Vävnad-specifika mikroRNA hämning är en teknik som är underutvecklad i fältet mikroRNA. Häri, beskriver vi ett protokoll för att framgångsrikt hämma familjen miR-181 mikroRNA i gorgina celler från hjärtat. Nanovector teknik används för att leverera en mikroRNA svamp som visar betydande i vivo cardio-specifika miR-181 familj hämning.
MikroRNA (miRNA) är små icke-kodande RNA som hämmar post-transcriptional budbärar-RNA (mRNA) uttryck. Sjukdomar, som cancer och hjärt-kärlsjukdom, har visat att aktivera vävnad eller cell-specifika miRNA uttryck som är associerat med sjukdomsprogression. Hämning av miRNA uttryck erbjuder möjlighet till en terapeutisk intervention. Traditionella metoder att hämma MicroRNA, anställa antagomir oligonukleotider, påverkar dock specifika miRNA funktioner vid global leverans. Häri, presenterar vi ett protokoll för i vivo cardio-specifik hämning av familjen miR-181 i en råtta modell. En miRNA-svamp konstruktion syftar till att omfatta 10 upprepade anti-miR-181 bindande sekvenser. Cardio-specifika α-MHC arrangören är klonade in pEGFP ryggraden att köra cardio-specifika miR-181 miRNA-svamp uttrycket. För att skapa en stabil cell finns line uttrycker den miR-181-svamp, gorgina H9c2 celler transfekterade med den α-MHC-EGFP-miR-181-sponge konstruktionen och sorterade fluorescens-aktiverad cell sortering (FACs) i GFP positiva H9c2 celler som odlas med neomycin (G418). Efter stabil tillväxt i neomycin, monoklonala cellpopulationer fastställs av ytterligare FACs och enda cell kloning. De resulterande gorgina H9c2-miR-181-svamp-GFP cellerna uppvisar en förlust av funktion i miR-181 familjemedlemmar bedömt genom det ökat uttrycket av miR-181 målproteiner och jämfört med H9c2 celler som uttrycker en rusning icke-funktionella svamp. Dessutom utvecklar vi en nanovector för systemisk leverans av den miR-181-svamp konstruktionen av komplexbildande positivt laddade liposomalt nanopartiklar och negativt laddade miR-181-svamp plasmider. In vivo imaging av GFP avslöjar att flera svans ven injektioner av en nanovector under en tre veckors period ska kunna främja en betydande uttryck av miR-181-svampen på ett hjärt-specifika sätt. Ännu viktigare, observeras en förlust av miR-181 funktion i hjärtat men inte i njurarna eller levern. MiRNA-svampen är en kraftfull metod att hämma vävnadsspecifika miRNA uttryck. Körning uttrycket miRNA-svamp från en vävnad-specifika promotorn ger specificitet för miRNA hämning, som kan begränsas till en riktad organ eller vävnad. Dessutom möjliggör att kombinera nanovector och miRNA-svamp teknik en effektiv leverans och vävnadsspecifika miRNA hämning i vivo.
Under de senaste två decennierna, har förekommit många studier som har pekat på den betydande roll MicroRNA i mänskliga sjukdomar. Resultat från en stor mängd litteratur visar obestridligt vikten av MicroRNA i patofysiologin av sjukdomar, såsom cancer1 och hjärt-kärlsjukdom2,3,4,5. MiR-21 är exempelvis uppreglerad i många cancerformer, vilket resulterar i en ökad cellcykeln och cell spridning6. MiR-122 spelar en viktig roll i replikeringen av virus7i hepatit C infektioner, och det har visat att hämning av miR-122 minskar den virusmängd8. I hjärthypertrofi, miR-212/132 är uppreglerad i hjärtat och är involverad i patologiska fenotyp9. Den uppenbara betydelsen av nedreglering eller funktionella hämning av en uppreglerad miRNA antyder möjligheter för terapeutiskt utnyttjar miRNA biologi i nästan alla sjukdomar.
De fyra miR-181 familjemedlemmarna, miR-181a/b/c/d, finns i tre genomisk platser i det mänskliga genomet. Regionen intronic i en icke-kodande RNA värd gen (MIR181A1-HG) kodar kluster av miR-181-a/b-1. Regionen intronic i den NR6A1 genen kodar den miR-181-a/b-2. MiR-181-c/d klustret ligger i en uncharacterized avskrift på kromosom 19. Alla miR-181 familjemedlemmarna dela samma ”frö” sekvens och alla fyra miR-181 familjemedlemmar kan potentiellt reglera samma mRNA mål.
Vi3,4 och andra10 har betonat vikten av miR-181 familjemedlemmar under slutstadiet hjärtsvikt. Vi har också erkänt att en miR – 181c uppreglering uppstår under sjukdomstillstånd som är associerad med en ökad risk för hjärtsjukdom, såsom diabetes typ II, fetma och åldrande3,4,5. Det har föreslagits att överuttryck av miR – 181c orsakar oxidativ stress som leder till en hjärt-dysfunktion4.
Flera grupper har föreslagit att miRNA finns i mitokondrierna11,12,13,14, men vi var de första att visa att miR – 181 c härrör från kärntekniska genomet, bearbetas, och därefter flyttad till mitokondrierna i RISC3. Dessutom har vi upptäckt ett lågt uttryck av miR-181a och miR-181b i mitokondriell facket av hjärtat5. Ännu viktigare, har vi funnit att miR – 181c förtrycker mt-COX1 mRNA uttrycket, vilket visar att MicroRNA delta i det mitokondriella genreglering och förändra mitokondriefunktion3,4.
I artikeln beskrivs de metoder som krävs för att utforma en miRNA-svamp för att slå ner hela miR-181 familjen i hjärtmuskelceller. Dessutom beskriver vi ett protokoll för programmet i vivo av miR-181-svampen.
Den här artikeln beskrivs design och syntes av en miRNA-svamp och visat hur vävnadsspecifika uttrycket av svampen är ett kraftfullt verktyg att hämma vävnadsspecifika miRNA familjeuttryck.
Vi har visat att en miR-181 familj inriktning svamp kan klonas in i ett uttryck plasmid med en hjärt-specifika promotorn. Plasmiden kan vara effektivt förpackad till en nanovector för leverans både in vitro- och in-vivo med elektroporation eller en svans ven injektion, respektive (…
The authors have nothing to disclose.
Vi tackar Anthony K. L. Leung av Institutionen för biokemi och molekylärbiologi, Bloomberg School of Public Health, Johns Hopkins University för hans tekniska hjälp utforma den miR-181-svamp bygga. Vi tackar också Polina Sysa-Shah och Kathleen Gabrielson av Department of Molecular och jämförande patobiologi, Johns Hopkins Medical institutioner för deras tekniskt bistånd av de in-vivo imaging av miRNA-Sponge leveransen.
Detta arbete fick stöd genom bidrag från NIH, HL39752 (till Charles Steenbergen) och av en vetenskapsman utveckling bidrag från den American Heart Association 14SDG18890049 (till Samarjit Das). Rat cardio-specifika promotorn lämnades generöst av Jeffery D. Molkentin vid Cincinnati Children’s Hospital.
pEGFP-C1 vector | Addgene | 6084-1 | |
In-fusion | Clontech | 121416 | |
QIAprep Miniprep | Qiagen | 27104 | |
QIAquick Gel Extraction Kit | Qiagen | 28704 | |
miR-181-sponge synthesis | Introgen GeneArt | custome made | |
PCR primers | Integrated DNA Technologies | custome | |
EcoRI enzymes | New Endland Biolabs | R0101S | |
KpnI enzymes | New Endland Biolabs | R0142S | |
Rapid DNA Ligation Kit | Sigma-Aldrich | 11635379001 | |
H9c2 cells | ATCC | CRL-1446 | |
DMEM Media | Thermo Fisher Scientific | 11965092 | |
Fetal Bovine Serum | Thermo Fisher Scientific | 10082139 | |
Nucleofector 2b Device | Lonza | AAB-1001 | |
Nucleofector Kits for H9c2 (2-1) | Lonza | VCA-1005 | |
G418, Geneticin | Thermo Fisher Scientific | 11811023 | |
FACSAria II Flow cytometer | BD Bioscience | 644832 | |
Branson 450 sonifier | Marshall Scientific | EDP 100-214-239 | |
The Xenogen IVIS Spectrum optical imaging device | Caliper Life Sciences | ||
Anti-MTCO1 antibody | Abcam | ab14705 | |
α-tubulin antibody | Abcam | ab7291 | |
Sequoia C256 ultrasound system | Siemens |