Vev-spesifikke microRNA hemming er en teknologi som er underutviklet i feltet microRNA. Her beskriver vi en protokoll for vellykket hemme miR-181 microRNA familien i myoblast celler fra hjertet. Nanovector teknologi brukes til å levere en microRNA svamp som viser betydelig i vivo cardio-spesifikke miR-181 med familien hemming.
MicroRNA (miRNA) er liten ikke-koding RNA som hemmer post-transcriptional budbringer RNA (mRNA) uttrykk. Menneskelige sykdommer som kreft og kardiovaskulær sykdom, har blitt vist å aktivere vev og/eller cellen-spesifikke miRNA uttrykk forbundet med sykdomsprogresjon. Hemming av miRNA uttrykk tilbyr muligheter for en terapeutisk intervensjon. Tradisjonelle tilnærminger å hemme miRNAs, ansette antagomir oligonucleotides, påvirker imidlertid bestemte miRNA funksjoner ved globale levering. Her presenterer vi en protokoll for cardio-spesifikke i vivo hemming av miR-181 familien i en rotte modell. En miRNA-svamp konstruksjon er utformet for å inkludere 10 gjentatte miR-181 bindende sekvenser. Cardio-spesifikke α-MHC selskapet er klonet i pEGFP ryggraden å kjøre cardio-spesifikke miR-181 miRNA-svamp uttrykket. Hvis du vil opprette en stabil celle er uttrykke miR-181-svamp, myoblast H9c2 celler transfekterte med den α-MHC-EGFP-miR-181-sponge konstruere og sortert etter fluorescens-aktivert celle sortering (FACs) i GFP positivt H9c2 celler som er kultivert med neomycin (G418). Etter stabil vekst i neomycin, monoklonale celle populasjoner er etablert av ekstra FACs og enkelt celle kloning. De resulterende myoblast H9c2-miR-181-svamp-GFP cellene exhibit tap av funksjon av miR-181 familiemedlemmer som vurdert gjennom økt uttrykk for miR-181 målet proteiner og sammenlignet H9c2 celler uttrykke en scramble fungerer ikke svamp. I tillegg utvikle vi en nanovector for systemisk levering av miR-181-svamp Konstruer av complexing positivt ladet liposomal nanopartikler og negativt ladet miR-181-svamp plasmider. I vivo avbildning av GFP avslører at flere hale blodåre injeksjoner av en nanovector over en tre-ukers periode, kan fremme en betydelig uttrykk for miR-181-svamp på cardio-spesifikk måte. Viktigere, er tap av miR-181 funksjonen observert i hjertet tissue men ikke i nyre eller leveren. MiRNA-svamp er en kraftig metode å hemme vev-spesifikke miRNA uttrykk. Kjører miRNA-svamp uttrykket fra en vev-spesifikke promoter gir spesifisitet for miRNA hemming, som kan være begrenset til en målrettet organ eller vev. Videre tillater kombinerer nanovector og miRNA-svamp teknologi en effektiv levering og vev-spesifikke miRNA hemming i vivo.
De siste to tiårene, har det vært mange studier som har pekt på betydelig rollen som miRNAs i menneskelig sykdom. Resultatene fra en stor mengde litteratur viser unektelig betydningen av miRNAs i patofysiologien av sykdommer som kreft1 og hjerte-og karsykdommer2,3,4,5. For eksempel er miR-21 upregulated i mange kreftformer, som resulterer i en økt celle syklus og celle spredning6. I hepatitt C infeksjoner, miR-122 spiller en viktig rolle i replikering av virus7, og det har vist at hemming av miR-122 reduserer Virusmengden8. Hjerte-hypertrofi, miR-212/132 er upregulated i hjertet og er involvert i patologisk fenotypen9. Åpenbare betydningen av downregulation eller funksjonelle hemming av en upregulated miRNA antyder muligheter for terapeutisk utnytte miRNA biologi i nesten alle sykdommer.
Fire miR-181 familiemedlemmer, miR-181a/b/c/d, finnes i tre genomisk steder i det menneskelige genomet. Intronic regionen med et ikke-koding RNA vert (MIR181A1-HG) koder klyngen av miR-181-a/b-1. Intronic regionen av NR6A1 genet koder til miR-181-a/b-2. MiR-181-c/d klyngen ligger i en uncharacterized utskrift på kromosom 19. Alle miR-181 familiemedlemmer deler samme “frø” sekvens, og alle fire miR-181 familiemedlemmer kan potensielt regulere samme mRNA mål.
Vi3,4 og andre10 har understreket viktigheten av miR-181 familiemedlemmer under sluttstadiet hjertesvikt. Vi har også anerkjent at en miR – 181c oppregulering oppstår under patologiske forhold knyttet til en økt risiko for hjertesykdom, som type II diabetes, fedme og aldring3,4,5. Det har blitt postulert at overuttrykte av miR – 181c fører oksidativt stress som fører til hjerte-dysfunksjon4.
Flere grupper har antydet at miRNA finnes i mitokondrier11,12,13,14, men vi var de første til å demonstrere at miR – 181 c er avledet fra kjernefysiske genomet, behandlet, og senere translocated til mitokondrier i RISC3. Videre har vi oppdaget en lav uttrykk for miR-181a og miR-181b i mitokondrie rommet av hjertet5. Viktigere, har vi funnet at miR – 181c represses mt-COX1 mRNA uttrykket, og dermed demonstrere at miRNAs delta i mitokondrie genet regulering og endre mitokondrie funksjonen3,4.
Denne artikkelen beskriver metodene som kreves for å utforme en miRNA-svamp å slå ned hele miR-181 familien i cardiomyocytes. Videre skissere vi en protokoll for programmet i vivo av miR-181-svampen.
Denne artikkelen beskrives design og syntese av miRNA-svampen og vist hvordan vev-spesifikke uttrykk for svamp er et kraftig verktøy for å hemme vev-spesifikke miRNA familie uttrykk.
Vi har vist at en miR-181 familie målretting svamp kan klones i et uttrykk plasmider med en hjerte-spesifikke promoter. Plasmider effektivt kan pakkes inn i en nanovector partikkel for levering i vitro og i vivo med electroporation eller en hale blodåre injeksjon, henholdsvis (<strong class="…
The authors have nothing to disclose.
Vi takker Anthony K. L. Leung avdeling for biokjemi og molekylærbiologi, Bloomberg School of Public Health, Johns Hopkins University for hans teknisk hjelpe med å utforme den miR-181-svamp konstruere. Vi takker også Polina Sysa-Shah og Kathleen Gabrielson Institutt for molekylær og komparative Pathobiology, Johns Hopkins medisinske institusjoner for deres teknisk assistanse av i vivo -tenkelig miRNA-svamp levering.
Dette arbeidet ble støttet av tilskudd fra NIH, HL39752 (til Charles Steenbergen) og en forsker Development Grant fra American Heart Association 14SDG18890049 (til Samarjit Das). Rotte cardio-spesifikke selskapet ble sjenerøst gitt av Jeffery D. Molkentin ved Cincinnati Children’s Hospital.
pEGFP-C1 vector | Addgene | 6084-1 | |
In-fusion | Clontech | 121416 | |
QIAprep Miniprep | Qiagen | 27104 | |
QIAquick Gel Extraction Kit | Qiagen | 28704 | |
miR-181-sponge synthesis | Introgen GeneArt | custome made | |
PCR primers | Integrated DNA Technologies | custome | |
EcoRI enzymes | New Endland Biolabs | R0101S | |
KpnI enzymes | New Endland Biolabs | R0142S | |
Rapid DNA Ligation Kit | Sigma-Aldrich | 11635379001 | |
H9c2 cells | ATCC | CRL-1446 | |
DMEM Media | Thermo Fisher Scientific | 11965092 | |
Fetal Bovine Serum | Thermo Fisher Scientific | 10082139 | |
Nucleofector 2b Device | Lonza | AAB-1001 | |
Nucleofector Kits for H9c2 (2-1) | Lonza | VCA-1005 | |
G418, Geneticin | Thermo Fisher Scientific | 11811023 | |
FACSAria II Flow cytometer | BD Bioscience | 644832 | |
Branson 450 sonifier | Marshall Scientific | EDP 100-214-239 | |
The Xenogen IVIS Spectrum optical imaging device | Caliper Life Sciences | ||
Anti-MTCO1 antibody | Abcam | ab14705 | |
α-tubulin antibody | Abcam | ab7291 | |
Sequoia C256 ultrasound system | Siemens |