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Biology

In Vivo Nanovector consegna di una cuore specifici MicroRNA-spugna

Published: June 15, 2018 doi: 10.3791/57845
Automatic Translation
1, 2, 2
1Princess Margaret Cancer Centre, University of Toronto, 2Department of Pathology, Department of Cardiology, Johns Hopkins University

Summary

Inibizione di tessuto-specifici microRNA è una tecnologia che è sottosviluppata nel campo dei microRNA. Qui, descriviamo un protocollo per inibire la famiglia di microRNA miR-181 in cellule dei mioblasti dal cuore. Nanovector tecnologia viene usata per fornire un microRNA spugna che dimostra significativa in vivo cardio-miR-181 famiglia inibizione specifica.

Abstract

MicroRNA (miRNA) è piccolo non-codificanti RNA che inibisce l'espressione post-trascrizionale RNA messaggero (mRNA). Malattie umane, come cancro e malattie cardiovascolari, sono stati indicati per attivare il tessuto e/o espressione di miRNA cellula-specifico associato a progressione della malattia. L'inibizione dell'espressione dei miRNA offre il potenziale per un intervento terapeutico. Tuttavia, gli approcci tradizionali per inibire Mirna, impiegando oligonucleotidi ipotesi, influisce sulle funzioni di miRNA specifici al momento della consegna globale. Qui, presentiamo un protocollo per l'inibizione in vivo cardio-specifico della famiglia miR-181 in un modello del ratto. Un costrutto di miRNA-spugna è progettato per includere 10 sequenze di associazione anti-miR-181 ripetuta. Il promotore di cardio specifiche α-MHC è clonato nel backbone del pEGFP per guidare l'espressione di miR-181 cardio specifici miRNA-spugna. Per creare una cella stabile linea esprimendo il miR-181-spugna, dei mioblasti H9c2 cellule è trasfettata con il costrutto α-MHC-EGFP-miR-181-sponge e filtrata per fluorescenza-attivato delle cellule ordinano (FACs) in cellule H9c2 positive GFP che sono coltivate con neomicina (G418). A seguito di una crescita stabile a neomicina, popolazioni di cellule monoclonali vengono stabilite mediante ulteriori FACs e clonazione di singola cellula. Cellule risultanti dei mioblasti H9c2-miR-181-spugna-GFP presentano una perdita di funzione dei membri della famiglia miR-181 come valutato attraverso l'aumentata espressione di proteine bersaglio miR-181 e confrontato alle cellule H9c2 esprimendo una spugna non funzionali di scramble. Inoltre, sviluppiamo un nanovector per la consegna sistematica del costrutto miR-181-spugna complessandosi liposomiale nanoparticelle caricato positivamente e negativamente miR-181-spugna plasmidi. In vivo imaging di GFP rivela che coda vena le iniezioni multiple di un nanovector su un periodo di tre settimane sono in grado di promuovere un'espressione significativa della miR-181-spugna in modo specifico per cardio. Cosa importante, una perdita di funzione di miR-181 è osservata nel tessuto del cuore ma non nel rene o del fegato. La spugna di miRNA è un potente metodo per inibire l'espressione di miRNA specifici del tessuto. L'espressione di miRNA-spugna di guida da un promotore tessuto-specifica fornisce specificità per l'inibizione di miRNA, che possa essere limitata a una mirata organo o tessuto. Inoltre, combinando tecnologie nanovector e miRNA-spugna consente un'erogazione efficace e tessuto-specifici miRNA inibizione in vivo.

Introduction

Negli ultimi due decenni, ci sono stati numerosi studi che hanno messo in evidenza il ruolo significativo dei miRNA nella malattia umana. Risultati da un grande corpo di letteratura dimostrano l'importanza innegabile dei miRNA nella fisiopatologia di malattie quali cancro1 e malattia cardiovascolare2,3,4,5. Ad esempio, miR-21 è aumentata in molti cancri, conseguente a un'aumentata proliferazione ciclo cellulare e6. Nelle infezioni di epatite C, miR-122 svolge un ruolo importante nella replicazione del virus7, ed è stato dimostrato che l'inibizione di miR-122 diminuisce il carico virale8. Nell'ipertrofia cardiaca, miR-212/132 è upregulated nel cuore ed è coinvolto nel fenotipo patologico9. L'evidente importanza del downregulation o inibizione funzionale di un miRNA sovraregolati suggerisce opportunità per sfruttare terapeuticamente la biologia di miRNA in quasi tutte le malattie.

I quattro membri della famiglia miR-181, miR-181 a/b/c/d, si trovano in tre luoghi genomic nel genoma umano. La regione intronic di un gene di host RNA non codificanti (MIR181A1-HG) codifica il cluster miR-181-a/b-1. La regione intronic del gene NR6A1 codifica il miR-181-a/b-2. Il cluster miR-181-c/d si trova in una trascrizione atipico sul cromosoma 19. Tutti i membri della famiglia di miR-181 condividono la stessa sequenza di "seme" e tutti i quattro membri della famiglia miR-181 potenzialmente possono regolare i medesimi obiettivi di mRNA.

Abbiamo3,4 e altri10 hanno sottolineato l'importanza di miR-181 membri della famiglia durante l'infarto di stadio finale. Abbiamo anche riconosciuto che un upregulation di miR - 181 quater si verifica in presenza di condizioni patologiche associate con un rischio aumentato di malattia cardiaca, quale il diabete di tipo II, obesità e invecchiamento3,4,5. È stato postulato che la sovraespressione di miR - 181c causa lo sforzo ossidativo che conduce a una disfunzione cardiaca4.

Parecchi gruppi hanno suggerito che esiste di miRNA in mitocondri11,12,13,14, ma siamo stati i primi a dimostrare che miR - 181 c è derivato dal genoma nucleare, elaborato, e successivamente spostato ai mitocondri in RISC3. Inoltre, abbiamo rilevato una bassa espressione di miR-181a e miR-181b nel compartimento mitocondriale del cuore5. D'importanza, abbiamo trovato che miR - 181c reprime l'espressione di mRNA di mt-COX1, dimostrando in tal modo che i miRNA partecipano alla regolazione del gene mitocondriale e alterano la funzione mitocondriale3,4.

Questo articolo discute la metodologia necessaria per progettare una miRNA-spugna per abbattere l'intera famiglia di miR-181 in cardiomiociti. Inoltre, abbiamo delineare un protocollo per l'applicazione in vivo della miR-181-spugna.

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Protocol

Tutte le procedure sperimentali sono state approvate dal istituzionale Animal Care e uso Comitato della Johns Hopkins University.

1. spugna Design

  1. MicroRNA associazione 3' UTR
    Nota: A miRNA funzioni attraverso specifiche interazioni accoppiamento base con siti parzialmente complementari nella regione 3' non tradotta (UTR) del suo mRNA bersaglio (per una rassegna completa, vedere Bartel)15.
    1. Progettare gli inibitori dell'espressione dei miRNA come oligonucleotidi contenenti significative complementarità alla sequenza di miRNA. Sequestrare un miRNA a un oligonucleotide complesso mediante appaiamento vasto di bloccare la funzione di miRNA.
  2. Progettazione di una spugna di miRNA
    1. Progettazione schierati tandemly sequenze miRNA parzialmente complementari per includere un rigonfiamento nella posizione normalmente spaccati di Argonaute 2. Il rigonfiamento è posizionato a nucleotidi 9-12 della sequenza miRNA maturo per prevenire qualsiasi RNA interferenza tipo fenditura e la degradazione della spugna.
    2. Se lo si desidera, è possibile progettare alla sequenza di destinazione esca da associare a tutti i membri della famiglia miR-181. Al momento di un esame e il confronto delle sequenze famiglia miRNA miR-181, trovare una sequenza comune sul lato 5' del rigonfiamento contenente 8 nucleotidi consecutivi, o trovare una sequenza comune a tutti i membri della famiglia miR-181 4 sul lato 3' del rigonfiamento di un ulteriore 8 nucleotidi consecutivi. Queste 2 sequenze rappresentano i siti di legame di metà sinistra e destra, rispettivamente.
      Nota: La sequenza di esca è una matrice di tandem delle sedi del legame di metà di destro e sinistro separati da un distanziatore GGA. Collegare insieme la sequenza 5'-fine e la sequenza di 3'-lato (descritto al punto 1.2.2) con un distanziatore GGA progettato per creare il rigonfiamento quando ricotto per un miRNA (come descritto al punto 1.2.1). Ripetere questo 1 sito di legame di miRNA 10 x nel costrutto finale miR-spugna.
  3. Altre considerazioni di spugna di miRNA
    Nota: Al fine di clonare la sequenza di spugna nel vettore di espressione destinatario, siti di riconoscimento nucleasi di restrizione devono essere inclusi a ciascuna estremità della sequenza. Un'analisi in silico digestione dovrebbe essere utilizzata per confermare la scissione non specifici della sequenza spugna dagli enzimi di restrizione selezionati e altri enzimi di restrizione utilizzati in applicazioni di clonazione a valle.
    1. Aggiungere un codone di arresto doppia (TAA TAA) all'estremità 5' del sintetico 3' UTR, tale che la sequenza di miR-181-spugna non è parte della sequenza codificante per una proteina fluorescente verde avanzata (EGFP).
  4. Sintesi della spugna del DNA per la clonazione
    1. Utilizzare un sintetizzatore di DNA o impiegare una fonte disponibile in commercio per sintetizzare la sequenza di spugna finale miRNA con siti di riconoscimento di nucleasi di restrizione in luogo per la clonazione. La spugna viene spedita su un plasmide che può contenere indicatori selezionabili per un'amplificazione nei batteri. Ulteriormente, la spugna può essere amplificata da una reazione a catena della polimerasi (PCR) per la clonazione o semplicemente caduta fuori il vettore di donatore utilizzando i siti di restrizione descritti al punto 1.3 (vedere anche punto 3.1).

2. clonazione il vettore destinatario per includere un promotore tessuto-specifici

Nota: Utilizzare il vettore pEGFP-C1 come il vettore destinatario per la cassetta di espressione della spugna miRNA. Il vettore pEGFP-C1 contiene una cornice di lettura per un EGFP guidato da un promotore del citomegalovirus (CMV). Il promotore di CMV è costitutivamente attivo in cellule di mammifero. Se un promotore tessuto-specifica è necessario, il promotore CMV può essere rimosso tramite digestione degli enzimi di AseI e NheI (Vedi punto 2.1). Il plasmide contiene un vasto polylinker (MCS), kanamicina (Kan) e marcatori di neomicina (G418) per una selezione in batteri e un'espressione stabile in cellule di mammifero, rispettivamente.

  1. Rimozione del promotore CMV da pEGFP-C1
    1. Fare 50 μL di reazione di digestione contenente tampone digest commercialmente disponibili suggerito dalla fabbricazione degli enzimi di restrizione usato 1x, 5 μg di plasmide DNA (in acqua) e 5 µ l di AseI e NheI enzimi. Aggiungere tutti i componenti di un tubo del microcentrifuge e mescolarle delicatamente da sfogliando. Girare il tubo per 10 s in una microcentrifuga per raccogliere la reazione nella parte inferiore. Incubare la reazione in bagnomaria a 37 ° C per 15 min.
    2. Purificare il plasmide linearizzato digerito. Aggiungere 5 x il volume di reazione di buffer di colonna obbligatorio (un mix di proprietà del buffer associazione adatta per la fabbricazione delle colonne di purificazione di DNA utilizzate) e purificare la reazione con una colonna di purificazione del DNA come descritto dal produttore. Eluire con 25 μL di tampone di eluizione (acqua) aggiunto attentamente al centro della colonna.
    3. Gel di purificare il plasmide digerito su gel di agarosio 0,5% come segue: aggiungere 5 μL di tampone di caricamento (50% glicerolo-3 x caricamento tintura) per il plasmide eluito. Caricare l'intero esempio in 1 bene su gel di agarosio di 0,5%. Includere una corsia separata con 500 ng di vettore uncut. Eseguirlo per 30-40 minuti fino ad ottenere un'adeguata separazione dei plasmidi di taglio e non tagliati.
    4. Purificare il plasmide linearizzato come segue: visualizzare il DNA in gel di agarosio su una scatola di luce UV. Con una lama di rasoio pulita, attentamente accise alla fascia corrispondente al plasmide lineare.
      Nota: Il plasmide lineare dovrebbe eseguire inferiore il plasmide non tagliato e verrà visualizzato come una singola banda a circa 4,2 kb. Il promotore CMV asportato apparirà come una banda di luce a circa 500 nucleotidi (nt).
    5. Estrarre il DNA dal gel slice usando un kit disponibile in commercio ed eluire il DNA dalla colonna con 25 µ l di acqua.
  2. Clonazione di un promotore di cuore-specifico in pEGFP-C1
    Nota: Il promotore di catene pesanti alfa-miosina (α-MHC) ha stato precedentemente caratterizzato e dimostrato per dirigere robusti livelli di espressione cardiaco-limitati come descritto nel seguente Molkentin, Jobe e Markham16. Le sezioni successive descrivono come amplificare il promotore del vettore per la clonazione.
    1. Clonare il promotore di α-MHC tra elementi + 420 a-2934 relativo al sito di inizio della trascrizione nel plasmide p4016 di prima progettazione degli iniettori PCR che fiancheggiano questa regione e quindi il plasmide come modello per la PCR. Amplificare la regione del promotore mediante PCR primer precedentemente descritti5. Forward e reverse primer PCR contengono sequenze di sovrapposizione fino agli estremi confini digeriti del pEGFP-C1 (punto 2.1) per consentire la clonazione diretto In Fusion. Consultare il manuale di In-fusione per un'esauriente spiegazione del disegno primer per clonazione In-Fusion. Sequenze dell'iniettore si trovano nella tabella 1.
    2. Preparare una reazione di PCR 50 μL, che contiene 1 μM di ogni primer e 10 ng di DNA campione. Aggiungere una quantità appropriata di enzima PCR e dNTP a seconda la fabbricazione dei reagenti PCR scelto. Eseguire PCR su un blocco di ciclismo del DNA standard. Eseguire un 3 min 98 ° C denaturazione passaggio, seguito da 35 cicli di denaturazione, ricottura ed estensione per 5, 30 e 120 s ciascuno, rispettivamente. Include un'estensione finale di 10 min a 72 ° C.
    3. Ripulire l'estrazione PCR e gel. Al completamento del ciclo di PCR, aggiungere 5 x il volume di reazione di buffer di associazione di colonna per la reazione di PCR e purificarla con una colonna di purificazione di DNA, come descritto dal produttore. Eluire la miscela con 25 μL di tampone di eluizione (acqua) aggiunto attentamente al centro della colonna.
      1. Aggiungere 5 µ l di tampone di caricamento [50% glicerolo (3x) tintura di caricamento] a eluiti plasmide. Caricare l'intero esempio in 1 bene su gel di agarosio 1%. Eseguirlo per 30-40 min; visualizzare e asportare il prodotto PCR come descritto in precedenza (punto 2.1.5).
    4. Legare il promotore di α-MHC con pEGFP-C1 come segue: aggiungere la reazione di legatura 10 μL contenente 1x buffer di legatura commercialmente disponibili, 2 μL di PCR purificato e 1 μL di vettore linearizzato. Eseguire la legatura a 50 ° C per 15 min e poi raffreddarlo sul ghiaccio.
    5. Eseguire una trasformazione batterica come segue: transfect 50 μL di cellule competenti con 2,5 µ l di miscela di legatura In Fusion aggiungendo i componenti. Riposare la Eppendorf tube sul ghiaccio per 20 min, metterlo a bagnomaria a 42 ° C per 40 s e quindi posizionare il tubo sul ghiaccio per 2 min.
      1. A seguito della trasformazione, aggiungere 350 μL di media SOC e far crescere cellule a 37 ° C per 45 min. piastra 200 μL di soluzione di escrescenza su piastre LB con Kan eseguire una PCR per identificare cellule resistenti Kan che contengono la legatura del promotore di α-MHC della Colonia.
        Nota: Gli iniettori di Screening sono stati progettati per PCR attraverso la giunzione di legatura.
    6. Espandere i cloni positivi di PCR in brodo LB-Kan e in plasmidi purificati mediante protocolli di purificazione del plasmide standard mini-prep come descritto dal produttore.

3. clonazione la spugna

  1. Digerire il vettore destinatario
    1. Rendere il plasmide pEGFP-MHC-α lineare per la clonazione con EcoRI e KpnI e purificare il gel come descritto in precedenza (punto 2.1).
  2. PCR amplificano e digerire la spugna del DNA
    1. Utilizzare la storyline di 284-nt-lungo miR-181-spugna e corrispondente vettori di spedizione come il modello per la PCR. Amplificare la regione di spugna utilizzando precedentemente descritti PCR primer5. Si noti che gli iniettori di PCR di forward e reverse contengono sequenze di enzima di restrizione per consentire legatura in α-MHC-pEGFP-C1. Eseguire PCR come descritto in precedenza (punto 2.2.2). Purificare i prodotti di PCR prima digestione descritti (punto 2.2.3) e li eluiti con acqua per la digestione. Per sequenze dell'iniettore, vedere nella tabella 1.
    2. Digerire la spugna del DNA per la legatura. Una reazione di digestione 50 μL contiene 1x buffer di digest, la reazione di PCR gel-purificato dal punto 3.2.1 e 5 μL di enzimi EcoRI sia KpnI. Aggiungere tutti i componenti di un tubo del microcentrifuge e mescolarle delicatamente da sfogliando. Girare il tubo per 10 s in una microcentrifuga per raccogliere la reazione nella parte inferiore. Incubare la reazione in bagnomaria a 37 ° C per 15 min.
    3. Purificare la spugna PCR digerita utilizzando una colonna di pulizia PCR come descritto in precedenza (punto 2.2.1).
  3. Legare la miR-181-spugna in vettore α-MHC-pEGFP-C1
    1. Impostare una reazione di legatura μL 21 che contiene 1 x legatura buffer, 3 μL di digerito e purificato PCR miR-181-spugna, 1 μL di vettore linearizzato α-MHC-pEGFP-C1, tampone DNA 1x e 1 μL di DNA ligasi. Eseguire la legatura a temperatura ambiente per 5 min e poi metterlo sul ghiaccio.
    2. Trasformare 50 μL di cellule competenti XL1-blu con 2 μL di miscela di legatura. Utilizzare la trasformazione e la placcatura protocolli come descritto in precedenza (punto 2.2.5). Eseguire una PCR per identificare batteri resistenti Kan che contengono la sequenza corretta di α-MHC-pEGFP-miR-181-sponge della Colonia. Progettazione degli iniettori di PCR di screening attraverso la giunzione di legatura. Vedere la tabella 1 per sequenze dell'iniettore.
    3. Amplificare e il vettore di sequenza. Espandere i cloni positivi di PCR in brodo LB-Kan e in plasmidi purificati mediante protocolli di purificazione del plasmide standard mini-prep. Eseguire un sequenziamento del DNA per verificare il plasmide esprimente le sequenze di DNA desiderate.

4. generazione di cellule che esprimono miR-181-spugna di H9c2 stabile

  1. Crescita e il mantenimento delle cellule H9c2
    1. Cellule di cultura il H9c2 dell'Aquila per volta di Dulbecco Medium (DMEM) contenente siero bovino fetale (FBS) ad una concentrazione finale di 10%. Sub-cultura le celle utilizzando protocolli standard e farle crescere a 37 ° C in 5% di anidride carbonica.
  2. Transfezione e selezione di α-MHC-pEGFP-C1-miR-181-sponge che esprimono le cellule H9c2
    1. Eseguire un elettroporazione delle cellule H9c2 per ottenere risultati ottimali. Transfect ratto mioblasti (H9c2) con una spugna di scramble (una sequenza di scramble 284-nt-lungo che sostituisce la miR-181-spugna-sequenza) o il costrutto α-MHC-pEGFP-miR-181-sponge con un electroporator.
      1. Brevemente, transfect 4 x 10-5 cellule con 2 μg di DNA del plasmide (in 5 µ l di H2O) e 100 µ l di una soluzione compatibile con il dispositivo di elettroporazione. Utilizzare un programma di elettroporazione di DS-120 a transfect le cellule H9c2.
      2. Incubare le cellule transfettate in cuvetta per 10 min a temperatura ambiente. Aggiungere 500 µ l di DMEM direttamente la cuvetta. Trasferire delicatamente il contenuto di cuvetta totale in un pozzetto di una piastra a 6 pozzetti.
    2. Selezionare per cellule positive GFP dopo post-trasfezione 48 h di FACs. Piastra solo le cellule GFP-espressi in una piastra a 6 pozzetti con un'aggiunta di neomicina (G418) (400ng/mL) per i media di crescita completa.
      Nota: Prima della selezione di G418, una curva di uccidere dovrebbe essere stabilita per determinare la quantità di neomicina richiesto per la selezione. Per le cellule H9c2, 400 ng/mL di G418 ha provocato un tasso di mortalità di circa l'80% del non-plasmide transfected le cellule H9c2 dopo 24 h ed è stato considerato come la concentrazione di lavoro desiderata di G418 per queste cellule. La linea cellulare era considerata stabile dopo la crescita è stata mantenuta in G418 per 16 giorni.
    3. Eseguire l'ordinamento di FACs delle cellule stabili G418 usando l'espressione della GFP come indicatore per una selezione positiva di spugna. Semi di 5-10 cellule in ciascun pozzetto di una piastra a 96 pozzetti da flusso di ordinamento. Espandere le cellule monoclonali dalla piastra a 96 pozzetti a 24 pozzetti sopra diversi passaggi. Uso congelatore scorte delle cellule dal passaggio 3 (P3) cellule come punto di partenza per successivi esperimenti.
    4. Eseguire tutti gli esperimenti basati su linee cellulari con cellule di basso-passaggio tra P5 e P10.

5. sintesi e purificazione di spugna-nanoparticelle (miR-181-spugna nanoparticelle)

  1. Preparate le nanoparticelle liposomiale sciogliendo amphiphile cationici (DOTAP) e co-lipidi, colesterolo e DSPE-PEG-OMe, in un rapporto di mM 5:5:0.1, rispettivamente, in una miscela di cloroformio e metanolo in un flaconcino di vetro.
  2. Rimuovere il solvente organico a 44-45 ° C, sotto vuoto mediante un evaporatore rotante, seguito da un delicato flusso di azoto privo di umidità. Tenere il restante film secchi del lipido sotto alto vuoto per 8 h.
  3. Preparare una miscela con l'aggiunta di glucosio 5% per il film lipidico Essicato sottovuoto. Lasciare durante la notte per consentire questa miscela idratare il film. Vortice del flacone per 2 a 3 min a temperatura ambiente per produrre vescicole multilamellari con un'agitazione occasionale in bagnomaria a 45 ° C.
    1. Sonicare le vescicole multilamellari per preparare le vescicole unilamellari piccole in un bagno di ghiaccio per 3-4 minuti fino a quando la chiarezza può essere osservato, a un 100% duty cycle e 25 W di potenza di uscita.
  4. Mescolare una sequenza di scramble o una sequenza di miR-181-spugna clonati nel vettore pEGFP(α-MHC) e liposoma su una base di rapporto 1:3 carica per formare la nanovector4.
    Nota: Un complesso elettrostatico di nanoparticelle liposomiale caricati positivamente e negativamente DNA plasmidico è noto come un nanovector.

6. consegna sistemica di spugna-nanoparticelle e convalida degli effetti In Vivo

  1. Somministrazione sistemica di spugna-nanoparticelle in ratti
    1. Utilizzare ratti Sprague-Dawley (deviazione standard). Iniettare per via endovenosa i ratti con il miR-181-spugna nanovector o scramble nanovector attraverso la vena caudale. Utilizzare ratti maschii di SD, che sono circa 200 g di peso corporeo.
    2. Eseguire l'iniezione della vena della coda utilizzando una dose di 4 mg di nanovector/kg di peso corporeo e ripetere l'operazione usando un regime di 6 iniezioni di vena di coda oltre 2 settimane. A seguito della pronuncia di nanovector ripetuti, consentire un periodo di 1 settimana (giorni 15-21) per l'espressione del vettore in vivo.
    3. Confermare l'ottimizzazione da imaging il segnale GFP, prima, durante e dopo la consegna di nanovector. Analizzare il segnale GFP di software di imaging tomografico, che genera dati semi-quantitativa.
  2. Convalida di in vivo miR-181 inibizione da miR-181-spugna
    1. Eseguire macchia occidentale al fine di dimostrare l'espressione di miR-181-spugna funzionale nel tessuto del cuore.
      Nota: Per questo studio, espressione di mt-COX1 è stata esaminata.
  3. Conseguenze funzionali dell'espressione di miR-181-spugna in vivo nel cuore
    1. Eseguire un'ecocardiografia bidimensionale, M-mode e Doppler durante e dopo la consegna di nanovector per analizzare la funzione cardiaca ed i cambiamenti morfologici. Per una migliore scansione capacità nei cuori del roditore, utilizzare un sistema a ultrasuoni dotato di un trasduttore ad array lineare 15 MHz.
    2. L'anestesia può influenzare la contrattilità cardiaca; Pertanto, effettuare la consegna della nanovector miR-181-spugna o scramble nanovector agli animali che sono cosciente e senza qualsiasi reagente anestetico durante il processo di ecocardiografia. Si prega di consultare Das, et al. 4 per ulteriori chiarimenti.

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Representative Results

In stabile pEGFP-miR-181-spugna-esprimendo H9c2 cellule transfected (dalla fase 4.2), l'espressione di miR-181 tutta la famiglia (miR-181a, miR-181b, miR - 181c e miR - 181d) è stata diminuita moderatamente relativo pEGFP-uova strapazzate-esprimendo le cellule H9c2. MiR-181-spugna serve come un inibitore competitivo dell'intera famiglia miR-181, così abbiamo anticipato che l'espressione del miR - 181c mitocondriale target gene, mt-COX1, aumenterebbe. Macchia occidentale dati suggeriscono che l'espressione di mt-COX1 è stato aumentato nelle cellule H9c2 pEGFP-miR-181-spugna-esprimendo rispetto alle cellule H9c2 pEGFP-scramble-espresso. Inoltre, nessun cambiamento di espressione per mt-COX2 o mt-COX3 sono stati rilevati tramite immunoblot nelle cellule H9c2 pEGFP-miR-181-spugna-espressione. Abbiamo usato α-tubulina come il controllo di normalizzazione per l'analisi di immunoblotting. Segnali GFP pricipalmente sono stati osservati nel fegato e nel rene fino alla consegna post-sistemica di 2 settimane di nanovector il miR-spugna (Figura 1A). Tuttavia, l'espressione della GFP era significativamente più alta nel tessuto del cuore dopo 3 settimane di consegna nanovector miR-181-spugna (Figura 1A e 1B). Da notare, c'è un segnale GFP rilevato nel tessuto del fegato in alcuni animali 3 settimane dopo la consegna sistematica; Tuttavia, non c'erano effetti funzionali della miR-181-spugna nel fegato a quel punto di tempo.

Il western blot ha mostrato un aumento significativo nell'espressione di mt-COX1 nei ratti iniettati nanovector miR-181-spugna rispetto ai gruppi di nanovector scramble (Figura 2). Più alto mt-COX1 suggerisce che c'è una bassa espressione di miR - 181c nel cuore dopo 3 settimane della consegna nanovector miR-181-spugna, come mt-COX1 è l'obiettivo diretto per miR - 181 quater. Abbiamo usato α-tubulina come il controllo di normalizzazione per i immunoblots.

Ecocardiografia ha mostrato nessun cambiamento nella funzione cardiaca dei ratti iniettati nanovector miR-181-spugna, prima, durante e alla fine del regime di trattamento, rispetto al gruppo di nanovector scramble di animali.

Figure 1
Figura 1. In vivo analisi di nanovector consegna della miR-181-spugna. (A), questo pannello mostra i protocolli di trattamento di 3 settimane ottimizzato con 6 iniezioni endovenose attraverso la vena caudale. La colorazione gialla nell'immagine epifluorescenza dimostra l'espressione del vettore pEGFP. La massima intensità della colorazione gialla è osservata alla settimana 3 punto di tempo. (B), il α-MHC sequenza del promotore nel vettore pEGFP esprime in modo selettivo la miR-181-spugna o la sequenza di uova strapazzata nel cuore al giorno 21. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 2
Figura 2. Convalida dell'effetto di miR-181-spugna nanovector sull'espressione di miR - 181c. Questa è l'analisi di western blot dell'espressione mt-COX1 nei cuore lisati ottenuti da pEGFP-scramble e ratti nanovector-iniettati pEGFP-miR-181-spugna. Intero-cuore omogeneati erano sondati con gli anticorpi indicati. Abbiamo usato α-tubulina come un controllo di carico. La banda-densitometria è mostrata nel grafico a barre qui sotto. Di Student t-test è stato eseguito, e l'errore standard è stata tracciata nel grafico a barre come barre di errore. p < 0.05 vs gruppo pEGFP-scramble. n = 4.

Nome di primer Sequenza TM Note Uso Destinazione
SAM3-1F ATGCATTAGTTATTAATGCTT
GACACACTTGACAATTTCT		 58,4 Promotore di ratto MHC per clonare in EGFP PCR Promotore di MHC
SAM3-2R GACCGGTAGCGCTAGCTG
ACTCACTGGGAGATTGCTT		 59,8 Promotore di ratto MHC per clonare in EGFP PCR Promotore di MHC
SAM3-3F CGAACGACCTACACCGAACT 64 Schermo EGFP-F PCR della Colonia Cloni positivi promotore
SAM3-4R CGCTAGTCCTTGACCCTCTG 63,9 Schermo MHC-R PCR della Colonia Cloni positivi promotore
SAM5-1F CCTGTCTCCAACACACAAGC 59,3 Promotore di sequenza MHC Sequenziamento Promotore di MHC
SAM5-2R CAGACTGCAGGGCTGGTT 60 Promotore di sequenza MHC Sequenziamento Promotore di MHC

Tabella 1. Sequenze dell'iniettore.

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Discussion

In questo articolo descritta la progettazione e la sintesi di una miRNA-spugna e ha dimostrato come l'espressione tessuto-specifica della spugna è un potente strumento per inibire l'espressione famiglia tessuto-specifici miRNA.

Abbiamo dimostrato che una famiglia di miR-181 spugna di targeting può essere clonata in un plasmide di espressione con un promotore specifico. Il plasmide può essere confezionato in modo efficiente in una particella di nanovector per la consegna sia in vitro che in vivo usando elettroporazione o un'iniezione della vena della coda, rispettivamente (Figura 1). La spugna di miR-181 può inibire un'espressione specifico della famiglia miR-181 e possa influenzare l'espressione dei geni bersaglio di miR-181 (Figura 2). La GFP nel plasmide è un vantaggio aggiunto, che può visualizzare la consegna e il profilo di espressione della nanovector senza sacrificare gli animali.

Brevemente, una miRNA-spugna è costituito da una serie di sequenze antisenso di miRNA collocato dopo un gene del reporter che agisce come un miRNA decoy bersaglio mRNA. Naturalmente miRNA-spugne d'avvenimento sono stati trovati per essere espresso in modo endogeno in cellule animali e vegetali come tempo di non-codificazione RNAs (lncRNAs)17. Nello studio presente, abbiamo utilizzato un approccio di spugna per inibire l'intera famiglia di miR-181 nel cuore. Sebbene l'approccio di miR-181-spugna è un metodo fisiologicamente rilevante a downregulate la famiglia di miR-181 in cellule coltivate, un'applicazione in vivo di miR-181-spugne può essere dannosa. Ad esempio, diversi studi hanno dimostrato un ruolo protettivo di miR-181a e miR-181b in cellule/tessuti diversi tipi18,19,20. Pertanto, l'espressione di miR-181-spugna dovrebbe essere mirato specificamente al tessuto del cuore.

Piccoli oligonucleotidi sono stati dimostrati per bloccare la funzione di miRNA attraverso ricottura per filo guida del miRNA maturo e impediscono un corretto caricamento dentro il complesso di silenziamento indotto da RNA (RISC). Un problema connesso con questo approccio è che oligonucleotidi devono essere consegnati in una dose saturante sufficiente a bloccare la pool cellulari di Mirna maturi. Oligonucleotidi soffrono anche di sfide che coinvolgono il trasporto attraverso le membrane cellulari e una generale stabilità della molecola. Ingegnosamente, è stato dimostrato che un obiettivo di miRNA esogenicamente fornito può agire come esca per sue cognate miRNA21. In virtù di più siti di legame legati insieme in un pseudo 3' UTR costruire, l'esca target o miRNA-spugna, è in grado di interagire con relativo destinazione Mirna stabilmente sequestrare il miRNA in complessi di microribonucleoprotein (miRNPs), così efficacemente impedire la funzione di miRNA. La cosiddetta "miRNA-spugna" è un'efficace tecnologia di anti-senso, che può in modo efficiente downregulate miRNA sia in vitro che in vivo. Di conseguenza, l'applicazione di una miRNA-spugna consente di studiare i fenotipi di perdita-de-funzione di miRNA.

L'idea che l'interferenza del RNA (RNAi) potrebbe portare a una nuova classe di agenti terapeutici ha catturato l'attenzione di molti ricercatori presto dopo la sua scoperta. Il campo del applicata RNAi therapeutics è spostato molto rapidamente dal laboratorio al letto del paziente. Attualmente, miRNA therapeutics è uno degli interventi terapeutici rapida crescita in oncologia ed è attualmente in fase di sperimentazioni cliniche 1. Oligonucleotidi antisenso, o recentemente, sono uno degli approcci più ampiamente usato miRNA inibitorio. Ma et al. 22 utilizzato miR-10b ipotesi, sia in vitro che in vivo, per mettere a tacere sovraregolati miR-10b in un tumore solido.

In vivo, l'efficiente silencing dei miRNA sovraregolati richiede una modificazione chimica degli recentemente per migliorare l'affinità di legame, biostabilità e proprietà farmacocinetiche. Per aumentare il duplex (Tm) temperatura di fusione e migliorano la resistenza di nucleasi di recentemente, modificazioni chimiche possono essere eseguite, ad esempio 2 '-O-metilica (2 '-O-Me), 2 '-O-metossietile (2 ′-MOE) 2 ′-fluoro e la (biciclico bloccato dell'acido nucleico LNA)23,24,25,26,27,28,29,30,31. Per una migliore efficienza della consegna in vivo , l'ipotesi possono essere modificato dai collegamenti fosforotioato (PS), che hanno aumentato la resistenza di nucleasi28. Inoltre, le modifiche di spina dorsale PS anche migliorano il legame alle proteine plasmatiche, ridurre l'escrezione urinaria. Così, PS-modificati recentemente mostrano un miglioramento significativo delle proprietà farmacocinetiche, facilitando la loro consegna sistemica32. Inoltre è stato dimostrato che utilizzando Acido peptidonucleico (PNA) o oligomeri di morpholino, progettati per indirizzare un miRNA specifici, può essere utilizzato per studiare miRNA fenotipi di perdita-de-funzione33,34,35, 36 , 37 , 38 , 39. recentemente PNA polilisina-coniugati e nanoparticelle-complessato inibire in modo efficiente il miRNA funzionare sia in vitro che in vivo36,37,38, 39. nonostante i recenti progressi, una consegna efficace e tessuto-specifica dei miRNA-derivati rimane una sfida. Questi includono il potenziale per gli effetti fuori bersaglio, innescando la risposta immunitaria innata e, soprattutto, ottenere una consegna specifica nelle cellule di organi/tessuti mirati.

Inoltre, i livelli di espressione di miRNA variano notevolmente a seconda della cellula e tessuto tipo40. Inoltre, l'espressione di miRNA può essere aumentata o diminuita nella malattia. La conseguenza di un'espressione di miRNA alterata e l'effetto sulla funzione cellulare e tessutale con espressione dei miRNA ha inibito la spugna deve essere convalidato e determinato empiricamente. Approfonditi studi preclinici in modelli animali di malattia sono necessari per determinare il livello ottimale dell'inibizione per un obiettivo determinato miRNA.

È interessante notare che, miRNA miR - 181c esibisce subcellulare compartimentalizzazione3,4,5. In particolare, come previsto, il miR-181s sono codificate nel nucleo e trascritto come trascrizioni di lungo-pri-miRNA che vengono elaborate nel citoplasma di macchinari dadini e inglobate RISC. Tuttavia, a differenza di Mirna canonici che funzionano nel citoplasma, la forma matura di miR - 181c trasloca in mitocondri e funzioni nella regolazione di geni mitocondriali specifici3. Abbiamo dimostrato che miR-181-spugna possibile associare la forma matura di miR - 181c nella frazione citoplasmatica, prevenendo così la traslocazione dei mitocondri. Di conseguenza, si può osservare un upregulation di mt-COX1 nei mitocondri nelle condizioni di una downregulation dell'espressione di miR - 181c.

Abbiamo segnalato la metodologia necessaria per progettare una miRNA-spugna per abbattere l'espressione di qualsiasi miRNA e delineato un protocollo per l'applicazione in vivo della miRNA-spugna. Tessuto-specifici miRNA inibizione è attualmente una tecnica sottosviluppata nel campo di miRNA. L'importanza della downregulation o inibizione funzionale dei miRNA sovraregolati nella malattia umana suggerisce che potrebbe essere possibile sfruttare miRNA biologia per intervento terapeutico.

Questo studio ha evidenziato una strategia per abbassare un miRNA, che può essere impiegato con successo in un modo tessuto-specifico in vivo. MiRNA-spugne utilizzano la sequenza antisenso della sequenza "seme" miRNA. Di conseguenza, miRNA-spugne possono downregulate tutti i miRNA che condividono lo stesso "seme" sequenza, cioè, la famiglia intera miRNA. In questo studio, abbiamo osservato un significativo downregulation dell'intera famiglia miR-181 (miR-181a, miR-181b, miR - 181c e miR - 181d) con l'espressione di miR-181-spugna, sia in vitro che in vivo. Se un membro della famiglia conferisce la protezione mentre un altro membro della famiglia ha effetti nocivi all'interno dell'organo stesso, utilizzando la tecnologia di miRNA-spugna non sarebbe l'approccio ideale.

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Disclosures

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Acknowledgments

Ringraziamo Anthony K. L. Leung del dipartimento di biochimica e biologia molecolare, Bloomberg School of Public Health, Johns Hopkins University per la sua tecnica aiutare con la progettazione del costrutto di miR-181-spugna. Ringraziamo anche Polina Sysa-Shah e Kathleen Gabrielson del dipartimento di molecolare e comparativa Pathobiology, Johns Hopkins Medical istituzioni per la loro assistenza tecnica per l'imaging in vivo della consegna miRNA-spugna.

Quest'opera è stata sostenuta da sovvenzioni dal NIH, HL39752 (di Charles Steenbergen) e da una sovvenzione scienziato sviluppo l'American Heart Association 14SDG18890049 (a Samarjit Das). Il promotore di cardio-specifico del ratto è stato generosamente fornito da Jeffery D. Molkentin all'ospedale pediatrico di Cincinnati.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
pEGFP-C1 vector Addgene 6084-1
In-fusion Clontech 121416
QIAprep Miniprep Qiagen 27104
QIAquick Gel Extraction Kit Qiagen 28704
miR-181-sponge synthesis Introgen GeneArt custome made
PCR primers Integrated DNA Technologies custome
EcoRI enzymes New Endland Biolabs R0101S
KpnI enzymes New Endland Biolabs R0142S
Rapid DNA Ligation Kit Sigma-Aldrich 11635379001
H9c2 cells ATCC CRL-1446
DMEM Media Thermo Fisher Scientific 11965092
Fetal Bovine Serum Thermo Fisher Scientific 10082139
Nucleofector 2b Device Lonza AAB-1001
Nucleofector Kits for H9c2 (2-1) Lonza VCA-1005
G418, Geneticin Thermo Fisher Scientific 11811023
FACSAria II Flow cytometer BD Bioscience 644832
Branson 450 sonifier Marshall Scientific EDP 100-214-239
The Xenogen IVIS Spectrum optical imaging device Caliper Life Sciences
Anti-MTCO1 antibody Abcam ab14705
α-tubulin antibody Abcam ab7291
Sequoia C256 ultrasound system Siemens

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Biologia problema 136 MicroRNA miRNA miRNA-spugna inibizione di miRNA nanoparticelle nanovector miR-181 cuore miRNA mitocondriale
<em>In Vivo</em> Nanovector consegna di una cuore specifici MicroRNA-spugna
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Kent, O. A., Steenbergen, C., Das, S. In Vivo Nanovector Delivery of a Heart-specific MicroRNA-sponge. J. Vis. Exp. (136), e57845, doi:10.3791/57845 (2018).

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