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Génération d’un modèle de Cancer du sein métastatique orthotopique murin et effectuant une mastectomie radicale Murine

Published: November 29, 2018 doi: 10.3791/57849
Automatic Translation
1, 1, 2,3,4,5, 1,6,7,8,9,10
1Breast Surgery, Department of Surgical Oncology, Roswell Park Comprehensive Cancer Center, 2Holy Cross Hospital Michael and Dianne Bienes Comprehensive Cancer Center, 3Department of Surgery, Massachusetts General Hospital, 4Department of Surgery, University of Miami Miller School of Medicine, 5Department of Surgery, Nova Southeastern University School of Medicine, 6Department of Surgery, University at Buffalo Jacobs School of Medicine and Biomedical Sciences, 7Department of Breast Surgery and Oncology, Tokyo Medical University, 8Department of Surgery, Yokohama City University, 9Department of Surgery, Niigata University Graduate School of Medical and Dental Sciences, 10Department of Surgery, Fukushima Medical University

Summary

Nous introduisons un modèle de cancer du sein orthotopique murin et modèle de mastectomie radicale avec la technologie de la bioluminescence pour quantifier le fardeau tumoral pour imiter la progression du cancer du sein humain.

Abstract

Modèles de souris in vivo pour évaluer la progression du cancer du sein sont essentiels pour la recherche sur le cancer, y compris les développements précliniques de médicaments. Cependant, la majorité des détails techniques et pratiques est généralement omise dans les manuscrits publiés qui, par conséquent, fait qu’il est difficile de reproduire les modèles, en particulier lorsqu’il s’agit de techniques chirurgicales. Bioluminescence technologie permet l’évaluation de petites quantités de cellules cancéreuses même lorsqu’une tumeur n’est pas palpable. Utilisant les cellules cancéreuses exprimant luciférase, nous établissons une technique d’inoculation d’orthotopique du sein cancer avec un taux élevé de tumorigenèse. Métastases pulmonaires est évaluée en utilisant une technique ex vivo . Nous, ensuite, établir un modèle de mastectomie avec un taux faible de récidive locale pour évaluer la charge de tumeur métastatique. Dans les présentes, nous décrire en détail, les techniques chirurgicales d’implantation orthotopique et mastectomie pour cancer du sein avec un taux élevé de tumorigenèse et les taux de récidive locale faible, respectivement, pour améliorer l’efficacité de modèle pour le cancer du sein.

Introduction

Modèles animaux jouent un rôle clé dans la recherche sur le cancer. Quand une hypothèse est démontrée in vitro, il devrait être testé in vivo pour évaluer sa pertinence clinique. La progression du Cancer et des métastases sont souvent mieux captés par des modèles animaux par rapport à des modèles in vitro, et il est essentiel de tester un nouveau médicament chez un modèle animal d’une étude préclinique pour drug development1,2. Toutefois, les détails techniques de l’expérimentation animale ne sont souvent pas bien décrites dans les articles publiés, rendant difficile à reproduire le modèle avec succès. En effet, les auteurs qui ont établi ces modèles orthotopiques de l’inoculation et la mastectomie a traversé un processus long et rigoureux de tâtonnements. Le taux de réussite de tumorigénèse après que inoculation de cellules de cancer est un des facteurs clés pour déterminer le succès et l’efficacité d’un animal étude3. La lignée cellulaire et le nombre de cellules à ensemencer, le site de l’inoculation et la souche des souris sont tous des facteurs importants. Il est bien connu qu’il y a des énormes variations dans les résultats de l’expérimentation animale en raison des différences individuelles, par rapport aux techniques in vitro. À l’aide d’un modèle bien établi avec une technique standard est donc important d’obtenir des résultats constants, pour améliorer l’efficacité de l’expérimentation animale et d’éviter des résultats trompeurs.

Cet article fournit des techniques bien établies4 pour générer des modèles du cancer du sein orthotopique et la mastectomie de souris. Les objectifs de ces méthodes sont 1) pour imiter la progression du cancer du sein humain et cours de traitement et 2) pour mener des expériences in vivo avec une plus grande efficacité et les taux de réussite plus élevés par rapport aux autre inoculation de cancer du sein ou des techniques de mastectomie. Dans inoculation de cellules du cancer orthotopique pour imiter la progression du cancer du sein humain, nous choisissons les coussinets adipeux mammaire #2 comme un site d’inoculation, qui se trouve dans la poitrine. Dans la plupart des études, les cellules cancéreuses du sein sont inoculées par voie sous-cutanée5. Cette technique ne nécessite pas de chirurgie et, par conséquent, il est simple et directe. Toutefois, le microenvironnement sous-cutanée est très différent du microenvironnement de la glande mammaire, qui se traduit par la progression du cancer différentes et des profils moléculaires même6,7. Certaines études utilisent la glande mammaire #4, qui se trouve dans l’abdomen, comme un lieu d’inoculation6. Toutefois, puisque les glandes mammaires #4 sont localisés dans l’abdomen, le patron le plus souvent métastatique est carcinose péritonéale7, qui se produit avec moins de 10 % de cancer du sein métastatique du cancer8. Générée par la technique présentée ici, dans la glande mammaire #2, le cancer du sein métastase dans le poumon, qui est l’un des plus courants sites métastatiques du sein cancer9.

Avec cette technique, le but est aussi de parvenir à un taux plus élevé de la tumorigenèse avec variabilité de taille de tumeur minime par rapport à d’autres techniques d’inoculation du cancer du sein. Pour ce faire, les cellules cancéreuses en suspension dans un mélange de protéines gélatineux sont inoculés sous vision directe par une incision de paroi thoracique antérieur médian. Cette technique produit un taux élevé de tumorigenèse avec moins de variabilité dans la taille de la tumeur et de la forme par rapport à l’injection sous-cutanée ou non chirurgicales, comme indiqué précédemment3,7.

Nous introduisons également une technique de mastectomie radicale de souris dans lequel la tumeur du sein orthotopique est réséquée avec les tissus environnants et les ganglions lymphatiques axillaires. Dans le contexte clinique, la norme de soins pour les patients atteints de cancer du sein sans maladie de métastases à distance est une mastectomie10,11. Avant la mammectomie, métastases ganglionnaires axillaires est recensée par imagerie et sentinelle biopsie ganglionnaire. S’il n’y a aucun signe de métastases aux ganglions axillaires, le patient est ensuite traité avec une mastectomie totale ou partielle, dans laquelle la résection des ganglions axillaires est omise. Mastectomie totale est une technique de résection du cancer avec le tissu mammaire tout en bloc, tandis que Mastectomie partielle est à la résection du cancer avec une marge d’entourant le tissu mammaire normal seulement, conservant ainsi le tissu mammaire normal restant dans le patient. Cependant, les patients qui préservent le tissu mammaire normal qui reste après une mastectomie partielle doivent radiothérapie postopératoire pour éviter une récidive locale10. Les patients ayant des métastases ganglionnaires axillaires procéder à une mastectomie radicale qui supprime le cancer du sein avec la normale tous les ganglions axillaires et de tissus des seins et envahirent les tissus en bloc10,11. Chez la souris, la surveillance des radiations de métastases et/ou post-opératoire des ganglions axillaires n’est pas raisonnable ni réalisable. Ainsi, nous utilisons la technique de la mastectomie radicale pour éviter les métastases ganglionnaires axillaires ou local.

Inoculation de cellules de cancer par l’intermédiaire de la veine caudale est le plus commun poumon métastase souris modèle12, la soi-disant « métastases expérimentale ». Ce modèle est facile à produire et ne nécessite pas de chirurgie ; Cependant, il n’imite pas la progression du cancer du sein humain qui peut entraîner un comportement différent de la maladie métastatique. Pour imiter la cure de cancer du sein humain où les métastases se produit souvent après une mastectomie, la tumeur primitive est retirée après l’inoculation de cellules orthotopique du cancer. Cette technique produit moins récidive locale par rapport à la résection de tumeur simple, comme indiqué précédemment13et est utile pour les nouvelles thérapeutiques, des études précliniques et pour les études de recherche pour le cancer du sein métastatique. Les techniques décrites ici sont appliquent pour la plupart breast cancer orthotopique modèle expériences. Toutefois, il est important de considérer que le mélange gélatineux de protéine peut affecter le microenvironnement et chirurgie peut influer sur la réponse de stress/immunitaire14. Donc, les enquêteurs étudient le microenvironnement et/ou le stress/système immunitaire devraient être conscients du risque, facteurs de confusion.

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Protocol

L’approbation de la Roswell Park Cancer Center Institutional Animal prise en charge globale et utilisation a été obtenue pour toutes les expériences.

Remarque : Neuf à douze semaines femelles BALB/c souris sont obtenus. Les cellules 4 t 1-luc2, une souris Adénocarcinome mammaire lignée cellulaire provenant de souris BALB/c qui a été conçu à la luciférase express, sont utilisés. Ces cellules sont cultivées dans un milieu 1640 Roswell Park Memorial Institute (RPMI) avec 10 % sérum fœtal (SVF).

1. préparation des Instruments

  1. Décongeler un mélange de protéine gélatineux congelés (p. ex., Matrigel) sur la glace dans une hotte de culture de tissus.
  2. Nettoyer et stériliser deux ensembles d’instruments chirurgicaux (microdissection ciseaux, pince Adson et un porte-aiguille) avant la chirurgie. Préparer stérilisé 5-0 des sutures en soie et sèche stérilisant (séries chirurgies sont prévues).
  3. Couper les cheveux de poitrine moyen des souris avec la pince et marquer les souris pour identification par poinçonnage de l’oreille avant l’heure de la chirurgie.
  4. Préparer la table de la procédure, qui peut être utilisée immédiatement pour l’opération.
    1. Répandre un tampon absorbant et fixer les coins avec du ruban, fixer les coiffes anesthésie avec du ruban, mettre stérilisant et désinfectant (chlorhexidine, iode et 75 % d’éthanol) à côté de l’espace de manoeuvre et placez les souris dans l’ordre d’opération.

2. préparation des cellules (pour 10 souris)

Remarque : Les cellules doivent être utilisés moins de 1 h après détaché de la capsule afin d’éviter une diminution de la viabilité. Plus précisément, la suspension cellulaire doit être jetée dans le mélange de protéines gélatineux dans 15 min après avoir détaché les cellules du plat pour maintenir leur viabilité.

  1. La culture des cellules 4 t 1-luc2, une lignée de cellules d’Adénocarcinome mammaire de souris exprimant la luciférase, en milieu RPMI 1640 avec 10 % FBS dans un incubateur à 37 ° C à 5 % de CO2à humidifié.
  2. Laver les cellules 4 t 1-luc2 adhérente dans un plat de 10 cm avec une solution saline tamponnée au phosphate (PBS) à l’aide d’une pipette sérologique de 10 mL. Ajouter 1 mL de 0,25 % de trypsine à l’aide d’une pipette P1000 et, ensuite, incuber les échantillons à 37 ° C pendant 5 min. Puis, ajouter 4 mL de milieux de culture (RPMI-1640 avec 10 % FBS) à l’aide de 5 mL sérologique Pipeter et transférer la suspension cellulaire dans un tube conique de 15 mL sous une hotte de culture de tissus. Centrifuger la suspension cellulaire à 180 x g pendant 5 min.
  3. Aspirer le surnageant et remettre en suspension les cellules dans 2 mL de PBS ; Ensuite, compter les cellules à l’aide de l’hémocytomètre.
  4. Suspension 2 x 106 cellules 4 t 1-luc2 40 μl de PBS froid (pH 7,4, 4 ° C) dans la hotte de la culture de tissus.
  5. Mélanger la suspension cellulaire 40 μL avec 360 μl du mélange protéique gélatineux dans un tube de microtubes de 1,5 mL sur la glace dans la hotte de la culture de tissus.
    Remarque : La concentration finale est de 1 x 10520 μL (1:9 PBS : mélange de protéines gélatineux). Pour le modèle orthotopique (sans mastectomie), 1 x 10420 μL de la concentration finale a été utilisé, pour éviter d’atteindre les critères de l’euthanasie (tumeur taille > 2 cm) dans les deux semaines.

3. Inoculation de cellules de Cancer

  1. Mettre les souris dans la chambre d’induction de l’anesthésie avec 2 à 4 % isoflurane et 0,2 L/min débit d’oxygène jusqu'à ce que les souris respirent calmement (2 – 3 min).
  2. Saisissez la souris et injecter 0,05 mg/kg de buprénorphine dans son épaule par voie sous-cutanée.
  3. Confirmez anesthésie adéquate en l’absence de réaction à une pincée d’orteil. Insérez les nez de la souris dans l’orifice du masque souris, qui permet une anesthésie par inhalation avec 2-4 % isoflurane et 2 L/min débit d’oxygène attaché à une unité de filtre à charbon actif.
  4. Empêcher les membres de la souris à l’aide de ruban adhésif lab et stériliser sa peau à l’aide de chlorhexidine, iode et 75 % d’éthanol, à l’aide de tampons de coton.
  5. Faire une incision cutanée de 5 mm au milieu de la paroi thoracique antérieure utilisant des ciseaux stériles microdissection, ascenseur droite à côté de l’incision de la peau et détacher la peau de la paroi thoracique à l’aide des ciseaux et ensuite, inverser la peau afin d’exposer le droit #2 coussinets adipeux mammaire.
  6. Soigneusement injecter 20 μL de la suspension de cellules de cancer à l’aide d’une seringue à insuline 1 mL avec une aiguille de 28,5 G dans les coussinets adipeux sous vision directe par le biais de la plaie.
    Remarque : L’aiguille traverse la plaie, pas la peau. Gardez maintenant l’aiguille dans la grosse garniture pour 5 avant de s à tirant, qui permet à temps pour le mélange de protéines gélatineux se solidifier.
  7. Fermer les incisions cutanées par une couture, à l’aide de sutures non résorbables stériles 5-0.
  8. Après la chirurgie, retourner les animaux à une cage propre et de les surveiller jusqu'à ce qu’ils ont récupéré et sont déplacent librement (après environ 1-2 min). Si un animal ne semble pas être en bonne santé dans les 24h de la chirurgie, administrer la buprénorphine (0,2 mg/kg).
  9. Enlever les sutures sous anesthésie (voir étape 3.1) 7D après la chirurgie.

4. mastectomie

Remarque : Le calendrier de la mastectomie est très important. Si c’est fait trop tôt, les métastases pulmonaires ne se produit pas. Si elle est faite trop tard, la tumeur primitive a envahi des principaux vaisseaux sanguins, rendant difficile une résection oncologique complète. Ainsi, plusieurs points dans le temps ont été testés pour la mastectomie déterminer quel point de temps produit un juste équilibre dans l’attente de métastases avant résection ne devienne trop difficile. Après cela dans plus de 50 expériences de souris, il a été démontré que la mastectomie à 8 jours après l’inoculation de cellules de cancer (ou lorsque la taille de la tumeur atteint 5 mm) était l’idéal temps point pour atteindre qui équilibrent le13.

  1. Anesthésier une souris avec 2 à 4 % par inhalation isoflurane et injecter la buprénorphine (voir étapes 3.1 et 3.2).
  2. Bloquer la souris et stériliser sa peau (Voir l’étape 3.4).
  3. Faire une incision cutanée de 5 mm 2 mm à gauche de la cicatrice chirurgicale qui a été faite à l’inoculation de cellules du cancer initial, en utilisant les ciseaux de microdissection. Prolonger l’incision vers la racine de la patte avant pour enlever la tumeur, la peau dont la cicatrice chirurgicale et la lésion au contact de la tumeur, ainsi que le bassin de ganglions axillaires dans laquelle la plupart du temps qu'aucun ganglion visible n’existe au moment de la mastect Omy13. Veillez à ne pas endommager la veine axillaire.
  4. Fermer les défauts de l’épiderme par une couture, à l’aide de sutures non résorbables stériles 5-0 dans la forme d’un « Y ».
  5. Les mêmes qu’à l’étape 3.8, retourner la souris à une cage propre et moniteur jusqu'à ce qu’ils ont récupéré.
  6. Enlever les sutures sous anesthésie (voir étape 3.1) 7 jours après la chirurgie.

5. bioluminescente Quantification de la tumeur primitive (orthotopique Inoculation sans mastectomie) ou métastases pulmonaires (modèle de mastectomie)

Remarque : Pour la quantification de la tumeur primaire de fardeau, la bioluminescence est mesurée 2 x par semaine à compter du jour suivant l’inoculation orthotopique. Pour la quantification de métastases pulmonaires, la bioluminescence est mesurée 2 x par semaine à compter du lendemain de la mastectomie.

  1. D-luciférine dissoudre tampon phosphate salin de Dulbecco (SPD) à une concentration finale de 15 mg/mL dans une hotte de culture de tissus. Aliquote dans microcentrifugeuse blindé léger 1,5 mL tubes. Stocker la solution diluée à-80 ° C.
    Remarque : Pour une souris de 20 g, 200 µL de D-luciférine dilué est requise.
  2. Ouvrez le logiciel d’imagerie, puis cliquez sur initialiser.
    Remarque : Il faut environ 15 min pour refroidir le dispositif couplage de charge (CCD). Lorsque le CCD atteint la température réglée, la couleur de la barre de température passe du rouge au vert.
  3. Anesthésier les souris à l’isoflurane 2 à 4 % dans une chambre à induction dédié avant l’imagerie (voir étape 3.1).
  4. Peser les souris.
  5. Injection D-luciférine de 150 mg/kg par voie intrapéritonéale au point le milieu de l’abdomen, à l’aide d’une aiguille de 28,5 G.
  6. Placer chaque souris avec un cône de nez à l’intérieur du système d’imagerie en décubitus dorsal (lieu un maximum de cinq souris en même temps). Maintenir l’anesthésie à l’isoflurane 1 % - 3 % (à 100 % d’oxygène) par le biais de la coiffe en imagerie.
  7. Capturer une image toutes les 5 min pour détecter la bioluminescence de crête pendant 50 min (ou jusqu'à la bioluminescence pic confirmés).
    1. Sélectionnez Luminescence Auto, Binning comme médiumet champ de vision comme D.
    2. Cliquez sur acquérir pour capturer l’image.
  8. Retourner les souris à leurs cages et analysez-les jusqu'à ce qu’ils ont récupérés (voir étape 3,8).

6. poumon métastase tumorale fardeau Quantification par imagerie Ex Vivo

Remarque : Quantification de métastases pulmonaires est applicable pour l’orthotopic inoculation avec et sans des modèles de mastectomie. Dans le modèle de la mastectomie, ex vivo imagerie ou la survie observation est choisie, selon le but. Dans le modèle de l’inoculation (sans mastectomie) orthotopique, la plupart des cas produisent des critères d’euthanasie taille tumeur primitive (> 2 cm) environ 21 jours après l’inoculation.

  1. Quantifier des lésions métastatiques 21 jours après l’inoculation de cellules de cancer par imagerie ex vivo.
  2. Anesthésier les souris à l’isoflurane 2 à 4 % dans une chambre à induction dédié (voir étape 3.1).
  3. Peser les souris.
  4. Injecter par voie intrapéritonéale de 150 mg/kg D-luciférine (voir point 5.6).
  5. Euthanasier les souris par dislocation cervicale, 15 min après les injections.
  6. Ouvrir l’abdomen en coupant la peau et le péritoine dans le milieu de l’abdomen, à l’aide des ciseaux de Mayo courbés. Prolonger l’incision à droite et à gauche. Sortez le foie avec une pince jusqu'à ce que le diaphragme est visualisé ; Ensuite, couper la membrane.
  7. En utilisant les ciseaux Mayo courbés, couper les côtes bilatéraux de caudale (12 côtes) à céphalique (1ère côtes) pour exposer les poumons par retournement de la paroi du thorax antérieur.
  8. Identifier le œsophage thoracique, qui ressemble à une corde reliant les poumons à la colonne vertébrale, en soulevant les poumons à l’aide de pinces et, ensuite, couper le œsophage à l’aide des ciseaux de microdissection.
  9. Soulevez le bilatérales poumons et le coeur avec une pincette (tirant tirant vers le bas, en direction de céphalique à caudale) et, ensuite, couper la trachée et les gros bateaux à l’apex du poumon à la céphalique, à l’aide de ciseaux de microdissection.
    Remarque : Cela permet d’isoler les poumons et le cœur du corps.
  10. Retirer le cœur des poumons à l’aide de ciseaux de microdissection.
  11. Mettre les poumons dans une boîte de Pétri de 10 cm.
  12. Capturer l’image de la bioluminescence (voir étapes 5.7.1 et 5.7.2) 5 min après l’euthanasie (20 min après l’injection de la luciférine).

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Representative Results

Le but du modèle orthotopique consiste à mimer la progression du cancer chez l’humain (c'est-à-dire, la croissance de la tumeur primitive, suivie de métastases ganglionnaires et métastases pulmonaires puis lointain)15. Après l’inoculation de cellules de cancer, la bioluminescence est quantifiée régulièrement (deux à trois fois / semaine) (Figure 1 a). La bioluminescence dans les poumons est plus profond et plus petit que la lésion primaire. La bioluminescence reflète principalement le fardeau de la tumeur primaire chez les souris vivantes3 (Figure 1 b et 1C). La taille de la tumeur a été également mesurée par mesure de calibre. Le volume de la tumeur a été estimé à l’aide de l’équation suivante : volume = (longueur) x (largeur)22 (Figure 1). Quantification de la charge tumorale par bioluminescence et mesure de calibre a montré des tendances similaires dans les résultats représentatifs (Figure 1 b et 1D) ; Cependant, nous rencontrent parfois des divergences. Nous supposons que quantifier le fardeau de la tumeur primaire utilisant la bioluminescence est plus précis par rapport à la mesure de la taille de la tumeur par un étrier lorsque la taille de la tumeur est inférieure à 1,5 cm. Parce qu’il reflète viable les cellules cancéreuses, même qu'un petit nombre de cellules peut être détecté par bioluminescence, et seulement les cellules cancéreuses peuvent être détectés à l’intérieur de la tumeur, sans compter les infiltration de cellules immunitaires et qui entoure les cellules du stroma3. Ce modèle est utile pour évaluer l’efficacité d’une régression tumorale médiée par médicament anticancéreux et réponses immunitaires3,7,16. Le fardeau de la tumeur des métastases pulmonaires peut également être quantifié par ex vivo imagerie dans ce modèle (Figure 1E) ; Toutefois, la limitation est que les souris doivent être euthanasiés pour quantifier le fardeau de la tumeur métastatique.

Le but du modèle mastectomie est de 1) reproduire la norme de soin du cancer du sein humain, qui est l’ablation chirurgicale de la tumeur primaire17et 2) permettent la série quantification de la charge de tumeur métastatique in vivo. Ce modèle est particulièrement utile dans l’étude préclinique du développement de nouvelles thérapeutiques13. Comme déjà publiés, un inhibiteur de la Src, AZD0530, qui a montré l’efficacité du modèle préclinique de souris, mais a échoué dans un essai clinique pour le traitement du cancer, a montré l’efficacité dans la lésion primaire utilisant l’orthotopic inoculation sans mastectomie mais pas dans les métastases pulmonaires utilisant le modèle de mastectomie présentées ici. Bien que les médicaments contre le cancer (p. ex., anthracyclines) sont parfois utilisés chez les humains comme thérapie néoadjuvante pour traiter les tumeurs du sein primitif, la grande majorité des médicaments est utilisée comme traitement adjuvant où les médicaments sont donnés après la chirurgie pour réduire le risque de récidive de traitement du cancer cliniquement indétectable ou comme traitement palliatif pour un cancer métastatique1,7,18. Ainsi, ce modèle de la mastectomie a été établi, qui imite le processus de traitement humain11.

Huit jours après l’inoculation de cellules de cancer, la tumeur primitive est chirurgicalement enlevé (Figure 2). Pour tester un de l’efficacité du médicament pour les lésions métastatiques, elle doit être placée après la mastectomie. Ce modèle permet de quantification de lésion métastatique pulmonaire, mais aussi de quantification de lésion métastatique dans tout l’organisme, tant que le fardeau de la tumeur métastatique a une bioluminescence détectable utilisant l’imagerie in vivo. Le taux de récidive locale de mur de poitrine est assez faible. Dans notre expérience, le taux de récidive locale était inférieur à 5 % dans les expériences de plus de 50 souris. Toutefois, si la bioluminescence jour postopératoire 1 dépasse 1.00E + 06 photons (10 x plus grande que les autres individus), il y a un risque élevé d’une tumeur résiduelle local13. S’il y a des cellules cancéreuses de vestige actuels, une tumeur palpable apparaît dans les deux semaines. Lorsqu’il y a une tumeur résiduelle locale, la bioluminescence reflète principalement cette récidive locale plutôt que toute lésion métastatique. Les tumeurs résiduelles sont connus pour se comportent très différemment des métastases à distance19; ainsi, ces animaux avec des récidives locales (< 5 % dans notre expérience) devraient être exclues d’une analyse ultérieure. Ce modèle de mastectomie permet aussi de tumeur métastatique série fardeau suivi sans devoir euthanasier les animaux. En outre, une telle surveillance bioluminescentes peut être confirmée par ex vivo quantification de métastases pulmonaires. Au lieu de quantifier des métastases pulmonaires par imagerie ex vivo, ayant ainsi euthanasier les animaux, la survie de souris après traitement chirurgical peut être également surveillée comme un critère d’évaluation clinique traduisible (Figure 2D). Puisqu’il n’y a aucune lésion primaire, souris ne peuvent satisfaire les critères de tumeur de l’euthanasie qui sont généralement définies comme une taille de la tumeur de > 2 cm ou une ulcération de la tumeur primitive. Dans ce modèle de mastectomie 4 t 1, toutes les souris sont morts dans les 60 jours après l’inoculation de cellules du cancer en raison de métastases.

Figure 1
Figure 1 : vue d’ensemble du modèle orthotopique sans mastectomie. (A), ce panneau indique une évolution temporelle de l’orthotopic modèle utilisant le modèle syngénique 4 t 1. (B), ce panneau affiche la bioluminescence confiné d’un modèle orthotopique qui reflète principalement la tumeur primitive. La barre d’erreur indique l’erreur-type de la moyenne (n = 10). (C), ce panneau affiche séries images de la bioluminescence de tout le corps (de la même souris). La barre d’échelle indique 1 cm. (D) ce panneau montre la taille de la tumeur réelle du groupe B, mesurée par des étriers. La barre d’erreur indique l’erreur-type de la moyenne (n = 10). (E), ce panneau affiche poumon ex vivo images de bioluminescence de 10 souris de modèle orthotopique (n = 10). La barre d’échelle indique 1 cm. s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 2
Figure 2 : vue d’ensemble du modèle mastectomie. (A), ce panneau indique une évolution temporelle de la mastectomie modèle après l’implantation syngénique orthotopique 4 t 1. La barre d’échelle indique 1 cm. (B), ce panneau affiche la bioluminescence de tout le corps du modèle mastectomie, qui reflète principalement la lésion métastatique. La barre d’erreur indique l’erreur-type de la moyenne (n = 10). (C), ce panneau affiche séries images de la bioluminescence de tout le corps (de la même souris). Utilisant l’imagerie ex vivo, il a été confirmé que les signaux provenaient de métastases pulmonaires, et aucune récidive locale a été confirmée par l’imagerie du corps entier après l’ablation du poumon. Echelle = 1 cm. (D), cette courbe de survie panneau montre le Kaplan-Meier du modèle mastectomie sans n’importe quel traitement de la toxicomanie. Souris ont été euthanasiés quand ils ont atteint les critères de l’euthanasie avec n’importe quelle condition morbide. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

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Discussion

Pour la dernière décennie, nous avons mis en place plusieurs modèles de cancer murine, y compris du sein cancer modèles3,7,13,16,20,21. Auparavant, nous avons démontré que breast cancer cell orthotopique l’inoculation dans le tissu de la glande mammaire sous vision directe produit une tumeur plus grande avec moins de variabilité taille par rapport à l’injection de cellules autour du mamelon sans une incision chirurgicale7 . Ce modèle a été amélioré grâce à une suspension de cellules dans un mélange de protéines gélatineux. Les formes de la tumeur générée par les cellules de la protéine gélatineux suspendu mélange étaient ronds avec moins de variabilité, tandis que ceux générés par PBS-suspension de cellules se sont dispersés dans la glande mammaire3.

De plus, nous avons vérifié que les tumeurs générés par la méthode d’implantation orthotopique chirurgicales présentée ici très exprimé les gènes dont les réseaux d’interaction sont importants dans la progression du cancer par rapport à ceux générés par non chirurgical ou sous-cutanée injection,7. Ces résultats indiquent que ce modèle imite cancer du sein humain mieux comparé à orthotopique non chirurgical ou implantation sous-cutanée7. Nous avons également démontré que ce modèle ne convient d’évaluer la régression immunitaire du cancer du sein à l’aide de rejet de l’allogreffe3. Toutefois, incision cutanée peut également causer l’inflammation autour de la tumeur14. Par conséquent, selon l’hypothèse testée par l’enquêteur, il est important de considérer l’inflammation comme un facteur de confusion possible.

Autre que le néoadjuvante définissant, la grande majorité des thérapies systémiques est administrée après que la tumeur mammaire primaire est chirurgicalement enlevé11. A ce jour, la majorité des études précliniques pour le développement de nouveaux médicaments évalue la réaction aux médicaments dans la tumeur primitive, mais pas dans les lésions métastatiques1,18. Cet écart entre les modèles animaux et traitement humain est important car le profil génétique des lésions métastatiques est significativement différent de celles de la lésion primaire22, qui a des implications importantes pour la biologie du cancer et le traitement , en particulier dans l’ère de la thérapie ciblée22. Par conséquent, l’efficacité du médicament pour le traitement adjuvant doit être évaluée dans les lésions métastatiques, non seulement dans la tumeur primitive. Nous avons vérifié le calendrier de la formation de métastases ganglionnaires et pulmonaires après inoculation orthotopique, utilisant le 4 t 1 breast cancer orthotopique modèle16. Nous avons aussi démontré qu’une résection de la tumeur primitive améliore la survie dans le cancer du sein métastatique utilisant la mastectomie modèle23. Ainsi, nous avons essayé d’établir un modèle de mastectomie après l’implantation orthotopique du cancer cell. Cependant, beaucoup de temps a été dépensé pour établir ce modèle faible de récidive locale. Parce que les cellules cancéreuses sont injectées par l’incision chirurgicale, les cellules cancéreuses migrent facilement dans la plaie. En outre, les cellules cancéreuses envahissent les tissus en contact direct avec la tumeur, comme les environnantes muscle de mur de poitrine et la peau. Les cellules cancéreuses a également métastaser dans les ganglions axillaires sans former une masse axillaire visible au moment de la mastectomie. Enlever la tumeur peut être une technique plus facile, cette opération n'est pas traduisible pour mastectomie dans le traitement du cancer du sein car il provoque une récidive locale13. Ainsi, ce « modèle de mastectomie radicale » a été créé afin d’éliminer toutes les cellules cancéreuses de la paroi thoracique antérieure et le bassin de ganglions axillaires, tel que décrit à la Figure 2. Nous avons confirmé de métastases pulmonaires par histologie et poumon imagerie ex vivo, et il n’y avait aucune lésion brillante présente par imagerie du corps entier après l’ablation du poumon. Dans ce modèle orthotopique de 4 t 1, cellules cancéreuses éventuellement métastaser vers les poumons, dans tous les cas, dans les 21 jours. Cependant, le calendrier des métastases dépend de la taille de la tumeur primaire ; moins la taille de la tumeur primaire variabilité est donc importante de surveiller non seulement la tumeur primitive, mais aussi le fardeau de la tumeur métastatique. En utilisant le mélange de protéines gélatineux, variabilité de taille de tumeur peut être minimisée. Cependant, le mélange de protéines gélatineux peut également affecter le microenvironnement tumoral. Donc, le potentiel de confusion des facteurs liés à l’utilisation de mélange de protéine gélatineux devrait être considéré, selon l’hypothèse de l’enquêteur.

Utilisant ces techniques et la luciférase exprimant des cellules cancéreuses permettent de quantification fardeau tumoral avec moins erreur de mesure, même dans les tumeurs non palpables. Il existe deux systèmes de journaliste, bioluminescentes et fluorescents, de visualiser les signaux dans les animaux vivants. Bien qu’il ait été rapporté que le signal de bioluminescence et fluorescence peut être suffisamment lumineux pour la quantification, lorsque le signal de la cible est très faible, le signal de fluorescence de fond est plus élevé, ce qui réduit l’exactitude de l’analyse. En revanche, la bioluminescence est détecté avec plus de précision à un signal plus faible avec moins d’interférence de fond24. En conséquence, la plupart des chercheurs préfèrent utiliser des systèmes de journaliste de bioluminescence en live animal experiments24,25. Cependant, la quantification de fardeau tumoral par bioluminescence a ses limites. Les cellules exprimant luciférase brillent quand luciférine atteint les cellules cancéreuses par perfusion cardio-vasculaire26. Si la lésion a une superficie de hypoxie et/ou hypoperfusion, luciférine n’est pas distribué dans les cellules et la valeur de bioluminescence pourrait, alors, être mesurée pour être inférieure à la charge réelle tumeur. En effet, nous avons vécu quantification de bioluminescence inapproprié lorsque la taille de la tumeur a atteint plus de 1,5 cm. Nous supposons que c’est dû à la décrit hypoxique ou hypoperfusion condition. Ainsi, lorsque la tumeur atteint une taille palpable, le fardeau de la tumeur est quantifié par bioluminescence et mesure de calibre. Une limitation importante de quantification de la bioluminescence à considérer est la fourrure noire de souris. Même après que la fourrure est supprimée, il n’y a pigmentation sur la peau27. Tandis que la bioluminescence peut être détecté et quantifié chez les souris avec fourrure noire, elle est diminuée et, par conséquent, il est important de comparer les souris de la même couleur de fourrure les uns aux autres afin de réduire les effets confondants de couleur de la fourrure sur la quantification bioluminescente. L’utilisation de cellules exprimant luciférase fournit certaines modalités uniques pour l’étude. Par exemple, luciférase ainsi utilisable pour la quantification du fardeau tumoral par mesure de sang ou d’urine bioluminescence28. Dans le modèle présenté ici, quantification charge tumorale directe des cellules cancéreuses viables dans les animaux vivants avec luciférase non-ainsi est simple et directe, qui ne requiert pas le prélèvement d’échantillons de sang ou d’urine.

Semblable aux modèles qui introduit ici, la production d’un plus efficace expérimentation animale en produisant un taux de succès plus élevé de la tumorigenèse avec moins de variabilité est essentielle pour prouver les résultats. Dans le modèle actuel, une fois qu’un enquêteur a appris la technique, il est facile d’atteindre un taux de tumorigenèse 100 %. Nous avons également atteint des taux plus élevés de tumorigenèse autres que les modèles que nous avons mis en place ; de plus, nous avons établi un modèle d’orthotopique de cancer du côlon utilisant la suspension cellulaire dans un mélange de protéines gélatineux, ainsi que de la technologie de la bioluminescence pour quantifier le fardeau de tumeur21. En conclusion, le modèle animal présenté ici fournit un modèle murin pour mener l’étude sur le cancer.

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Disclosures

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Acknowledgments

Ce travail a été soutenu par subvention NIH R01CA160688 et Susan G. Komen Foundation chercheur initié Research grant (IIR12222224) à des souris K.T. bioluminescence images ont été acquises par la ressource partagée translationnelle Imaging Resource partagée au Roswell Park Comprehensive Cancer Center, qui a été appuyée par le Cancer Center Support (P30CA01656) et Instrumentation partagé subvention (S10OD016450).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Micro Dissection Scissors Roboz RS-5983 For cancer cell inoculation and masstectomy
Adson Forceps Roboz RS-5233 For cancer cell inoculation and masstectomy
Needle Holder Roboz RS-7830 For cancer cell inoculation and masstectomy
Mayo Roboz RS-6873 For ex vivo
5-0 silk sutures Look 774B For cancer cell inoculation and masstectomy
Dry sterilant (Germinator 500) Braintree Scientific GER 5287-120V For cancer cell inoculation and masstectomy
Clipper Wahl 9908-717 For cancer cell inoculation and masstectomy
Matrigel Corning 354234 For cancer cell inoculation
D-Luciferin, potassium salt GOLD-Bio LUCK-1K For bioluminescence quantification
Roswell Park Memorial Insitute 1640 Gibco 11875093 For cell culture
Fetal Bovine Serub Gibco 10437028 For cell culture
Trypsin-EDTA (0.25%) Gibco 25200056 For cell culture

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Katsuta, E., Oshi, M., Rashid, O. M., Takabe, K. Generating a Murine Orthotopic Metastatic Breast Cancer Model and Performing Murine Radical Mastectomy. J. Vis. Exp. (141), e57849, doi:10.3791/57849 (2018).

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