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Generación de un modelo Murino ortotópico de cáncer de mama metastásico y la realización de mastectomía Radical murino

Published: November 29, 2018 doi: 10.3791/57849
Automatic Translation
1, 1, 2,3,4,5, 1,6,7,8,9,10
1Breast Surgery, Department of Surgical Oncology, Roswell Park Comprehensive Cancer Center, 2Holy Cross Hospital Michael and Dianne Bienes Comprehensive Cancer Center, 3Department of Surgery, Massachusetts General Hospital, 4Department of Surgery, University of Miami Miller School of Medicine, 5Department of Surgery, Nova Southeastern University School of Medicine, 6Department of Surgery, University at Buffalo Jacobs School of Medicine and Biomedical Sciences, 7Department of Breast Surgery and Oncology, Tokyo Medical University, 8Department of Surgery, Yokohama City University, 9Department of Surgery, Niigata University Graduate School of Medical and Dental Sciences, 10Department of Surgery, Fukushima Medical University

Summary

Presentamos un modelo de cáncer de mama Murino ortotópico y mastectomía radical modelo con tecnología de bioluminiscencia para cuantificar la carga del tumor para imitar la progresión del cáncer de mama humano.

Abstract

Modelos de ratón in vivo para evaluar la progresión del cáncer de mama son esenciales para la investigación del cáncer, incluyendo el desarrollo preclínico de fármacos. Sin embargo, la mayoría de los detalles técnicos y prácticos comúnmente se omite en los manuscritos publicados que, por lo tanto, hace que sea difícil de reproducir los modelos, particularmente cuando se trata de técnicas quirúrgicas. Tecnología de bioluminiscencia permite la evaluación de pequeñas cantidades de células cancerosas incluso cuando un tumor no palpable. Utilizando las células de cáncer expresan luciferasa, establecemos una técnica de inoculación de mama cáncer ortotópico con una tasa alta de tumorigénesis. Metástasis del pulmón se evalúa utilizando una técnica ex vivo . Nosotros, entonces, establecer un modelo de mastectomía con una tasa baja de recurrencia local para evaluar la carga de tumor metastático. Adjunto, describimos, detalladamente, las técnicas quirúrgicas de implantación ortotópica y mastectomía para cáncer de mama con una tasa alta de tumorigenesis y tasas de baja recurrencia local, respectivamente, para mejorar la eficiencia de modelo de cáncer de mama.

Introduction

Modelos animales juegan un papel clave en la investigación del cáncer. Cuando una hipótesis se prueba in vitro, debe ser probado in vivo para evaluar su relevancia clínica. Metástasis y progresión del cáncer son a menudo mejor capturados por los modelos animales en comparación con modelos in vitro, y es esencial para probar un nuevo fármaco en un modelo animal como un estudio preclínico de drogas desarrollo1,2. Sin embargo, los detalles técnicos de los experimentos con animales a menudo no son bien descritos en los artículos publicados, lo que es difícil reproducir el modelo con éxito. De hecho, los autores que establecieron estos modelos de la inoculación y la mastectomía de orthotopic pasaron a través de largos y rigurosos procesos de prueba y error. La tasa de éxito de tumorigenesis después de la inoculación de células de cáncer es uno de los factores clave para determinar el éxito y la eficiencia de un animal de estudio3. La línea celular y el número de células a inocular, el sitio de inoculación y la cepa de los ratones, son factores importantes. Es bien sabido que hay enormes variaciones en los resultados de los experimentos en animales debido a las diferencias individuales, en comparación con técnicas in vitro. Por lo tanto, usando un modelo bien establecido con una técnica estándar es importante para obtener resultados estables, para mejorar la eficiencia de los experimentos con animales y para evitar resultados engañosos.

Este artículo ofrece técnicas bien establecidas4 para generar modelos de ratón de cáncer ortotópico y mastectomía de mama. Los objetivos de estos métodos son 1) para imitar la progresión del cáncer de mama humanas y cursos del tratamiento y 2) para llevar a cabo experimentos en vivo con una mayor eficiencia y mayores tasas de éxito en comparación con otros inoculación de cáncer de mama o mastectomía técnicas. En la inoculación de células de cáncer ortotópico, para imitar la progresión del cáncer de mama humano, elegimos la almohadilla de grasa mamaria #2 como un sitio de la inoculación, que se encuentra en el pecho. En la mayoría de los estudios, las células de cáncer de mama son inoculadas por vía subcutánea5. Esta técnica no requiere cirugía y por lo tanto, es simple y sencillo. Sin embargo, el microambiente subcutáneo es absolutamente diferente del microambiente de la glándula mamaria, que resulta en la progresión del cáncer diferentes y perfiles incluso molecular6,7. Algunos estudios usan la glándula mamaria de #4, que se encuentra en el abdomen, como una inoculación sitio6. Sin embargo, puesto que las glándulas mamarias #4 se encuentran en el abdomen, el patrón más común de metástasis es carcinomatosis peritoneal7, que se produce con menos de 10% de cáncer de mama metastásico8. Generados por la técnica presentada aquí, en la glándula mamaria de #2, el cáncer de mama metastatiza en el pulmón, que es uno de los más común cáncer mama sitios metastáticos9.

Con esta técnica, el objetivo también es alcanzar una tasa de tumorigenesis con variabilidad de tamaño de tumor mínimo en comparación con otras técnicas de inoculación del cáncer de mama. Para ello, se inoculan células cancerosas suspendidas en una mezcla de proteína gelatinosa bajo visión directa a través de una incisión de la pared de pecho anterior mediana. Esta técnica produce una tasa alta de tumorigenesis con menos variabilidad en el tamaño del tumor y la forma en comparación con la inyección subcutánea o no quirúrgicos, como previamente divulgados3,7.

También presentamos una técnica de mastectomía radical de ratón en el que el tumor de mama ortotópico es resecado con los tejidos circundantes y los ganglios linfáticos axilares. En el ajuste clínico, el estándar de cuidado para pacientes de cáncer de mama sin enfermedad metástasis distante es mastectomía10,11. Antes de una mastectomía, metástasis de nodo de linfa axilar es examinada por la proyección de imagen y el centinela biopsia de ganglio linfático. Si no existe evidencia de metástasis ganglionar axilar, el paciente entonces se trata con una mastectomía total o parcial, en la que se omite la resección ganglionar axilar. Mastectomía total es una técnica para extirpar el cáncer de mama con el tejido de la mama en bloque, mientras mastectomía parcial es para resecar el cáncer de mama con un margen de tejido mamario normal, conservando así el tejido mamario normal restante en la paciente. Sin embargo, los pacientes que conservan resto de tejido mamario normal después de una mastectomía parcial requieren radioterapia postoperatoria para evitar la recidiva local10. Pacientes que tienen metástasis de nodo de linfa axilar mastectomía radical que elimina el cáncer de mama con todo normal se comprometen los ganglios linfáticos tejidos y axilar de la mama e invadieron tejidos en bloque10,11. En el modelo murino, vigilancia para axilar del nodo de linfa metástasis o en el post-operatorio la radiación no es razonable o factible. Así, utilizamos la técnica de mastectomía radical para evitar la metástasis de nodo de linfa axilar o local.

Inoculación de células de cáncer a través de la vena de la cola es el más frecuente pulmón metástasis ratón modelo12, la llamada "metástasis experimental". Este modelo es fácil de generar y no requiere cirugía; sin embargo, no imitar a progresión del cáncer de mama que puede generar un comportamiento diferente de enfermedad metastásica. Con el fin de imitar el curso de tratamiento de cáncer de mama donde la metástasis a menudo se produce después de la mastectomía, se quita el tumor primario después de la inoculación de células de cáncer ortotópico. Esta técnica produce menos recidiva local en comparación con la resección simple del tumor, previamente divulgados13y es útil para nuevas terapias, estudios preclínicos y para estudios de investigación de cáncer de mama metastásico. Las técnicas aquí descritas son aplicables para la mayoría mamas cáncer orthotopic modelo de los experimentos. Sin embargo, es importante considerar que la mezcla de proteína gelatinosa puede afectar el microambiente y la cirugía puede afectar la respuesta de estrés inmunitario14. Por lo tanto, los investigadores estudian el microambiente y/o la respuesta de estrés inmunitario deben ser conscientes de potenciales factores de confusión.

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Protocol

Se obtuvo aprobación del Comité de uso y Roswell Park Cancer Center institucional Animal atención integral para todos los experimentos.

Nota: Se obtienen nueve a ratones BALB/c hembras de doce semanas de edad. Se utilizan células luc2 4T1, un ratón adenocarcinoma mamario línea celular derivada de ratones BALB/c que ha sido diseñado para luciferase expresa. Estas células se cultivan en medio de Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 con 10% suero bovino fetal (FBS).

1. preparación de instrumentos

  1. Descongelar una mezcla de proteína gelatinosa congelada (por ejemplo, Matrigel) en el hielo en una campana de cultivo de tejidos.
  2. Limpieza y autoclave dos sets de instrumentos quirúrgicos (microdisección tijeras, fórceps de Adson y un sostenedor de la aguja) antes de la cirugía. Preparar esterilizada 5-0 suturas de seda y seca esterilizante (cirugías seriales están previstas).
  3. Clip del pelo en el pecho media de los ratones utilizando una maquinilla y marque los ratones para identificación perforando la oreja antes de la hora de la cirugía.
  4. Preparar la mesa de procedimiento, que puede utilizarse inmediatamente para la operación.
    1. Difundir una almohadilla absorbente y fijar las esquinas con cinta adhesiva, fije anestesia nariz conos con cinta, poner esterilizante y desinfectante (clorhexidina, yodo, etanol del 75%) al lado del espacio del funcionamiento y los ratones en orden de operación.

2. preparación de las células (para 10 ratones)

Nota: Las células deben ser inoculadas dentro de 1 h después de ser separado del plato para evitar la viabilidad celular disminuida. Específicamente, se debe mezclar la suspensión de células en la mezcla de proteína gelatinosa dentro de 15 min después de separar las células de la fuente para mantener su viabilidad.

  1. Cultura 4T1-luc2 células, una línea de células de adenocarcinoma mamario de ratón expresan luciferasa en Medio RPMI 1640 con 10% FBS en un incubador humedecido a 37 ° C en 5% CO2.
  2. Lavar las células adherentes 4T1-luc2 en un plato de 10 cm con solución salina tamponada con fosfato (PBS) con una pipeta serológica de 10 mL. Añadir 1 mL de tripsina 0,25% con una pipeta P1000 y, luego, incubar la muestra a 37 ° C durante 5 minutos. A continuación, añadir 4 mL de medio de crecimiento (RPMI-1640 con 10% FBS) usando serológica 5 mL pipeta y transferir la suspensión de células a un tubo cónico de 15 mL en una campana de cultivo de tejidos. Centrifugue la suspensión de células a 180 x g durante 5 minutos.
  3. Aspirar el sobrenadante y resuspender las células en 2 mL de PBS; entonces, contar las células con el hemocitómetro.
  4. Suspender 2 x 106 células 4T1-luc2 en 40 μL de PBS frío (pH 7,4, 4 ° C) en la campana de cultivo de tejidos.
  5. La suspensión de células de 40 μL de la mezcla con 360 μL de la mezcla de proteína gelatinosa en un tubo de microcentrífuga de 1,5 mL en hielo en la campana de cultivo de tejidos.
    Nota: La concentración final es de 1 x 10520 μL (1:9 PBS: mezcla de proteína gelatinosa). Para el modelo ortotópico (sin mastectomía), se utilizó 1 x 10420 μL de la concentración final, para evitar llegar a criterios de eutanasia (tumor tamaño > 2 cm) dentro de dos semanas.

3. inoculación de células de cáncer

  1. Pusieron los ratones en la cámara de inducción de la anestesia con 2-4% de isoflurano y 0,2 L/min flujo de oxígeno hasta que los ratones respiran tranquilamente (2-3 min).
  2. Sujete el ratón e inyectar 0,05 mg/kg de buprenorfina en su hombro por vía subcutánea.
  3. Adecuada anestesia para confirmar la falta de reacción a un pellizco del dedo del pie. Introduzca la nariz del ratón en el orificio de la máscara de ratón, que permite la anestesia por inhalación con 2-4% de isoflurano y flujo de oxígeno de 2 L/min a una unidad de cartucho de carbón.
  4. Refrenar la extremidades del ratón usando cinta de laboratorio y esteriliza la piel con clorhexidina, el yodo y el 75% de etanol, utilizando bastoncillos de algodón.
  5. Haga una incisión de piel de 5 mm en el centro de la pared de pecho anterior utilizando tijeras estériles microdissection, levante el lado derecho al lado de la incisión de la piel y separar la piel de la pared de pecho con las tijeras y luego invierta la piel para exponer el derecho #2 almohadilla de grasa mamaria.
  6. Cuidadosamente inyectar 20 μL de la suspensión de células de Cáncer utilizando una jeringa de insulina 1 mL con una aguja de 28,5 G en la almohadilla de grasa bajo visión directa a través de la herida.
    Nota: La aguja pasa a través de la herida, no la piel. Seguir manteniendo la aguja en la almohadilla de grasa 5 antes de s a tirar de él hacia fuera, que permite la mezcla de proteína gelatinosa solidificar.
  7. Cerrar las incisiones de piel costura, utilizando suturas no absorbibles estériles de 5-0.
  8. Después de la cirugía, regresar los animales a una jaula limpia y controlarlos hasta que se han recuperado y se muevan libremente (después de ~ 1-2 min). Si un animal no parece estar en buena salud dentro de las 24 h de la cirugía, administrar buprenorfina (0,2 mg/kg).
  9. Retire las suturas bajo anestesia (ver paso 3.1) 7 d después de la cirugía.

4. mastectomía

Nota: El momento de la mastectomía es muy importante. Si se hace demasiado pronto, no se produce la metástasis del pulmón. Si se hace demasiado tarde, el tumor primario ha invadido los vasos sanguíneos principales, que hacen difícil una completa resección oncológica. Así, varios puntos de tiempo fueron probadas para que mastectomía determinar qué punto de tiempo un equilibrio adecuado en espera de metástasis antes de la resección se convirtió demasiado provocativos. Después de hacerlo en más de 50 experimentos de ratón, se demostró que la mastectomía a los 8 días después de la inoculación de células de cáncer (o cuando el tamaño de tumor alcanza 5 m m) fue el ideal el tiempo para lograr el punto equilibrio13.

  1. Anestesiar un ratón con 2-4% inhalado isoflurano e inyectar buprenorfina (ver pasos 3.1 y 3.2).
  2. Refrenar el ratón y para esterilizar su piel (véase el paso 3.4).
  3. Hacer una incisión de piel de 5 mm de 2 mm a la izquierda de la cicatriz quirúrgica que se realizó en la inoculación de células de cáncer inicial, usando las tijeras de microdisección. Extender la incisión hacia la raíz de la extremidad delantera para extirpar el tumor, la piel incluyendo la cicatriz quirúrgica y la lesión en contacto con el tumor, así como la cuenca ganglionar axilar en el que la mayoría de las veces no ganglionar visible existe en el momento de la mastect Omy13. Asegúrese de no dañar la vena axilar.
  4. Cerrar los defectos de la piel por costura, utilizando suturas no absorbibles estériles de 5-0 en la forma de una "Y".
  5. Al igual que en paso 3.8, retomar el ratón una jaula limpia y un monitor hasta que han recuperado.
  6. Retire las suturas bajo anestesia (ver paso 3.1) 7 días después de la cirugía.

5. bioluminiscente cuantificación del Tumor primario (ortotópico inoculación sin mastectomía) o metástasis del pulmón (modelo de mastectomía)

Nota: Para la cuantificación de la carga del tumor primario, la bioluminiscencia es medida 2 x una semana desde el día después de la inoculación de orthotopic. Para la cuantificación de la metástasis de pulmón, la bioluminiscencia es medida 2 x una semana desde el día después de la mastectomía.

  1. Diluir D-luciferin con tampón fosfato salino de Dulbecco, (DPBS) para una concentración final de 15 mg/mL en una campana de cultivo de tejidos. Alícuota en microcentrífuga 1.5ml protegidos de la luz tubos. Almacenar la solución diluida a-80 ° C.
    Nota: Para un ratón de 20 g, 200 μL del diluido D-luciferin es necesario.
  2. Abra el software de proyección de imagen y haga clic en inicializar.
    Nota: Tarda unos 15 minutos para enfriar el dispositivo de carga acoplada (CCD). Cuando el CCD alcanza la temperatura, el color de la barra de temperatura cambia de rojo a verde.
  3. Anestesiar los ratones con 2-4% de isoflurano en una cámara de inducción dedicado antes de la proyección de imagen (ver paso 3.1).
  4. Peso de los ratones.
  5. Inyectar el luciferin D 150 mg/kg por vía intraperitoneal en el punto de la parte central del abdomen, utilizando una aguja 28,5 G.
  6. Ajuste cada ratón con un cono de nariz dentro del sistema de proyección de imagen en la posición supina (lugar de un máximo de cinco ratones al mismo tiempo). Mantener anestesia en 1-3% de isoflurano (en oxígeno al 100%) a través de los conos de nariz durante proyección de imagen.
  7. Capturar una imagen cada 5 min para la detección de la bioluminiscencia de pico durante 50 minutos (o hasta la bioluminiscencia pico confirmada).
    1. Seleccione luminiscencia como Auto, Binning como medioy campo de visión como D.
    2. Haga clic en adquirir para capturar la imagen.
  8. Volver a los ratones a su cage(s) y controlarlos hasta que han recuperado (ver paso 3.8).

6. pulmón metástasis Tumor carga cuantificación por proyección de imagen de Ex Vivo

Nota: Cuantificación de metástasis de pulmón es aplicable para la inoculación de orthotopic con y sin modelos de mastectomía. En el modelo de la mastectomía, es elegido ex vivo observación de imágenes o supervivencia, dependiendo de la finalidad. En el modelo ortotópico de inoculación (sin mastectomía), la mayoría de los casos produce criterios de eutanasia tumor primario tamaño (> 2 cm) aproximadamente 21 días después de la inoculación.

  1. Cuantificar las lesiones metastásicas pulmonares 21 días después de la inoculación de células de cáncer por ex vivo la proyección de imagen.
  2. Anestesiar los ratones con 2-4% de isoflurano en una cámara de inducción dedicado (ver paso 3.1).
  3. Peso de los ratones.
  4. Inyectar por vía intraperitoneal 150 mg/kg D luciferin (ver paso 5.6).
  5. Eutanasia a los ratones por dislocación cervical, 15 minutos después de las inyecciones.
  6. Abierto el abdomen cortando la piel y el peritoneo en el abdomen medio, usando tijeras de Mayo curvas. Extender la incisión hacia la derecha y la izquierda. Saque el hígado con pinzas hasta que se visualiza el diafragma; Luego, se corta el diafragma.
  7. Usando las tijeras de Mayo curvas, corte las costillas bilaterales de caudad (12 costillas) a cefálica (1 º costillas) para exponer los pulmones poniendo la pared anterior del tórax.
  8. Identificar el esófago torácico, que parece un cable de conexión de los pulmones a la espina dorsal, levantando los pulmones con unas pinzas y, luego, se corta el esófago con las tijeras de microdisección.
  9. Levante los pulmones bilaterales y el corazón con unas pinzas (ejerciendo una tracción tirando hacia abajo, en dirección cefálica a él) y, luego, cortar la tráquea y los grandes vasos sanguíneos hasta el ápice del pulmón en la cefálica, con unas tijeras de microdissection.
    Nota: Esto permite el aislamiento del pulmón y del corazón del cuerpo.
  10. Quite el corazón del pulmón con unas tijeras de microdissection.
  11. Poner los pulmones en una placa de Petri de 10 cm.
  12. Capturar la imagen de bioluminiscencia (ver pasos 5.7.1 y 5.7.2) 5 min después de la eutanasia (a 20 min después de la inyección de luciferin).

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Representative Results

El propósito del modelo ortotópico es imitar la progresión del cáncer humano (es decir, el crecimiento del tumor primario, seguido por metástasis de ganglios linfáticos y metástasis del pulmón entonces distante)15. Después de la inoculación de células de cáncer, la bioluminiscencia se cuantifica regularmente (dos o tres veces / semana) (figura 1A). La bioluminiscencia en los pulmones es más profundo y más pequeño que la lesión primaria. La bioluminiscencia refleja principalmente la carga de tumor primario en ratones vivos3 (figura 1B y 1C). También se midió el tamaño del tumor por medición del calibre. El volumen del tumor se estimó mediante la siguiente ecuación: volumen = (longitud) x (ancho)22 (figura 1). Cuantificación de la carga del tumor por bioluminiscencia y medición del calibre mostraron similares tendencias en los resultados representativos (figura 1B y 1D); sin embargo, a veces encontramos discrepancias. Asumimos que, cuantificación de la carga de tumor primario utilizando bioluminiscencia es más precisa en comparación con medir el tamaño del tumor por zapata cuando el tamaño del tumor es menor de 1,5 cm. Porque refleja viables las células cancerosas, incluso que un pequeño número de células puede detectarse mediante bioluminiscencia, y sólo las células cancerosas pueden ser detectados dentro del tumor, no incluyendo las células inmunes de la infiltración o que rodea las células del estroma3. Este modelo es útil para evaluar la eficacia de la regresión del tumor mediada por drogas contra el cáncer y la respuesta inmune3,7,16. La carga tumoral de las metástasis de pulmón también puede ser cuantificada por ex vivo la proyección de imagen en este modelo (Figura 1E); sin embargo, la limitación es que los ratones deben ser sacrificados para cuantificar la carga de tumor metastático.

El propósito del modelo de mastectomía es 1) reproducir el estándar de tratamiento de cáncer de mama humano, que es la extirpación quirúrgica del tumor primario17, y 2) permite la cuantificación de la serie de la carga de tumor metastático en vivo. Este modelo es particularmente útil en el estudio preclínico del desarrollo de nuevas terapias13. Como previamente publicados, un inhibidor de la fuente, AZD0530, que demostró eficacia en el modelo preclínico ratones pero no en un ensayo clínico para el tratamiento de cáncer de mama, demostró eficacia en la lesión primaria utilizando inoculación orthotopic sin mastectomía pero no en metástasis de pulmón utilizando el modelo de mastectomía presentó aquí. Aunque fármacos contra el cáncer (p. ej., antraciclinas) se utilizan a veces en los seres humanos como terapia neoadyuvante para tratar los tumores de mama primario, la mayoría de las drogas se utiliza como terapia adyuvante donde los fármacos se administran después de la cirugía para reducir el riesgo de recurrencia por tratamiento del cáncer clínicamente indetectable o como tratamiento paliativo para el cáncer metastásico1,7,18. Así, este modelo de mastectomía fue establecido, que imita el proceso de tratamiento humano11.

Ocho días después de la inoculación de células de cáncer, el tumor primario es quirúrgico quitado (figura 2). Para probar cualquiera de los efficacies de drogas para las lesiones metastáticas, debe ser administrado después de la mastectomía. Este modelo permite cuantificación de lesión metastásica de pulmón, así como cuantificación de la lesión metastática de cuerpo entero, como la carga del tumor metastásico tiene una bioluminiscencia detectable utilizando la proyección de imagen in vivo. La tasa de recurrencia local de pared anterior del pecho es bastante baja. En nuestra experiencia, la tasa de recidiva local fue menos del 5% en experimentos de ratones más de 50. Sin embargo, si la bioluminiscencia día postoperatorio 1 excede 1.00E + 06 fotones (10 x más grande que otras personas), hay una alta posibilidad de un tumor residual local13. Si hay células de cáncer remanente presente, aparece un tumor palpable dentro de dos semanas. Cuando hay un tumor residual local, la bioluminiscencia principalmente refleja esa recurrencia local en lugar de lesiones metastásicas. Tumores residuales locales se saben que se comportan muy diferentemente que las metástasis a distancia19; así, los animales con la repetición local (< 5% en nuestra experiencia) deben ser excluidos de cualquier análisis posterior. Este modelo de mastectomía también permite tumor metastático serial control de carga sin necesidad de eutanasia a los animales. Además, el monitoreo bioluminiscente puede confirmarse por ex vivo cuantificación de metástasis de pulmón. En lugar de cuantificar las metástasis del pulmón por ex vivo la proyección de imagen, así que eutanasia a los animales, la supervivencia de ratones después del tratamiento quirúrgico puede controlarse también como un criterio de valoración clínica traducible (Figura 2D). Ya que no existe ninguna lesión primaria, ratones no cumplen criterios de tumor de eutanasia que se definen generalmente como del tamaño de un tumor de > 2 cm o ulceración del tumor primario. En este modelo de mastectomía 4T1, todos los ratones murieron dentro de 60 días después de la inoculación de células de cáncer debido a la metástasis.

Figure 1
Figura 1: Resumen del modelo ortotópico sin mastectomía. (A) este panel muestra un curso de tiempo del trasplante orthotopic del modelo utilizando el modelo syngeneic 4T1. (B) este panel muestra la bioluminiscencia del cuerpo entero de un modelo de orthotopic que refleja principalmente el tumor primario. La barra de error indica el error estándar de la media (n = 10). (C) este panel muestra imágenes seriales de bioluminescence de cuerpo entero (del mismo ratón). La barra de escala indica que 1 cm. (D) este panel muestra el tamaño real del tumor del panel B, medido por pinzas. La barra de error indica el error estándar de la media (n = 10). (E) este panel muestra pulmonar ex vivo imágenes de bioluminiscencia de 10 orthotopic modelo de ratones (n = 10). La barra de escala indica 1 cm. haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 2
Figura 2: Resumen del modelo mastectomía. (A) este panel muestra un curso de tiempo de la mastectomía de modelo después de la implantación syngeneic de 4T1 ortotópico. La barra de escala indica que 1 cm. (B) este panel muestra el bioluminescence de cuerpo entero del modelo de la mastectomía, que refleja principalmente la lesión metastática. La barra de error indica el error estándar de la media (n = 10). (C) este panel muestra imágenes seriales de bioluminescence de cuerpo entero (del mismo ratón). Utilizando ex vivo la proyección de imagen, se confirmó que las señales eran de metástasis del pulmón, y no recidiva local fue confirmada por la proyección de imagen de cuerpo entero después del retiro de pulmón. Barra de escala = 1 cm. (D) este panel muestra el Kaplan-Meier curva de supervivencia del modelo mastectomía sin cualquier tratamiento farmacológico. Ratones fueron sacrificados cuando alcanzaron criterios de eutanasia con cualquier estado mórbido. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Discussion

En la última década, hemos venido estableciendo varios modelos murinos de cáncer, incluyendo mama cáncer modelos3,7,13,16,20,21. Previamente, hemos demostrado que mama cáncer células orthotopic la inoculación en el tejido de la glándula mamaria bajo visión directa produce un tumor más grande con menos variabilidad de tamaño en comparación con la inyección de células alrededor del pezón sin una incisión quirúrgica7 . Este modelo ha sido mejorado a mediante la utilización de una suspensión en una mezcla de proteína gelatinosa. Las formas del tumor generado por las células de proteína gelatinosa mezcla suspendido redondas con menos variabilidad, mientras que los generan por las células suspendidas en PBS fueron dispersadas en la glándula mamaria3.

Además verificamos que los tumores generados por el método de implantación ortotópica quirúrgico presentado aquí muy expresaran los genes cuyas redes de interacción son importantes en la progresión del cáncer en comparación con los generados por no quirúrgico o subcutánea inyección7. Estos resultados implican que este modelo imita mejor en comparación con orthotopic no quirúrgico o de implantación subcutánea7el cáncer de mama humano. También hemos demostrado que este modelo es adecuado para evaluar la regresión inmune-mediada del cáncer de mama utilizando alógeno rechazo3. Sin embargo, la incisión de la piel también puede causar inflamación alrededor de los14del tumor. Por lo tanto, dependiendo de la hipótesis por el investigador, es importante considerar la inflamación como un posible factor de confusión.

Aparte la neoadyuvante ajuste, la gran mayoría de los tratamientos sistémicos se administra después de que el tumor primario de mama es quirúrgico quitado11. Hasta la fecha, la mayoría de los estudios preclínicos para desarrollo de nuevos fármacos evaluar respuesta del fármaco en el tumor primario, pero no en las lesiones metastásicas1,18. Esta discrepancia entre los modelos animales y el trato humano es importante porque el perfil del gene de las lesiones metastáticas es significativamente diferente de los de la lesión primaria22, que tiene importantes implicaciones para la biología del cáncer y tratamiento , especialmente en la era de la terapia dirigida22. Por lo tanto, se debe evaluar la eficacia de la droga para la terapia adyuvante en las lesiones metastáticas, no sólo en el tumor primario. Verificamos el tiempo de la formación de metástasis de ganglios linfáticos y el pulmón después de la inoculación de orthotopic, utilizando 4T1 mama cáncer orthotopic modelo16. También hemos demostrado que una resección del tumor primario mejoró la supervivencia en el cáncer de mama metastásico utilizando la mastectomía modelo23. Así, hemos intentado establecer un modelo de mastectomía después de la implantación de células de cáncer ortotópico. Sin embargo, mucho tiempo se dedicó a establecer este modelo de baja recurrencia local. Porque las células cancerosas se inyectan a través de la incisión quirúrgica, las células cancerosas migran fácilmente en la herida. Además, las células cancerosas invaden los tejidos en contacto directo con el tumor, como el músculo de pared circundante del pecho y la piel. Las células cancerosas también se extienden por metástasis a los ganglios linfáticos axilares sin formar una masa axilar visible en el momento de la mastectomía. Eliminación del tumor puede ser una técnica más fácil, ello no es traducible a la mastectomía en el tratamiento de cáncer de mama como causa de recidiva local13. Así, este modelo"mastectomía radical" fue establecido con el fin de eliminar todas las células de cáncer de la pared de pecho anterior y nodo de linfa axilar cuenca, como se describe en la figura 2. Se confirmó la metástasis del pulmón por la histología y pulmón ex vivo la proyección de imagen, y no había ninguna lesión brillante presente por proyección de imagen de cuerpo entero después del retiro de pulmón. En este modelo de orthotopic 4T1, las células cancerosas eventualmente metastatizan a los pulmones, en todos los casos dentro de 21 días. Sin embargo, el tiempo de metástasis depende del tamaño del tumor primario; por lo tanto, menos tamaño del tumor primario variabilidad es importante para el control del tumor primario, sino también la carga de tumor metastático. Mediante el uso de la mezcla de proteína gelatinosa, se puede minimizar variabilidad de tamaño de tumor. Sin embargo, la mezcla de proteína gelatinosa también puede afectar el microambiente tumoral. Por lo tanto, debe considerarse el potencial de confundir factores asociados con el uso de proteína gelatinosa mezcla, dependiendo de la hipótesis del investigador.

Utilizando estas técnicas y las células de cáncer expresan luciferasa que para la cuantificación de carga del tumor con menor error de medición, incluso en tumores no palpables. Hay dos sistemas de reportero, bioluminiscentes y fluorescentes, para visualizar las señales en los animales vivos. Mientras que se ha informado de que la señal de bioluminiscencia y fluorescencia puede ser lo suficientemente brillante para la cuantificación, cuando la señal es muy baja, la señal de fluorescencia de fondo es mayor, que reduce la precisión del ensayo. Por el contrario, bioluminiscencia se detecta con mayor precisión en una señal más baja con menos interferencia de fondo24. Por consiguiente, mayoría de los investigadores prefiere utilizar sistemas de bioluminiscencia reportero en vivo animal experimentos24,25. Sin embargo, la cuantificación de la carga de tumor por bioluminiscencia tiene sus limitaciones. Células de expresión de luciferasa brillan cuando luciferin llega a las células cancerosas por perfusión cardiovascular26. Si la lesión tiene un área de hipoxia o hipoperfusión, luciferin no se entrega a las células y el valor de bioluminiscencia se podría, entonces, medido para ser inferior a la carga tumoral actual. De hecho, hemos experimentado cuantificación de bioluminiscencia inadecuado cuando el tamaño de tumor alcanza más de 1,5 cm. Suponemos que es debido a lo descrito hipóxico o hypoperfused condición. Así, cuando el tumor alcanza un tamaño palpable, se cuantifica la carga del tumor por bioluminiscencia y medición del calibre. Una limitación importante de la cuantificación de la bioluminiscencia a considerar es el pelaje negro de los ratones. Incluso después de retira la piel, hay pigmentación en la piel27. Mientras que la bioluminiscencia puede ser detectado y cuantificado en ratones con piel negra, se disminuye y, por lo tanto, es importante comparar ratones del mismo color de piel entre sí con el fin de reducir los efectos de confusión del color de la piel en cuantificación bioluminiscente. El uso de células de expresión de luciferasa proporciona algunas modalidades únicas para el estudio. Por ejemplo, luciferasa secretable puede utilizarse para la cuantificación de carga de tumor por medición de la sangre u orina bioluminiscencia28. En el modelo presentado aquí, cuantificación de carga directa del tumor de las células cancerosas viables en animales vivos con luciferasa no secretable es simple y directo, que no es necesario recoger muestras de sangre u orina.

Similares a los modelos que presenten aquí, la producción de una forma más eficiente experiencia con animales al producir una mayor tasa de éxito de tumorigenesis con menos variabilidad es clave para demostrar los resultados. En el actual modelo, una vez que un investigador ha aprendido la técnica, es fácil de lograr una tasa de tumorigenesis del 100%. También logramos tasas de tumorigenesis que no sean los modelos que hemos introducido; Además, hemos establecido un modelo de ortotópico de cáncer de colon utilizando suspensión en una mezcla de proteína gelatinosa, junto con la tecnología de bioluminiscencia para cuantificar la carga de tumor21. En conclusión, el modelo animal presentado aquí ofrece un modelo murino conveniente para realizar estudio de cáncer.

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Disclosures

Los autores no tienen nada que revelar.

Acknowledgments

Este trabajo fue apoyado por subvenciones de NIH grant R01CA160688 y Susan G. Komen Foundation investigador inició investigación (IIR12222224) a los ratones K.T. se adquirieron imágenes de bioluminiscencia por recurso compartido de recurso compartido imágenes traslacional en el Roswell Park Centro integral del cáncer, que fue apoyado por el cáncer centro apoyo Grant (P30CA01656) y subvención compartida de la instrumentación (S10OD016450).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Micro Dissection Scissors Roboz RS-5983 For cancer cell inoculation and masstectomy
Adson Forceps Roboz RS-5233 For cancer cell inoculation and masstectomy
Needle Holder Roboz RS-7830 For cancer cell inoculation and masstectomy
Mayo Roboz RS-6873 For ex vivo
5-0 silk sutures Look 774B For cancer cell inoculation and masstectomy
Dry sterilant (Germinator 500) Braintree Scientific GER 5287-120V For cancer cell inoculation and masstectomy
Clipper Wahl 9908-717 For cancer cell inoculation and masstectomy
Matrigel Corning 354234 For cancer cell inoculation
D-Luciferin, potassium salt GOLD-Bio LUCK-1K For bioluminescence quantification
Roswell Park Memorial Insitute 1640 Gibco 11875093 For cell culture
Fetal Bovine Serub Gibco 10437028 For cell culture
Trypsin-EDTA (0.25%) Gibco 25200056 For cell culture

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References

  1. Rashid, O. M., Takabe, K. Animal models for exploring the pharmacokinetics of breast cancer therapies. Expert Opinion on Drug Metabolism & Toxicology. 11 (2), 221-230 (2015).
  2. Schuh, J. C. Trials, tribulations, and trends in tumor modeling in mice. Toxicologic Pathology. 32, 53-66 (2004).
  3. Katsuta, E., et al. Modified breast cancer model for preclinical immunotherapy studies. Journal of Surgical Research. 204 (2), 467-474 (2016).
  4. Sidell, D. R., et al. Composite mandibulectomy: a novel animal model. Otolaryngology-Head and Neck Surgery. 146 (6), 932-937 (2012).
  5. Ewens, A., Mihich, E., Ehrke, M. J. Distant metastasis from subcutaneously grown E0771 medullary breast adenocarcinoma. Anticancer Research. 25, 3905-3915 (2005).
  6. Kocaturk, B., Versteeg, H. H. Orthotopic injection of breast cancer cells into the mammary fat pad of mice to study tumor growth. Journal of Visualized Experiments. (96), e51967 (2015).
  7. Rashid, O. M., et al. An improved syngeneic orthotopic murine model of human breast cancer progression. Breast Cancer Research and Treatment. 147 (3), 501-512 (2014).
  8. Bertozzi, S., et al. Prevalence, risk factors, and prognosis of peritoneal metastasis from breast cancer. SpringerPlus. 4, 688 (2015).
  9. Kennecke, H., et al. Metastatic behavior of breast cancer subtypes. Journal of Clinical Oncology. 28 (20), 3271-3277 (2010).
  10. Valero, M. G., Golshan, M. Management of the Axilla in Early Breast Cancer. Cancer Treatment and Research. 173, 39-52 (2018).
  11. National Comprehensive Cancer Network. Breast Cancer, NCCN Clinical Practice Guidelines in Oncology. , Available from: https://www.nccn.org/professionals/physician_gls/pdf/breast.pdf (2018).
  12. Versteeg, H. H., et al. Inhibition of tissue factor signaling suppresses tumor growth. Blood. 111 (1), 190-199 (2008).
  13. Katsuta, E., Rashid, O. M., Takabe, K. Murine breast cancer mastectomy model that predicts patient outcomes for drug development. Journal of Surgical Research. 219, 310-318 (2017).
  14. Veenhof, A. A., et al. Surgical stress response and postoperative immune function after laparoscopy or open surgery with fast track or standard perioperative care: a randomized trial. Annals of Surgery. 255 (2), 216-221 (2012).
  15. Wei, S., Siegal, G. P. Surviving at a distant site: The organotropism of metastatic breast cancer. Seminars in Diagnostic Pathology. 35 (2), 108-111 (2018).
  16. Nagahashi, M., et al. Sphingosine-1-phosphate produced by sphingosine kinase 1 promotes breast cancer progression by stimulating angiogenesis and lymphangiogenesis. Cancer Research. 72 (3), 726-735 (2012).
  17. Jones, C., Lancaster, R. Evolution of Operative Technique for Mastectomy. Surgical Clinics of North America. 98 (4), 835-844 (2018).
  18. Rashid, O. M., Maurente, D., Takabe, K. A Systematic Approach to Preclinical Trials in Metastatic Breast Cancer. Chemotherapy (Los Angeles). 5 (3), (2016).
  19. Ramaswamy, S., Ross, K. N., Lander, E. S., Golub, T. R. A molecular signature of metastasis in primary solid tumors. Nature Genetics. 33 (1), 49-54 (2003).
  20. Aoki, H., et al. Murine model of long-term obstructive jaundice. Journal of Surgical Research. 206 (1), 118-125 (2016).
  21. Terracina, K. P., et al. Development of a metastatic murine colon cancer model. Journal of Surgical Research. 199 (1), 106-114 (2015).
  22. Rashid, O. M., et al. Is tail vein injection a relevant breast cancer lung metastasis model? Journal of Thoracic Disease. 5 (4), 385-392 (2013).
  23. Rashid, O. M., et al. Resection of the primary tumor improves survival in metastatic breast cancer by reducing overall tumor burden. Surgery. 153 (6), 771-778 (2013).
  24. Troy, T., Jekic-McMullen, D., Sambucetti, L., Rice, B. Quantitative comparison of the sensitivity of detection of fluorescent and bioluminescent reporters in animal models. Molecular Imaging. 3 (1), 9-23 (2004).
  25. Adams, S. T. Jr, Miller, S. C. Beyond D-luciferin: expanding the scope of bioluminescence imaging in vivo. Current Opinion in Chemical Biology. 21, 112-120 (2014).
  26. Close, D. M., Xu, T., Sayler, G. S., Ripp, S. In vivo bioluminescent imaging (BLI): noninvasive visualization and interrogation of biological processes in living animals. Sensors (Basel). 11 (1), 180-206 (2011).
  27. Chen, H., Thorne, S. H. Practical Methods for Molecular In Vivo Optical Imaging. Current Protocols in Cytometry. 59 (1224), (2012).
  28. Wurdinger, T., et al. A secreted luciferase for ex vivo monitoring of in vivo processes. Nature Methods. 5 (2), 171-173 (2008).
  29. Aoki, H., et al. Host sphingosine kinase 1 worsens pancreatic cancer peritoneal carcinomatosis. Journal of Surgical Research. 205 (2), 510-517 (2016).

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Medicina número 141 ratón mama cáncer modelo ortotópico syngeneic mastectomía metástasis bioluminiscencia IVIS
Generación de un modelo Murino ortotópico de cáncer de mama metastásico y la realización de mastectomía Radical murino
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Katsuta, E., Oshi, M., Rashid, O.… More

Katsuta, E., Oshi, M., Rashid, O. M., Takabe, K. Generating a Murine Orthotopic Metastatic Breast Cancer Model and Performing Murine Radical Mastectomy. J. Vis. Exp. (141), e57849, doi:10.3791/57849 (2018).

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