Weefsel-specifieke microRNA remming is een technologie die in het veld microRNA onderontwikkeld is. Hierin beschrijven we een protocol om met succes het remmen van de familie van de miR-181 microRNA in myoblast cellen uit het hart. Nanovector technologie wordt gebruikt voor het leveren van een microRNA spons die significante in vivo cardio-specifieke miR-181 familie remming toont.
MicroRNA (miRNA) is klein niet-coderende RNA die post-transcriptional boodschapper-RNA (mRNA) expressie remt. Menselijke ziekten, zoals kanker en hart-en vaatziekten, hebben aangetoond dat het activeren van weefsel en/of cel-specifieke miRNA expressie die is gekoppeld met de progressie van de ziekte. De remming van miRNA meningsuiting biedt de mogelijkheid voor een therapeutische interventie. Traditionele benaderingen voor de remming van miRNAs, dienst antagomir oligonucleotides, beïnvloeden echter specifieke miRNA functies op wereldwijde levering. Hierin presenteren wij een protocol voor de in vivo cardio-specifieke remming van de miR-181-familie in een rat-model. Een miRNA-spons construct is ontworpen om 10 herhaalde anti-miR-181 bindende sequenties. De cardio-specifieke α-MHC promotor wordt gekloond in de ruggengraat van de pEGFP om te rijden de cardio-specifieke miR-181 miRNA-spons-expressie. Als u wilt maken van een stabiele cel zijn lijn uitdrukken van de miR-181-spons, myoblast H9c2 cellen transfected met de α-MHC-EGFP-miR-181-sponge constructie en gesorteerd door fluorescentie-activated cell sorting (FACs) in GFP positieve H9c2 cellen, die worden gekweekt met Neomycine (G418). Naar aanleiding van stabiele groei in neomycine, zijn monoclonal cel populaties opgericht door extra FACs en eencellige klonen. De resulterende myoblast H9c2-miR-181-spons-GFP cellen vertonen een verlies van functie van miR-181 familieleden zoals beoordeeld door de verhoogde expressie van miR-181 doel eiwitten en vergeleken met H9c2 cellen, uiting geven aan een niet-functionele spons scramble. Bovendien ontwikkelen wij een nanovector voor de systemische levering van de miR-181-spons constructie door complexvormers positief geladen Liposomale nanodeeltjes en negatief geladen miR-181-spons plasmiden. In vivo imaging van GFP blijkt dat meerdere staart ader injecties van een nanovector een drie weken durende periode kunnen bevorderen een belangrijke uiting van de miR-181-spons op een cardio-specifieke wijze. Nog belangrijker is, wordt een verlies van miR-181 functie waargenomen in het hartweefsel maar niet in de nieren of de lever. De miRNA-spons is een krachtige methode voor de remming van weefsel-specifieke miRNA expressie. Rijden de miRNA-spons expressie van een weefsel-specifieke promotor biedt specificiteit voor de remming van de miRNA, die kan worden beperkt tot een gerichte orgaan of weefsel. Bovendien maakt combineren nanovector en miRNA-spons technologieën een effectieve levering en weefsel-specifieke miRNA remming in vivo.
In de afgelopen twee decennia, zijn er tal van studies die hebben gewezen op de belangrijke rol van miRNAs in ziekten bij de mens. Bevindingen van een grote hoeveelheid literatuur tonen het onmiskenbare belang van miRNAs in de pathofysiologie van ziekten, zoals kanker1 en hart-en vaatziekten2,,3,,4,5. MiR-21 is bijvoorbeeld upregulated in vele vormen van kanker, wat resulteert in een verhoogde celcyclus en cel proliferatie6. MiR-122 speelt een belangrijke rol in de replicatie van het virus7in hepatitis-C-infecties, en het heeft aangetoond dat de remming van de miR-122 de virale lading-8 vermindert. In de hypertrofie van het hart, miR-212/132 is upregulated in het hart en is betrokken bij de pathologisch fenotype9. Het voor de hand liggende belang van de Downregulatie of functionele remming van een upregulated miRNA suggereert kansen voor de therapeutische exploitatie de miRNA biologie in bijna alle ziekten.
De vier miR-181 familieleden, miR-181 a/b/c/d, zijn te vinden in drie genomic locaties in het menselijk genoom. De intronic regio van een niet-coderende RNA host gen (MIR181A1-HG) codeert het cluster van miR-181-a/b-1. De intronic regio van het NR6A1-gen codeert de miR-181-a/b-2. De miR-181-c/d-cluster bevindt zich in een genfunctieonderzoek transcript op chromosoom 19. Alle de miR-181 familieleden delen dezelfde “zaad” volgorde en alle vier miR-181 familieleden mogelijk dezelfde mRNA doelstellingen kunnen regelen.
Wij3,–4 en anderen10 hebben gewezen op het belang van de leden van de familie van de miR-181 tijdens de einde-fase hartfalen. Wij hebben ook erkend dat een miR – 181c opregulatie onder pathologische voorwaarden in verband met een verhoogd risico op hart-en vaatziekten, zoals type II diabetes, zwaarlijvigheid en veroudering3,4,5 optreedt. Het heeft zijn gepostuleerd dat de overexpressie van miR – 181c veroorzaakt oxidatieve stress die tot een cardiale dysfunctie4 leidt.
Verschillende groepen hebben gesuggereerd dat de miRNA bestaan in mitochondriën11,12,13,14, maar wij de eersten om aan te tonen dat miR – 181 c is afgeleid van het nucleair genoom waren, verwerkt, en vervolgens translocated naar de mitochondriën in de RISC-3. We hebben bovendien een lage uitdrukking van miR-181 a en miR-181b gedetecteerd in de mitochondriale compartiment van de hart-5. Nog belangrijker is, hebben we gevonden dat miR – 181c onderdrukt de mt-COX1 mRNA uitdrukking, aldus aan te tonen dat miRNAs deelnemen aan de mitochondriale genregulatie en veranderen van mitochondriale functie3,4.
Dit artikel bespreekt de methodologie moet ontwerpen een miRNA-spons voor het hele gezin van de miR-181 in cardiomyocytes neerhalen. Anderzijds schetsen we een protocol voor de in vivo toepassing van de miR-181-spons.
In dit artikel beschreven van het ontwerp en de synthese van een miRNA-spons en aangetoond hoe de weefsel-specifieke expressie van de spons is een krachtig hulpmiddel voor de remming van weefsel-specifieke miRNA familie expressie.
We hebben aangetoond dat een familie van de miR-181 gericht op de spons in een plasmide expressie kan worden gekloond met een cardiale-specifieke promotor. Het plasmide efficiënt kan worden verpakt in een deeltje van de nanovector voor levering zowel in vitro</e…
The authors have nothing to disclose.
We bedanken Anthony K. L. Leung van het departement van biochemie en moleculaire biologie, Bloomberg School of Public Health, Johns Hopkins University voor zijn technisch helpen met het ontwerpen van de miR-181-spons-constructie. Wij danken ook Polina Sysa-Shah en Kathleen Gabrielson van de afdeling van moleculaire en vergelijkende Pathobiology, Johns Hopkins Medical instellingen voor hun technische bijstand door de in vivo imaging van de miRNA-spons levering.
Dit werk werd gesteund door subsidies van de NIH, HL39752 (naar Charles Steenbergen) en door een subsidie van de wetenschapper-ontwikkeling van de American Heart Association 14SDG18890049 (aan de Samarjit Das). De rat cardio-specifieke promotor was gulle wijze aangeboden door Jeffery D. Molkentin in het kinderziekenhuis van Cincinnati.
pEGFP-C1 vector | Addgene | 6084-1 | |
In-fusion | Clontech | 121416 | |
QIAprep Miniprep | Qiagen | 27104 | |
QIAquick Gel Extraction Kit | Qiagen | 28704 | |
miR-181-sponge synthesis | Introgen GeneArt | custome made | |
PCR primers | Integrated DNA Technologies | custome | |
EcoRI enzymes | New Endland Biolabs | R0101S | |
KpnI enzymes | New Endland Biolabs | R0142S | |
Rapid DNA Ligation Kit | Sigma-Aldrich | 11635379001 | |
H9c2 cells | ATCC | CRL-1446 | |
DMEM Media | Thermo Fisher Scientific | 11965092 | |
Fetal Bovine Serum | Thermo Fisher Scientific | 10082139 | |
Nucleofector 2b Device | Lonza | AAB-1001 | |
Nucleofector Kits for H9c2 (2-1) | Lonza | VCA-1005 | |
G418, Geneticin | Thermo Fisher Scientific | 11811023 | |
FACSAria II Flow cytometer | BD Bioscience | 644832 | |
Branson 450 sonifier | Marshall Scientific | EDP 100-214-239 | |
The Xenogen IVIS Spectrum optical imaging device | Caliper Life Sciences | ||
Anti-MTCO1 antibody | Abcam | ab14705 | |
α-tubulin antibody | Abcam | ab7291 | |
Sequoia C256 ultrasound system | Siemens |