Summary
Aquí, presentamos un protocolo para medir la virulencia de las bacterias planctónicas o conectado a superficie utilizando D. discoideum (ameba) como anfitrión. Virulencia se mide durante un período de 1 h y anfitrión matando se cuantifica usando análisis de imagen y microscopia de fluorescencia. Demostramos este protocolo utilizando la bacteria p. aeruginosa.
Abstract
Ensayos de virulencia bacterianos tradicionales implican la exposición prolongada de las bacterias a lo largo de varias horas a las células del huésped. Durante este tiempo, las bacterias pueden experimentar cambios en la fisiología debido a la exposición al ambiente de crecimiento de anfitrión y la presencia de las células hospedadoras. Hemos desarrollado un ensayo para medir rápidamente el estado de virulencia de las bacterias que reducen al mínimo el grado al cual las bacterias crecen en presencia de las células del huésped. Bacterias y amebas se mezclan juntos e inmovilizadas en un solo plano de proyección de imagen con una almohadilla de agar. El procedimiento utiliza imágenes por fluorescencia unicelular con calceína-acetoxymethyl ester (calceína-AM) como un indicador de salud de la célula huésped. La fluorescencia de las células huésped se analiza después de 1 h de la exposición de las células del huésped a las bacterias mediante microscopía de epifluorescencia. Software de análisis de imagen se utiliza para calcular un índice de matanza de host. Este método se ha utilizado para medir la virulencia dentro de planctónicos y une superficie de Pseudomonas aeruginosa las subpoblaciones durante la etapa inicial de formación de biopelículas y puede ser adaptado a otras bacterias y otras etapas del crecimiento de biopelícula. Este protocolo proporciona un método rápido y robusto para medir la virulencia y evita muchas de las complejidades asociadas con el crecimiento y mantenimiento de líneas de células de mamífero. Fenotipos de virulencia mide aquí con las amebas también han sido validados con los macrófagos de ratón. En particular, este análisis fue utilizado para establecer esa virulencia de upregulates accesorio superficie en p. aeruginosa.
Introduction
La infección bacteriana es una de las principales causas de mortalidad en humanos y animales1,2. La capacidad para medir la virulencia de las bacterias en cultivos o biofilms es importante en entornos de cuidado de la salud y la investigación. Aquí, describimos un método versátil, rápido y relativamente simple para cuantificar la virulencia bacteriana. El organismo eucariota Dictyostelium discoideum (ameba) se utiliza como organismo modelo host. D. discoideum se ha utilizado como un host para identificar factores de virulencia de Pseudomonas aeruginosa (p. aeruginosa)3,4,5 y otras bacterias6,7 ,8 y es susceptible a en gran parte los mismos factores de virulencia que matan las células mamíferas, incluyendo el tipo III secreción9,10. Anteriores ensayos de virulencia mediante D. discoideum han implicado la exposición prolongada de las bacterias con D. discoideum las células en el transcurso de horas3,4,5. Protocolo, aquí, presenta un método rápido de determinación de virulencia usando esta ameba. Este protocolo (figura 1) se describe como: (1) crecen las amebas axenically (en ausencia de bacterias), (2) crecer bacterias para el análisis, (3) preparar las bacterias y las células del huésped para microscopía, (4) realizan microscopía de epifluorescencia y (5) analizan los ameba fluorescencia.
Amebas inicialmente con mechas hacia fuera de la acción congelada y crecidas en un jardín de Escherichia coli (e. coli), donde las amebas producen esporas. Estas esporas son seleccionadas y se inocula en un medio enriquecido para el crecimiento axénico. Las amebas se mantienen a través del crecimiento axénico en condiciones ricas en nutrientes hasta que están listos para ser mezclados con bacterias para la evaluación de la virulencia bacteriana. La supervivencia o la muerte de las amebas se cuantifica midiendo la fluorescencia de calceína-acetoxymethyl (calceína-AM), que es hendida por esterasas intracelulares y, por lo tanto, activado por fluorescencia11,12. Amebas vivo exhiben poca o ninguna fluorescencia mientras que subrayó y fluorescencia de células muertas intensamente. Este resultado es debido a poca o ninguna incorporación de calceína-AM en amebas saludables e incorporación y clivaje del sustrato en amebas estresado13. Este comportamiento es notablemente distinto de fluorescencia de calceína-AM en células de mamífero11,14,15,16.
Las bacterias que se aplicará para la virulencia se cultivan por separado. Aquí, describimos cómo medir la virulencia de los patógenos oportunistas p. aeruginosa y detalle cómo cuantificar la virulencia de planctónico (natación) y las subpoblaciones conectado a superficie. Este protocolo puede ser adaptado para probar la virulencia de otras bacterias. En la sección de resultados de representante, demostramos que la virulencia se activa en las células de superficie conectado y es baja en las células planctónicas, que fue divulgado previamente13. Virulencia-activado superficie unida p. aeruginosa mata amebas mientras no virulenta células planctónicas son consumidas por las amebas. Si únicamente se es analizar la virulencia de las bacterias planctónicas, las bacterias pueden ser cultivadas en tubos de cultivo ordinario en lugar de utilizar placas de Petri como se describe en el protocolo.
El crecimiento de las amebas y las culturas de p. aeruginosa debe coordinarse que cultivos de p. aeruginosa alcanzan la fase de crecimiento previsto, mientras que las amebas están creciendo en estado estacionario en condiciones ricas en nutrientes. Esta condición requiere típicamente culturas amebas a diluirse al menos 1 día antes cuando se mezclan con las bacterias. Amebas y bacterias se inmovilizan usando teclas de agar son co se incubó por 1 h y fotografiado con una resolución baja (10 X, abertura numérica 0.3) filtros de la proteína de fluorescencia verde, objetiva (GFP) y una cámara. Análisis se pueden realizar usando el software ImageJ libremente disponible o modificado para requisitos particulares software de análisis de imagen. Nuestro análisis fue realizado usando nuestro propio software escrito usando un paquete de análisis científico13. El software debe crear una máscara con la imagen de contraste de fase y extraer valores de fluorescencia de las áreas enmascaradas en la imagen de fluorescencia. Valores de fluorescencia son un promedio sobre por lo menos 100 células, resultando en un índice de matanza de host numéricos.
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Protocol
Todos los procedimientos experimentales se llevaron a cabo en la Universidad de California, Irvine.
1. tampones y soluciones
- Para preparar caldo de lisogenia (LB) en un frasco de vidrio de 1 L agregar 25 g de mezcla LB-Miller en 1 L de agua destilada doble (ddH2O). Para placas de Petri, agregar un adicional 20 g de agar. Autoclave para esterilizar. Vierte 25 mL de medio agar fundido en platos de Petri de 10 cm de diámetro y dejar para solidificar a temperatura ambiente. Almacenar medios líquidos a temperatura ambiente y las placas de agar a 4 ° C.
- Preparar platos para glucosa levadura peptona (GYP) en una botella de vidrio de 1 L mezclando 1 g de D-glucosa, extracto de 2 g de peptona, 0,25 g de levadura, 4,2 g de KH2PO4, 5,1 g de Na2HPO47 H2O y 25 g de agar en 1 L de ddH2 O. Autoclave para esterilizar. Vierte 25 mL de agar fundido en platos de Petri de 10 cm de diámetro y dejar para solidificar a temperatura ambiente. Almacenar a 4 ° C.
- Preparación de medio de peptona S (PS) en una botella de vidrio de 1 L mezclando 10 g de peptona, extracto de 7 g de levadura, 15 g de D-glucosa, 0,12 g de Na2HPO47 H2O, 1,4 g de KH2PO4, 40 μg de vitamina B12 , y 80 μg de ácido fólico en 800 mL de ddH2O. calibrar un medidor de pH electrónico utilizando estándares de pH 7 y pH 4, si el medidor de pH no ha sido utilizado dentro de un día.
- Medir el pH del medio PS utilizando el medidor de pH. Añadir KOH de 5 M o 5 M H3PO4 para ajustar el pH a 6.5. Ajustar el volumen final de 1 L con ddH2filtro de O. esterilice usando 0.22 μm filtro vacío y almacenar a 4 ° C.
Nota: Proceder con cautela con los ajustes de pH con el uso de equipo de protección como guantes, ropa protectora, protección para los ojos y cara protección.
- Medir el pH del medio PS utilizando el medidor de pH. Añadir KOH de 5 M o 5 M H3PO4 para ajustar el pH a 6.5. Ajustar el volumen final de 1 L con ddH2filtro de O. esterilice usando 0.22 μm filtro vacío y almacenar a 4 ° C.
- Preparar 10 x Buffer de desarrollo primer (DB') buffer en una botella de vidrio de 1 litro mediante la adición de 3,4 g de KH2PO4, 13,4 g de Na2HPO4 7 H2O y ddH2O hasta un volumen total de 800 mL. Calibrar un medidor de pH electrónico utilizando estándares de pH 7 y pH 4, si el medidor de pH no ha sido utilizado dentro de un día.
- Medir el pH del buffer usando el medidor de pH electrónico. Suavemente agregar KOH de 5 M o 5 M H3PO4 según sea necesario para ajustar el pH a 6.5. Ajustar el volumen final de 1 L con ddH2O y esterilizar en autoclave. Almacenar a temperatura ambiente.
Nota: Proceder con cautela con los ajustes de pH con el uso de equipo de protección como guantes, ropa protectora, protección para los ojos y cara protección.
- Medir el pH del buffer usando el medidor de pH electrónico. Suavemente agregar KOH de 5 M o 5 M H3PO4 según sea necesario para ajustar el pH a 6.5. Ajustar el volumen final de 1 L con ddH2O y esterilizar en autoclave. Almacenar a temperatura ambiente.
- Hacer 1 x de tampón de desarrollo (DB) mezclando 100 mL de 10 x DB' buffer con 1 mL de esterilizada 2 M MgCl2, y 1 mL de esterilizado 1 M CaCl2. Ajustar el volumen final de 1 L en una botella de vidrio de 1 L con un ddH esterilizada en autoclave2O. almacén a temperatura ambiente.
- Medio PS:DB en una botella de vidrio de 1 L se preparan mezclando 100 mL de medio de PS estéril, 100 mL de esterilizado 10 x DB' buffer y ddH esterilizada2O hasta un volumen total de 1 L. suplemento con 1 mL de esterilización de MgCl 2 M2 y 1 mL de esterilizado 1 M CaCl 2. almacenar a 4 ° C.
- Preparar la solución madre de calceína-AM por añadiendo 50 μl de DMSO a 50 μg de calceína-AM en el envase plástico proporcionado por el fabricante. Almacenar a-20 ° C.
2. crecimiento y mantenimiento de las amebas
- Crecer la cepa de e. coli B/r17 como fuente de alimento para las amebas durante el período de crecimiento inicial. Racha de e. coli B/r de un stock congelado almacenados a-80 ° C sobre una placa de agar LB e incubar a 37 ° C durante la noche para obtener colonias individuales.
- Inocular una sola Colonia de e. coli B/r en 2 mL de medio LB e incubar en un tambor de rodillo o una coctelera a 37 ° C durante la noche.
- Llevar durante la noche de cultura de e. coli a la temperatura ambiente. Usando un palo de madera, inocular amebas de un stock congelado guardado a-80 ° C en 750 μl de la cultura durante la noche.
Nota: Uso D. discoideum cepa AX3, que es capaz de crecimiento axénico18. Este paso no requiere crecimiento axénico, pero los pasos posteriores tendrán su requisito. - Inmediatamente añadir 700 μl de la mezcla dee. coli de amebas - sobre una placa de glucosa levadura peptona (GYP). Difundir la cultura uniformemente en la superficie de la placa inclinándola y hacia atrás y de lado a lado según sea necesario. Evitar el uso de un esparcidor.
- Coloque la placa GYP con el agar hacia arriba en una caja que mantiene la humedad. Utilizar dos envases de plástico desechables (183 cm x 183 cm x 91 cm) apilados en la parte superior unos a otros. Llene el recipiente inferior con aproximadamente 25 mL de agua y colocar el contenedor superior con varios 0,5 cm de diámetro agujeros perforados a través del suelo del recipiente para permitir que la humedad mover el tanque de agua en el contenedor superior.
- Incubar la placa de GYP y caja de 22 ° C durante 4-5 días hasta que las esporas de la ameba se observan creciendo cerca de la superficie de la placa (figura 2). Utilizar una incubadora refrigerada para incubar las placas en lugar de incubación a temperatura ambiente.
Nota: Después de que las esporas han crecido, siguen siendo viables en las placas durante varias semanas si se almacena a 4 ° C. Almacenar las placas con agar hacia arriba. Después de 3-4 días de incubación, se observan zonas de claro en el césped bacteriano, que indican el inicio de la esporulación de la ameba.- Observar amebas pequeñas esporas sobre la superficie de la placa tras 4-5 días de incubación (figura 2).
Nota: Crecen las amebas por más de una semana, como la calidad de las esporas disminuye más allá de este período de tiempo.
- Observar amebas pequeñas esporas sobre la superficie de la placa tras 4-5 días de incubación (figura 2).
- Recoger las esporas de las amebas para prepararse para el crecimiento axénico de las amebas por barrido paralelo a la superficie de la placa de una punta de pipeta estéril 1 mL. Recoger las esporas de la mitad de un plato de Petri de 10 cm.
Nota: Evite tocar la punta de la superficie de la placa de agar como esta propuesta recogerá gran cantidad de e. coli. - Resuspender las amebas en la punta de la pipeta por sumergir la punta en 1 mL de medio de PS y pipeteando suavemente hacia arriba y hacia abajo.
- Transferir la mezcla inoculada en un frasco de 250 mL que contenga 25 mL del medio PS complementado con la solución de antibiótico-antimicótico en concentración x 0.25.
Nota: Almacene la solución antibiótico-antimicótico como alícuotas de μl 250 a-20 ° C. Evite ciclos repetidos de descongelación y congelación de esta solución como esto puede disminuir su eficacia. - Crecen amebas axenically a 22 ° C en un agitador rotatorio a 100 rpm. Para el análisis de la virulencia en el paso 5, crecen las células a una densidad óptica medida a 600 nm (OD600) de 0.2 a 0.5.
Nota: Este paso requiere 3-4 días de crecimiento desde el momento de la inoculación (paso 2.7). Si las células han crecido a una densidad más alta, diluir la cultura en el medio PS a un OD600 de 0.05 o menor y crecer a un OD600 de 0.2 a 0.5.
3. el crecimiento de p. aeruginosa
- Escoger una sola Colonia de p. aeruginosa de una placa LB, inocular en una cultura de PS:DB de 2 mL y crecer durante la noche a 37 ° C a la saturación.
Nota: No agregue la solución antibiótico-antimicótico para los medios de PS:DB. - Diluir la noche cultura 1: 100 o 1:1,000 en un plato de Petri de 6 cm de diámetro utilizando PS:DB. Si únicamente se es analizar la virulencia de las células planctónicas, crecen las culturas usando tubos de cultivo convencional en su lugar. Sacudir la cultura en un rotador de benchtop de 100 rpm a 37 ° C.
- Culturas en momentos específicos para asegurar la reproducibilidad de la cosecha. A los 30 min a 1 h antes de la evaluación de virulencia, preparar una almohadilla de agar como se describe en la sección 4.
Nota: Virulencia en p. aeruginosa es inducida por aproximadamente 8 h de crecimiento en las superficies. - Para aislar las células conectado a superficie, quite el medio líquido de la caja Petri, lavar de inmediato con 1 mL de tampón de DB para eliminar las células planctónicas y proceder de inmediato al paso 5.1.
PRECAUCIÓN: No lave más de 30 s como este se perturban y separar células conectado en superficie y puede afectar la medición de la virulencia. - Para aislar las células planctónicas, transferir 10 μl de la cultura de la placa de Petri a una caja de Petri limpia y proceder de inmediato al paso 5.1.
4. microscopía - preparación de la almohadilla de Agar
- Preparar pastillas de agar aproximadamente 30 min a 1 h antes de las amebas están listas para ser mezclados con p. aeruginosa.
- Microondas 50 mL de agar 1% (p/v) en buffer DB en un matraz de 250 mL. Mezcla cada 20 s hasta grupos de agar desaparecen.
- Enfriar el agar fundido al colocarlo en baño de agua precalentada 55 ° C durante 15 minutos.
- Añadir 15 μl de la solución madre de calceína-AM a 15 mL del agar fundido en un tubo cónico. Mezcle suavemente invirtiendo el tubo 4 - 5 veces y proceder de inmediato al siguiente paso.
Nota: Realice este paso en un tubo de centrífuga de polipropileno de 15 mL. No use un recipiente de vidrio grueso ya que el agar solidifique demasiado rápido. - Vierta la mezcla de agar fundido en la parte superior una placa de vidrio de 12 cm x 10 cm y permitir que el agar solidifique durante 10 minutos a temperatura ambiente. Cortar la almohadilla de agar solidificado en secciones más pequeñas de 1,5 cm x 1,5 cm colocando la placa de vidrio sobre una cuadrícula impresa y corte a lo largo de la rejilla usando una regla de metal.
- Mantenga el gel hidratado en una caja húmeda hasta que esté listo para su uso.
5. microscopía - preparación de la muestra de Bacteria ameba imagen
- Para la virulencia de células bacterianas con conexión por superficie de ensayo, añadir 10 μl de células de Ameba de paso 2.10 bacterias conectado a superficie del paso 3.4.
Nota: Este paso describe la mezcla de amebas con las bacterias. - Para analizar la virulencia de las células planctónicas, mezclar 10 μl de las células de la ameba de paso 2.10 con 10 μl de las bacterias planctónicas de paso 3.5.
Nota: No lave las células cultivadas axenically Ameba (en un OD600 de 0.2 a 0.5) antes de mezclar con la bacteria. No crecimiento de e. coli se observará en la cultura de Ameba debido al uso de la solución de antibiótico-antimicótico. - Inmediatamente colocar la almohadilla de agar de calceína-AM 1,5 cm x 1,5 cm de paso 4.5 sobre la mezcla de bacterias-ameba en la superficie de la placa de Petri.
Nota: Coloque la almohadilla de agar en la parte superior la mezcla utilizando un movimiento suave de rápido. Este movimiento tiende a empujar las células hacia la periferia y de la parte inferior de la almohadilla, no baje la almohadilla lentamente en la mezcla. Este paso garantizará que las bacterias y las amebas son uniformemente mezclados, inmovilizada y que ambos tipos de células están confinadas en el mismo plano. - Quitar exceso de líquido mediante pipeteo suavemente hacia fuera cualquier líquido restante alrededor de la almohadilla de agar. Permita que la placa de Petri secar por 20 min a temperatura ambiente.
- Cubrir con la placa de Petri con tapa e incubar la mezcla inmovilizados ameba-bacterias a temperatura ambiente durante un adicional 40 min. proceda al paso 6.1.
Nota: Es importante incubar las muestras durante la misma cantidad de tiempo, como el fondo fluorescencia aumenta con el tiempo. Se recomienda un tiempo de incubación de 1 h. Incubaciones por más de 1 h son menos reproducibles como las células de las amebas pueden empezar a explotar.
6. microscopia - adquisición de imágenes
- Amebas de imagen utilizando un microscopio de fluorescencia capaz de adquirir imágenes de fluorescencia verde y trasmitida. Para fluorescencia verde, usar filtros de fluorescencia verde (GFP) de la proteína con 474/27 nm y 525/45 nm de excitación y emisión, respectivamente. Utilice un objetivo de (apertura numérica ≥0.3) X 10 a la imagen de las amebas.
Nota: La calceína-AM en el agar causará muerte amebas a fluorescencia en el canal de fluorescencia verde. Amebas sanas de lo contrario no son fluorescentes. - Ajustar tiempos de adquisición para el contraste de fase, canales GFP para limitar fototoxicidad y optimizar el rango dinámico de las intensidades de la imagen. Sustituir el interferencia diferencial (DIC) fase contraste si es necesario.
Nota: Usar exposiciones de 100-200 ms contraste de fases y fluorescencia de GFP si es posible. Mantener los ajustes de exposición e instrumento sin cambios a lo largo de todo el experimento. Esto es fundamental para calcular el índice de homicidio de host. - Adquirir imágenes de por lo menos 100 células de Ameba para obtener buenas estadísticas para calcular el host índice de matanza.
7. Análisis e índice de la matanza de Host de la imagen
- Cabo el análisis de imagen con ImageJ.
- Abra el archivo de imagen de contraste de fase en ImageJ haciendo clic en archivo | Abierto y seleccionar la imagen. Ajustar el umbral haciendo clic en imagen | Análisis | Umbral. Ajustar el umbral superior e inferior para seleccionar sólo el pico de intensidad (figura 3A).
- Convertir la imagen a binario haciendo clic proceso | Binario | Hacer binario. Rellenar agujeros seleccionando proceso | Binario | Llenar los agujeros.
Nota: Utilizando la imagen en la figura 1 como el origen, pasos 7.1-7.2 producirá una imagen en la que las amebas y las bacterias superficie adjunta aparecen como las regiones oscuras (figura 3B). - Asegurar que los cuadros de área y valor del gris medio se incorporan analizar | Establecer las medidas. Medir el tamaño aproximado de las amebas seleccionando la herramienta óvalo de la barra de herramientas principal. Haga clic en analizar | Medida y observe la zona de amebas representante.
- Crear máscaras para las amebas haciendo clic analizar | Analizar las partículas. En el cuadro tamaño, escriba el área que se incluyen las amebas pero excluyen las bacterias. Seleccionar máscaras en el menú desplegable de la opción de mostrar. Asegúrese de que está marcada la casilla añadir a gerente .
- Haga clic en OK y una imagen que muestra sólo las amebas y un ROI Manager aparecerá el cuadro de diálogo (figura 3C).
- Abra la imagen de la fluorescencia usando archivo | Abierto y seleccionar el archivo correspondiente. Seleccionar todas las regiones en el ROI Manager manteniendo pulsada la tecla Mayús y clic en cada región en la lista (figura 3D).
- Haga clic en el botón de medir en el ROI Manager. Se abrirá una ventana de resultados muestra el valor de la intensidad media de cada ameba.
- Copiar los valores de fluorescencia para cada ameba en un programa de hoja de cálculo y calcular el anfitrión matando índice tomando el promedio de todos los valores de fluorescencia.
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Representative Results
Hemos crecido salvaje p. aeruginosa cepa PA1419 o un ΔlasR cepa20 en el mismo fondo de PA14 en cajas Petri de 6 cm de diámetro y se analiza la virulencia de las células planctónicas y conectado a superficie. Culturas fueron inoculadas de colonias solo en las culturas PS:DB, cultivadas durante la noche en tubos de cultivo en un tambor de rodillo a 37 ° C saturación, diluido 1: 100 en PS:DB, cultiva para 8 h de 6 cm de diámetro placas de Petri agitación a 100 rpm y planctónicas y conectado a superficie Las subpoblaciones de p. aeruginosa se aislaron como se describe en la sección 3.
Superficie con conexión tipo salvaje p. aeruginosa mató a amebas, que fue indicado por una forma de célula ameba redondas y la observación de la fluorescencia de calceína (figura 4A, panel superior izquierdo). Esto dio lugar a un índice del asesinato de host alta (figura 4B). Células planctónicas fueron consumidas por las amebas, que fue indicado por formas de célula ameba amorfa y la observación de la fluorescencia de calceína poco o nada sobre el fondo (figura 4A, panel superior derecho). Esto dio lugar a un índice de matanza de host relativamente bajo (figura 4B). Superficie unida tanto las células planctónicas de la cepa delasR Δ fueron consumidas por las amebas, que fue indicado por el anfitrión baja matando a índices (figura 4B, panel inferior). Los resultados muestran así que virulencia es upregulated en poblaciones con conexión por superficie y el LasR es necesaria para la virulencia de superficie activa, que se describió anteriormente13. Estos experimentos así establecen sólidos controles positivos y negativos para experimentos futuros.
Figura 1 : Diagrama esquemático que describe un resumen de la prueba de virulencia. (1) las células del huésped ameba se cultivan cultivos (2) bacterianos se cultivan, y (3) planctónicas o conectado en superficie de las células bacterianas se mezclan con amebas e inmovilizadas en el mismo plano de proyección de imagen con una almohadilla de agar. Las células del huésped están cuantificadas para la salud con calceína-AM, microscopía de fluorescencia y análisis de imágenes. Representan barras de escala 50 μm. haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2 : Ameba esporas en un GYP 10 cm de diámetro placa de Petri después de 5 días de crecimiento. Forma de esporas sobre la superficie del plato de Petri. El recuadro muestra una vista ampliada de una sola sección de la superficie del plato. La superficie puede contener bacterias que no pueden percibirse en esta resolución. Barras de escala en las imágenes principales e inserción representan 1 cm y 2 mm, respectivamente. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3 : Análisis de datos de microscopia con ImageJ de imagen. (A) selección de la intensidad de pico con la herramienta umbral. (B) la imagen resultante después de la imagen de fuente de contraste de fase de la figura 1 se convierte en una imagen binaria. (C) resultando la imagen después de que la imagen se convierte posteriormente en una máscara. (D) imágenes de la selección de regiones de interés utilizando el ROI Manager. Representan barras de escala 50 μm. haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4 : Resultados representativos de Ameba matando por las células de p. aeruginosa . (A) fluorescencia de calceína-AM superpuesta en imágenes de microscopía de fase y host (B) matando a los índices de superficie unida o planctónicos tipo salvaje o ΔlasR p. aeruginosa. Tipo salvaje une superficie de p. aeruginosa mata amebas, que exhiben fluorescencia calceína significativa y por lo tanto, un anfitrión importante matar a índice. Las células planctónicas se consumen por amebas, que exhiben poca fluorescencia de calceína y producen un índice de matanza bajo host. Superficie unida tanto planctónicos ΔlasR son consumidos por amebas y dan como resultado un índice de matanza bajo host. Escala representan 50 μm. barras indican el promedio de tres experimentos independientes y barras de errores indican desviación estándar. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
Este protocolo describe un método rápido y cuantitativo para analizar la virulencia en p. aeruginosa. Este protocolo puede ser probado con otras bacterias. Sin embargo, es importante tener en cuenta que el medio de crecimiento debe ser compatible con las condiciones de crecimiento de la ameba. En particular, hemos optimizado el protocolo usando PS:DB como el medio de crecimiento bacteriano. Si se utilizan otros medios, puede ser necesario realizar un control del crecimiento sólo de los medios de comunicación en la que no hay las células bacterianas presentes para verificar que el medio es compatible con las amebas.
Este método puede ser ampliado para analizar la dependencia de la fase de crecimiento de virulencia. En particular, se puede cultivar cultivos bacterianos para una amplia gama de tiempos en vez de un punto de tiempo fijo. En nuestra experiencia, es importante cosechar cultivos bacterianos en puntos temporales específicos como virulencia en p. aeruginosa parece ser dependiente de la fase de crecimiento. Se observó que la virulencia en p. aeruginosa fue inducida entre 6-8 h de crecimiento en placas de Petri.
Muchas variables relacionadas con el medio ambiente de crecimiento afectan la salud de anfitrión y la virulencia bacteriana. Por lo tanto, es importante utilizar controles positivos y negativos adecuados para cada experimento. Hemos usado tipo une superficie de p. aeruginosa como unlasR positivo control y Δ como un control negativo. Sugerimos realizar estos controles cada vez que se realice el ensayo de virulencia. Estos controles son importantes para verificar que las muertes de la célula anfitrión no son debido a los factores externos tales como la edad de las amebas, las variaciones de temperatura, etc. además, le sugerimos realizar todos los experimentos en repetición biológica para establecer la reproducibilidad de los fenotipos de virulencia.
Nos han dado nuestros experimentos con amebas en densidad óptica de 0.2 a 0.5 después de una dilución de al menos 1:10 y se han regulado la temperatura de cultivo de amebas exactamente a 22 ° C. Fuera de estas condiciones de crecimiento, hemos encontrado que la susceptibilidad de las amebas a bacterias virulentas y la reproducibilidad de la prueba de virulencia se alteran. Las células de la ameba de pellets relativamente rápidamente. Asegúrese de que las culturas se resuspendió mediante pipeteo arriba y abajo inmediatamente antes de la medición de la densidad óptica. Crecen las culturas ameba superiores a una densidad de600 OD de 1 como crecimiento a altas densidades afecta la reproducibilidad del experimento. Difundir las culturas axénicos durante no más de 1 semana. Además, es importante verificar que las amebas se cultivan axenically (comenzando en el paso 2.7) a través de 20 X o microscopio de alta magnificación tal que otros microbios no están presentes en la cultura. Si las culturas son turbias en paso 2.10 después de 2 días de crecimiento después de la inoculación inicial, es probable que esto indicaría la presencia de contaminación microbiana. Si se sospecha contaminación bacteriana, sugerimos cultivo 1 mL del cultivo de amebas en 37 ° C durante 4-8 h. La observación de una turbia cultura en estas condiciones sugieren contaminación bacteriana. Si se observa contaminación bacteriana, debe reemplazarse la solución antibiótico-antimicótico.
El índice de homicidio de host es un indicador confiable de que una población bacteriana sea virulento o avirulentas. Este ensayo no ha sido optimizado para las comparaciones entre los distintos niveles intermedios de virulencia (es decir, de baja virulencia respecto a media-baja virulencia) y debe evitarse la excesiva interpretación de los resultados. Los posibles métodos para abordar este tema son la repetición de la prueba de virulencia durante varios días con diferentes lotes de células hospedadoras para establecer la confianza en los resultados, realizar experimentos de replicación adicionales y la realización adecuada Análisis estadísticos.
La multiplicidad de infección (MOI) de las células planctónicas puede controlarse con la normalización de la densidad óptica de la cultura bacteriana. Sin embargo, este ensayo no controla el Ministerio del interior de la células de las bacterias con conexión por superficie. Hemos observado que la densidad superficial bacteriana aumenta con tiempo. Por lo tanto, regular el tiempo de crecimiento en la placa de Petri puede resultar en un cambio correspondiente en una superficie de densidad. Además, la densidad superficial depende del material de la superficie. Las células de p. aeruginosa fijar a superficies de poliestireno en el ensayo descrito aquí. Sin embargo, otras superficies como vidrio, agar y poliacrilamida también pueden ser analizado13. La densidad superficial de las poblaciones bacterianas sola capa puede medirse utilizando 100 X microscopio de fases de ampliación. Si las densidades superficiales son varias capas, la microscopia confocal puede ser apropiada.
Aquí, hemos descrito un método rápido y robusto para medir la virulencia bacteriana. Modificando los parámetros tales como tiempos de incubación, el tinte fluorescente, la cepa bacteriana, el tipo de la célula huésped o medios de crecimiento, este método puede ampliarse para cuantificar la virulencia de una amplia gama de organismos y condiciones de crecimiento.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
KP y como escribieran y revisaron el manuscrito. KP realiza los experimentos y el análisis. Este trabajo fue apoyado por el Premio de transición de carrera de institutos nacionales de salud (NIH) (K22AI112816) a AS.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents | |||
| Bacto agar, dehydrated | BD Difco | 214010 | |
| Antibiotic-Antimycotic (100X) | Life Technologies | 15240062 | Aliquot < 1 mL and store at -20 °C |
| Calcein-acetoxymethyl ester (calcein-AM) | Life Technologies | C34852 | Calcein Acetoxymethyl (AM) |
| Calcium chloride, anhydrous | Sigma-Aldrich | C1016 | |
| D-Glucose | Fisher Chemical | D16500 | Dextrose |
| Dimethyl sulfoxide | Sigma-Aldrich | D5879 | |
| Folic acid | Sigma-Aldrich | F8758 | |
| LB-Miller | BD Difco | 244620 | |
| Magnesium chloride | Sigma-Aldrich | M8266 | |
| Yeast extract | Oxoid | LP0021 | |
| Special peptone | Oxoid | LP0072 | |
| Potassium hyroxide | Fisher Chemical | P250 | |
| Potassium phosphate monobasic | Sigma-Aldrich | P0662 | |
| Sodium phosphate dibasic heptahydrate | Fisher Chemical | S373 | |
| Vitamin B12 | Sigma-Aldrich | V2876 | |
| Strains | |||
| Dictyostelium discoideum | Siryaporn lab | Strain AX318 | |
| Escherichia coli | Siryaporn lab | Strain B/r17 | |
| Pseudomonas aeruginosa | Siryaporn lab | PA14 | PA14 strain19 |
| Pseudomonas aeruginosa ΔlasR | Siryaporn lab | AFS20.1 | PA14-derived strain20 |
| Supplies | |||
| 0.22 µm filter | Millipore | SCGPT01RE | For filter sterilization |
| Conical tube, 15 mL | Corning | 352097 | |
| Glass storage bottles | Pyrex | 13951L | 250 mL, 500 mL, 1000 mL |
| Petri dish, 6 cm diameter | Corning | 351007 | 60 x 15 mm polystyrene plates |
| Petri dish, 10 cm diameter | Fisher | FB0875712 | 100 x 15 mm polystyrene plates |
| Plastic containers with lid | Ziploc | 2.57E+09 | Square 3-cup containers |
| Glass plates | Bio-Rad | 1653308 | For preparing agar pads. Other glass plates may be used with similar dimensions. |
| Wooden sticks | Fisher | 23-400-102 | |
| Equipment | |||
| Eclipse Ti-E microscope | Nikon | MEA53100 | Microscope setup |
| 10X Plan Fluor Ph1 objective 0.3 NA | Nikon | MRH20101 | Microscope setup |
| Fluorescence excitation source | Lumencor | Sola light engine | Microscope setup |
| Fluorescence filter set | Semrock | LED-DA/FI/TX-3X3M-A-000 | Microscope setup |
| Orca Flash 4.0 V2 Camera | Hamamatsu | 77054098 | Microscope setup |
| ImageJ | NIH | v. 1.49 | Software for image analysis |
| MATLAB | Mathworks | R2013 | Software for image analysis |
| Orbital shaker incubator | VWR | 89032-092 | For growth of bacteria at 37 °C |
| Platform shaker | Fisher | 13-687-700 | For growth of amoebae at 22 °C |
| Spectrophotometer | Biochrom | Ultrospec 10 | |
| Undercounter refrigerated incubator | Fisher | 97990E | For growth of amoebae at 22 °C |
| Isotemp waterbath | Fisher | 15-462-21Q | For cooling media to 55 °C |
References
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