Doku özel mikroRNA inhibisyon mikroRNA alanında az gelişmiş bir teknolojidir. Burada, biz başarılı bir şekilde myoblast hücreleri miR-181 mikroRNA ailesinde kalp etkisizleştirmek için bir protokol tanımlamak. Nanovector teknoloji önemli vivo kardiyo özgü miR-181 aile inhibisyon gösteren sünger bir mikroRNA amacıyla kullanılabilir.
MikroRNA (miRNA) küçük çoğu mesajcı RNA (mRNA) ifade inhibe RNA kodlamayan. İnsan hastalıkları, kanser ve kardiyovasküler hastalık, gibi doku ve/veya hastalık ilerlemesi ile ilişkili hücre özgü miRNA ifade etkinleştirmek gösterilmiştir. MiRNA ifade inhibisyonu bir terapötik müdahale için potansiyel sunmaktadır. Ancak, miRNAs, antagomir oligonucleotides, istihdam etkisizleştirmek için geleneksel yaklaşımlar belirli miRNA işlevleri küresel teslim üzerine etkiler. Burada, bir sıçan modelinde bir protokol miR-181 aile içinde vivo kardiyo özgü inhibisyonu için mevcut. MiRNA-sünger yapı 10 tekrarlanan miR-181 bağlayıcı sıraları içerecek şekilde tasarlanmıştır. Kardiyo özgü α-MHC organizatörü kardiyo özgü miR-181 miRNA-sünger ifade sürmeyi pEGFP omurga klonlanmış. İstikrarlı bir hücre oluşturmak için ifade miR-181-sünger, myoblast H9c2 hücre satırı sahip α-MHC-EGFP-miR-181-sponge yapı transfected ve floresan aktif hücre paromisin ile kültürlü GFP olumlu H9c2 hücre içine (FACs) sıralama göre sıralanmış (G418). Paromisin istikrarlı büyüme, monoklonal hücre popülasyonlarının ek FACs ve tek hücre klonlama tarafından oluşturulur. Elde edilen myoblast H9c2-miR-181-sünger-GFP hücreleri yoluyla miR-181 hedef proteinlerin ifade artan değerlendirildi gibi miR-181 aile üyelerinin fonksiyon kaybı sergi ve kapış işlevsel olmayan sünger ifade H9c2 hücrelere kıyasla. Buna ek olarak, tarafından olumlu liposomal nano tanecikleri kullanılıyorsa ve olumsuz miR-181-sünger plazmid tahsil kompleks bir nanovector miR-181-sünger yapı sistemik teslim etmek için geliştirmek. GFP in vivo görüntüleme bir nanovector, üç haftalık süre içinde birden fazla kuyruk ven enjeksiyonları miR-181-sünger önemli bir ifade bir kardiyo özgü şekilde tanıtmak mümkün olduğunu ortaya koymaktadır. Önemlisi, miR-181 fonksiyon kaybı kalp doku ama böbrek veya karaciğer içinde görülmektedir. MiRNA-sünger doku özgü miRNA ifade etkisizleştirmek için güçlü bir yöntemdir. MiRNA-sünger ifade bir doku özgü organizatörü sürüş özgüllük bir hedef organ veya doku binayla miRNA inhibisyonu için sağlar. Ayrıca, nanovector ve miRNA-sünger teknolojileri birleştirerek bir etkili teslim ve doku özgü miRNA inhibisyon vivo içindeverir.
Son yirmi yılda insan hastalığında miRNAs önemli rol işaret çok sayıda çalışma yapılmıştır. Edebiyatı büyük gövdeli bulgular miRNAs kanser1 ve kardiyovasküler hastalık2,3,4,5gibi hastalıkların Patofizyoloji yadsınamaz önemini göstermek. Örneğin, miR-21 upregulated birçok kanserleri, sonuçlanan bir artan hücre döngüsü ve hücre proliferasyonu6‘ dir. Hepatit C enfeksiyonu, miR-122 virüs7çoğaltma içinde önemli bir rol oynar ve miR-122 inhibisyonu viral yük8azalır kanıtlanmıştır. İçinde kalp hipertrofisi, miR-212/132 upregulated ‘ kalbinde ve patolojik fenotip9‘ ilgilenmektedir. Bariz önemini downregülasyon ya da işlevsel bir upregulated miRNA inhibisyonu tedavi amaçlı hemen hemen tüm hastalıklar miRNA biyolojide istismar için fırsatlar öneriyor.
Dört miR-181 aile üyeleri, miR-181a/b/c/d, insan genomu üç genomik konumlarda bulunur. Kümenin miR-181-a/b-1’in bir kodlamayan RNA ana bilgisayar gen (MIR181A1-HG) intronic bölge kodlar. NR6A1 gen intronic bölge miR-181-a/b-2 kodlar. MiR-181-c/d küme uncharacterized bir transkript kromozom 19 üzerinde yer alır. Tüm miR-181 aile üyeleri aynı “tohum” sıra paylaşmak ve tüm dört miR-181 aile üyeleri büyük olasılıkla aynı mRNA hedefleri düzenleyen.
Biz3,4 ve diğerleri10 önemini miR-181 aile fertleri sırasında son aşama kalp yetmezliği parlak nokta. MiR – 181 c upregulation bir tip II diyabet gibi kalp hastalığı riski, obezite ve yaşlanma3,4,5ile ilişkili patolojik şartlar altında gerçekleşir de tanımış. Overexpression miR – 181 c kardiyak disfonksiyon4‘ e uzanan oksidatif stres nedenleri öne.
Çeşitli gruplar miRNA mitokondri11,12,13,14‘ te var, ama o miR – 181 c işlenen, nükleer genom türetilmiştir göstermek için ilk tavsiye ettiler ve sonradan mitokondri RISC3için translocated. Ayrıca, kalp5mitokondrial kompartımanda miR-181a ve miR-181b düşük bir ifade tespit etti. Da önemlisi, o miR – 181 c mt-COX1 mRNA ifade represses böylece miRNAs mitokondrial gen düzenlemesi katılmak ve mitokondriyal işlev3,4alter gösteren bulduk.
Bu makalede cardiomyocytes tüm miR-181 ailesinde aşağı vurmak için bir miRNA sünger tasarlamak için gerekli yöntemi anlatılmaktadır. Ayrıca, bir protokol miR-181-sünger vivo içinde uygulanması için anahat.
Bu makalede açıklanan tasarım ve sentez miRNA-sünger ve nasıl sünger doku özgü ifade doku özgü miRNA aile ifade etkisizleştirmek için güçlü bir araçtır gösterdi.
Sünger hedefleme miR-181 aile bir ifade plazmid ile bir kalp özgü organizatörü klonlanmış göstermiştir. Plazmid verimli bir şekilde nanovector parçacık’dır içine paketlenmiş vitro ve in vivo (Şekil 1) Elektroporasyon veya kuyruk ven enjeksiyon sırasıyl…
The authors have nothing to disclose.
Anthony K. L. Leung Bölümü Biyokimya ve moleküler biyoloji teşekkür ediyoruz, Bloomberg Halk Sağlığı Okulu, Johns Hopkins Üniversitesi onun teknik için miR-181-sünger yapı tasarlama konusunda yardım et. Biz de Polina Sysa-Şah ve Kathleen Gabrielson moleküler bölümü ve karşılaştırmalı Pathobiology, miRNA-sünger teslimat Johns Hopkins Tıp Kurumları yanında vivo içinde düşsel teknik yardım için teşekkür ederiz.
Bu eser NIH HL39752 (Charles Steenbergen için) gelen hibe ve Amerikan Kalp Derneği 14SDG18890049 bir bilim adamı kalkınma hibe (için tolga Das) tarafından desteklenmiştir. Sıçan kardiyo özgü organizatörü cömertçe Jeffery ö Molkentin Cincinnati çocuk hastanesinde tarafından sağlandı.
pEGFP-C1 vector | Addgene | 6084-1 | |
In-fusion | Clontech | 121416 | |
QIAprep Miniprep | Qiagen | 27104 | |
QIAquick Gel Extraction Kit | Qiagen | 28704 | |
miR-181-sponge synthesis | Introgen GeneArt | custome made | |
PCR primers | Integrated DNA Technologies | custome | |
EcoRI enzymes | New Endland Biolabs | R0101S | |
KpnI enzymes | New Endland Biolabs | R0142S | |
Rapid DNA Ligation Kit | Sigma-Aldrich | 11635379001 | |
H9c2 cells | ATCC | CRL-1446 | |
DMEM Media | Thermo Fisher Scientific | 11965092 | |
Fetal Bovine Serum | Thermo Fisher Scientific | 10082139 | |
Nucleofector 2b Device | Lonza | AAB-1001 | |
Nucleofector Kits for H9c2 (2-1) | Lonza | VCA-1005 | |
G418, Geneticin | Thermo Fisher Scientific | 11811023 | |
FACSAria II Flow cytometer | BD Bioscience | 644832 | |
Branson 450 sonifier | Marshall Scientific | EDP 100-214-239 | |
The Xenogen IVIS Spectrum optical imaging device | Caliper Life Sciences | ||
Anti-MTCO1 antibody | Abcam | ab14705 | |
α-tubulin antibody | Abcam | ab7291 | |
Sequoia C256 ultrasound system | Siemens |