della scala rappresentano 50 µm. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4 : Risultati rappresentativi di ameba uccidendo le cellule di p. aeruginosa . (A) fluorescenza calceina-AM sovrapposto su immagini di microscopia di fase e (B) host uccidendo gli indici di collegata alla superficie o planctonici wild-type o Δieri p. aeruginosa. Selvaggio-tipo collegata alla superficie p. aeruginosa uccide amebe, che presentano fluorescenza significativa calceina e quindi un host significativo abbattimento indice. Le cellule planctoniche sono consumate da amebe, che esibiscono poco calceina fluorescenza e producono un indice di uccisione di host basso. Sia Δ planctoniciieri sono consumati da amebe e risultato in un indice di abbattimento di host basso e collegato alla superficie. Scala bar rappresentano 50 µm. barre indicano la media di tre esperimenti indipendenti ed errori barre indicano la deviazione standard. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
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Discussion
Questo protocollo descrive un metodo veloce e quantitativo per analizzare la virulenza di p. aeruginosa. Questo protocollo può essere testato con altri batteri. Tuttavia, è importante tenere a mente che il mezzo di crescita dovrebbe essere compatibile con le condizioni di crescita di ameba. In particolare, abbiamo ottimizzato il protocollo usando PS:DB come mezzo di crescita batterica. Se vengono utilizzati altri supporti, può essere necessario eseguire un controllo di sola media di crescita in cui non sono presenti celle batteriche presenti per verificare che il supporto è compatibile con le amebe.
Questo metodo può essere espansa per analizzare la dipendenza della fase di crescita della virulenza. In particolare, le colture batteriche possono essere coltivate per una vasta gamma di volte invece di un punto di tempo fisso. Nella nostra esperienza, è importante raccogliere le colture batteriche a intervalli di tempo specifici come virulenza di p. aeruginosa sembra essere dipendente dalla fase di crescita. Abbiamo osservato che la virulenza di p. aeruginosa è stato indotto tra 6-8 h di crescita in capsule di Petri.
Molte variabili associate con l'ambiente di crescita influenzano la salute dell'ospite e la virulenza batterica. Pertanto, è importante utilizzare adeguati controlli positivi e negativi per ogni esperimento. Abbiamo usato selvaggio-tipo collegata alla superficie p. aeruginosa come un positivo controllo e Δieri come controllo negativo. Suggeriamo di eseguire questi controlli ogni volta che si effettua il dosaggio di virulenza. Questi controlli sono importanti per verificare che host cella morti non sono a causa di eventuali fattori esterni come l'età delle amebe, variazioni di temperatura, ecc inoltre, suggeriamo di eseguire tutti gli esperimenti biologici replica per stabilire la riproducibilità dei fenotipi di virulenza.
Abbiamo hanno effettuato i nostri esperimenti usando amebe ad una densità ottica di 0,2-0,5 dopo una diluizione di al almeno 01:10 ed hanno regolato la temperatura della cultura di amebe precisamente a 22 ° C. Di fuori di queste condizioni di crescita, abbiamo trovato che la suscettibilità delle amebe ai batteri virulenti e la riproducibilità del dosaggio virulenza sono alterati. Cellule di ameba a pellet in tempi relativamente brevi. Garantire che le culture sono risospese pipettando su e giù immediatamente prima che la misura di densità ottica è effettuata. Non si sviluppano le culture di ameba superiore a una densità di600 OD di 1 come crescita per alte densità colpisce la riproducibilità dell'esperimento. Propagare le colture axeniche per non più di 1 settimana. Inoltre, è importante verificare che le amebe sono coltivate axenically (che comincia al punto 2.7) attraverso 20 X o microscopia ad alto ingrandimento tale che altri microbi non sono presenti nella cultura. Se le culture sono torbide nel passaggio 2.10 dopo 2 giorni di crescita dopo l'inoculazione iniziale, probabilmente ciò indicherebbe la presenza di un contaminante microbica. Se si sospetta una contaminazione batterica, suggeriamo che crescendo 1 mL della cultura amebe a 37 ° C per 4-8 h. L'osservazione di una cultura torbida in queste condizioni suggerirei di contaminazione batterica. Se ripetuto la contaminazione batterica è osservata, la soluzione di antibiotico antimicotico deve essere sostituita.
L'indice di uccisione di host è un indicatore affidabile se una popolazione batterica è virulento o non virulenti. Questo test non è stato ottimizzato per i confronti tra i diversi livelli intermedi di virulenza (cioè, bassa virulenza rispetto a medio-bassa virulenza) e sovra-interpretazione dei risultati dovrebbe essere evitato. Possibili metodi per risolvere questo problema sono la ripetizione del dosaggio virulenza di più giorni utilizzando diversi lotti di cellule dell'ospite per stabilire la fiducia nei risultati, esecuzione ulteriori esperimenti di replicare e l'esecuzione appropriata analisi statistiche.
La molteplicità di infezione (MOI) di cellule planctoniche può essere controllata da normalizzare la densità ottica della coltura batterica. Tuttavia, questo test non controlla il MOI di celle collegata alla superficie dei batteri. Abbiamo osservato che la densità di superficie batterica aumenta con il tempo. Così, regolazione tempo di crescita in di Petri può provocare un corrispondente cambiamento nella densità di superficie. Inoltre, la densità di superficie dipende dal materiale della superficie. Le cellule di p. aeruginosa fissare a polistirolo superfici nel dosaggio descritto qui. Tuttavia, altre superfici quali vetro, agar e poliacrilammide possono anche essere analizzati13. La densità della superficie delle popolazioni batteriche a strato singolo può essere misurata usando 100 X microscopia di fase di ingrandimento. Se la densità di superficie sono multistrato, microscopia confocale potrebbe essere appropriata.
Qui, abbiamo descritto un metodo rapido e affidabile per misurare la virulenza batterica. Modificando i singoli parametri quali tempi di incubazione, il colorante fluorescente, il ceppo batterico, il tipo di cella di host o mezzi di sviluppo, questo metodo può essere prorogato per quantificare la virulenza in una vasta gamma di organismi e di condizioni di crescita.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla a rivelare.
Acknowledgments
KP e AS ha scritto e rivisto il manoscritto. KP eseguito gli esperimenti e l'analisi. Questo lavoro è stato supportato dal National Institutes of Health (NIH) carriera transizione premio (K22AI112816) per As
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents | |||
| Bacto agar, dehydrated | BD Difco | 214010 | |
| Antibiotic-Antimycotic (100X) | Life Technologies | 15240062 | Aliquot < 1 mL and store at -20 °C |
| Calcein-acetoxymethyl ester (calcein-AM) | Life Technologies | C34852 | Calcein Acetoxymethyl (AM) |
| Calcium chloride, anhydrous | Sigma-Aldrich | C1016 | |
| D-Glucose | Fisher Chemical | D16500 | Dextrose |
| Dimethyl sulfoxide | Sigma-Aldrich | D5879 | |
| Folic acid | Sigma-Aldrich | F8758 | |
| LB-Miller | BD Difco | 244620 | |
| Magnesium chloride | Sigma-Aldrich | M8266 | |
| Yeast extract | Oxoid | LP0021 | |
| Special peptone | Oxoid | LP0072 | |
| Potassium hyroxide | Fisher Chemical | P250 | |
| Potassium phosphate monobasic | Sigma-Aldrich | P0662 | |
| Sodium phosphate dibasic heptahydrate | Fisher Chemical | S373 | |
| Vitamin B12 | Sigma-Aldrich | V2876 | |
| Strains | |||
| Dictyostelium discoideum | Siryaporn lab | Strain AX318 | |
| Escherichia coli | Siryaporn lab | Strain B/r17 | |
| Pseudomonas aeruginosa | Siryaporn lab | PA14 | PA14 strain19 |
| Pseudomonas aeruginosa ΔlasR | Siryaporn lab | AFS20.1 | PA14-derived strain20 |
| Supplies | |||
| 0.22 µm filter | Millipore | SCGPT01RE | For filter sterilization |
| Conical tube, 15 mL | Corning | 352097 | |
| Glass storage bottles | Pyrex | 13951L | 250 mL, 500 mL, 1000 mL |
| Petri dish, 6 cm diameter | Corning | 351007 | 60 x 15 mm polystyrene plates |
| Petri dish, 10 cm diameter | Fisher | FB0875712 | 100 x 15 mm polystyrene plates |
| Plastic containers with lid | Ziploc | 2.57E+09 | Square 3-cup containers |
| Glass plates | Bio-Rad | 1653308 | For preparing agar pads. Other glass plates may be used with similar dimensions. |
| Wooden sticks | Fisher | 23-400-102 | |
| Equipment | |||
| Eclipse Ti-E microscope | Nikon | MEA53100 | Microscope setup |
| 10X Plan Fluor Ph1 objective 0.3 NA | Nikon | MRH20101 | Microscope setup |
| Fluorescence excitation source | Lumencor | Sola light engine | Microscope setup |
| Fluorescence filter set | Semrock | LED-DA/FI/TX-3X3M-A-000 | Microscope setup |
| Orca Flash 4.0 V2 Camera | Hamamatsu | 77054098 | Microscope setup |
| ImageJ | NIH | v. 1.49 | Software for image analysis |
| MATLAB | Mathworks | R2013 | Software for image analysis |
| Orbital shaker incubator | VWR | 89032-092 | For growth of bacteria at 37 °C |
| Platform shaker | Fisher | 13-687-700 | For growth of amoebae at 22 °C |
| Spectrophotometer | Biochrom | Ultrospec 10 | |
| Undercounter refrigerated incubator | Fisher | 97990E | For growth of amoebae at 22 °C |
| Isotemp waterbath | Fisher | 15-462-21Q | For cooling media to 55 °C |
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