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Biology

In Vivo Nanovector Lieferung von einem Herz-spezifische MicroRNA-Schwamm

Published: June 15, 2018 doi: 10.3791/57845
Automatic Translation
1, 2, 2
1Princess Margaret Cancer Centre, University of Toronto, 2Department of Pathology, Department of Cardiology, Johns Hopkins University

Summary

Gewebe-spezifische MicroRNA-Hemmung ist eine Technologie, die im Feld MicroRNA unterentwickelt ist. Hier beschreiben wir ein Protokoll, um erfolgreich die MiR-181 MicroRNA-Familie in Myoblast Zellen aus dem Herzen zu hemmen. Nanovector-Technologie wird verwendet, um eine MicroRNA Schwamm zu liefern, die erhebliche in Vivo Cardio-spezifische MiR-181 Familie Hemmung zeigt.

Abstract

MicroRNA (MiRNA) ist kleine nicht-kodierende RNA die posttranskriptionelle Boten-RNA (mRNA) Ausdruck hemmt. Menschlichen Krankheiten wie Krebs und Herz-Kreislauf-Krankheit haben gezeigt, um Gewebe und/oder zellspezifische MiRNA Ausdruck verbunden mit Fortschreiten der Krankheit zu aktivieren. Die Hemmung der MiRNA Ausdruck bietet das Potenzial für eine therapeutische Intervention. Jedoch beeinflussen traditionelle Ansätze zur MiRNAs, beschäftigt Antagomir Oligonukleotide, hemmen bestimmte MiRNA-Funktionen bei der weltweiten Lieferung. Hier präsentieren wir ein Protokoll für die in Vivo Cardio-spezifischen Hemmung der MiR-181-Familie in einem Rattenmodell. Ein MiRNA-Schwamm-Konstrukt soll 10 wiederholten miR-181-Bindung-Sequenzen enthalten. Der Cardio-spezifische α-MHC-Promoter wird in das pEGFP Rückgrat den Cardio-spezifische MiR-181 MiRNA-Schwamm Ausdruck fahren geklont. Um eine stabile Zelle erstellen Linie mit dem Ausdruck der MiR-181-Schwamm "," Myoblast H9c2 Zellen mit α-MHC-EGFP-miR-181-sponge Konstrukt transfiziert und Fluoreszenz-aktivierte Zelle Sortieren (FACs) in GLP positive H9c2-Zellen, die mit Neomycin kultiviert werden sortiert (G418). Nach einem stabilen Wachstum im Neomycin sind monoklonale Zellpopulationen durch zusätzliche FACs und einzelne Zelle Klonen gegründet. Die resultierenden Myoblast H9c2-MiR-181-Schwamm-GFP Zellen zeigen einen Verlust der Funktion von MiR-181 Familienmitglieder durch die erhöhte Expression von MiR-181 Zielproteine bewertet und im Vergleich zu H9c2-Zellen, die mit dem Ausdruck eines Gerangel nichtfunktionale Schwamm. Darüber hinaus entwickeln wir ein Nanovector für die systemische Lieferung des MiR-181-Schwamm-Konstrukts durch Komplexbildner positiv geladenen liposomalen Nanopartikel und negativ geladene MiR-181-Schwamm Plasmide. In-Vivo Bildgebung der GLP zeigt, dass mehrere Schweif Vene Injektionen von einer Nanovector über einen Zeitraum von drei Wochen in der Lage, einen signifikanten Ausdruck von MiR-181-Schwamm ein Cardio-spezifisch zu fördern. Wichtig ist, ist ein Verlust von MiR-181-Funktion im Herzgewebe, aber nicht in der Niere oder der Leber beobachtet. Die MiRNA-Schwamm ist eine leistungsfähige Methode, gewebespezifische MiRNA Ausdruck zu hemmen. Fahren des MiRNA-Schwamm-Ausdrucks von einem gewebespezifischen Promoter bietet Spezifität für die MiRNA-Hemmung, die auf eine gezielte Organ oder Gewebe beschränkt werden kann. Darüber hinaus erlaubt die Kombination von Nanovector und MiRNA-Schwamm-Technologien eine effektive Lieferung und gewebespezifische MiRNA Hemmung in Vivo.

Introduction

In den letzten zwei Jahrzehnten wurden zahlreiche Studien, die die wichtige Rolle der MiRNAs bei der menschlichen Krankheit hingewiesen haben. Ergebnisse von einem großen Körper der Literatur zeigen die unbestreitbare Bedeutung von MiRNAs in der Pathophysiologie von Erkrankungen wie Krebs1 und Herz-Kreislauf-Krankheit2,3,4,5. Zum Beispiel ist MiR-21 hochreguliert in vielen Krebsarten, was zu einer erhöhten Zellzyklus und Zelle Verbreitung-6. Hepatitis C-Infektionen MiR-122 spielt eine wichtige Rolle bei der Replikation des Virus7, und es hat sich gezeigt, dass die Hemmung der MiR-122 die Viruslast8verringert. In Herzhypertrophie MiR-212/132 ist hochreguliert im Herzen und engagiert sich in der pathologischen Phänotyp-9. Die offensichtliche Bedeutung der Downregulation oder funktionelle Hemmung der eine hochreguliert MiRNA schlägt Möglichkeiten die MiRNA-Biologie bei fast allen Erkrankungen therapeutisch zu nutzen.

Die vier Familienmitglieder MiR-181, MiR-181a/b/c/d, sind in drei genomischen Standorten im menschlichen Genom gefunden. Die intronischen Region eines nicht-kodierende RNA Host Gens (MIR181A1-HG) kodiert die Cluster von MiR-181-a/b-1. Die intronischen Region des NR6A1-Gens kodiert die MiR-181-a/b-2. MiR-181-c/d-Cluster befindet sich in einem fußgelenkes Protokoll auf Chromosom 19. Die MiR-181 Familienmitglieder teilen die gleiche Sequenz "Samen" und alle vier MiR-181 Familienmitglieder können potentiell die gleichen mRNA Ziele regulieren.

Wir3,4 und andere10 haben deutlich gemacht, dass die Bedeutung von MiR-181 Familienmitglieder bei terminaler Herzinsuffizienz. Wir haben auch erkannt, dass ein MiR - 181c Hochregulation unter pathologischen Bedingungen ein erhöhtes Risiko für Herz-Kreislauferkrankungen, wie Typ-II-Diabetes, Übergewicht und Alterung3,4,5zugeordnet tritt. Es wurde postuliert worden, dass die Überexpression von MiR - 181c verursacht oxidativen Stress führt zu einer kardialen Dysfunktion4.

Mehrere Gruppen haben vorgeschlagen, dass MiRNA in Mitochondrien11,12,13,14vorhanden, aber wir die ersten waren, die zeigen, dass MiR - 181 c ergibt sich aus dem Kerngenom verarbeitet, und anschließend umgesiedelt zu den Mitochondrien in den RISC-3. Darüber hinaus haben wir eine geringe Expression von MiR-181a und MiR 181b im mitochondrialen Abteil des Herzens5festgestellt. Wichtig ist, haben wir gefunden, dass MiR - 181 c unterdrückt die Mt-COX1 mRNA Expression, dadurch belegen, dass MiRNAs in der mitochondrialen Genregulation teilnehmen und mitochondriale Funktion3,4zu ändern.

Dieser Artikel beschreibt die Methodik MiRNA-Schwamm die ganze MiR-181-Familie in Kardiomyozyten abzureißen entwerfen. Darüber hinaus erläutern wir ein Protokoll für die in-Vivo -Anwendung von MiR-181-Schwamm.

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Protocol

Alle experimentelle Verfahren wurden von den institutionellen Animal Care und Nutzung Ausschuss der Johns Hopkins University angenommen.

(1) Schwamm Design

  1. MicroRNA verbindlich 3' UTR
    Hinweis: A MiRNA Funktionen durch spezifischen base pairing Wechselwirkungen mit teilweise ergänzende Websites im 3' untranslatierten Bereich (UTR) von ihrer Ziel-mRNAs (für eine umfassende Überprüfung siehe Bartel)15.
    1. Entwerfen Sie die Inhibitoren MiRNA-Ausdruck als Oligonukleotide, die erhebliche Komplementarität der MiRNA-Reihenfolge enthalten. Sequester MiRNA in ein Oligonukleotid Komplex durch umfangreiche Basenpaarung die MiRNA-Funktion blockieren.
  2. Entwurf eines MiRNA-Schwamm
    1. Design tandemly angeordneten teilweise ergänzende MiRNA-Sequenzen enthalten eine Beule an der Stelle, die normalerweise von Argonaut 2 gespalten. Die Wölbung ist Nukleotide 9-12 die Reife MiRNA Sequenz zur Verhinderung jeder RNA Interferenz Art Spaltung und Abbau des Schwammes positioniert.
    2. Auf Wunsch entwerfen Sie die Lockvogel-Zielsequenz binden an alle Familienmitglieder von MiR-181. Nach einer Prüfung und Vergleich der MiR-181 Familie MiRNA Sequenzen finden einer gemeinsamen Sequenz an der 5'-Seite der Ardennenoffensive, enthält 8 aufeinanderfolgende Nukleotide oder eine Sequenz am 3'-Seite der Ausbuchtung eines zusätzlichen 8 üblich, alle 4 MiR-181 Familienmitglieder zu finden aufeinanderfolgende Nukleotide. Die linke und Rechte Hälfte Bindungsstellen, repräsentieren diese 2 Sequenzen.
      Hinweis: Die Köder-Sequenz ist ein Tandem-Array von die linke und Rechte Hälfte-Bindungsstellen durch GGA Abstandshalter getrennt. Verknüpfen Sie die 5'-Ende-Sequenz und der 3'-Seite-Sequenz (in Schritt 1.2.2 beschrieben) mit einem GGA-Abstandshalter entwickelt, um die Wölbung wenn zu einem MiRNA geglüht (wie in Schritt 1.2.1 beschrieben) zu erstellen. Wiederholen Sie diese 1 MiRNA-Bindungsstelle 10 X in das endgültige MiR-Schwamm-Konstrukt.
  3. Andere Überlegungen MiRNA Schwamm
    Hinweis: Um die Schwamm-Sequenz in den Empfänger Expressionsvektor Klonen, Restriktionsschnittstellen Nuklease Anerkennung an jedem Ende der Sequenz beizufügen. In Silico Verdauung Analyse sollte verwendet werden, die unspezifische Spaltung der Schwamm-Sequenz zu bestätigen durch die gewählte Beschränkung Enzyme und andere Restriktionsenzyme in nachgeschalteten Klonen Anwendungen eingesetzt.
    1. Fügen Sie eine doppelte Stopcodon (TAA TAA) am 5'-Ende der synthetischen 3' UTR, so dass die MiR-181-Schwamm-Sequenz nicht Bestandteil der kodierenden Sequenz für eine verbesserte grün fluoreszierendes Protein (EGFP ist).
  4. Synthese des Schwammes DNA zum Klonen
    1. Verwenden Sie einen DNA-Synthesizer oder beschäftigen Sie eine kommerziell verfügbare Quelle, die endgültige MiRNA Schwamm Sequenz mit Nuklease Anerkennung Restriktionsschnittstellen im Ort für das Klonen zu synthetisieren. Der Schwamm wird auf einem Plasmid geliefert, die wählbaren Marker für eine Verstärkung in Bakterien enthalten kann. Weiter, der Schwamm verstärkt durch eine Polymerase-Kettenreaktion (PCR) zum Klonen oder einfach brach der Spender-Vektor mit den Restriktionsschnittstellen im Schritt 1.3 beschrieben werden kann (siehe auch Schritt 3.1).

(2) Klonen den Empfänger Vektor um einen gewebespezifischen Promoter erweitert

Hinweis: Verwenden des pEGFP-C1-Vektors als Empfänger Vektor für die Expressionskassette der MiRNA-Schwamm. Der pEGFP-C1-Vektor enthält einen Leseraster für eine EGFP, angetrieben von einem Förderer Cytomegalovirus (CMV). Der CMV-Projektträger ist konstitutiv aktiv in Säugetierzellen. Gewebespezifischen Promoter erforderlich ist, kann der CMV-Promoter durch Verdauung von AseI und NheI Enzyme (siehe Punkt 2.1) entfernt werden. Das Plasmid enthält eine umfangreiche Site mit mehreren Klonen (MCS) sowie (Kan) Kanamycin und Neomycin (G418) Marker für eine Auswahl in Bakterien und eine stabile Expression in Säugerzellen, beziehungsweise.

  1. Entfernen der CMV-Promoter aus pEGFP-C1
    1. Machen Sie 50 μL der Verdauung Reaktion mit 1 x handelsübliche Digest Puffer vorgeschlagen durch die Herstellung von den Restriktionsenzymen eingesetzt, 5 μg von Plasmid DNA (im Wasser) und 5 μL AseI und NheI Enzyme. Fügen Sie alle Komponenten zu einem Microcentrifuge Schlauch hinzu und mischen sie vorsichtig durch streichen es. Drehen Sie das Rohr für 10 s in einem Microcentrifuge die Reaktion an der Unterseite zu sammeln. Inkubieren Sie die Reaktion im Wasserbad 37 ° C für 15 min.
    2. Reinigen Sie das verdaute linearisierte Plasmid. Fügen Sie 5 x das Reaktionsvolumen von Spalte Bindung Puffer (eine proprietäre Mischung des Puffers entsprechende Bindung für die Herstellung der verwendeten DNA-Reinigung-Spalten hinzu) und reinigen Sie die Reaktion mit einer DNA-Reinigung-Spalte zu, wie vom Hersteller beschrieben. Eluieren Sie mit 25 μL der Elution Buffer (Wasser) vorsichtig in die Mitte der Spalte hinzugefügt.
    3. Gel zu reinigen das verdaute Plasmid auf 0,5 % Agarose-Gel wie folgt: 5 μL der Ladepuffer (50 % Glycerin-3 x laden Farbstoff), der eluierten Plasmids hinzufügen. Laden Sie die gesamte Probe in 1 auf 0,5 % Agarose-Gel. Gehören eine separate Spur mit 500 ng ungeschnitten Vektors. Führen Sie es für 30-40 min., bis eine angemessene Trennung der geschnitten und ungeschnitten Plasmide erreicht ist.
    4. Die linearisierte Plasmid wie folgt zu reinigen: die DNA in das Agarosegel auf ein UV-Licht-Box zu visualisieren. Mit einer sauberen Rasierklinge Verbrauchsteuern Sie vorsichtig die Band entsprechend linear Plasmid.
      Hinweis: Das lineare Plasmid niedriger als die unbeschnittenen Plasmid laufen und erscheint als ein einzelnes Band bei ca. 4,2 kb. Die ausgeschnittenen CMV-Veranstalter erscheint als ein Lichtband auf rund 500 Nukleotide (nt).
    5. Die DNA aus dem Gel-Scheibe mit einem kommerziell erhältlichen Kit extrahieren und die DNA aus der Spalte mit 25 μL des Wassers eluieren.
  2. Klonen eines Herz-spezifischen Promotors in pEGFP-C1
    Hinweis: Der Alpha-Myosin heavy Chain (α-MHC) Veranstalter zuvor geprägt und wurde demonstriert, um robuste Niveaus der kardialen beschränkt Ausdruck zu lenken, wie in den folgenden Molkentin, Jobe und Markham16beschrieben. In den folgenden Abschnitten wird beschrieben, wie der Veranstalter des Vektors für das Klonen zu verstärken.
    1. Klonen der α-MHC-Veranstalter zwischen Elementen + 420,-2934 relativ zur Transkription Start Website in die p40 Plasmid16 erste PCR-Primer, die diese Region und dann das Plasmid als Vorlage für die PCR flankieren entwerfen. Der Promotor-Region mittels PCR Primer zuvor beschriebenen5zu verstärken. Forward und reverse PCR Primer enthalten Sequenzen überschneiden sich die verdauten Enden des pEGFP-C1 (Schritt 2.1) erlauben In Fusion gerichtet zu klonen. Handbuch für eine umfassende Erklärung des besser gekleideteres Design zum Klonen von In-Fusion In-Fusion. Primer-Sequenzen sind in Tabelle 1gefunden.
    2. Vorbereiten eine PCR-Reaktion von 50 μL, enthält 1 μM jede Grundierung und 10 ng der Schablone DNA. Fügen Sie eine entsprechende Menge an PCR-Enzym und dNTPs abhängig von der Herstellung der PCR Reagenzien ausgewählt. Durchführen Sie PCR auf eine DNA-Radsport standardstein. Führen Sie eine 3 min 98 ° C denaturierenden Schritt, gefolgt von 35 Zyklen der Denaturierung, Glühen und Erweiterung für 5, 30 und 120 s, beziehungsweise. Umfassen Sie eine letzte Verlängerung von 10 min bei 72 ° C.
    3. Bereinigen Sie die Gewinnung von PCR und Gel. Nach Abschluss der PCR-Zyklus der PCR-Reaktion 5 x das Reaktionsvolumen des Puffers Spalte Bindung hinzu und reinigen Sie es mit einer DNA-Reinigung-Spalte, wie vom Hersteller beschrieben. Eluieren Sie die Mischung mit 25 μL der Elution Buffer (Wasser) vorsichtig in die Mitte der Spalte hinzugefügt.
      1. Fügen Sie 5 μL der Ladepuffer [50 % Glycerin (3 X) laden Farbstoff] eluierten Plasmid. Laden Sie die gesamte Probe in 1 auf 1 % Agarose-Gel. Führen Sie es für 30-40 min.; Visualisieren Sie und Verbrauchsteuern Sie das PCR-Produkt, wie beschrieben (Schritt 2.1.5).
    4. Die α-MHC-Veranstalter mit dem pEGFP-C1 wie folgt verbinden: die 10 μL Ligatur Reaktion mit 1 x handelsübliche Ligatur Puffer, 2 μL der gereinigten PCR und 1 μL der linearisierten Vektor hinzufügen. Durchführen Sie der Ligatur bei 50 ° C für 15 min und dann auf Eis abkühlen.
    5. Führen Sie eine bakterielle Transformation folgendermaßen: 50 μl kompetente Zellen mit 2,5 μL In Fusion Ligatur Mix transfizieren, indem die Komponenten. Ruhen der Eppendorf tube auf Eis für 20 min, steckte es in ein Wasserbad 42 ° C für 40 s und legen Sie dann den Schlauch für 2 min auf Eis.
      1. Fügen Sie nach der Transformation 350 μl SOC Medien hinzu und wachsen Sie Zellen bei 37 ° C für 45 min. Platte 200 μL Auswuchs-Lösung auf LB-Platten mit Perform Kan eine Kolonie PCR Kan resistente Zellen zu identifizieren, die der α-MHC-Promotor-Ligatur enthalten.
        Hinweis: Screening Primer wurden über die Ligatur Kreuzung PCR entwickelt.
    6. Erweitern Sie die PCR positive Klone in LB-Kan Brühe und in Plasmiden gereinigt, unter Verwendung von standard Mini-Vorbereitung Plasmid Reinigung Protokollen wie vom Hersteller beschrieben.

3. das Klonen des Schwamms

  1. Den Empfänger Vektor zu verdauen
    1. Machen Sie die α-MHC-pEGFP-Plasmid linear zum Klonen mit EcoRI und KpnI, und reinigen Sie das Gel zu, wie oben (Schritt 2.1) beschrieben.
  2. PCR zu verstärken und den Schwamm DNA zu verdauen
    1. Verwenden Sie das MiR-181-Schwamm und entsprechende 284-nt-langen Gerangel Versand Vektoren als Vorlage für die PCR. Die Schwamm-Region mit der zuvor beschriebenen PCR Primer5zu verstärken. Beachten Sie, dass forward und reverse PCR Primer Restriktionsenzym Sequenzen um Ligatur in α-MHC-pEGFP-C1 ermöglichen enthalten. Durchführen Sie PCR, wie beschrieben (Schritt 2.2.2). Reinigen Sie die PCR-Produkte vor der Verdauung wie beschrieben (Schritt 2.2.3) und sie mit Wasser für die Verdauung eluiert. Primer-Sequenzen finden Sie unter Tabelle 1.
    2. Den Schwamm DNA für die Ligatur zu verdauen. 1 x Digest Puffer, der Gel-gereinigte PCR-Reaktion aus Schritt 3.2.1 und 5 μL EcoRI und KpnI Enzyme enthält 50 μL Verdauung Reaktion. Fügen Sie alle Komponenten zu einem Microcentrifuge Schlauch hinzu und mischen sie vorsichtig durch streichen es. Drehen Sie das Rohr für 10 s in einem Microcentrifuge die Reaktion an der Unterseite zu sammeln. Inkubieren Sie die Reaktion im Wasserbad 37 ° C für 15 min.
    3. Reinigen des verdauten PCR Schwamms mit einer PCR-Aufräumarbeiten-Spalte, wie zuvor beschrieben (Schritt 2.2.1).
  3. Verbinden Sie den MiR-181-Schwamm in α-MHC-pEGFP-C1-Vektor
    1. Richten Sie eine 21 μL Ligatur Reaktion, die 1 X Ligatur Puffer enthält, 3 μL der verdaut und gereinigte MiR-181-Schwamm-PCR, 1 μL der linearisierten Vektor α-MHC-pEGFP-C1, 1 X DNA-Puffer und 1 μl DNA Ligase. Durchführen Sie der Ligatur bei Raumtemperatur für 5 min und dann legen Sie es auf dem Eis.
    2. 50 μL der XL1-blau kompetente Zellen mit 2 μL Ligatur-Mix zu verwandeln. Verwenden Sie die Transformation und Plattieren Protokolle wie beschrieben (Schritt 2.2.5). Führen Sie eine Kolonie PCR Kan resistente Bakterien zu identifizieren, die die korrekte α-MHC-pEGFP-miR-181-sponge Sequenz enthalten. Design-Screening Primer an die PCR über die Ligatur-Kreuzung. Primer-Sequenzen finden Sie unter Tabelle 1 .
    3. Verstärken und Sequenz des Vektors. Erweitern Sie die PCR positive Klone in LB-Kan Brühe und in Plasmiden gereinigt standard Mini-Vorbereitung Plasmid Reinigung Protokolle verwendet. Führen Sie eine DNA-Sequenzierung, um zu überprüfen, das Plasmid mit dem Ausdruck der gewünschten DNA-Sequenzen.

4. Generation von stabilen H9c2 MiR-181-Schwamm mit dem Ausdruck ihrer Zellen

  1. Wachstum und Erhalt von H9c2 Zellen
    1. Kultur der H9c2 Zellen in Dulbeccos geändert Eagle Medium (DMEM) mit fetalen bovine Serum (FBS), eine Endkonzentration von 10 %. Sub-Kultur der Zellen unter Verwendung von Standardprotokollen und wachsen sie bei 37 ° C in 5 % Kohlendioxid.
  2. Transfektion und Auswahl von H9c2 α-MHC-pEGFP-C1-miR-181-sponge mit dem Ausdruck Zellen
    1. Führen Sie eine Elektroporation H9c2 Zellen für die besten Ergebnisse. Transfizieren Sie Ratte Myoblasten (H9c2) mit einem Gerangel Schwamm (eine 284-nt-langen Gerangel Sequenz, die MiR-181-Schwamm-Sequenz ersetzt) oder die α-MHC-pEGFP-miR-181-sponge Konstrukt mit einem Electroporator.
      1. Kurz, transfizieren 4 x 10-5 Zellen mit 2 µg Plasmid DNA (in 5 µL H2O) und 100 µL einer Lösung mit dem Elektroporation Gerät kompatibel. Verwenden Sie ein Elektroporation-Programm von DS-120, um die H9c2-Zellen zu transfizieren.
      2. Inkubieren Sie die transfizierten Zellen in die Küvette für 10 min bei Raumtemperatur. Fügen Sie 500 µL DMEM direkt in die Küvette. Übertragen Sie sanft die total Küvette Inhalte zu einem Brunnen von einem 6-Well-Platte.
    2. Wählen Sie für GFP-positiven Zellen nach 48 h nach Transfektion durch FACs. Platte nur die GFP ausgedrückt Zellen in einem 6-Well-Platte mit einem Zusatz von Neomycin (G418) (400ng/mL), die komplette Wachstumsmedium.
      Hinweis: Vor der Auswahl G418 sollte eine Kill-Kurve eingerichtet werden, die Höhe der für die erforderlichen Neomycin bestimmen. Für H9c2 Zellen, 400 ng/mL G418 führte zu einer ca. 80 % Todesrate von nicht-Plasmid transfizierten H9c2 Zellen nach 24 h und galt als die gewünschte Konzentration der Arbeiten von G418 für diese Zellen. Die Zell-Linie galt als stabil, nach Wachstum in G418 für 16 Tage gepflegt wurde.
    3. Führen Sie die FACs-Sortierung der G418 stabilen Zellen mit dem Ausdruck der GLP als Marker für eine Positivauswahl Schwamm. Samen von 5-10 Zellen in jede Vertiefung einer 96-Well-Platte Fluss sortieren. Erweitern Sie die monoklonalen Zellen aus der 96-Well-Platte 24-Well-Platten in mehreren Durchgängen. Verwendung Gefrierschrank Bestände von Zellen aus Abschnitt 3 (P3) Zellen als Ausgangspunkt für spätere Experimente.
    4. Durchführen Sie alle Zell-Linie-basierte Experimente mit niedrig-Passage Zellen zwischen P5 und P10.

5. Synthese und Reinigung von Schwamm-Nanopartikeln (MiR-181-Schwamm Nanopartikel)

  1. Bereiten Sie die liposomale Nanopartikel durch Auflösen von kationisch Amphiphile (DOTAP) und Co Lipide, Cholesterin und DSPE-PEG-OMe, in einem 5:5:0.1 mM Verhältnis bzw. in einem Gemisch aus Chloroform und Methanol in einer Glasflasche.
  2. Die organische Lösungsmittel bei 44-45 ° C unter Vakuum mit einem drehverdampfer, gefolgt von einem sanften Fluss von Feuchtigkeit-freien Stickstoff zu entfernen. Halten Sie die restlichen getrockneten Films Lipid im Hochvakuum für 8 h.
  3. Bereiten Sie eine Mischung von Vakuum getrocknet Lipid-Film 5 % Glukose hinzufügen. Lassen Sie es über Nacht um diese Mischung zu den Film-Hydrat zu ermöglichen. Wirbel der Fläschchen für 2 bis 3 min bei Raumtemperatur um multilamellar Vesikel mit einem gelegentlichen schütteln in einem 45 ° C Wasserbad zu produzieren.
    1. Beschallen Sie die multilamellar Vesikel zur Vorbereitung kleine Unilamellar Vesikel im Eisbad für 3-4 min bis Klarheit beobachtet werden kann, bei einer Einschaltdauer von 100 % und 25 W Ausgangsleistung.
  4. Mischen Sie entweder ein Scramble-Sequenz oder eine MiR-181-Schwamm-Sequenz in der pEGFP(α-MHC) Vektoren und Liposomen auf 1:3 kostenlos Verhältnis Basis bilden die Nanovector4kloniert.
    Hinweis: Ein elektrostatische Komplex von positiv geladenen liposomalen Nanopartikel und negativ geladene Plasmid DNA wird als eine Nanovector bezeichnet.

6. systemische Lieferung von Schwamm-Nanopartikeln und Validierung der In Vivo -Effekte

  1. Systemische Lieferung von Schwamm-Nanopartikeln in Ratten
    1. Verwenden Sie Sprague-Dawley (SD) Ratten. Injizieren Sie die Ratten intravenös mit MiR-181-Schwamm Nanovector oder Scramble Nanovector durch die Rute Vene. Verwenden Sie SD männliche Ratten, die über 200 g Körpergewicht sind.
    2. Führen Sie die Rute Vene Injektion mit einer Dosis von 4 mg von Nanovector/kg Körpergewicht und wiederholen Sie diesen Vorgang mit ein Regime von 6 Schweif Vene Injektionen mehr als 2 Wochen. Ermöglichen Sie nach der wiederholten Nanovector Lieferung eine 1-Wochen-Frist (15-21 Tage) für den Ausdruck der Vektor in Vivo.
    3. Bestätigen Sie die Optimierung von imaging das GFP-Signal vor, während und nach der Nanovector Lieferung. Analysieren Sie das GFP-Signal durch tomographische imaging-Software, die semi-quantitativen Daten erzeugt.
  2. Validierung der in Vivo MiR-181 Hemmung von MiR-181-Schwamm
    1. Führen Sie western-Blot, um den Ausdruck eines funktionalen MiR-181-Schwamm im Herzgewebe zu demonstrieren.
      Hinweis: Für diese Studie wurde Mt-COX1 Ausdruck geprüft.
  3. Funktionelle Folgen der in Vivo MiR-181-Schwamm Ausdruck im Herzen
    1. Führen Sie eine zweidimensionale, M-Modus und Doppler-Echokardiographie, während und nach der Nanovector Lieferung an die Herzfunktion und morphologische Veränderungen zu analysieren. Verwenden Sie für eine bessere Scan Kapazität in den Nagetieren Herzen eine Ultraschall-System mit einer 15 MHz linear-Array-Transducer ausgestattet.
    2. Anästhesie kann die kardiale Kontraktilität beeinflussen; Daher führen Sie die Lieferung von MiR-181-Schwamm Nanovector oder Scramble Nanovector für Tiere, die bewusst und ohne jede Narkose Reagenz bei der Echokardiographie sind. Finden Sie Das, Et Al. 4 zur weiteren Abklärung.

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Representative Results

In den stabil transfizierten pEGFP MiR-181-Schwamm-exprimierenden H9c2 Zellen (aus Schritt 4.2) wurde der Ausdruck der gesamten Familie MiR-181 (MiR-181a, MiR 181b, MiR - 181 c und MiR - 181 d) mäßig im Verhältnis zu pEGFP Rührei-exprimierenden H9c2 Zellen verringert. MiR-181-Schwamm dient als als kompetitiver Inhibitor der gesamten MiR-181-Familie, so dass wir erwartet, dass der Ausdruck des MiR - 181c mitochondriale gen Ziel, Mt-COX1 erhöhen würde. Western-Blot-Daten deuten darauf hin, dass der Mt-COX1 Ausdruck in den pEGFP MiR-181-Schwamm-exprimierenden H9c2-Zellen im Vergleich zu den pEGFP-Scramble zum Ausdruck gebracht H9c2-Zellen erhöht wurde. Darüber hinaus ergaben sich keine Änderungen der Ausdruck für Mt-COX2 oder Mt-COX3 erkannten über Immunoblot in den pEGFP MiR-181-Schwamm-exprimierenden H9c2-Zellen. Wir benutzten α-Tubulin als Normalisierung Kontrolle für die Immunoblotting Analyse. GFP wurden hauptsächlich in der Leber und Niere bis zu 2 Wochen Post-systemische Lieferung von MiR-Schwamm Nanovector (Abbildung 1A) beobachtet. Der GFP-Ausdruck war jedoch nach 3 Wochen von MiR-181-Schwamm Nanovector Lieferung (Abbildung 1A und 1 b) deutlich höher im Herzgewebe. Übrigens gab es ein GLP-Signal erkannt in das Lebergewebe bei einigen Tieren 3 Wochen nach der systemischen Lieferung; Allerdings gab es keine funktionalen Auswirkungen von MiR-181-Schwamm in der Leber zu diesem Zeitpunkt.

Der western-Blot zeigte einen signifikanten Anstieg im Mt-COX1 Ausdruck in der MiR-181-Schwamm Nanovector injiziert Ratten im Vergleich zu den Scramble Nanovector Gruppen (Abbildung 2). Höheren Mt-COX1 schlägt, gibt es ein unteren MiR - 181 c Ausdruck im Herzen nach 3 Wochen der MiR-181-Schwamm Nanovector Lieferung, wie Mt-COX1 das direkte Ziel für MiR - 181c ist. Α-Tubulin verwendeten als Normalisierung Steuerelement wir für die Immunoblots.

Echokardiographie zeigte keine Veränderung in der Herzfunktion der MiR-181-Schwamm Nanovector injiziert Ratten vor, während und am Ende der Therapie, im Vergleich zu den Scramble Nanovector Gruppe von Tieren.

Figure 1
Abbildung 1. In vivo Analyse der Nanovector Lieferung des MiR-181-Schwamms. (A) dieses Panel zeigt optimierte 3-wöchigen Behandlungsprotokolle mit 6 intravenöse Injektionen durch die Rute Vene. Die gelbe Färbung im Epifluoreszenz Bild zeigt den Ausdruck des pEGFP Vektors. Die maximale Intensität der gelben Färbung wird in der Woche 3 Zeitpunkt beobachtet. (B) die α-MHC promotorsequenz im pEGFP Vektor drückt selektiv die MiR-181-Schwamm oder verschlüsselte Sequenz im Herzen am 21. Tag. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 2
Abbildung 2: Überprüfung der Wirkung von MiR-181-Schwamm Nanovector auf MiR - 181c Ausdruck. Dies ist die western-Blot Analyse des Mt-COX1 Ausdrucks in der Herz-Lysaten aus pEGFP-Scramble und pEGFP-MiR-181-Schwamm Nanovector injiziert Ratten gewonnen. Vollem Herzen Homogenates wurden mit der angegebenen Antikörper geprüft. Wir benutzten α-Tubulin als ein Steuerelement laden. Die Band-Densitometrie zeigt das Balkendiagramm unten. Der Student t-Test wurde durchgeführt, und der Standardfehler wurde als Fehlerbalken im Balkendiagramm dargestellt. p < 0,05 vs. pEGFP-Scramble-Gruppe. n = 4.

Primer-Name Sequenz TM Notizen Verwendung Ziel
SAM3-1F ATGCATTAGTTATTAATGCTT
GACACACTTGACAATTTCT		 58.4 Ratte MHC-Promotor in EGFP Klonen PCR MHC-Förderer
SAM3-2R GACCGGTAGCGCTAGCTG
ACTCACTGGGAGATTGCTT		 59,8 Ratte MHC-Promotor in EGFP Klonen PCR MHC-Förderer
SAM3-3F CGAACGACCTACACCGAACT 64 Bildschirm EGFP-F Kolonie PCR Positiven Promotor Klone
SAM3-4R CGCTAGTCCTTGACCCTCTG 63,9 Bildschirm MHC-R Kolonie PCR Positiven Promotor Klone
SAM5-1F CCTGTCTCCAACACACAAGC 59,3 Sequenz MHC-Förderer Sequenzierung MHC-Förderer
SAM5-2R CAGACTGCAGGGCTGGTT 60 Sequenz MHC-Förderer Sequenzierung MHC-Förderer

Tabelle 1. Primer-Sequenzen.

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Discussion

In diesem Artikel beschrieben, das Design und die Synthese eines MiRNA-Schwamm und demonstriert, wie der gewebespezifischen Ausdruck des Schwammes ist ein leistungsfähiges Werkzeug zur gewebespezifischen MiRNA Familie Ausdruck hemmen.

Wir haben gezeigt, dass eine MiR-181-Familie targeting Schwamm in einer expressionsplasmid mit einem Herz-Kreislauf-spezifischen Promotor geklont werden kann. Das Plasmid kann effizient in ein Nanovector Teilchen für die Lieferung verpackt werden in Vitro und in Vivo mittels Elektroporation oder eine Heck-Vene-Injektion bzw. (Abbildung 1). MiR-181 Schwamm kann einen Herz-Kreislauf-spezifischen Ausdruck der MiR-181-Familie hemmen und den Ausdruck von MiR-181 Zielgene (Abbildung 2) beeinflussen kann. Die GFP in das Plasmid ist ein zusätzlicher Vorteil, der die Lieferung und das Expressionsprofil von den Nanovector visualisieren kann, ohne Einbußen bei den Tieren.

Kurz, ein MiRNA-Schwamm besteht aus einer Reihe von MiRNA antisense Sequenzen nach ein Reportergen, dass wirkt wie ein Lockvogel MiRNA mRNA gezielt platziert. Natürlich wurden vorkommende MiRNA-Schwämme gefunden wie lange nicht-kodierende RNAs (LncRNAs)17endogen in Pflanzen und tierischen Zellen ausgedrückt werden. In der vorliegenden Studie haben wir einen Schwamm Ansatz für die ganze Familie von MiR-181 im Herzen zu hemmen genutzt. Obwohl der MiR-181-Schwamm-Ansatz eine physiologisch relevanten Methode, Downregulate die MiR-181-Familie in kultivierten Zellen besteht, kann eine in-Vivo -Anwendung von MiR-181-Schwämme nachteilig sein. Mehrere Studien haben zum Beispiel eine schützende Rolle des MiR-181a und MiR-181b in verschiedenen Zellgewebe Typen18,19,20gezeigt. Daher sollte der MiR-181-Schwamm Ausdruck speziell auf Herzgewebe ausgerichtet werden.

Kleinen Oligonukleotide haben nachgewiesen, dass um die MiRNA-Funktion durch Glühen, die Reife MiRNA Reiseführer Strang zu blockieren und zu verhindern, dass eine ordnungsgemäße Beladung in den RNA-induced silencing-Komplex (RISC). Ein Problem im Zusammenhang mit diesem Ansatz ist, dass Oligonukleotide in einer gesättigten Dosis ausreicht, um zelluläre Pools von Reifen MiRNAs blockieren geliefert werden. Oligonukleotide leiden auch Herausforderungen mit Transport durch Zellmembranen und eine allgemeine Stabilität des Moleküls. Genial, hat sich gezeigt, dass ein exogen zugeführten MiRNA-Ziel als Köder für seine Verwandten MiRNA21handeln kann. Aufgrund mehrerer Bindungsstellen, die zusammen in einer Pseudo 3' UTR angebunden konstruieren, der Lockvogel Ziel oder MiRNA-Schwamm, ist in der Lage zu stabil interagieren mit ihren Ziel-MiRNAs und sequester die MiRNA in Microribonucleoprotein komplexe (MiRNPs), so effektiv die MiRNA-Funktion zu verhindern. Der so genannte "MiRNA-Schwamm" ist eine wirksame Anti-Sense-Technologie, die können effizient Downregulate MiRNA in Vitro und in Vivo. Daher kann die Anwendung eines MiRNA-Schwamm verwendet werden, MiRNA Verlustfunktion-Phänotypen zu studieren.

Die Vorstellung, die RNA-Interferenz (RNAi) zu einer neuen Klasse von Therapeutika könnte erregte die Aufmerksamkeit von vielen Ermittler schon bald nach seiner Entdeckung. Dem Gebiet der angewandten RNAi-Therapeutika hat sehr schnell von Lab in Bett verschoben. Derzeit MiRNA Therapeutika gehört zu den schnell wachsenden therapeutischen Interventionen in der Onkologie und befindet sich derzeit in Phase 1 klinischen Studien. Antisense Oligonukleotide oder antagomire, sind eine der am weitesten verbreitete MiRNA hemmenden Ansätze. MA Et al. 22 genutzt MiR-10 b Antagomir, sowohl in Vitro und in Vivo, hochreguliert MiR-10 b in einer soliden Tumoren zum Schweigen zu bringen.

In Vivo, erfordert die effiziente Inaktivierung von hochreguliert MiRNAs eine chemische Modifikation der antagomire die Bindungsaffinität,-Kompatibilität und pharmakokinetischen Eigenschaften zu verbessern. Zur Erhöhung des Duplex Schmelztemperatur (Tm) und Verbesserung des Nuklease Widerstands der antagomire, können chemische Modifikationen wie 2′-O-Methyl (2′-O-Me), 2′-O-Methoxyethyl (2′-MOE) 2′-Fluor und die Nukleinsäure bicyclischen gesperrt (durchgeführt werden, LNA)23,24,25,26,27,28,29,30,31. Für einen besseren Wirkungsgrad der in Vivo -Lieferung der Antagomir durch die Phosphorothioat (PS)-Verbindungen, modifizierbar der Nuklease Widerstand28erhöht haben. Darüber hinaus erhöhen PS Rückgrat Modifikationen auch die Bindung an Plasmaproteine, die Verringerung der Ausscheidung. So zeigen PS geändert antagomire eine deutliche Verbesserung der pharmakokinetischen Eigenschaften, ihrer systemischen Lieferung32zu erleichtern. Es hat auch gezeigt, dass mit Peptid-Nukleinsäure (PNA) oder Morpholino Oligomere, entwickelt, um eine spezifische MiRNA Ziel lässt sich MiRNA Verlustfunktion-Phänotypen33,34,35, zu studieren 36 , 37 , 38 , 39. Polylysin konjugiert und Nanopartikel komplexiert PNA antagomire effizient hemmen die MiRNA funktionieren sowohl in Vitro und in Vivo36,37,38, 39. trotz der jüngsten Fortschritte, eine effektive und gewebespezifische Lieferung von MiRNA-Derivaten bleibt eine Herausforderung. Dazu gehören das Potenzial für Ziel-Effekte, angeborene Immunantwort auslösen und, am wichtigsten ist, eine bestimmte Lieferung in die Zellen gezielt Organe/Gewebe zu erhalten.

Darüber hinaus MiRNA Ausdruck unterschiedlich stark abhängig von der Zelle und Gewebe Typ40. Darüber hinaus kann der MiRNA-Ausdruck erhöht oder verringert in der Krankheit sein. Die Folge der veränderten MiRNA Ausdruck und die Wirkung auf Zell- und Gewebe-Funktion mit Schwamm gehemmt MiRNA Ausdruck muss validiert und empirisch ermittelt werden. Umfangreiche präklinische Untersuchungen in tierische Krankheitsmodelle sind erforderlich, um das optimale Niveau der Hemmung für ein bestimmtes MiRNA Ziel bestimmen.

Interessanterweise zeigt MiR - 181 c MiRNA subzelluläre Abschottung3,4,5. Wie erwartet, sind MiR-181s insbesondere im Zellkern codiert und transkribiert als Long-Pri-MiRNA Transkripte, die im Zytoplasma von Würfeln Maschinen verarbeitet und in RISC integriert. Jedoch anders als kanonische MiRNAs, die im Zytoplasma zu fungieren, translocates die ältere Form von MiR - 181 c in den Mitochondrien und Funktionen bei der Regulation des mitochondrialen-spezifischen Gene3. Wir haben gezeigt, dass die MiR-181-Schwamm Reifen Form von MiR - 181 c in den zytoplasmatischen Bruchteil binden kann und verhindert so die Translokation in die Mitochondrien. Infolgedessen kann eine Hochregulation der Mt-COX1 in den Mitochondrien unter den Bedingungen einer Herunterregulierung des MiR - 181 c Ausdrucks beobachtet werden.

Wir haben berichtet die Methodik MiRNA-Schwamm, knock down der Ausdruck jeder MiRNA entwerfen und skizziert ein Protokoll für die in-Vivo -Anwendung der MiRNA-Schwamm. Gewebespezifische MiRNA Hemmung ist derzeit eine unterentwickelte Technik im Feld MiRNA. Die Bedeutung der Downregulation oder funktionelle Hemmung der hochreguliert MiRNAs bei der menschlichen Krankheit deutet darauf hin, dass es möglich eventuell, MiRNA Biologie für eine therapeutische Intervention zu nutzen.

Diese Studie wurde eine Strategie zur Senkung eines MiRNA, die erfolgreich in ein Gewebe-spezifisch in Vivoeingesetzt werden können. Die MiRNA-Schwämme nutzen die antisense Reihenfolge der MiRNA "Samen" Sequenz. MiRNA-Schwämme können daher Downregulate aller MiRNAs, die die gleiche "seed" Sequenz, dh., die gesamte MiRNA-Familie. In dieser Studie haben wir eine bedeutende Herabregulation der gesamten Familie MiR-181 (MiR-181a, MiR 181b, MiR - 181c und MiR - 181d) mit dem Ausdruck der MiR-181-Schwamm, beobachtet in Vitro und in Vivo. Wenn ein Familienmitglied Schutz verleiht, während ein anderes Familienmitglied nachteilige Auswirkungen innerhalb der selben Organ hat, wäre mit der MiRNA-Schwamm-Technologie nicht der ideale Ansatz.

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Disclosures

Die Autoren haben nichts preisgeben.

Acknowledgments

Wir bedanken uns bei Anthony K. L. Leung von der Fakultät für Biochemie und Molekularbiologie, Bloomberg School of Public Health, Johns Hopkins University für seine technische Hilfe bei der Gestaltung der MiR-181-Schwamm-Konstrukt. Wir danken auch Polina Sysa-Shah und Kathleen Gabrielson der Abteilung Molekulare und vergleichende Pathobiologie, Johns Hopkins Medical Institutionen für ihre technische Unterstützung durch die in-Vivo Bildgebung der MiRNA-Schwamm-Lieferung.

Diese Arbeit wurde durch Zuschüsse aus dem NIH, HL39752 (zu Charles Steenbergen) und durch einen Wissenschaftler-Entwicklung-Zuschuss von der American Heart Association 14SDG18890049 (an Samarjit Das) unterstützt. Der Ratte Cardio-spezifischen Promoter wurde großzügig von Jeffery D. Molkentin am Cincinnati Children Hospital bereitgestellt.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
pEGFP-C1 vector Addgene 6084-1
In-fusion Clontech 121416
QIAprep Miniprep Qiagen 27104
QIAquick Gel Extraction Kit Qiagen 28704
miR-181-sponge synthesis Introgen GeneArt custome made
PCR primers Integrated DNA Technologies custome
EcoRI enzymes New Endland Biolabs R0101S
KpnI enzymes New Endland Biolabs R0142S
Rapid DNA Ligation Kit Sigma-Aldrich 11635379001
H9c2 cells ATCC CRL-1446
DMEM Media Thermo Fisher Scientific 11965092
Fetal Bovine Serum Thermo Fisher Scientific 10082139
Nucleofector 2b Device Lonza AAB-1001
Nucleofector Kits for H9c2 (2-1) Lonza VCA-1005
G418, Geneticin Thermo Fisher Scientific 11811023
FACSAria II Flow cytometer BD Bioscience 644832
Branson 450 sonifier Marshall Scientific EDP 100-214-239
The Xenogen IVIS Spectrum optical imaging device Caliper Life Sciences
Anti-MTCO1 antibody Abcam ab14705
α-tubulin antibody Abcam ab7291
Sequoia C256 ultrasound system Siemens

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References

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Biologie Ausgabe 136 MicroRNA MiRNA MiRNA-Schwamm MiRNA Hemmung Nanopartikel Nanovector MiR-181 Herz mitochondriale miRNA
<em>In Vivo</em> Nanovector Lieferung von einem Herz-spezifische MicroRNA-Schwamm
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Kent, O. A., Steenbergen, C., Das,… More

Kent, O. A., Steenbergen, C., Das, S. In Vivo Nanovector Delivery of a Heart-specific MicroRNA-sponge. J. Vis. Exp. (136), e57845, doi:10.3791/57845 (2018).

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