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Biology

In Vivo Nanovector livraison d’une coeur spécifiques microARN-éponge

Published: June 15, 2018 doi: 10.3791/57845
Automatic Translation
1, 2, 2
1Princess Margaret Cancer Centre, University of Toronto, 2Department of Pathology, Department of Cardiology, Johns Hopkins University

Summary

L’inhibition spécifique des tissus micro-ARN est une technologie qui est sous-développé dans le domaine des micro-ARN. Ici, nous décrivons un protocole pour empêcher avec succès la famille miR-181 micro-ARN dans des cellules myoblastiques du cœur. Technologie Nanovector est utilisée pour livrer un microARN éponge illustrant l’importante en vivo cardio spécifique miR-181 famille inhibition.

Abstract

MicroARN (miARN) est petit non codant l’ARN qui inhibe l’expression post-transcriptionnelle ARN messager (ARNm). Des maladies humaines, comme le cancer et les maladies cardiovasculaires, ont été démontrés pour activer des tissus et/ou spécifiques des cellules miRNA expression associée à la progression de la maladie. L’inhibition de l’expression de miRNA offre la possibilité d’une intervention thérapeutique. Cependant, les approches traditionnelles d’inhiber les miARN, utilisant des oligonucléotides antagomir, affectent miRNA spécifiques fonctions lors de la livraison mondiale. Ici, nous présentons un protocole pour l’inhibition in vivo cardio spécifique de la famille de miR-181 dans un modèle de rat. Une construction de miRNA-éponge est conçue pour inclure les 10 séquences répétées de liaison anti-pré-Mir-181. Le promoteur de cardio propres α-MHC est cloné dans l’épine dorsale de pEGFP pour conduire l’expression spécifique cardio miR-181 miRNA-éponge. Pour créer une cellule stable lignée exprimant le miR-181-éponge, les myoblastes H9c2 cellules est transfectée avec la construction de α-MHC-EGFP-miR-181-sponge et triée par cellule activée par fluorescence (FACs) de tri en cellules H9c2 positives de GFP, qui sont cultivées avec la néomycine (G418). Suite à une croissance stable à la néomycine, populations de cellules monoclonales sont établies par FACs supplémentaires et le clonage de cellules du même. Les cellules de H9c2-miR-181-éponge-GFP de myoblastes qui en résulte présentent une perte de fonction des membres de la famille miR-181 tel qu’évalué par le biais de l’augmentation de l’expression des protéines cibles miR-181 et par rapport aux cellules H9c2 exprimant une éponge non-fonctionnel scramble. En outre, nous développons un nanovector pour la délivrance systémique de la construction de miR-181-éponge par complexation chargés positivement les nanoparticules liposomales et chargés négativement les plasmides de miR-181-éponge. L’imagerie in vivo de GFP révèle que les injections multiples de queue veineuse d’une nanovector sur une période de trois semaines sont capables de promouvoir une expression significative de la miR-181-éponge dans une manière spécifique cardio. Ce qui est important, une perte de fonction de miR-181 est observée dans le tissu cardiaque, mais pas dans les reins ou le foie. L’éponge-miRNA est une méthode puissante pour inhiber l’expression tissu-spécifique miRNA. L’expression de miRNA-éponge au volant d’un promoteur spécifique aux tissus fournit la spécificité pour l’inhibition de miRNA, qui peut se limiter à un organe ciblé ou un tissu. En outre, combinant les technologies nanovector et miRNA-éponge permet une livraison efficace et spécifique des tissus miRNA inhibition in vivo.

Introduction

Au cours des deux dernières décennies, il y a eu de nombreuses études qui ont souligné le rôle important des miARN dans la maladie humaine. Résultats d’un vaste corpus de littérature démontrent l’importance indéniable des miARN dans la physiopathologie des maladies comme le cancer1 et maladies cardiovasculaires2,3,4,5. Par exemple, miR-21 est augmenté dans nombreux cancers, ce qui entraîne une prolifération accrue cycle cellulaire et la cellule6. Dans les infections de virus de l’hépatite C, miR-122 joue un rôle important dans la réplication du virus7, et il a été démontré que l’inhibition de miR-122 diminue la charge virale8. Dans l’hypertrophie cardiaque, miR-212/132 est augmentée dans le cœur et est impliqué dans le phénotype pathologique9. L’importance évidente de la diminution de l’expression ou l’inhibition fonctionnelle d’un miRNA surexprimés suggère des possibilités d’exploitation thérapeutique de la biologie de miRNA dans presque toutes les maladies.

Les quatre membres de famille miR-181, miR-181 a/b/c/d, sont trouvent dans trois sites génomiques dans le génome humain. La région intronic d’un gène du hôte d’ARN non codants (MIR181A1-HG) encode le cluster de miR-181-a/b-1. La région intronic du gène NR6A1 encode le miR-181-a/b-2. Le cluster de miR-181-c/d se trouve dans un relevé de notes non caractérisé sur le chromosome 19. Tous les membres de la famille miR-181 partagent la même séquence de « semences » et tous les quatre membres de famille miR-181 peuvent potentiellement réguler les mêmes objectifs d’ARNm.

Nous avons3,4 et autres10 ont mis en évidence l’importance de miR-181 membres de la famille au cours de l’insuffisance cardiaque terminale. Nous avons également reconnu qu’une upregulation de miR - 181c se produit dans des conditions pathologiques associées à un risque accru de maladie cardiaque, tels que diabète de type II, obésité et vieillissement3,4,5. Il a été postulé que la surexpression de miR - 181c cause un stress oxydatif qui mène à une dysfonction cardiaque4.

Plusieurs groupes ont suggéré que miRNA existent dans les mitochondries11,12,13,14, mais nous avons été les premiers à démontrer que miR - 181 c est dérivé le génome nucléaire, traité, et par la suite déplacés vers les mitochondries dans le RISC3. En outre, nous avons détecté une faible expression de miR-181 et miR-181 dans le compartiment mitochondrial du cœur5. Ce qui est important, nous trouvons que miR - 181c réprime l’expression de l’ARNm mt-COX1, démontrant ainsi que les miARN participe à la régulation du gène mitochondrial et altérer la fonction mitochondriale3,4.

Cet article décrit la méthodologie requise pour concevoir une miRNA-éponge d’abattre toute la famille de miR-181 dans les cardiomyocytes. En outre, nous exposons un protocole pour l’application in vivo de le miR-181-éponge.

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Protocol

Toutes les procédures expérimentales ont été approuvées par l’animalier institutionnel et utilisation Comité de l’Université Johns Hopkins.

1. éponge Design

  1. Micro-ARN liaison 3' UTR
    Remarque : Fonctions de miRNA A travers interactions appariements base spécifiques avec des sites complémentaires partiellement dans la région 3' non traduite (UTR) de son ARNm cible (pour un examen complet, voir Bartel)15.
    1. Concevoir les inhibiteurs de miRNA expression comme oligonucléotides contenant une complémentarité importante à la séquence de miRNA. Séquestrer un miRNA dans un oligonucléotide complex grâce à une vaste base appariement pour bloquer la fonction de miRNA.
  2. Conception d’une éponge de miRNA
    1. Conception disposés en tandem des séquences de miRNA partiellement complémentaires afin d’inclure un renflement à la position normalement clivé par Argonaute 2. Le renflement est positionné à 9-12 les nucléotides de la séquence des miARN matures pour empêcher toute RNA interférence type clivage et la dégradation de l’éponge.
    2. Si vous le souhaitez, concevoir la séquence cible de leurre pour lier à tous les membres de la famille miR-181. Après un examen et comparaison des séquences miRNA famille miR-181, trouver une séquence commune du côté 5' des Ardennes contenant 8 nucléotides consécutifs, ou trouver une séquence commune à tous les membres de famille 4 miR-181 du côté 3'-des Ardennes de 8 supplémentaires nucléotides consécutifs. Ces 2 séquences représentent les sites de fixation de moitié droite et gauche, respectivement.
      Remarque : La séquence de leurre est un tableau de tandem des sites de fixation de moitié gauche et droit séparés par une entretoise GGA. Relier la séquence 5'-fin et la séquence du côté 3' (décrit à l’étape 1.2.2) avec un espacement GGA conçu pour créer des Ardennes quand recuit à un miRNA (comme indiqué au point 1.2.1). Répétez cet 1 site de liaison de miRNA 10 x dans la construction finale miR-éponge.
  3. Autres considérations d’éponge de miRNA
    Remarque : Pour cloner la séquence d’éponge dans le vecteur d’expression destinataire, sites de reconnaissance de nucléase restriction doivent être incluses à chaque extrémité de la séquence. Une analyse de digestion in silico devrait être utilisée pour confirmer le clivage non spécifique de la séquence de l’éponge par les enzymes de restriction choisies et d’autres enzymes de restriction utilisées dans des applications de clonage en aval.
    1. Ajouter un codon d’arrêt double (TAA TAA) à l’extrémité 5' de la synthèse 3' UTR, telle que la séquence de miR-181-éponge ne fait pas partie de la séquence codant pour une protéine fluorescente verte améliorée (EGFP).
  4. Synthèse de l’ADN d’éponge pour le clonage
    1. Utiliser un synthétiseur d’ADN ou d’employer une source disponible dans le commerce pour synthétiser la séquence d’éponge miRNA final avec les sites de reconnaissance de nucléase de restriction en place pour le clonage. L’éponge est livré sur un plasmide qui peut contenir des marqueurs optionnels pour une amplification chez les bactéries. En outre, l’éponge peut être amplifiée par une réaction en chaîne par polymérase (PCR) pour le clonage ou ont tout simplement abandonné le vecteur de donneur, vous utilisez les sites de restriction décrits à l’étape 1.3 (en outre, reportez-vous à l’étape 3.1).

2. le bénéficiaire vecteur afin d’inclure un promoteur spécifique aux tissus de clonage

Note : Utiliser le vecteur pEGFP-C1 comme le vecteur bénéficiaire pour la cassette d’expression de l’éponge de miRNA. Le vecteur pEGFP-C1 contient une trame de lecture pour un EGFP pilotée par un promoteur de cytomégalovirus (CMV). Le promoteur du CMV est constitutivement actif dans les cellules de mammifères. Si un promoteur de tissu-spécifique est requis, le promoteur de CMV peut être retiré par digestion d’enzymes AseI et NheI (reportez-vous à l’étape 2.1). Le plasmide contient un vaste site multiple de clonage (MCS) ainsi que la kanamycine (Kan) et marqueurs de néomycine (G418) pour une sélection chez les bactéries et une expression stable dans les cellules de mammifères, respectivement.

  1. Retirer le promoteur CMV pEGFP-C1
    1. Faire 50 μL de réaction de digestion contenant 1 x tampon digest disponible dans le commerce, suggérée par la fabrication des enzymes de restriction utilisées, 5 μg de plasmide ADN (en eau) et 5 μl d’enzymes AseI et NheI. Ajouter tous les composants dans un tube de microcentrifuge et mélangez-les délicatement par pichenette elle. Tourner le tube pendant 10 s dans une micro-centrifugeuse pour recueillir la réaction au fond. Incubez la réaction dans un bain-marie à 37 ° C pendant 15 min.
    2. Purifier le plasmide linéarisé digéré. Ajouter 5 fois le volume réactionnel de tampon de liaison de colonne (un mélange exclusif de la mémoire tampon de liaison appropriée pour la fabrication des colonnes de purification de l’ADN utilisé) et purifier la réaction avec une colonne de purification de l’ADN comme indiqué par le fabricant. Éluer avec 25 μL de tampon d’élution (eau) ajouté prudemment vers le centre de la colonne.
    3. Gel de purifier le plasmide digéré sur gel d’agarose 0,5 % comme suit : ajouter 5 μl de tampon (50 % de glycérol-3 x chargement colorant) de chargement pour le plasmide éluée. Charger la totalité de l’échantillon dans 1 bien sur gel d’agarose à 0,5 %. Inclure un couloir séparé avec 500 ng du vecteur non circonci. Exécutez-le pour 30-40 min jusqu'à l’obtention d’une séparation adéquate des plasmides coupés et non circoncis.
    4. Purifier le plasmide linéarisé comme suit : visualiser l’ADN contenu dans le gel d’agarose sur une boite à lumière UV. Avec une lame de rasoir propre, soigneusement exciser la bande correspondant à la plasmide linéaire.
      Remarque : Le plasmide linéaire devrait fonctionner plus bas que le plasmide non circonci et apparaît comme une seule bande à environ 4,2 kb. Le promoteur de CMV excisé apparaîtra comme une bande de lumière à environ 500 nucléotides (nt).
    5. Extraire l’ADN de la tranche de gel à l’aide d’un kit disponible dans le commerce et éluer l’ADN de la colonne avec 25 μL d’eau.
  2. Clonage d’un promoteur spécifique coeur en pEGFP-C1
    Remarque : Le promoteur de la chaîne lourde de myosine-alpha (α-MHC) a été précédemment caractérisé et démontré pour diriger les niveaux robustes d’expression restreinte cardiaque tel que décrit dans le suivant Molkentin, Jobe et Markham16. Les sections suivantes décrivent comment amplifier le promoteur du vecteur de clonage.
    1. Cloner le promoteur de le α-MHC entre éléments + 420 à-2934 par rapport à la site de début de transcription dans le plasmide de p4016 d’abord concevoir des amorces PCR qui entourent cette région, puis le plasmide comme gabarit pour l’ACP. Amplifier la région promotrice en utilisant des amorces PCR décrites précédemment5. Amorces PCR et inverses contiennent des séquences de chevauchement aux extrémités digérées de le pEGFP-C1 (étape 2.1) pour permettre le clonage réalisée en Fusion. Consultez le manuel de l’In-Fusion pour une explication détaillée de la conception d’amorce pour le clonage In-Fusion. Séquences d’amorces sont trouvent dans le tableau 1.
    2. Préparer une réaction de PCR 50 μL, qui contient 1 μM de chaque amorce et 10 ng d’ADN. Ajouter une quantité appropriée de l’enzyme de la PCR et dNTPs selon la fabrication des réactifs PCR choisi. Effectuer des PCR sur un bloc de cyclisme ADN standard. Effectuer un 3 min 98 ° C dénaturation étape, suivi par 35 cycles de dénaturation, recuit et extension pour 5, 30 et 120 s chacun, respectivement. Inclure une extension finale de 10 min à 72 ° C.
    3. Nettoyer l’extraction PCR et le gel. À la fin du cycle de PCR, ajouter 5 fois le volume de la réaction du tampon de liaison de colonne à la réaction de PCR et de le purifier avec une colonne de purification de l’ADN comme indiqué par le fabricant. Éluer le mélange avec 25 μL de tampon d’élution (eau) ajouté prudemment vers le centre de la colonne.
      1. Ajouter 5 μl de tampon [50 % de glycérol (3 x) de chargement colorant] de chargement à élution de plasmide. Charger la totalité de l’échantillon dans 1 bien sur gel d’agarose à 1 %. Exécutez-le pour 30-40 min ; visualiser et d’accise du produit PCR comme décrit ci-dessus (étape 2.1.5).
    4. Ligaturer le promoteur de le α-MHC avec pEGFP-C1 comme suit : ajouter la réaction de ligature de 10 μL contenant 1 x tampon disponible dans le commerce de la ligature, 2 μL de PCR purifié et 1 μL de vecteur linéarisé. Effectuer la ligature à 50 ° C pendant 15 min et puis refroidir sur glace.
    5. Exécuter une transformation bactérienne comme suit : transfecter 50 μL de cellules compétentes avec 2,5 μl du mélange de ligation In-Fusion en ajoutant les composants. Reposer le Eppendorf tube sur la glace pendant 20 min, placez-le dans un bain-marie à 42 ° C pendant 40 s et puis placer le tube sur la glace pendant 2 min.
      1. Après la transformation, ajoutez 350 μL de médias SOC et la croissance de cellules à 37 ° C pendant 45 min. plaque 200 μL de solution d’excroissance sur plaques LB avec kan. effectuer une colonie PCR pour identifier les cellules résistantes à la Kan qui contiennent la ligature de promoteur de α-MHC.
        Remarque : Dépistage amorces visaient à PCR à travers la jonction de la ligature.
    6. Développez les clones positifs de PCR dans bouillon LB-Kan et plasmides purifiés à l’aide de protocoles de purification pour le plasmide standard mini-préparent comme indiqué par le fabricant.

3. clonage l’éponge

  1. Digérer le vecteur destinataire
    1. Faire le plasmide de α-MHC-pEGFP linéaires de clonage avec EcoRI et KpnI et purifier le gel comme décrit ci-dessus (étape 2.1).
  2. PCR amplification et digérer l’éponge ADN
    1. Utilisez le scramble 284-nt-long miR-181-éponge et correspondant, vecteurs d’expédition comme modèle pour l’ACP. Amplifier la région éponge l’utilisation décrite précédemment d’amorces PCR5. Notez que les amorces de PCR avant et arrière renfermant des séquences d’enzyme de restriction afin de permettre la ligature en α-MHC-pEGFP-C1. Effectuer la PCR comme décrit ci-dessus (étape 2.2.2). Purifier les produits PCR avant la digestion comme décrit (étape 2.2.3) et eux élué avec de l’eau pour la digestion. Pour les séquences d’amorces, consultez Table 1.
    2. Digérer l’ADN d’éponge pour la ligature. Une réaction de digestion 50 μL contient 1 x tampon digest, la réaction de PCR gel purifié de l’étape 3.2.1 et 5 μL d’enzymes fois EcoRI et KpnI. Ajouter tous les composants dans un tube de microcentrifuge et mélangez-les délicatement par pichenette elle. Tourner le tube pendant 10 s dans une micro-centrifugeuse pour recueillir la réaction au fond. Incubez la réaction dans un bain-marie à 37 ° C pendant 15 min.
    3. Purifier l’éponge PCR digéré à l’aide d’une colonne de nettoyage PCR comme décrit plus haut (étape 2.2.1).
  3. Ligaturer le miR-181-éponge en vecteur α-MHC-pEGFP-C1
    1. Mettre en place une réaction de ligature μL 21 qui contient 1 x tampon de ligature, 3 μL de digéré et purifié PCR miR-181-éponge, 1 μL de vecteur linéarisé de α-MHC-pEGFP-C1, 1 tampon d’ADN x et 1 μL de DNA ligase. Effectuer la ligature à température ambiante pendant 5 min et puis placez-le sur la glace.
    2. Transformer 50 μL de cellules compétentes XL1-bleu avec 2 μl du mélange de ligature. Utilisez la transformation et l’électrodéposition de protocoles tel que décrit ci-dessus (2.2.5 étape). Effectuer une colonie PCR pour identifier des bactéries résistantes Kan qui contiennent la bonne séquence de α-MHC-pEGFP-miR-181-sponge. Conception des amorces pour la PCR de dépistage à travers la jonction de la ligature. Voir le tableau 1 pour les séquences d’amorces.
    3. Amplifier et le vecteur de la séquence. Développez les clones positifs de PCR dans bouillon LB-Kan et plasmides purifiés à l’aide de protocoles de purification pour le plasmide standard mini-préparent. Effectuer un séquençage de l’ADN pour vérifier le plasmide exprimant les séquences d’ADN désirées.

4. génération de cellules exprimant du miR-181-éponge H9c2 Stable

  1. Croissance et le maintien des cellules H9c2
    1. Cellules de culture de la H9c2 dans de l’aigle de la modification de Dulbecco Medium (DMEM) contenant du sérum fœtal (SVF) à une concentration finale de 10 %. La culture sous les cellules à l’aide de protocoles standard et cultivez-les à 37 ° C à 5 % de dioxyde de carbone.
  2. Transfection et sélection de H9c2 α-MHC-pEGFP-C1-miR-181-sponge exprimant des cellules
    1. Effectuer une électroporation des cellules H9c2 pour de meilleurs résultats. Transfecter myoblastes de rat (H9c2) avec une éponge scramble (une séquence de scramble 284-nt-long qui remplace la miR-181-éponge-séquence) ou la construction de α-MHC-pEGFP-miR-181-sponge avec un électroporateur.
      1. Transfecter brièvement, 4 x 10-5 cellules avec 2 μg d’ADN plasmidique (dans 5 µL d’H2O) et 100 µL d’une solution compatible avec le dispositif d’électroporation. Utilisez un programme d’électroporation de DS-120 à transfecter les cellules H9c2.
      2. Incuber les cellules transfectées dans la cuve pendant 10 min à température ambiante. Ajouter 500 µL de DMEM directement à la cuve. Transférer doucement le contenu de la cuve totale à un puits d’une plaque de 6 puits.
    2. Sélectionner des cellules positives GFP après transfection après 48 h de FACs. Seules les cellules GFP-exprimé la plaque dans une plaque de 6 puits avec un ajout de néomycine (G418) (400ng/mL) pour les milieux de culture complet.
      Remarque : Avant d’avoir sélectionné G418, une courbe de tuer devrait être établie afin de déterminer le montant de néomycine requis pour la sélection. Pour les cellules H9c2, 400 ng/mL de G418 a entraîné une environ 80 % de taux de mortalité des non-plasmide transfected des cellules H9c2 après 24h et était considéré comme la concentration de travail désirée de G418 pour ces cellules. La lignée cellulaire était considéré comme stable après que la croissance a été maintenue en G418 pendant 16 jours.
    3. Effectuer le tri de FACs des cellules G418 stables à l’aide de l’expression de la GFP comme marqueur pour une sélection positive de l’éponge. Les semences 5 à 10 cellules dans chaque puits d’une plaque 96 puits par tri des flux. Développez les cellules monoclonales de la plaque à 96 puits à plaques 24 puits sur plusieurs passages. Utilisation du congélateur stocks de cellules de passage 3 cellules (P3) comme point de départ pour des expériences ultérieures.
    4. Effectuer toutes les expériences de cellule-ligne-basée avec cellules de faible-passage entre P5 et P10.

5. synthèse et Purification de l’éponge-nanoparticules (miR-181-éponge nanoparticules)

  1. Préparer les nanoparticules LIPOSOMALES en dissolvant cationique amphiphile (DOTAP) et des lipides, cholestérol et DSPE-PEG-OMe, dans un rapport de mM 5:5:0.1, respectivement, dans un mélange de chloroforme / méthanol dans un flacon en verre.
  2. Éliminer le solvant organique à 44-45 ° C, sous un vide à l’aide d’un évaporateur rotatif, suivi d’un léger courant d’azote sec. Garder le film sec restant de lipides sous un vide poussé pendant 8 h.
  3. Préparer un mélange en ajoutant 5 % de glucose dans le film lipidique séchés sous vide. Laisser toute la nuit pour permettre à ce mélange hydrater le film. Vortex le flacon pendant 2 à 3 min à température ambiante afin de produire des vésicules multilamellaires avec une agitation occasionnels dans un bain d’eau de 45 ° C.
    1. Laisser agir les vésicules multilamellaires pour préparer des petites vésicules unilamellaires dans un bain de glace pendant 3-4 min jusqu'à ce que la clarté peut être observée, à un cycle de 100 % et de 25 W puissance de sortie.
  4. Mélanger une séquence scramble ou une séquence de miR-181-éponge clonés dans les vecteurs de la pEGFP(α-MHC) et les liposomes sur une base de ratio 1:3 frais pour former le nanovector4.
    Remarque : Un complexe électrostatique de nanoparticules LIPOSOMALES chargé positivement et l’ADN de plasmide charge négative est connu comme un nanovector.

6. systémique livraison d’éponge-nanoparticules et Validation In Vivo effets

  1. Délivrance systémique d’éponge-nanoparticules chez le rat
    1. Utiliser des rats Sprague-Dawley (SD). Injecter par voie intraveineuse les rats avec le nanovector miR-181-éponge ou scramble nanovector par l’intermédiaire de la veine caudale. Utiliser des rats mâles SD, qui sont environ 200 g de poids.
    2. Effectuer l’injection dans la veine queue à l’aide d’une dose de 4 mg de nanovector/kg de poids corporel et répétez cette opération à l’aide d’un schéma de 6 injections de veine de queue pendant 2 semaines. Suite à la livraison des nanovector répétés, accorder un délai de 1 semaine (15-21 jours) pour exprimer le vecteur in vivo.
    3. Confirmer l’optimisation par imagerie le signal de la GFP, avant, pendant et après la livraison de nanovector. Analyser le signal de la GFP par logiciel d’imagerie tomographique, qui génère des données semi-quantitatives.
  2. Validation d’en vivo miR-181 inhibition par la miR-181-éponge
    1. Effectuer la tache occidentale afin de démontrer l’expression d’une fonctionnelle miR-181-éponge dans le tissu cardiaque.
      Remarque : Pour cette étude, mt-COX1 expression a été examinée.
  3. Conséquences fonctionnelles d’en vivo expression miR-181-éponge dans le coeur
    1. Réaliser une échocardiographie bidimensionnelle, M-mode et Doppler pendant et après la livraison de nanovector pour analyser la fonction cardiaque et les changements morphologiques. Pour une capacité de balayage mieux dans les coeurs de rongeurs, utilisez un échographe équipé d’un transducteur linéaire de 15 MHz.
    2. L’anesthésie peut influer sur la contractilité cardiaque ; par conséquent, effectuer la livraison du nanovector miR-181-éponge ou scramble nanovector envers les animaux qui sont conscient et sans aucune anesthésie réactif pendant le processus de l’échocardiographie. S’il vous plaît voir Das, et al. 4 pour plus de précision.

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Representative Results

Dans les stable pEGFP-miR-181-éponge-exprimant H9c2 cellules transfectées (de l’étape 4.2), l’expression de toute la famille miR-181 (miR-181 a, miR-181, miR - 181c et miR - 181d) est modérément diminuée par rapport aux cellules H9c2 pEGFP brouillés-exprimant. MiR-181-éponge sert comme un inhibiteur compétitif de toute la famille de miR-181, donc nous avons attendu que l’expression de la miR - 181c mitochondrial cible génique, mt-COX1, augmenterait. La tache occidentale suggèrent que l’expression de la mt-COX1 a augmenté dans les cellules H9c2 pEGFP-miR-181-éponge-exprimant par rapport aux cellules H9c2 pEGFP-scramble-exprimé. En outre, aucun changement d’expression pour mt-COX2 ou mt-COX3 ont été détectés par immunoblot dans les cellules H9c2 pEGFP-miR-181-éponge-exprimer. Nous avons utilisé des α-tubuline sous le contrôle de normalisation pour l’analyse de l’immunotransfert. GFP signaux ont été principalement observés dans le foie et les reins vers le haut jusqu'à la livraison systémique après 2 semaines de la nanovector miR-éponge (Figure 1 a). Toutefois, l’expression de la GFP a été significativement plus élevée dans le tissu cardiaque après 3 semaines de livraison nanovector miR-181-éponge (Figure 1 a et 1 b). À noter, il y avait un signal GFP détecté dans les tissus du foie chez certains animaux, 3 semaines après la délivrance systémique ; Cependant, il n’y a aucun effets fonctionnels de le miR-181-éponge dans le foie à ce point dans le temps.

La tache occidentale a montré une augmentation significative dans l’expression de mt-COX1 chez les rats de miR-181-éponge nanovector-injecté par rapport aux groupes nanovector scramble (Figure 2). Mt-COX1 supérieur suggère qu'il y a une expression de miR - 181c inférieure au cœur après 3 semaines de la livraison de miR-181-éponge nanovector, mt-COX1 est la cible directe de miR - 181c. Nous avons utilisé des α-tubuline comme le contrôle de normalisation pour l’immuno-blot.

Échocardiographie a montré aucun changement dans la fonction cardiaque des rats nanovector injection miR-181-éponge avant, pendant et à la fin du schéma thérapeutique, comparée au groupe nanovector scramble d’animaux.

Figure 1
Figure 1. In vivo analyse des nanovector de livraison de le miR-181-éponge. (A), ce panneau indique les protocoles de traitement optimisé de 3 semaines avec 6 injections intraveineuses à travers la veine caudale. La colorisation en jaune dans l’image épifluorescence montre l’expression du vecteur pEGFP. L’intensité maximale de la colorisation en jaune est observée à la semaine 3 point dans le temps. (B), le α-MHC séquence du promoteur dans le vecteur pEGFP exprime sélectivement le miR-181-éponge ou la séquence codée en plein 21 jours. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 2
Figure 2. Validation de l’effet de nanovector miR-181-éponge sur expression de miR - 181c. Il s’agit de l’analyse par transfert western de l’expression de mt-COX1 dans les lysats de coeur provenant de pEGFP-scramble et les rats de nanovector à injection pEGFP-miR-181-éponge. Ensemble-coeur homogénats ont été hybridés avec les anticorps indiquées. Nous avons utilisé des α-tubuline comme un contrôle de chargement. La bande-densitométrie est montrée dans le graphique en barres ci-dessous. De Student t-test a été effectué, et l’écart-type a été tracée dans le graphique à barres sous forme de barres d’erreur. p < 0,05 – groupe vs pEGFP-scramble. n = 4.

Nom de l’apprêt Séquence TM Notes Utilisation Objectif
SAM3-1F ATGCATTAGTTATTAATGCTT
GACACACTTGACAATTTCT		 58.4 Promoteur de rat MHC pour cloner dans EGFP PCR Promoteur de MHC
SAM3-2R GACCGGTAGCGCTAGCTG
ACTCACTGGGAGATTGCTT		 59,8 Promoteur de rat MHC pour cloner dans EGFP PCR Promoteur de MHC
SAM3-3F CGAACGACCTACACCGAACT 64 Écran EGFP-F PCR sur colonie Clones positifs promoteur
SAM3-4R CGCTAGTCCTTGACCCTCTG 63,9 Écran MHC-R PCR sur colonie Clones positifs promoteur
SAM5-1F CCTGTCTCCAACACACAAGC 59,3 Promoteur de la séquence MHC Séquençage Promoteur de MHC
SAM5-2R CAGACTGCAGGGCTGGTT 60 Promoteur de la séquence MHC Séquençage Promoteur de MHC

Le tableau 1. Séquences d’amorces.

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Discussion

Cet article décrit la conception et la synthèse d’une éponge-miRNA et démontré comment l’expression tissu-spécifique de l’éponge est un outil puissant pour inhiber les famille expression tissu-spécifique miRNA.

Nous avons démontré qu’une famille de miR-181 ciblant l’éponge peut être clonée dans un plasmide d’expression avec un promoteur spécifique cardiaque. Le plasmide peut être efficacement empaqueté dans une particule nanovector pour livraison in vitro et in vivo à l’aide d’électroporation ou une injection dans la veine queue, respectivement (Figure 1). L’éponge de miR-181 peut inhiber une expression spécifique cardiaque de la famille de miR-181 et peut affecter l’expression des gènes de cible de miR-181 (Figure 2). La GFP dans le plasmide est un atout supplémentaire, qui peut visualiser la livraison et le profil d’expression de la nanovector sans pour autant sacrifier les animaux.

Brièvement, une miRNA-éponge se compose d’une série de séquences anti-sens miRNA placé après un gène rapporteur qu’agit comme un leurre miRNA cible des ARNm. MiRNA-éponges naturelles ont été présents naturellement à être exprimés dans les cellules végétales et animales comme longtemps non-codage RNAs (lncRNAs)17. Dans la présente étude, nous avons utilisé une approche d’éponge pour empêcher toute la famille au cœur de miR-181. Bien que l’approche de miR-181-éponge est une méthode physiologiquement pertinente pour régulent la famille miR-181 dans des cellules cultivées, une application en vivo de miR-181-éponges peut être néfaste. Par exemple, plusieurs études ont démontré un rôle protecteur de miR-181 et miR-181 dans les cellules et les tissus différents types18,19,20. Par conséquent, l’expression de miR-181-éponge doit viser spécifiquement aux tissus cardiaques.

Petits oligonucléotides ont été démontrés pour bloquer la fonction de miRNA par recuit au strand guide miARN matures et de prévenir dans le complexe silencieux RNA-induced (RISC), un apport adéquat. Un problème lié à cette approche est que des oligonucléotides doivent être livrés en dose suffisante pour bloquer les piscines cellulaires des miARN matures saturante. Oligonucléotides souffrent également de problèmes impliquant le transport à travers les membranes cellulaires et une stabilité générale de la molécule. Ingénieusement, il a été démontré qu’une cible de miRNA exogène peut agir comme un leurre pour son apparenté miRNA21. En raison de multiples sites de liaison attachés ensemble dans un pseudo 3' UTR de construire, la cible de leurre ou miRNA-éponge, est capable de stablement interagir avec sa cible miARN et séquestrer le miRNA dans des complexes microribonucleoprotein (miRNPs), donc effectivement empêcher la fonction de miRNA. Le soi-disant « miRNA-éponge » est une technologie anti-sens efficace, qui peut efficacement miRNA régulent in vitro et in vivo. Par conséquent, l’application d’une éponge-miRNA peut servir à étudier les phénotypes de perte de fonction de miRNA.

L’idée que l’interférence ARN (ARNi) pourrait conduire à une nouvelle classe d’agents thérapeutiques a attiré l’attention de nombreux chercheurs peu après sa découverte. Le domaine de la thérapeutique appliquée d’Arni est passé très rapidement du laboratoire au chevet du patient. Actuellement, miRNA thérapeutique est l’une des interventions thérapeutiques en oncologie en pleine croissance et est actuellement en phase 1 des essais cliniques. Oligonucléotides antisens, ou antagomirs, sont une des approches inhibitrice miRNA plus largement utilisé. Ma et al. 22 utilisé antagomir miR-10 b, in vitro et in vivo, de garder le silence surexprimés miR-10 b dans une tumeur solide.

In vivo, le silence efficace des miARN surexprimés nécessite une modification chimique de l’antagomirs pour améliorer l’affinité de liaison, biostabilité et propriétés pharmacocinétiques. Pour augmenter le duplex (Tm) la température de fusion et améliorer la résistance de la nucléase d’antagomirs, modifications chimiques peuvent être effectuées, comme 2′-O-méthyl (2′-O-Me), 2 '-fluoro-2 '-O-methoxyethyl (2′-MOE) et la bicycliques verrouillé d’acide nucléique ( LNA)23,24,25,26,27,28,29,30,31. Pour une meilleure efficacité de la livraison en vivo , l’antagomir peut être modifié par les liens phosphorothioate (PS), qui ont augmenté la nucléase résistance28. En outre, modifications d’épine dorsale PS améliorent également la liaison aux protéines plasmatiques, réduction de l’excrétion urinaire. Ainsi, antagomirs modification PS montrent une amélioration significative des propriétés pharmacocinétiques, faciliter leur délivrance systémique32. Il a également été démontré que l’utilisation d’acide nucléique peptidique (PNA) ou oligomères morpholino, conçus pour cibler un miRNA spécifique, peut servir à étudier miRNA perte de fonction des phénotypes33,34,35, 36 , 37 , 38 , 39. antagomirs PNA conjugué Polylysine et nanoparticules-complexé inhibe efficacement la miRNA fonctionnent aussi bien in vitro et in vivo36,37,38, 39. Malgré les progrès récents, une livraison efficace et spécifique aux tissus de miRNA-dérivés demeure un défi. Il s’agit de la possibilité d’effets hors cible, déclenchement des réponses immunitaires innées et, surtout, obtenir une remise spécifique dans les cellules des organes/tissus ciblés.

En outre, les niveaux d’expression miRNA varient beaucoup en fonction de la cellule et tissus type40. En outre, l’expression de miRNA peut augmenter ou diminuer dans la maladie. La conséquence d’une expression altérée miRNA et l’effet sur la fonction cellulaire et tissulaire avec éponge inhibées miRNA expression doit être validé et déterminées de manière empirique. Des études précliniques dans des modèles animaux de maladies sont nécessaires pour déterminer le niveau optimal de l’inhibition d’une cible donnée miRNA.

Fait intéressant, miR - 181c miRNA pièces compartimentation subcellulaire3,4,5. Plus précisément, comme prévu, le miR-181s sont codées dans le noyau et transcrit comme long-pri-miARN transcriptions qui sont traitées dans le cytoplasme par les machines de découpe et incorporées à RISC. Toutefois, à la différence des miARN canoniques qui fonctionnent dans le cytoplasme, la forme mature de miR - 181c translocation dans les mitochondries et les fonctions dans la régulation des gènes mitochondriaux spécifique3. Nous avons démontré que le miR-181-éponge peut lier la forme mature de miR - 181c dans la fraction cytoplasmique, empêchant ainsi la translocation vers les mitochondries. Par conséquent, une augmentation de mt-COX1 peut être observée dans les mitochondries dans les conditions d’une régulation négative de l’expression de miR - 181c.

Nous avons signalé la méthodologie requise pour concevoir une miRNA-éponge pour faire tomber l’expression de n’importe quel miRNA et décrit un protocole pour l’application in vivo de la miRNA-éponge. L’inhibition spécifique des tissus miRNA est actuellement une technique insuffisamment développée dans le domaine de miRNA. L’importance de la diminution de l’expression ou l’inhibition fonctionnelle des miARN surexprimés dans la maladie humaine suggère qu’il serait possible d’exploiter miRNA biologie pour une intervention thérapeutique.

Cette étude a mis en évidence une stratégie pour abaisser un miRNA, qui peut être employé avec succès dans une manière spécifique des tissus in vivo. Les éponges de miRNA utilisent la séquence anti-sens de la séquence de « semences » miRNA. Donc, miRNA-éponges peuvent restreindre tous les miARN qui partagent les mêmes « graine » séquence, à savoir, la famille de miRNA ensemble. Dans cette étude, nous avons observé une diminution significative de toute la famille miR-181 (miR-181 a, miR-181, miR - 181c et miR - 181d) avec l’expression de le miR-181-éponge, in vitro et in vivo. Si un membre de la famille confère une protection alors qu’un autre membre de la famille a des effets préjudiciables au sein de l’organe même, à l’aide de la technologie de miRNA-éponge ne serait pas l’approche idéale.

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Disclosures

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Acknowledgments

Nous remercions Anthony K. L. Leung du département de biochimie et de biologie moléculaire, Bloomberg School of Public Health, Université de Johns Hopkins pour sa technique aide à la conception de la construction de miR-181-éponge. Nous remercions également Polina Sysa-Shah et Kathleen Gabrielson du département de moléculaire et biopathologie comparée, Johns Hopkins Medical Institutions pour leur assistance technique de l’imagerie in vivo de la livraison de miRNA-éponge.

Ce travail a été soutenu par des subventions de la NIH, HL39752 (à Charles Steenbergen) et par une subvention de développement scientifique de l’American Heart Association 14SDG18890049 (pour Samarjit Das). Le promoteur de cardio spécifique de rat a été généreusement fourni par Jeffery D. Molkentin, hôpital pour enfants Cincinnati.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
pEGFP-C1 vector Addgene 6084-1
In-fusion Clontech 121416
QIAprep Miniprep Qiagen 27104
QIAquick Gel Extraction Kit Qiagen 28704
miR-181-sponge synthesis Introgen GeneArt custome made
PCR primers Integrated DNA Technologies custome
EcoRI enzymes New Endland Biolabs R0101S
KpnI enzymes New Endland Biolabs R0142S
Rapid DNA Ligation Kit Sigma-Aldrich 11635379001
H9c2 cells ATCC CRL-1446
DMEM Media Thermo Fisher Scientific 11965092
Fetal Bovine Serum Thermo Fisher Scientific 10082139
Nucleofector 2b Device Lonza AAB-1001
Nucleofector Kits for H9c2 (2-1) Lonza VCA-1005
G418, Geneticin Thermo Fisher Scientific 11811023
FACSAria II Flow cytometer BD Bioscience 644832
Branson 450 sonifier Marshall Scientific EDP 100-214-239
The Xenogen IVIS Spectrum optical imaging device Caliper Life Sciences
Anti-MTCO1 antibody Abcam ab14705
α-tubulin antibody Abcam ab7291
Sequoia C256 ultrasound system Siemens

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Biologie numéro 136 microARN miRNA miRNA-éponge inhibition de miRNA nanoparticules nanovector miR-181 coeur miRNA mitochondriale
<em>In Vivo</em> Nanovector livraison d’une coeur spécifiques microARN-éponge
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Kent, O. A., Steenbergen, C., Das, S. In Vivo Nanovector Delivery of a Heart-specific MicroRNA-sponge. J. Vis. Exp. (136), e57845, doi:10.3791/57845 (2018).

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