Summary
組織特異的マイクロ Rna 阻害は、マイクロ Rna において発展途上にある技術です。ここで、正常に心の底から筋細胞のマイクロ Rna ミール 181 家族を阻害するプロトコルについて述べる。Nanovector 技術を使用して、重要な生体内で心臓固有ミール 181 家族阻害を示しますスポンジ、マイクロ Rna を提供します。
Abstract
マイクロ Rna (miRNA) は小さい非コーディングの RNA 転写後のメッセンジャー RNA (mRNA) の発現を抑制します。がんや循環器病などのひと疾患は、組織および/または病気の進行に関連付けられているセル固有の miRNA の表現を有効に示されています。MiRNA の発現の阻害では、治療的介入の可能性を提供しています。ただし、antagomir オリゴヌクレオチドを用いた Mirna を抑制する従来のアプローチは、グローバル配信時に特定のマイクロ Rna の機能を影響します。ここで、ラットのモデル ミール 181 家族の生体内で心臓固有抑制のためのプロトコルを提案する.MiRNA スポンジ構造 10 繰り返しアンチ miR 181 バインド シーケンスを含むように設計されています。心臓固有 α-MHC プロモーターが心臓固有ミール 181 miRNA スポンジ式を運転する pEGFP のバックボーンに複製されます。安定したセルを作成するには、ミール-181-スポンジ、筋芽細胞 H9c2 細胞を表現するラインを発現する α-MHC-EGFP-miR-181-sponge コンストラクトと蛍光活性化セル ネオマイシンと培養される GFP 陽性 H9c2 細胞に (FACs) の並べ替え順(G418)。ネオマイシンの安定的な成長は、次モノクローナル細胞集団は追加 FACs と単一細胞のクローニングによって確立されます。結果筋 H9c2-ミール-181-スポンジ-GFP の細胞は、ミール-181 ターゲット蛋白質の発現増加を評価したミール 181 家族の機能の損失を展示し、スクランブル非機能的なスポンジを発現する H9c2 細胞と比較しています。さらに、正荷電リポソーム粒子と負荷電のミール-181-スポンジ プラスミドは錯形成によってミール-181-スポンジ構造の全身の配信のための nanovector を開発します。GFP のin vivoイメージングを 3 週間にわたって、nanovector の複数の尾静脈注射は心臓に固有の方法でミール 181 スポンジの重要な表現を促進することが明らかに。重要なは、腎臓や肝臓ではなく心臓の組織で、ミール 181 機能の損失が観察されます。MiRNA のスポンジは、組織固有の miRNA の発現を抑制する強力な方法です。組織固有のプロモーターからミルナ スポンジ式の運転 miRNA 阻害は、対象となる臓器や組織に限定することができますの特異性を提供します。さらに、nanovector や miRNA スポンジの技術を組み合わせることにより、効果的な配信と組織固有の miRNA 阻害体内。
Introduction
最後の 20 年間、人間の病気の miRNAs の重要な役割を指摘している数多くの研究がずっとあります。文献の大きいボディからの調査結果は、がん1および心血管疾患2,3,4,5などの疾患の病態において Mirna の紛れもない重要性を示しています。たとえば、ミール 21 は、増加細胞周期と細胞増殖6の結果、多くのがんで亢進です。C 型肝炎の感染症でミール 1227ウイルスの複製に重要な役割を果たしているし、ミール 122 の抑制が8ウイルス量を減少させることが示されています。心臓肥大のミール-212/132 は心で亢進、9病理学的表現型に関与します。誘導 miRNA の機能抑制または、ダウンレギュレーションの明白な重要性は、治療上ほとんどすべての病気の miRNA の生物学を悪用するための機会を示唆しています。
4 ミール 181 家族のメンバー、ミール-181a/b/c/d は、人間のゲノム ゲノム 3 つの場所にあります。非コーディングの RNA ホスト遺伝子 (MIR181A1 HG) のイントロン領域は、ミール-181-a/b - 1 クラスターをエンコードします。NR6A1 遺伝子のイントロン領域は、ミール-181-a/b-2 をエンコードします。ミール-181-c/d クラスターは染色体 19 の未同定トラン スクリプトにあります。ミール 181 家族のすべてのメンバーは同じ「シード」シーケンスを共有し、4 ミール 181 家族全員同じ mRNA ターゲットを調整できる可能性があります。
私たち3,4等10末期心不全中ミール 181 家族の重要性を強調しています。我々 はまた、ミール-181 c アップレギュレーションが II 型糖尿病など、心臓病のリスクの増加、肥満、加齢3,4、5と関連付けられる病理学の条件の下で発生することを認識しています。それは、過剰発現のミール-181 c が心臓機能障害4につながる酸化ストレスを引き起こすことが仮定されています。
いくつかのグループが、ミルナは、ミトコンドリア11,12,13,14, しかし、我々 はミール-181 c は処理、核ゲノムに由来を示すために最初に示唆しているとその後 RISC3内のミトコンドリアへの移行。さらに、ハート5のミトコンドリアのコンパートメントにミール 181a およびミール 181b 低発現が検出されました。重要なは、我々 を発見したミール-181 c mt COX1 mRNA の発現を抑制する実証 Mirna がミトコンドリア遺伝子に参加し、ミトコンドリアの機能3,4を変更することにより。
この資料では、心筋全体のミール 181 家族をノックダウンする miRNA スポンジを設計するために必要な方法論について説明します。さらに、我々 は、ミール-181-スポンジの生体内でのアプリケーションのためのプロトコルを概説します。
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Protocol
すべての実験手順は、機関動物ケアおよび使用委員会のジョンズ ・ ホプキンス大学によって承認されました。
1. スポンジ デザイン
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マイクロ Rna の 3' UTR のバインド
注: A miRNA 機能そのターゲット Mrna の 3' 非翻訳領域 (UTR) 部分的に補足のサイトと特定の基本ペアリング対話を通じて包括的なレビューを参照してくださいバーテル)15。- マイクロ Rna シーケンスに有意な相補性を含むオリゴヌクレオチドとして miRNA 発現の阻害剤を設計します。MiRNA の機能をブロックする広範な基礎に組み合わせるを介して複雑なオリゴヌクレオチドの miRNA を隔離します。
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MiRNA スポンジのデザイン
- デザインは録すアルゴノート 2 通常は切断位置に膨らみを含むように部分的に相補的なマイクロ Rna シーケンスを配列しました。バルジ大作戦は、RNA 干渉型胸の谷間とスポンジの劣化を防ぐために成熟 miRNA シーケンスの 9-12 のヌクレオチドに配置されます。
- 必要な場合は、ミール 181 家族全員にバインドするおとりターゲット シーケンスを設計します。ミール 181 家族 miRNA 配列の比較と考察、8 連続したヌクレオチドを含むバルジの 5' 側の一般的なシーケンスを見つけるまたは追加の 8 の膨らみの 3' 側に 4 ミール 181 家族全員に共通のシーケンスを見つける連続したヌクレオチド。これらの 2 つのシーケンスは、左と右の半結合部位をそれぞれ表しています。
注: おとりシーケンスは GGA スペーサーで区切られた左と右半結合部位のタンデム配列です。GGA スペーサー (1.2.1 の手順で説明) の miRNA を熱処理したときの膨らみを作成するように設計と 5' 終りシーケンスと (1.2.2 の手順で説明) 3' 側のシーケンスを一緒にリンクします。この 1 のマイクロ Rna 結合部位 10 を繰り返して最終的なミール スポンジ構造の x。
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他の miRNA スポンジに関する考慮事項
注: 受信者の発現ベクターにスポンジ シーケンスをクローンするのには制限ヌクレアーゼの認識部位がシーケンスの各端に含める必要があります。選択した制限酵素や下流のクローン作成アプリケーションで使用されるその他の制限の酵素によってスポンジの一連の非特異的胸の谷間を確認するインシリコ消化分析を使用ください。- ミール-181-スポンジ シーケンスがない強化された緑色蛍光タンパク質 (EGFP) のコーディング シーケンスの一部の合成 3' UTR、5' 端に二重停止コドン (TAA TAA) を追加します。
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スポンジ DNA のクローニングのための合成
- DNA のシンセサイザーを使用したり、クローン作成のための場所で制限ヌクレアーゼの認識サイトと最終 miRNA スポンジ シーケンスを合成する市販ソース。スポンジは、プラスミッド細菌増幅の選択可能なマーカーを含めることができますに出荷されます。さらに、スポンジをクローニングのためのポリメラーゼ連鎖反応 (PCR) による増幅または手順 1.3 で説明されている制限のサイトを使用してドナー ベクトルを単に削除できます (また、ステップ 3.1 を参照)。
2. クローンとして作る組織固有のプロモーターを含むように受信者のベクトル
注: 受信者のベクトルとして pEGFP C1 ベクトルを miRNA スポンジ式カセット用します。PEGFP C1 ベクトルには、サイトメガロ ウイルス (CMV) のプロモーターによって駆動される、EGFP のリーディング ・ フレームが含まれています。哺乳類細胞における CMV プロモーターは恒常活性です。組織固有のプロモーターは、必要がある場合、CMV プロモーターは (参照ステップ 2.1) 亜星と NheI の酵素の消化力によって削除できます。プラスミッドを含む大規模な多重クローニング サイト (MCS) カナマイシン (菅) および細菌の選択と哺乳類セルの安定した表現のためのネオマイシン (G418) マーカーだけでなく、それぞれ。
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PEGFP C1 からの CMV プロモーターの削除
- 使用制限の酵素の製造によって提案された市販ダイジェスト バッファー x 1 を含む消化反応の 50 μ L、5 μ g のプラスミド DNA を (水) に、亜星と NheI 酵素の 5 μ を作る。微量遠心チューブにすべてのコンポーネントを追加し、そっとそれをフリックでそれらをミックスします。スピン 10 チューブ下部に反応を収集するために遠心機の s。15 分の 37 ° C の水浴の反作用を孵化させなさい。
- 消化の線形プラスミッドを浄化します。反応量の列バインディング バッファー (適切な結合バッファー使用 DNA 精製カラムの製造のための独自のミックス) x 5 を追加し、前述の製造元によって DNA 精製カラムとの反応を浄化します。溶出バッファー (水) 列のセンターに慎重に追加の 25 μ L の溶出します。
- ゲルは次のように 0.5% の agarose のゲルの消化のプラスミドを浄化する: の読み込みバッファー (50% グリセロール-3 x のローディングの染料) の溶出のプラスミドを 5 μ L を追加。0.5% の agarose のゲルにも 1 に全体のサンプルをロードします。500 とは別の車線を含むノーカット ベクトルの ng。カットとカットされていないプラスミドの適切な分離を達成するまでは、30-40 分間実行します。
- 次のように線形プラスミッドの浄化: UV ライト ボックスに agarose のゲルの DNA を可視化します。きれいなかみそりの刃を持つ線形プラスミッドに対応するバンドを慎重に消費税します。
注: 線形プラスミッド ノーカット プラスミッドより低いを実行する必要があります、約 4.2 kb で単一バンドとして表示されます。摘出した CMV プロモーターは、約 500 ヌクレオチド (nt) で光の帯として表示されます。 - 市販のキットを使用してゲルのスライスから DNA を抽出し、水の 25 μ L を持つ列から DNA を溶出します。
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PEGFP C1 へ心臓特異プロモーターのクローニング
注: アルファ ・ ミオシン重鎖 (α-MHC) プロモーター以前特徴、次 Molkentin、ジョーブ、マーカム、16に従って心臓制限式の信頼性の高いレベルを直接に示した。クローニング用ベクターのプロモーターを増幅するには、次のセクションに説明します。- 最初の要素-2934 p40 プラスミド16に転写開始部位を基準に +420 α MHC プロモーターをクローン PCR のテンプレートとしてこの地域をクリックし、プラスミッドに逃げ、PCR のプライマーを設計します。PCR プライマー前述5を使用してプロモーター領域を増幅します。前方および逆引きの PCR のプライマーには、融合監督複製を許可する pEGFP C1 (ステップ 2.1) の消化の両端に重複のシーケンスが含まれています。融合のクローニングのためのプライマー デザインの包括的な説明のための融合マニュアルを参照してください。表1 のプライマー シーケンスがあります。
- 各プライマーと 10 の 1 μ M を含む 50 μ L PCR の反作用の準備テンプレート DNA の ng。PCR 酵素と選択した PCR 試薬の製造によって dNTPs の適切な量を追加します。標準的な DNA サイクリング ブロックで PCR を実行します。3 分 98 ° C 5、30、および 120 の変性、アニーリング、および拡張の 35 サイクルが続くステップの変化を実行 s 各、それぞれ。72 ° c. で 10 分の最終的な拡張子を含める
- PCR およびゲルの抽出をクリーンアップします。PCR のサイクルが完了したら、PCR の反作用に列結合バッファーの反応量 × 5 を追加し、前述のメーカーによって、DNA 精製カラムを浄化します。溶出バッファー (水) 列のセンターに慎重に追加の 25 μ L との混合物を溶出します。
- 読み込みバッファー [50% グリセロール (3 x) ローディングの染料] 溶出プラスミドを 5 μ L を追加します。1% アガロースゲル上も 1 に全体のサンプルをロードします。30-40 分; の実行します。視覚化し、(ステップ 2.1.5) 上記のように、PCR の製品を切除します。
- 次のように pEGFP C1 と α-MHC プロモーターを縛る: 市販結紮バッファー、精製 PCR の 2 μ L と一直線に並べられたベクトルの 1 μ L × 1 を含む 10 μ L の ligation の反作用を追加。15 分間 50 ° C で結紮を行い、氷で冷却します。
- 細菌の変換を次のように実行: コンポーネントを追加することで融合の結紮ミックスの 2.5 μ L の有能なセルの 50 μ L を transfect。残り、エッペン チューブ 40 s、およびその後の場所の 42 ° C の水お風呂に入れて、20 分間氷の上を 2 分間氷の上チューブ。
- 次の変換、350 μ L の SOC のメディアを追加し、コロニー PCR α MHC プロモーター結紮を含んだ菅耐性細胞を識別するために菅を実行と LB プレートに伸長ソリューションの 45 分プレート 200 μ L の 37 ° C で細胞を成長します。
注: スクリーニング プライマー PCR に結紮ジャンクション間で設計されました。
- 次の変換、350 μ L の SOC のメディアを追加し、コロニー PCR α MHC プロモーター結紮を含んだ菅耐性細胞を識別するために菅を実行と LB プレートに伸長ソリューションの 45 分プレート 200 μ L の 37 ° C で細胞を成長します。
- LB 菅スープとプラスミド精製メーカーの使用説明、標準的な小型準備プラスミッドの浄化のプロトコルを使用して PCR の肯定的なクローンを展開します。
3. スポンジのクローニング
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受信者のベクトルをダイジェストします。
- EcoRI と KpnI、クローニングのため線形 α MHC pEGFP プラスミドを作成し、(手順 2.1) 上記のようにゲルを浄化します。
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PCR 増幅、DNA スポンジを消化
- PCR のテンプレートとしてベクトルを配送ミール-181-スポンジと対応する 284 nt 長スクランブルを使用します。前述の PCR プライマー5を使用してスポンジの地域を増幅します。前方および逆引きの PCR プライマーを含む α MHC pEGFP C1 に結紮を許可する制限酵素のシーケンスに注意してください。(ステップ 2.2.2) 上記のように、PCR を実行します。(ステップ 2.2.3) を説明し、それらを消化するため水で溶出として消化前に PCR の製品を浄化します。プライマー シーケンスを参照してください表 1.
- 結紮用スポンジ DNA を消化します。50 μ L 消化反応には、ダイジェスト バッファー、3.2.1 のステップからゲル精製 PCR 反応および酵素 EcoRI と KpnI の 5 μ L × 1 が含まれています。微量遠心チューブにすべてのコンポーネントを追加し、そっとそれをフリックでそれらをミックスします。スピン 10 チューブ下部に反応を収集するために遠心機の s。15 分の 37 ° C の水浴の反作用を孵化させなさい。
- 消化 PCR スポンジ前述 PCR クリーンアップ列を使用して (手順 2.2.1) を浄化します。
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Α MHC pEGFP C1 ベクトルにミール 181 スポンジを縛る
- 1 x 結紮バッファーを含む 21 μ L の ligation の反作用を設定、3 μ L の消化し、ミール-181-スポンジ PCR、α MHC pEGFP C1 の一直線に並べられたベクトルの 1 μ L、1 x DNA バッファー、および DNA のリガーゼの 1 μ L を精製します。5 分間室温で結紮を行い、氷の上に置きます。
- 結紮ミックスの 2 μ L の XL1 青有能なセルの 50 μ L を変換します。変換とめっきのプロトコル (手順 2.2.5) を上記のように使用します。コロニー PCR α-MHC-pEGFP-miR-181-sponge 順序を含んでいる菅耐性菌を識別するを実行します。結紮接合を横切るスクリーニング PCR プライマーを設計します。プライマー シーケンスの表 1を参照してください。
- ベクトル シーケンスを増幅します。PCR 陽性クローン LB 菅スープと標準的な小型準備プラスミッドの浄化のプロトコルを使用して精製プラスミドを展開します。目的 dna の発現プラスミドを確認する DNA シーケンスを実行します。
4. 安定した H9c2 ミール-181-スポンジ発現細胞の生成
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H9c2 細胞の成長と維持
- 文化、H9c2 細胞にダルベッコ変更されたワシの媒体 (DMEM) に最終濃度 10% ウシ胎児血清 (FBS) を含みます。サブ標準プロトコルを使用して細胞の培養、5% 炭酸ガスの 37 ° C でそれらを育てます。
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トランスフェクションと H9c2 細胞を表現する α-MHC-pEGFP-C1-miR-181-sponge の選択
- 最高の結果を得るのための H9c2 細胞のエレクトロポレーションを実行します。スクランブル スポンジ (ミール-181-スポンジ-シーケンスに代わる 284 nt 長スクランブル手順) や、遺伝子導入装置と α-MHC-pEGFP-miR-181-sponge の構造とラット筋芽細胞 (H9c2) を transfect します。
- 4 x 10-5 2 μ g (H2O の 5 μ L) のプラスミッド DNA の細胞を簡単に言えば、transfect とエレクトロポレーションのデバイスと互換性のあるソリューションを 100 μ l 添加します。H9c2 細胞を使って DS 120 のエレクトロポレーション プログラムを使用します。
- 室温で 10 分間のキュベットに transfected セルを孵化させなさい。キュベットに直接 DMEM の 500 μ L を追加します。優しく 6 ウェル プレートのウェルに合計キュベット コンテンツを転送します。
- GFP 陽性細胞の FACs による 48 時間後トランスフェクション後を選択します。ネオマイシン (G418) 添加 6 ウェル プレートに GFP 発現細胞だけを板 (400 ng/mL) 完全な成長媒体に。
注: G418 選択前に殺すカーブが選択に必要なネオマイシンの量を決定する確立されます。H9c2 細胞に終わって G418 の 400 ng/mL、非プラスミドの約 80% 死亡率 24 h 後 H9c2 細胞をトランスフェクションし、これらの細胞の G418 の望ましい作業集中とみなされていた。成長 G418 で 16 日間維持した後、安定した細胞と考えられました。 - スポンジの肯定的な選択のマーカーとして GFP 発現を用いた G418 安定細胞の FACs の並べ替えを実行します。流れを並べ替えることにより 96 ウェル プレートの各ウェルに 5-10 セルをシードします。いくつかの通路の上 24 ウェル プレートに 96 ウェル プレートからモノクローナル細胞を展開します。使用冷凍庫株からの細胞の後の実験のための出発点として 3 (P3) 細胞を通路します。
- P5 と P10 の間低通過細胞すべての細胞ベース ライン実験を実行します。
- 最高の結果を得るのための H9c2 細胞のエレクトロポレーションを実行します。スクランブル スポンジ (ミール-181-スポンジ-シーケンスに代わる 284 nt 長スクランブル手順) や、遺伝子導入装置と α-MHC-pEGFP-miR-181-sponge の構造とラット筋芽細胞 (H9c2) を transfect します。
5. 合成・精製のスポンジ-ナノ粒子 (ミール-181-スポンジ ナノ粒子)
- 溶解陽イオン性両親媒性分子 (DOTAP) と共同の脂質、コレステロール、DSPE-ペグ-青梅 5:5:0.1 mM 比でそれぞれ、クロロホルムとガラス瓶のメタノールの混合物で、リポソームの粒子を準備します。
- 水分を含まない窒素の穏やかな流れが続くロータリーエバポレーターを使用して真空下で 44 から 45 ° c、有機溶媒を除去します。8 h の高真空下で乾燥脂質膜の残りを保ちます。
- 混合物を準備するには、真空乾燥の脂質膜に 5% ブドウ糖を追加します。一晩を残して映画を水和物にこの混合物を許可します。渦 45 ° C の水浴中時折揺れで多重層膜ベシクルを生成するために室温で 2 〜 3 分のバイアル。
- 3 〜 4 分明快さを観察することができますまで、100% のデューティ サイクルで 25 W 出力電力氷浴で小さなベシクルを準備する、多重層膜ベシクルを超音波照射します。
- ミックス スクランブル手順またはミール-181-スポンジ シーケンス pEGFP(α-MHC) ベクトルと nanovector4を形成する 1:3 電荷比ベースでのリポソームにクローンを作成します。
注: 荷電リポソーム型ナノ粒子と負荷電プラスミド DNA の静電コンプレックスは、nanovector と呼ばれます。
6. 全身配信スポンジ ナノ粒子の生体内での効果の検証
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ラットにおけるナノ粒子のスポンジの全身配信
- Sprague-dawley (SD) ラットを使用します。ミール-181-スポンジ nanovector または尾静脈スクランブル nanovector ラットを静脈内注入します。本体重量約 200 g は、SD 雄ラットを使用します。
- Nanovector/kg 体重の 4 mg の線量を使用して尾静脈注射を行い、2 週間以上 6 尾静脈注射療法を使用してこの手順を繰り返します。繰り返し nanovector 配信次ベクトルの vivoの式の 1 週間の期間 (日 15-21) を許可します。
- Nanovector 配信中に、前後に gfp をイメージングして最適化を確認します。半定量的なデータを生成する断層のイメージング ソフトウェアによって GFP 信号を分析します。
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ミール 181 スポンジで生体内でミール 181 抑制の検証
- 機能的なミール-181-スポンジの中心のティッシュの式を示すために西部のしみを実行します。
注: この研究のため mt COX1 式を検討しました。
- 機能的なミール-181-スポンジの中心のティッシュの式を示すために西部のしみを実行します。
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中心部に生体内でミール-181-スポンジ式の機能的な結果
- 中や心機能と形態学的変化を分析する nanovector 配布後、二次元、M モード、およびドップラー心エコー検査を実行します。齧歯動物の心のより良いスキャン容量は、15 MHz のリニアアレイ探触子を搭載した超音波システムを使用します。
- 心収縮力に影響を及ぼすかもしれない麻酔したがって、エコー処理中に意識されず任意の麻酔剤を動物にミール-181-スポンジ nanovector またはスクランブル nanovector の配信を実行します。Das を参照してくださいら。4さらに明確化のため。
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Representative Results
固定して transfected pEGFP-ミール-181-スポンジ-表現 H9c2 細胞 (4.2 の手順) から、全体のミール 181 家族 (ミール 181a、ミール 181b、ミール-181 c、およびミール-181 d) の式は pEGFP スクランブル表現 H9c2 細胞を基準にして緩やかな減少しました。ミール 181 家族の競争力阻害剤としてミール-181-スポンジがあり、我々 が予想する式のミール-181 c ミトコンドリア遺伝子をターゲットと、mt COX1 を増加させます。西部のしみが示唆された mt COX1 式が pEGFP スクランブル表現 H9c2 細胞に比較して pEGFP-ミール-181-スポンジ-発現 H9c2 細胞で増加しました。さらに、mt COX2 の mt COX3 式変更には pEGFP-ミール-181-スポンジ-発現 H9c2 細胞に検出されたを介してイムノブロットはありませんでした。Α-チューブリンは、イムノブロット解析の正規化コントロールとして使用しました。GFP シグナル主に認められた肝臓と腎臓をミール スポンジ nanovector (図 1 a) の 2 週間後に全身性配信する.ただし、GFP 発現有意に心臓組織のミール-181-スポンジ nanovector 配信 (図 1 aと1 b) の 3 週間後。注記のうち、全身出産後 3 週間いくつかの動物の肝臓の組織で検出された GFP シグナルがあったただし、その時点で肝臓のミール-181-スポンジの機能効果はありませんでした。
西部のしみは、スクランブル nanovector グループ (図 2) と比較してミール-181-スポンジ nanovector 投与ラットにおける mt COX1 式の大幅な増加を示した。高い mt COX1 ミール-181-スポンジ nanovector 配信の 3 週間後中心部に低いミール-181 c 式は mt COX1 は直接ターゲットのミール-181 c を示唆しています。我々 は、immunoblots に正規化コントロールとして α-チューブリンを使用しました。
心エコーは変化を認めなかったミール-181-スポンジ nanovector 投与ラットの心機能のおよび動物のスクランブル nanovector グループと比較して、治療計画の終わりに。
図 1.生体内でミール 181 スポンジの nanovector 配信の解析。(A) このパネルは尾静脈 6 静脈内注射で最適化された 3 週間の治療プロトコルを示しています。落射蛍光画像で黄色の色づけは、pEGFP ベクトルの表現を示します。黄色の色づけの最大輝度が 3 時間ポイント週に観察されます。PEGFP ベクトル (B) α-MHC プロモーターは選択的に 21 日目のミール 181 スポンジまたは中心部にスクランブルのシーケンスを表します。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 2。ミール-181-スポンジ nanovector のミール-181 c 式に及ぼす影響の検証します。これは pEGFP スクランブルと pEGFP-ミール-181-スポンジ nanovector 投与ラットから得られる心の lysates の mt COX1 式の西部のしみの分析です。全体心臓ホモジネートは示された抗体をプローブしました。ローディング コントロールとして α-チューブリンを使いました。バンド密度測定は、下のバー グラフで表示されます。学生のt-テストを行ったと標準誤差は誤差範囲としてバー グラフにプロットしました。p < 0.05対pEGFP スクランブル グループ。n = 4。
| プライマー名 | シーケンス | TM | ノート | 使用 | ターゲット | |
| SAM3 1F | ATGCATTAGTTATTAATGCTT GACACACTTGACAATTTCT |
58.4 | ラット MHC プロモーター EGFP にクローンを作成するには | PCR | MHC プロモーター | |
| SAM3-2R | GACCGGTAGCGCTAGCTG ACTCACTGGGAGATTGCTT |
59.8 | ラット MHC プロモーター EGFP にクローンを作成するには | PCR | MHC プロモーター | |
| SAM3 3F | CGAACGACCTACACCGAACT | 64 | 画面 EGFP F | コロニー PCR | 肯定的なプロモーターのクローン | |
| SAM3 4R | CGCTAGTCCTTGACCCTCTG | 63.9 | 画面 MHC-R | コロニー PCR | 肯定的なプロモーターのクローン | |
| SAM5 1F | CCTGTCTCCAACACACAAGC | 59.3 | シーケンス MHC プロモーター | シーケンス | MHC プロモーター | |
| SAM5-2R | CAGACTGCAGGGCTGGTT | 60 | シーケンス MHC プロモーター | シーケンス | MHC プロモーター | |
表 1。プライマー シーケンス。
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Discussion
この記事は設計および miRNA スポンジの合成を説明し、どのようにスポンジの組織特異的発現は組織特異 miRNA 家族式を抑制する強力なツール。
我々 は心臓におけるプロモーターと発現プラスミドにスポンジをターゲット ミール 181 家族で複製することができますを示しています。配信の nanovector 粒子にプラスミッドを効率的にパッケージできる両方体外と体内それぞれエレクトロポレーションまたは尾静脈注射を使用して (図 1)。ミール 181 スポンジ ミール 181 家族の心臓特異発現を抑制することができ、ミール 181 標的遺伝子 (図 2) の発現に影響を与えることができます。プラスミッドの GFP は、動物を犠牲にすることがなく配信し、nanovector の発現を可視化できる利点です。
簡単に言えば、miRNA スポンジは、レポーターの遺伝子 mRNA をおとりの miRNA の役目にターゲットの後に配置マイクロ Rna アンチセンスのシリーズで構成されます。自然発生する miRNA スポンジは、長い非コード Rna (lncRNAs)17として植物と動物の細胞における内生的表現に発見されています。本研究では心臓全体のミール 181 家族を阻害するスポンジのアプローチを活用しています。ミール-181-スポンジのアプローチは、レセプター細胞ミール 181 家族に生理学的に関連するメソッドは、ミール-181-スポンジの生体内でアプリケーションが有害なことができます。たとえば、いくつかの研究は、ミール 181a と異なる細胞・組織の種類18,19,20のミール 181b の保護役割を実証しています。したがって、具体的には心臓組織ミール-181-スポンジ式の対象なります。
小さなオリゴヌクレオチドにより成熟 miRNA ガイドの繊維に miRNA の機能をブロックする実証されている RNA によるサイレンシング複合体 (RISC) に適切なロードを防ぐ.このアプローチに関連付けられている問題は、オリゴヌクレオチドが成熟 Mirna の細胞プールをブロックするのに十分な飽和量に配信されることです。オリゴヌクレオチドはまた細胞膜分子の一般的な安定性、輸送を含んでいる挑戦に苦しみます。巧みに, その同種の miRNA21のおとりとして外指定された miRNA ターゲット使用できることが示されています。擬似 3' UTR に一緒につなぎ縄でつながれた複数の結合部位のおかげで構築、おとりのターゲット、または、miRNA スポンジは安定してそのターゲット Mirna と対話し、こうして効果的に microribonucleoprotein の複合体 (miRNPs) に、miRNA を隔離することができます。miRNA の機能を防止します。いわゆる「miRNA スポンジ」は効果的な対策をした意味技術、効率的にできるレセプター miRNAの in vitroとin vivoの両方。したがって、miRNA の機能喪失の表現型を勉強する miRNA スポンジのアプリケーションを使用できます。
RNA 干渉 (RNAi) が治療の新しいクラスにつながる可能性があるという概念は、その発見後すぐに多くの研究者の注目を集めた。RNAi 治療薬の応用分野は、ラボから枕元に非常に迅速に移動しました。現在、miRNA の治療は腫瘍の急成長している治療の一つで、1 臨床試験段階に現在あります。アンチセンス オリゴヌクレオチド、または antagomirs は、最も広く使用されている miRNA の抑制方法の一つです。Maら22使用ミール-10b antagomir 両方体外および体内誘導ミール-10b 固形癌を黙らせる。
生体内で誘導の miRNAs の効率的なサイレンシング結合親和性、biostability、および薬物動態学的特性を改善するために antagomirs の化学修飾が必要です。溶融温度 (Tm) 二重を高め、antagomirs のヌクレアーゼ耐性を向上させる、化学修飾、実行できます (2 '-O-私) 2 ′ O メチル、2'-O-メトキシエチル (2 '-萌え) 2'-フルオロ、二環式ロックされた核酸 (などLNA)23,24,25,26,27,28,29,30,31。生体内で配信の効率を高めるため、antagomir はヌクレアーゼ抵抗28が増えたホスホロチオエート (PS) の連携によって変更できます。さらに、PS バックボーン変更は、血漿蛋白の尿中排泄量を削減へのバインディングをまた高めます。したがって、PS 変更 antagomirs は、全身配信32を促進する、薬物動態的特性の大幅な改善を示します。また、miRNA の機能喪失の表現型33,34,35,を勉強するペプチド核酸 (PNA) または特定のマイクロ Rna をターゲットに設計された morpholino オリゴマーを使用することができます使用する示されています。36,37,38,39. ポリリジン共役とナノ粒子複合体の PNA antagomirs 抑制 miRNAの in vitroとin vivo36,37,38,の機能39. マイクロ Rna 誘導体の効果的なおよび組織固有配信最近の進歩にもかかわらず課題のまま。オフターゲット効果、自然免疫応答をトリガーし、最も重要なは、対象となる臓器・組織の細胞に特定の配信を取得する可能性が挙げられます。
さらに、miRNA 発現レベルはセルによって大きく異なり、組織は、40を入力します。さらに、miRNA 発現を増加または病気で低下できます。変更された miRNA 発現とスポンジ抑制 miRNA 発現と細胞およびティッシュの機能に及ぼす影響の結果は、検証および経験的に決定する必要があります。病態モデル動物の大規模な臨床研究が指定した miRNA ターゲット阻害活性の最適レベルを決定する必要です。
興味深いことに、ミール-181 c マイクロ Rna は細胞内区画3,4,5を展示します。具体的には、予想通り、ミール 181s は核でエンコードされ、ダイシング機械によって細胞質で処理され、RISC に組み込まれているロング-pri-マイクロ Rna 転写と転写されます。ただし、正規の miRNAs 細胞質で機能するとは違って成熟したフォームのミール-181 c はミトコンドリアとミトコンドリア特異遺伝子3の調節機能に移行します。このようにミトコンドリアへの転流を防止するミール 181 スポンジが細胞質分画中のミール-181 c の成熟のフォームをバインドできますを確認しました。その結果、mt COX1 のアップレギュレーションは、ミール-181 c 発現のダウンレギュレーションの条件の下でミトコンドリアの観察できます。
任意の miRNA の発現をノックダウンする miRNA スポンジを設計するために必要な方法論を報告し、miRNA スポンジの生体内でのアプリケーションのためのプロトコルを説明しました。組織固有の miRNA 阻害は、現在 miRNA フィールドで低開発の手法です。ダウンレギュレーションの重要性や人間の病気で誘導 Mirna の機能阻害は、治療的介入のための miRNA の生物学を悪用することがあることを示唆しています。
本研究では、組織に固有の方法で生体内で正常に使用できますの miRNA を下げるための戦略を強調表示されます。MiRNA スポンジは、miRNA「シード」シーケンスのアンチセンス シーケンスを利用します。したがって、miRNA スポンジがレセプターすべて同じを共有する Mirna の「シード」シーケンス、すなわち、全体の miRNA 家族。本研究で我々 は、ミール-181-スポンジの式全体のミール 181 家族 (ミール 181a、ミール 181b、ミール-181 c、およびミール-181 d) の重要なダウンレギュレーションを観察しているの in vitroとin vivoの両方。1 つの家族は、別の家族に同じ臓器内の有害な影響があるときに保護を与える、miRNA スポンジの技術を使用していないできれば理想的なアプローチ。
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Disclosures
著者が明らかに何もありません。
Acknowledgments
我々 は生化学と分子生物学のアンソニー K. L. レオンに感謝、ブルームバーグ公衆衛生大学院、ジョンズ ・ ホプキンス大学彼の技術のためにミール-181-スポンジ構造の設計に役立ちます。我々 はまた、ポリーナ Sysa シャーと専攻、比較病理学、miRNA スポンジ配信の生体内イメージングによる彼らのテクニカル サポートにジョンズ ・ ホプキンス医療機関のキャスリーン ・ Gabrielson に感謝します。
この仕事はだった (チャールズ Steenbergen) に HL39752、NIH からの補助金によって (Samarjit Das) に米国心臓協会 14SDG18890049 から科学者の開発助成金でサポートされています。ラット心臓固有のプロモーターは、シンシナティ小児病院のジェフリー D. Molkentin によって提供された寛大。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| pEGFP-C1 vector | Addgene | 6084-1 | |
| In-fusion | Clontech | 121416 | |
| QIAprep Miniprep | Qiagen | 27104 | |
| QIAquick Gel Extraction Kit | Qiagen | 28704 | |
| miR-181-sponge synthesis | Introgen GeneArt | custome made | |
| PCR primers | Integrated DNA Technologies | custome | |
| EcoRI enzymes | New Endland Biolabs | R0101S | |
| KpnI enzymes | New Endland Biolabs | R0142S | |
| Rapid DNA Ligation Kit | Sigma-Aldrich | 11635379001 | |
| H9c2 cells | ATCC | CRL-1446 | |
| DMEM Media | Thermo Fisher Scientific | 11965092 | |
| Fetal Bovine Serum | Thermo Fisher Scientific | 10082139 | |
| Nucleofector 2b Device | Lonza | AAB-1001 | |
| Nucleofector Kits for H9c2 (2-1) | Lonza | VCA-1005 | |
| G418, Geneticin | Thermo Fisher Scientific | 11811023 | |
| FACSAria II Flow cytometer | BD Bioscience | 644832 | |
| Branson 450 sonifier | Marshall Scientific | EDP 100-214-239 | |
| The Xenogen IVIS Spectrum optical imaging device | Caliper Life Sciences | ||
| Anti-MTCO1 antibody | Abcam | ab14705 | |
| α-tubulin antibody | Abcam | ab7291 | |
| Sequoia C256 ultrasound system | Siemens |
References
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