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Biology

En Vivo Nanovector entrega de una esponja de microARN específicos de corazón

Published: June 15, 2018 doi: 10.3791/57845
Automatic Translation
1, 2, 2
1Princess Margaret Cancer Centre, University of Toronto, 2Department of Pathology, Department of Cardiology, Johns Hopkins University

Summary

Inhibición de tejidos específicos microRNA es una tecnología que está poco desarrollada en el campo de microARN. Adjunto, describimos un protocolo para inhibir con éxito la familia de microRNA miR-181 en mioblastos células del corazón. Nanovector tecnología se utiliza para entregar un microRNA esponja que demuestra importantes en vivo cardio-específica miR-181 familia inhibición.

Abstract

MicroRNA (miRNA) es pequeño no codificante del RNA que inhibe la expresión postranscripcional ARN mensajero (ARNm). Enfermedades humanas, como el cáncer y las enfermedades cardiovasculares, se han demostrado para activar el tejido o célula-específica miRNA expresión asociada a progresión de la enfermedad. La inhibición de expresión de miRNA ofrece la posibilidad de una intervención terapéutica. Sin embargo, los enfoques tradicionales para inhibir miRNAs, empleando oligonucleótidos antagomir afectan funciones específicas miRNA suministro global. Adjunto, presentamos un protocolo para la inhibición de cardio-específica en vivo de la familia miR-181 en un modelo de rata. Una construcción de miRNA-esponja está diseñada para incluir secuencias repetidas enlace anti-miR-181 10. El promotor de la cardio-específico α-MHC se clona en la columna vertebral de pEGFP para impulsar la expresión de miR-181 miRNA-esponja de cardio-específico. Para crear una célula estable línea expresando el miR-181-esponja, mioblastos H9c2 células transfected con el constructo α-MHC-EGFP-miR-181-sponge y ordenado por celular activado por fluorescencia (FACs) de clasificación en GFP positivas H9c2 las células que se cultivan con neomicina (G418). Después de un crecimiento estable en neomicina, poblaciones de células monoclonales son establecidas por FACs adicional y la clonación de la célula. Las células resultantes de H9c2-miR-181-esponja-GFP mioblastos exhiben una pérdida de función de miembros de la familia miR-181 según lo determinado por el aumento de la expresión de las proteínas diana de miR-181 y compararon H9c2 las células con una esponja no funcional de scramble. Además, desarrollamos un nanovector para la entrega sistémica de la construcción de la miR-181-esponja secuestrantes nanopartículas liposomal con carga positiva y carga negativa miR-181-esponja plásmidos. En vivo la proyección de imagen de GFP revela que múltiples inyecciones de vena de la cola de un nanovector durante un período de tres semanas son capaces de promover una expresión significativa de la miR-181-esponja de forma cardio-específico. Lo importante, se observa una pérdida de función de miR-181 en el tejido del corazón pero no en el riñón o el hígado. La esponja de miRNA es un método eficaz para inhibir la expresión del miRNA de tejidos específicos. Conducir a la expresión del miRNA-esponja de un promotor específico de tejido proporciona especificidad de la inhibición de miRNA, que puede limitarse a una específica órgano o tejido. Además, combinando tecnologías nanovector y miRNA-esponja permite una entrega efectiva y la inhibición de miRNA de tejidos específicos en vivo.

Introduction

En las últimas dos décadas, ha habido numerosos estudios que han señalado el importante papel de miRNAs en enfermedad humana. Resultados de un gran cuerpo de literatura demuestran la indiscutible importancia de miRNAs en la patofisiología de enfermedades como el cáncer1 y las enfermedades cardiovasculares2,3,4,5. Por ejemplo, miR-21 es upregulated en muchos cánceres, lo que resulta en un mayor ciclo celular y la célula proliferación6. En las infecciones de hepatitis C, miR-122 desempeña un papel importante en la replicación de los virus7, y se ha demostrado que la inhibición de la miR-122 disminuye la carga viral8. En la hipertrofia cardiaca, miR-212/132 es upregulated en el corazón y está implicado en el fenotipo patológico9. La importancia obvia de la desregulación o la inhibición funcional de un miRNA alza sugiere oportunidades para explotar terapéuticamente la biología miRNA en casi todas las enfermedades.

Los cuatro miembros de la familia del miR-181, miR-181a/b/c/d, se encuentran en tres lugares genómicos en el genoma humano. La región intronic de una codificación no host gene del ARN (MIR181A1-HG) codifica el conjunto de miR-181-a/b-1. La región intronic del NR6A1 gen codifica el miR-181-a/b-2. El cluster de miR-181-c/d se encuentra en una transcripción desacostumbrada en el cromosoma 19. Todos los miR-181 miembros de la familia comparten la misma secuencia de "semilla" y los cuatro miembros de familia miR-181 potencialmente pueden regular los mismo objetivos de mRNA.

Somos3,4 y otros10 han destacado la importancia de miR-181 miembros de la familia durante la insuficiencia de la fase final. También hemos reconocido que un upregulation de miR - 181c ocurre bajo condiciones patológicas asociadas con un mayor riesgo de enfermedades del corazón, como el tipo de diabetes II, la obesidad y el envejecimiento3,4,5. Se ha postulado que la sobreexpresión de miR - 181c causa estrés oxidativo que conduce a una disfunción cardíaca4.

Varios grupos han sugerido que miRNA existe en mitocondrias11,12,13,14, pero fuimos los primeros en demostrar que miR - 181 c se deriva del genoma nuclear, procesado, y Posteriormente se translocan a la mitocondria en el RISC3. Además, hemos detectado una baja expresión de miR-181a y miR-181b en el compartimiento mitocondrial del corazón5. Lo importante, hemos encontrado que miR - 181c reprime la expresión de mRNA de COX1 mt, lo que demuestra que los miRNAs participan en la regulación del gene mitocondrial y altera la función mitocondrial3,4.

Este artículo aborda la metodología necesaria para diseñar una esponja miRNA derribar a toda la familia miR-181 en los cardiomiocitos. Por otra parte, describiremos un protocolo para el uso en vivo de la miR-181-esponja.

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Protocol

Todos los procedimientos experimentales fueron aprobados por el cuidado de Animal institucional y uso Comité de la Universidad Johns Hopkins.

1. esponja diseño

  1. MicroARN enlace 3' UTR
    Nota: Funciones de miRNA A través de la base sincronización interacciones con sitios parcialmente complementarios en la región 3' no traducida (UTR) de sus mRNAs de destino (para una revisión exhaustiva, véase Bartel)15.
    1. Diseño de los inhibidores de la expresión de miRNA como oligonucleótidos que contienen importante complementariedad a la secuencia de miRNA. Secuestrar un miRNA en un oligonucleótido complejo a través de amplia base que se aparea para bloquear la función de miRNA.
  2. Diseño de una esponja de miRNA
    1. Tándem de diseño v. secuencias parcialmente complementarias miRNA para incluir un abultamiento en la posición normalmente hendida por Argonaute 2. El bombeo se coloca en el 9-12 nucleótidos de la secuencia de miRNA maduros para evitar que cualquier escote de tipo RNA interferencia y degradación de la esponja.
    2. Si lo desea, diseñar la secuencia de destino de señuelo para enlazar a todos los miembros de familia de miR-181. En un examen y comparación de las secuencias de miRNA familia miR-181, encontrar una secuencia común en el lado 5' de las Ardenas que contiene 8 nucleótidos consecutivos, o encontrar una secuencia común a todos los 4 familiares de miR-181 en el lado 3' de las Ardenas un 8 adicional nucleótidos consecutivos. Estas 2 secuencias representan los sitios de unión de medio izquierdo y derecho, respectivamente.
      Nota: La secuencia de la trampa es una variedad del tándem de los sitios de unión de medio izquierdo y derecho separados por un espaciador GGA. Enlace a la secuencia del extremo 5' y la secuencia 3'-lateral (descrito en el paso 1.2.2) con un espaciador GGA diseñado para crear el bombeo cuando recocido a una miRNA (como se describe en el paso 1.2.1). Repita este sitio de unión de miRNA 1 10 x en la construcción final de miR-esponja.
  3. Otras consideraciones de esponja de miRNA
    Nota: Para clonar la secuencia de la esponja en el vector de expresión de receptores, sitios de reconocimiento de nucleasa de restricción debe incluidos en cada extremo de la secuencia. Un análisis de digestión en silico puede usarse para confirmar la ruptura no específicos de la secuencia de esponja por las enzimas de restricción solicitadas y otras enzimas de restricción utilizadas en aplicaciones de clonación de bajada.
    1. Añadir un codón de parada doble (TAA TAA) en el extremo 5' de los sintéticos 3' UTR, tales que la secuencia de miR-181-esponja no es parte de la secuencia de codificación para una mayor proteína verde fluorescente (EGFP).
  4. Síntesis de la esponja de ADN para la clonación
    1. Usar un sintetizador de ADN o emplear una fuente comercialmente disponible para sintetizar la secuencia de esponja miRNA final con sitios de reconocimiento de nucleasa de restricción en el lugar para la clonación. La esponja se embarca en un plásmido que puede contener marcadores seleccionables para una amplificación en bacterias. Además, la esponja puede ser amplificada por una reacción en cadena de polimerasa (PCR) para la clonación o simplemente abandonaron el vector de donantes mediante los sitios de restricción se describe en el paso 1.3 (también, vea el paso 3.1).

2. clonar el receptor Vector para incluir un promotor específico de tejido

Nota: Utilice el vector pEGFP-C1 como el vector del receptor para el casete de expresión de la esponja de miRNA. El vector pEGFP-C1 contiene un marco de lectura para un EGFP conducida por un promotor de citomegalovirus (CMV). El promotor del CMV es constitutivamente activo en células de mamíferos. Si se requiere de un promotor específico de tejido, el promotor del CMV se puede quitar por la digestión de las enzimas de AseI y NheI (vea el paso 2.1). El plásmido contiene un extenso sitio de clonado múltiple (MCS) y kanamicina (Kan) y neomicina (G418) marcadores para una selección de bacterias y una expresión estable en células de mamíferos, respectivamente.

  1. Quitar el promotor del CMV de pEGFP-C1
    1. Hacer 50 μL de la reacción de digestión que contiene 1 x buffer digest comercialmente disponibles sugerido por la fabricación de las enzimas de restricción utilizadas, 5 μg de plásmido ADN (en agua) y 5 μL de AseI y NheI enzimas. Añadir todos los componentes a un tubo de microcentrífuga y mézclelas suavemente por lo sacudiendo. Girar el tubo para 10 s en una microcentrífuga para recoger la reacción en la parte inferior. Incubar la reacción en un baño de agua de 37 ° C durante 15 minutos.
    2. Purificar el plásmido linearizado digerido. Agregue 5 veces el volumen de reacción de tampón de unión de columna (una mezcla propietaria del tampón de Unión adecuada para la fabricación de las columnas de purificación de ADN utilizado) y purificar la reacción con una columna de purificación de ADN descrito por el fabricante. Eluir con 25 μL de tampón de elución (agua), añadir con cuidado al centro de la columna.
    3. Gel purifica el plásmido digerido en gel de agarosa 0.5% como sigue: Añadir 5 μL de tampón (50% glicerol-3 x carga del tinte) de carga para el plásmido eluído. Cargar toda la muestra en 1 bien en gel de agarosa 0.5%. Incluir un carril independiente con 500 ng de vector sin cortar. Correr durante 30-40 minutos hasta que se logre una adecuada separación de plásmidos cortados y sin cortar.
    4. Purificar el plásmido lineal siguiente: visualizar el ADN en el gel de agarosa en una caja de luz UV. Con una cuchilla de afeitar limpia, cuidadosamente suprimir la banda correspondiente a los plásmidos lineales.
      Nota: El plásmido lineal debe ejecutar más bajo que el plásmido sin cortar y aparecerá como una sola banda en aproximadamente 4,2 kb. El promotor CMV suprimido aparecerá como una banda de luz en aproximadamente 500 nucleótidos (nt).
    5. Extraer el ADN de la rebanada de gel usando un kit disponible comercialmente y eluir el ADN de la columna con 25 μL de agua.
  2. Clonación de un promotor específico de corazón en pEGFP-C1
    Nota: El promotor de la cadena pesada de miosina alfa (α-MHC) previamente caracterizado y demostró a robustos niveles de expresión cardiaca restringidos como se describe en el siguiente Molkentin, Jobe y Markham16. Las siguientes secciones describen cómo amplificar el promotor del vector de clonación.
    1. Clonar el promotor α MHC entre elementos + 420 a-2934 en relación con el sitio de inicio de transcripción en el plásmido de p4016 primer diseño de primers PCR que flanquean esta región y, a continuación, el plásmido como plantilla para la polimerización en cadena. Amplificar la región del promotor mediante PCR primers descrito anteriormente5. Adelante y atrás primers PCR contienen secuencias de superposición en los extremos digeridos de pEGFP-C1 (paso 2.1) para permitir una clonación dirigida en fusión. Consulte el manual de In-Fusion para una explicación detallada del primer diseño para clonar en fusión. Secuencias de la cartilla se encuentran en la tabla 1.
    2. Preparar una reacción de PCR de 50 μL, que contiene 1 μM de cada primer y 10 ng de plantilla de ADN. Añadir una cantidad adecuada de enzimas PCR y dNTPs dependiendo de la fabricación de los reactivos de PCR elegido. Realizar PCR en un bloque estándar de bicicleta de ADN. Realizar un 3 min 98 ° C, desnaturalización paso, seguido por 35 ciclos de desnaturalización, recocido y extensión de 5, 30 y 120 s de cada uno, respectivamente. Incluye una extensión final de 10 min a 72 ° C.
    3. La extracción del PCR y gel de limpieza. Al finalizar el ciclo de la polimerización en cadena, agregue 5 veces el volumen de reacción del tampón de unión de columna a la reacción de PCR y purificar con una columna de purificación de ADN descrito por el fabricante. Eluir la mezcla con 25 μL de tampón de elución (agua), añadir con cuidado al centro de la columna.
      1. Añadir 5 μL de carga buffer [50% de glicerol (x 3) carga del tinte] a plásmido eluída. Cargar toda la muestra en 1 en gel de agarosa al 1%. Correr por 30-40 min; visualizar y suprimir el producto de la PCR como se describió anteriormente (paso 2.1.5).
    4. Ligar el promotor α MHC con el pEGFP-C1 como sigue: agregar la reacción de la ligadura de 10 μL que contiene 1 x buffer de ligadura comercialmente disponibles, 2 μL de PCR purificado y 1 μL de vector linearizado. Realizar la ligadura a 50 ° C durante 15 min y luego enfriar en hielo.
    5. Realizar una transformación bacteriana como sigue: transfectar 50 μL de células competentes con 2,5 μL de mezcla de ligadura In-Fusion agregando los componentes. Descansar el Eppendorf en hielo por 20 min, ponerlo en un baño de agua de 42 ° C durante 40 s y luego lugar el tubo en hielo durante 2 minutos.
      1. Después de la transformación, añadir 350 μL de medio SOC y crecen las células a 37 ° C por 45 min placa 200 μL de solución consecuencia en placas de LB con Kan. realizar una colonia PCR para identificar las células resistentes a Kan que contienen la ligadura de promotor α MHC.
        Nota: Proyección cebadores fueron diseñados para PCR a través de la Unión de la ligadura.
    6. Ampliar los clones positivos de PCR en caldo LB-Kan y en plásmidos purificados utilizando protocolos de purificación de plásmidos estándar Mini-prep según lo descrito por el fabricante.

3. clonación de la esponja

  1. Digerir el receptor vector
    1. Hacer el α-MHC-pEGFP plásmido lineal para clonar con EcoRI y KpnI y purificar el gel como se describió anteriormente (paso 2.1).
  2. PCR amplificación y digerir la esponja ADN
    1. Utilice el scramble 284-nt-largo miR-181-esponja y el correspondiente envío de vectores como la plantilla para la polimerización en cadena. Amplificar la región de esponja utilizando previamente descritos PCR primers5. Tenga en cuenta que adelante y atrás primers PCR contienen secuencias de enzima de la restricción para permitir que la ligadura en α-MHC-pEGFP-C1. Realizar PCR como se describió anteriormente (paso 2.2.2). Purificar los productos PCR antes de la digestión como había descrito (paso 2.2.3) y había eluida con agua para la digestión. Ver secuencias de la cartilla, tabla 1.
    2. Digerir el ADN de la esponja para ligadura. Una reacción de digestión 50 μL contiene 1 x buffer de digestión, la reacción de PCR purificado gel de paso 3.2.1 y 5 μL de las enzimas EcoRI y KpnI. Añadir todos los componentes a un tubo de microcentrífuga y mézclelas suavemente por lo sacudiendo. Girar el tubo para 10 s en una microcentrífuga para recoger la reacción en la parte inferior. Incubar la reacción en un baño de agua de 37 ° C durante 15 minutos.
    3. Purificar la esponja PCR digerida con una columna de limpieza PCR como se describió anteriormente (paso 2.2.1).
  3. Ligar la miR-181-esponja en vector α-MHC-pEGFP-C1
    1. Una reacción de ligadura 21 μL que contiene 1 x de tampón de ligadura, 3 μL de digerido y purificada miR-181-esponja PCR, 1 μL de vector linearizado de α-MHC-pEGFP-C1, 1 buffer de ADN x y 1 μL de ADN ligasa. Realizar la ligadura a temperatura ambiente durante 5 minutos y luego coloque en el hielo.
    2. Transformar 50 μL de células competentes XL1-blue con 2 μL de mezcla de ligadura. Utilice la transformación y protocolos de la galjanoplastia como se describió anteriormente (paso 2.2.5). Realizar una PCR para identificar las bacterias resistentes a Kan que contienen la secuencia correcta de α-MHC-pEGFP-miR-181-sponge de Colonia. Diseño de cebadores para la PCR de detección a través de la Unión de la ligadura. Vea la tabla 1 para las secuencias de la cartilla.
    3. Amplificar y secuenciar el vector. Ampliar los clones positivos de PCR en caldo LB-Kan y en plásmidos purificados usando protocolos de purificación de plásmidos estándar Mini-prep. Realizar una secuenciación de ADN para verificar el plásmido de expresión de las secuencias de ADN deseadas.

4. generación de células de expresión de miR-181-esponja H9c2 estable de

  1. Crecimiento y mantenimiento de las células H9c2
    1. Células en cultivo la H9c2 en medio modificado Eagle de Dulbecco (DMEM) que contenga suero fetal bovino (FBS) a una concentración final de 10%. El cultivo las células usando protocolos estándar y crecen a 37 ° C en 5% de dióxido de carbono.
  2. Transfección y selección de H9c2 α-MHC-pEGFP-C1-miR-181-sponge expresando las células
    1. Realizar una electroporación de H9c2 células para los mejores resultados. Transfectar rata mioblastos (H9c2) con una esponja de scramble (una secuencia 284-nt-largo scramble que sustituye a la miR-181-esponja-secuencia) o la construcción de α-MHC-pEGFP-miR-181-sponge con un electroporator.
      1. Brevemente, transfectar células de 4 x 10-5 con 2 μg de ADN del plásmido (en 5 μl de H2O) y 100 μl de una solución compatible con el aparato de electroporación. Utilizar un programa de electroporación de DS-120 para transfectar las células H9c2.
      2. Incube las células transfected en la cubeta durante 10 min a temperatura ambiente. Añadir 500 μl de DMEM directamente a la cubeta. Transferir suavemente el contenido total de la cubeta a un pozo de una placa de 6 pozos.
    2. Seleccione para las células positivas de GFP después de transfección tras 48 h por FACs. Placa de solamente las células GFP-expresado en una placa de 6 pozos con una adición de la neomicina (G418) (400ng/mL) a los medios de crecimiento completo.
      Nota: Antes de la selección de G418, debe establecerse una curva de la muerte para determinar la cantidad de la necesaria para la selección de la neomicina. Para las células H9c2, 400 ng/mL de G418 resultó en una tasa de mortalidad de aproximadamente el 80% del plásmido no transfected las células H9c2 después de 24 h y se considera la concentración deseada de trabajo de G418 para estas células. La línea celular era considerada estable después de crecimiento se mantuvo en G418 durante 16 días.
    3. Realizar la clasificación de la FACs de las células de G418 estables mediante la expresión de GFP como marcador de una selección positiva de esponja. Semilla 5-10 células en cada pozo de una placa de 96 pocillos por clasificación de flujo. Expandir las células monoclonales de la placa de 96 pocillos en placas de 24 pocillos varios pasajes. Las poblaciones de congelador de uso de las células de paso 3 (P3) células como punto de partida para posteriores experimentos.
    4. Realizar todos los experimentos con células de bajo pasaje entre P5 y P10 basado en línea de la célula.

5. síntesis y purificación de nanopartículas de esponja (miR-181-esponja nanopartículas)

  1. Preparar las nanopartículas liposómicos disolviendo amphiphile catiónico (DOTAP) y co lípidos, colesterol y DSPE-PEG-OMe, en una proporción de 5:5:0.1 mM, respectivamente, en una mezcla de cloroformo y metanol en un frasco de vidrio.
  2. Quite el solvente orgánico a 44-45 ° C, bajo vacío usando un evaporador rotatorio, seguido por un flujo suave de nitrógeno libre de humedad. Mantener la película seca restante de lípidos en un alto vacío de 8 h.
  3. Preparar una mezcla añadiendo glucosa 5% a la película lipídica de secado al vacío. Dejarlo durante la noche para permitir esta mezcla hidratar la película. Vórtice el frasco durante 2 a 3 minutos a temperatura ambiente para producir vesículas multilamellar con un temblor ocasional en un baño de agua de 45 ° C.
    1. Someter a ultrasonidos las vesículas multilamellar para preparar vesículas unilaminar pequeña en un baño de hielo durante 3-4 min hasta que la claridad puede ser observada, en un ciclo de trabajo 100% y de 25 W de potencia de salida.
  4. Mezclar una secuencia de lucha o una secuencia de miR-181-esponja clonados en los vectores de pEGFP(α-MHC) y liposomas en forma de proporción 1:3 carga para formar el nanovector4.
    Nota: Un complejo electrostático de nanopartículas liposómicos cargados positivamente y negativamente cargado de ADN plásmido es conocido como un nanovector.

6. sistémico entrega de esponja-nanopartículas y validación In Vivo de efectos

  1. Entrega sistémica de esponja-nanopartículas en ratas
    1. Uso de ratas Sprague-Dawley (SD). Inyectar por vía intravenosa las ratas con el miR-181-esponja nanovector o scramble nanovector a través de la vena de la cola. Utilizar ratas macho SD, que son aproximadamente 200 g en el peso corporal.
    2. Realizar la inyección en la vena cola utilizando una dosis de 4 mg de nanovector/kg de peso corporal y repetir este proceso con un régimen de 6 inyecciones de vena de la cola durante 2 semanas. Después de la entrega repetida nanovector, permitir un período de 1 semana (días 15-21) la expresión de los vectores en vivo.
    3. Proyección de imagen la señal GFP antes, durante y después de la entrega del nanovector para confirmar la optimización. Análisis de la señal GFP por software proyección de imagen tomográfico, que genera datos semi-cuantitativos.
  2. Validación en vivo inhibición miR-181 por el miR-181-esponja
    1. Realizar el western blot para demostrar la expresión de una miR-181-esponja funcional en el tejido del corazón.
      Nota: Para este estudio, mt-COX1 expresión fue examinado.
  3. Consecuencias funcionales de en vivo expresión de miR-181-esponja en el corazón
    1. Realizar una ecocardiografía bidimensional, modo M y Doppler durante y después de la entrega del nanovector para analizar la función cardiaca y cambios morfológicos. Para una mejor exploración capacidad en el corazón de roedor, utilizar un sistema de ultrasonido equipado con un transductor de matriz lineal de 15 MHz.
    2. Anestesia puede influir en la contractilidad cardiaca; por lo tanto, llevar a cabo la entrega de la miR-181-esponja nanovector o scramble nanovector para animales que son consciente y sin ningún reactivo anestésico durante el proceso de la ecocardiografía. Véase Das, et al. 4 para mayor aclaración.

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Representative Results

En las estable transfected pEGFP-miR-181-esponja-expresando H9c2 células (del paso 4.2), la expresión de miR-181 toda la familia (miR-181a, 181b miR, miR - 181c y miR - 181d) disminuyó moderadamente en comparación con células H9c2 pEGFP-revuelto-expresión. MiR-181-esponja sirve como un inhibidor competitivo de toda la familia miR-181, por lo que anticipó que la expresión del miR - 181c mitocondrial objetivo gene, mt-COX1, aumentaría. Mancha blanca /negra occidental los datos sugieren que la expresión de mt-COX1 fue aumentada en las células H9c2 pEGFP-miR-181-esponja-expresión en comparación con las células H9c2 pEGFP-scramble-expresó. Además, ningún cambio de expresión mt-COX2 o mt-COX3 fueron detectados mediante inmunoblot en las células de H9c2 pEGFP-miR-181-esponja-expresar. Se utilizaron α-tubulina como el control de normalización para el análisis de immunoblotting. GFP se observaron señales de principalmente en el hígado y el riñón para arriba hasta la entrega post-sistémica 2 semanas de la miR-esponja nanovector (figura 1A). Sin embargo, la expresión de GFP fue significativamente mayor en el tejido cardíaco después de 3 semanas de entrega nanovector miR-181-esponja (figura 1A y 1B). De nota, había una señal GFP detectada en el tejido del hígado en algunos animales 3 semanas después de la entrega sistémica; sin embargo, no hubo efectos funcionales de la miR-181-esponja en el hígado en ese momento.

La mancha blanca /negra occidental mostró un aumento significativo en la expresión de mt-COX1 en las ratas inyectadas nanovector miR-181-esponja, comparado con los grupos de nanovector de despegue en tiempo mínimo (figura 2). Mayor TA-COX1 sugiere que hay una menor expresión de miR - 181c en el corazón después de 3 semanas de la entrega de miR-181-esponja nanovector, como mt-COX1 es el objetivo directo de miR - 181c. Se utilizaron α-tubulina como el control de normalización para los immunoblots.

Ecocardiografía no mostraron cambios en la función cardiaca de las ratas inyectadas nanovector miR-181-esponja antes, durante y al final del régimen de tratamiento, en comparación con el grupo de nanovector scramble de animales.

Figure 1
Figura 1. En vivo análisis de entrega nanovector de la esponja de miR 181. (A) este panel muestra los protocolos de tratamiento optimizado de 3 semanas con 6 inyecciones intravenosas a través de la vena de la cola. La coloración amarilla en la imagen de epifluorescencia demuestra la expresión del vector pEGFP. La máxima intensidad de la coloración amarilla se observa en la semana 3 momento. (B) el α MHC secuencia de promotor en el vector pEGFP expresa selectivamente la esponja-181-miR o la secuencia codificada en el corazón en el día 21. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 2
Figura 2. Validación del efecto de miR-181-esponja nanovector para la expresión de miR - 181c. Este es el análisis de western blot de la expresión de mt-COX1 en los lisados de corazón de pEGFP-scramble y ratas inyectadas nanovector pEGFP-miR-181-esponja. Homogenados de todo corazón se sondeaba con los anticuerpos indicados. Se utilizaron α-tubulina como control de carga. La banda-densitometría se muestra en el gráfico de la barra de abajo. De Student t-test se realizó, y el error estándar fue trazado en el gráfico de barras como barras de error. p < 0.05 vs grupo pEGFP-scramble. n = 4.

Primer nombre Secuencia de TM Notas Uso Blanco
SAM3-1F ATGCATTAGTTATTAATGCTT
GACACACTTGACAATTTCT		 58.4 Promotor de rata MHC para clonar a EGFP POLIMERIZACIÓN EN CADENA Promotor de MHC
SAM3-2R GACCGGTAGCGCTAGCTG
ACTCACTGGGAGATTGCTT		 59.8 Promotor de rata MHC para clonar a EGFP POLIMERIZACIÓN EN CADENA Promotor de MHC
SAM3-3F CGAACGACCTACACCGAACT 64 Pantalla EGFP-F Colony PCR Clones positivos promotor
SAM3-4R CGCTAGTCCTTGACCCTCTG 63.9 Pantalla MHC-R Colony PCR Clones positivos promotor
SAM5-1F CCTGTCTCCAACACACAAGC 59.3 Promotor secuencia MHC Secuencia Promotor de MHC
SAM5-2R CAGACTGCAGGGCTGGTT 60 Promotor secuencia MHC Secuencia Promotor de MHC

Tabla 1. Secuencias de la cartilla.

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Discussion

Este artículo describe el diseño y síntesis de una esponja de miRNA y demostró cómo la expresión específica de tejido de la esponja es una poderosa herramienta para inhibir la expresión familia miRNA de tejidos específicos.

Hemos demostrado que una familia miR-181 a esponja puede ser clonada en un plásmido de expresión con un promotor específico cardiaco. El plásmido puede empacarse eficientemente en una partícula nanovector para la entrega en vitro y en vivo usando la electroporación o una inyección en la vena cola, respectivamente (figura 1). La esponja de miR-181 puede inhibir una expresión cardíaca específica de la familia miR-181 y puede afectar la expresión de genes diana de miR-181 (figura 2). La GFP en el plásmido es una ventaja añadida, que puede visualizar la entrega y el perfil de expresión de la nanovector sin sacrificar los animales.

Brevemente, una esponja de miRNA consiste en una serie de secuencias antisentido miRNA colocado después de un gen reportero que actúa como un señuelo miRNA blanco mRNA. Naturalmente que ocurre miRNA-esponjas se han encontrado para ser endógeno expresado en células animales y las plantas como largo no-codificación RNAs (lncRNAs)17. En el presente estudio, hemos utilizado un enfoque de esponja para inhibir toda la familia miR-181 en el corazón. Aunque el enfoque miR-181-esponja es un método fisiológico relevante al downregulate la familia miR-181 en células cultivadas, una aplicación en vivo del miR-181-esponjas puede ser perjudicial. Por ejemplo, varios estudios han demostrado un papel protector de miR-181a y miR-181b en diferentes células y tejidos tipos18,19,20. Por lo tanto, la expresión de miR-181-esponja debe estar dirigida específicamente al tejido del corazón.

Oligonucleótidos pequeños se han demostrado para bloquear la función de miRNA a través recocido a la hebra guía de miRNA maduros y evitar una carga adecuada en el complejo de silenciamiento inducido por RNA (RISC). Un problema asociado a este enfoque es que oligonucleótidos deben entregarse en una dosis de saturación suficiente para bloquear el celulares piscinas de miRNAs maduros. Oligonucleótidos sufren también de los desafíos que implica el transporte a través de las membranas celulares y una estabilidad de la molécula. Ingenioso, se ha demostrado que un objetivo de miRNA exógeno suministrado puede actuar como señuelo para su cognado miRNA21. En virtud de múltiples sitios de Unión atados juntos en un pseudo 3' UTR construir, el objetivo de señuelo, o esponja de miRNA, es capaz de interactuar con su objetivo miRNAs estable y secuestrar lo miRNA en complejos de microribonucleoprotein (miRNPs), así con eficacia prevención de la función de miRNA. La denominada "esponja de miRNA" es una eficaz tecnología de anti-sentido, que eficientemente puede downregulate miRNA in vitro e in vivo. Por lo tanto, la aplicación de una esponja de miRNA puede utilizarse para el estudio de fenotipos de pérdida de función de miRNA.

La noción de que el ARN de interferencia (ARNi) podría conducir a una nueva clase de terapias llamó la atención de muchos investigadores pronto después de su descubrimiento. El campo de aplicación basados en RNAi ha pasado muy rápidamente de laboratorio al paciente. Actualmente, la terapéutica miRNA es una de las intervenciones terapéuticas en oncología creciente y está actualmente en fase de ensayos clínicos 1. Oligonucleótidos antisentido o antagomirs, son uno de los enfoques inhibitorio miRNA más ampliamente utilizado. MA et al. 22 utilizado antagomir miR-10b, en vitro y en vivo, al upregulated miR-10b en un tumor sólido de silencio.

In vivo, el silenciamiento eficiente de miRNAs alza requiere una modificación química de la antagomirs para mejorar la afinidad de Unión, bioestabilidad y propiedades farmacocinéticas. Para aumentar el duplex (Tm) de temperatura de fusión y mejora la resistencia de la nucleasa del antagomirs, pueden realizarse modificaciones químicas, como 2 '-O-metil (2 '-O-Me), 2′-fluoro 2 '-O-methoxyethyl (2′-MOE) y el ácido nucleico bloqueado bicíclicos ( LNA)23,24,25,26,27,28,29,30,31. Para una mejor eficacia de la entrega en vivo , el antagomir puede modificarse por los vínculos del fosfotioato (PS), que han aumentado la nucleasa resistencia28. Además, modificaciones de columna vertebral PS también realzan el atascamiento a las proteínas del plasma reduce la excreción urinaria. Así, antagomirs modificado PS demuestran una mejora significativa de propiedades farmacocinéticas, facilitando su entrega sistémica32. También se ha demostrado que usando péptidos ácidos nucleicos (PNA) o morfolino oligómeros, diseñados para apuntar un miRNA específico, puede utilizarse para estudiar miRNA fenotipos de pérdida de función de34,de33,35, 36 , 37 , 38 , 39. Polylysine-conjugados y formando complejos nanopartícula PNA antagomirs inhiben eficazmente la miRNA función tanto in vitro e in vivo36,37,38, 39. a pesar de los avances recientes, una entrega eficaz y tejidos específicos de miRNA derivados sigue siendo un desafío. Estos incluyen el potencial para efectos off-target, desencadenar respuestas inmunes innatas y, lo más importante es obtener una entrega específica en las células de órganos/tejidos específicos.

Además, los niveles de expresión de miRNA varían mucho dependiendo de la célula y tejido tipo40. Además, la expresión del miRNA puede aumentarse o disminuirse en la enfermedad. La consecuencia de una expresión alterada de miRNA y el efecto sobre la función celular y tejido con miRNA esponja inhibió la expresión debe ser validado y determinado empíricamente. Extensos estudios preclínicos en modelos animales de enfermedad son necesarios para determinar el nivel óptimo de la inhibición para un objetivo dado de miRNA.

Curiosamente, el miRNA miR - 181c exhibe compartimentación subcelular3,4,5. Específicamente, como se esperaba, el miR-181s codificado en el núcleo y como transcripciones de largo-pri-miRNA que se procesan en el citoplasma por la maquinaria de corte en cuadritos e incorporadas en RISC. Sin embargo, a diferencia de los miRNAs canónica que funcionan en el citoplasma, la forma madura del miR - c 181 se transloca a la mitocondria y funciones en la regulación de genes mitocondriales específicos3. Hemos demostrado que la miR-181-esponja puede enlazar la forma madura del miR - c 181 en la fracción citoplasmática, evitando la translocación a la mitocondria. En consecuencia, un upregulation de mt-COX1 se observan en las mitocondrias en las condiciones de una desregulación de la expresión de miR - 181c.

Hemos divulgado la metodología necesaria para diseñar una esponja miRNA derribar a la expresión de cualquier miRNA y se describe un protocolo para el uso en vivo de la esponja de miRNA. Inhibición de miRNA de tejidos específicos es actualmente una técnica menos desarrollada en el campo de miRNA. La importancia de la regulación a la baja o la inhibición funcional de miRNAs upregulated en enfermedad humana sugiere que es posible explotar miRNA biología para la intervención terapéutica.

Este estudio puso de relieve una estrategia para bajar a miRNA, que puede emplearse con éxito en una manera tejido-específica in vivo. MiRNA-esponjas utilizan la secuencia antisentida de la secuencia de "semilla" de miRNA. Por lo tanto, miRNA-esponjas pueden regular a la baja de los miRNAs que comparten la misma "semilla" secuencia, es decir, la familia de miRNA todo. En este estudio, hemos observado una desregulación significativa de la familia entera de miR-181 (miR-181a, 181b miR, miR - 181c y miR - 181d) con la expresión de miR-181-esponja, tanto in vitro como in vivo. Si un miembro de la familia confiere protección mientras que otro miembro de la familia tiene efectos perjudiciales dentro del órgano mismo, usando la tecnología de miRNA-esponja no sería lo ideal.

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Disclosures

Los autores no tienen nada que revelar.

Acknowledgments

Agradecemos a Anthony K. L. Leung del Departamento de Bioquímica y Biología Molecular, Bloomberg School of Public Health, Universidad de Johns Hopkins para su técnico ayudar con el diseño de la construcción de la miR-181-esponja. También agradecemos a Polina Sysa-Shah y Kathleen Gabrielson de Departamento de Molecular y Biopatología comparada, Johns Hopkins Medical instituciones para su asistencia técnica de la proyección de imagen en vivo de la entrega de miRNA-esponja.

Este trabajo fue financiado por becas del NIH, HL39752 (a Charles Steenbergen) y por una beca de desarrollo científico de la 14SDG18890049 de la Asociación Americana del corazón (a Samarjit Das). El promotor de cardio-específica de la rata fue generosamente proporcionado por Jeffery D. Molkentin en Hospital infantil de Cincinnati.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
pEGFP-C1 vector Addgene 6084-1
In-fusion Clontech 121416
QIAprep Miniprep Qiagen 27104
QIAquick Gel Extraction Kit Qiagen 28704
miR-181-sponge synthesis Introgen GeneArt custome made
PCR primers Integrated DNA Technologies custome
EcoRI enzymes New Endland Biolabs R0101S
KpnI enzymes New Endland Biolabs R0142S
Rapid DNA Ligation Kit Sigma-Aldrich 11635379001
H9c2 cells ATCC CRL-1446
DMEM Media Thermo Fisher Scientific 11965092
Fetal Bovine Serum Thermo Fisher Scientific 10082139
Nucleofector 2b Device Lonza AAB-1001
Nucleofector Kits for H9c2 (2-1) Lonza VCA-1005
G418, Geneticin Thermo Fisher Scientific 11811023
FACSAria II Flow cytometer BD Bioscience 644832
Branson 450 sonifier Marshall Scientific EDP 100-214-239
The Xenogen IVIS Spectrum optical imaging device Caliper Life Sciences
Anti-MTCO1 antibody Abcam ab14705
α-tubulin antibody Abcam ab7291
Sequoia C256 ultrasound system Siemens

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Biología número 136 MicroRNA miRNA miRNA-esponja inhibición de miRNA nanopartículas nanovector miR-181 corazón miRNA mitocondrial
<em>En Vivo</em> Nanovector entrega de una esponja de microARN específicos de corazón
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Kent, O. A., Steenbergen, C., Das, S. In Vivo Nanovector Delivery of a Heart-specific MicroRNA-sponge. J. Vis. Exp. (136), e57845, doi:10.3791/57845 (2018).

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