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Biology

Zebrafish टाप में एकल-कक्ष रिज़ॉल्यूशन कैल्शियम इमेजिंग का उपयोग करके बीटा-कक्ष फ़ंक्शन का विश्लेषण

Published: July 3, 2018 doi: 10.3791/57851
Automatic Translation
1,2, 1, 1,2
1Center for Molecular and Cellular Bioengineering, TU Dresden, 2Paul Langerhans Institute Dresden of the Helmholtz Center Munich at the University Hospital Carl Gustav Carus of TU Dresden

Summary

बीटा-सेल कार्यक्षमता के लिए महत्वपूर्ण है रक्त-ग्लूकोज homeostasis, जो एकल सेल संकल्प में मूल्यांकन किया है कैल्शियम की आमद के लिए एक आनुवंशिक रूप से इनकोडिंग रिपोर्टर का उपयोग कर ।

Abstract

अग्नाशय बीटा कोशिकाओं हार्मोन इंसुलिन स्रावित द्वारा रक्त ग्लूकोज सांद्रता बढ़ाने के लिए प्रतिक्रिया. बीटा कोशिकाओं की शिथिलता hyperglycemia और गंभीर, जीवन के लिए खतरा परिणाम की ओर जाता है । समझ कैसे बीटा कोशिकाओं को शारीरिक स्थितियों के तहत काम और क्या आनुवंशिक और पर्यावरणीय कारकों के कारण उनके रोग मधुमेह रोगियों के लिए बेहतर इलाज के विकल्प के लिए नेतृत्व कर सकते हो सकता है । बीटा कोशिकाओं में कैल्शियम का स्तर को मापने की क्षमता बीटा कोशिका समारोह का एक महत्वपूर्ण संकेतक के रूप में कार्य करता है, के रूप में कैल्शियम आयनों की आमद इंसुलिन रिलीज से चलाता है. यहां हम ग्लूकोज की निगरानी के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन-zebrafish बीटा कोशिकाओं में कैल्शियम को उत्तेजित GCaMP6s, कैल्शियम का एक आनुवंशिक रूप से इनकोडिंग सेंसर का उपयोग करके । विधि पूर्व vivo घुड़सवार टाप में एकल सेल संकल्प के साथ intracellular कैल्शियम गतिशीलता की निगरानी की अनुमति देता है । एक ही टाप के भीतर बीटा कोशिकाओं की ग्लूकोज-जवाबदेही अलग ग्लूकोज सांद्रता, जो zebrafish बीटा कोशिकाओं के बीच कार्यात्मक विविधता की उपस्थिति का पता चलता है के तहत एक साथ कब्जा किया जा सकता है । इसके अलावा, तकनीक उच्च लौकिक और स्थानिक संकल्प है, जो ग्लूकोज उत्तेजना पर कैल्शियम का तांता की थरथरानवाला प्रकृति से पता चलता है प्रदान करता है । हमारे दृष्टिकोण के दरवाजे को खोलता है एक मॉडल के रूप में zebrafish का उपयोग करने के लिए बीटा सेल समारोह और शिथिलता के लिए आनुवंशिक और पर्यावरणीय कारकों के योगदान की जांच ।

Introduction

हमारे रक्त-ग्लूकोज एक संकीर्ण रेंज में बनाए रखा है, अंत में स्रावी अग्ंयाशय के समारोह के कारण बड़े हिस्से में । अंत में अग्ंयाशय की भूमिका आइलेट्स, जो हार्मोन स्रावित कोशिकाओं को नियंत्रित की टाप द्वारा किया जाता है । इंसुलिन स्रावित बीटा कोशिकाओं एक कार्बोहाइड्रेट युक्त भोजन के बाद रक्त ग्लूकोज के स्तर को कम करने के लिए जिम्मेदार हैं. बीटा कोशिका से अपर्याप्त इंसुलिन स्राव मधुमेह1में परिणाम कर सकते हैं, जो निरंतर उच्च रक्त ग्लूकोज की विशेषता है. प्रकार 1 और प्रकार 2 मधुमेह, जो वर्तमान में ४००,०००,००० से अधिक लोगों को दुनिया भर में पीड़ित, रुग्णता और मृत्यु2की ओर जाता है । आणविक और पर्यावरणीय कारकों है कि बीटा कोशिका रोग में योगदान की जांच करके, हम बेहतर कैसे टाइप 2 मधुमेह शुरू होता है और प्रगति समझ जाएगा । इसके अलावा, मानव स्टेम कोशिकाओं में कार्यात्मक बीटा कोशिकाओं में अंतर करने की क्षमता इन विट्रो में सेल प्रतिस्थापन चिकित्सा के लिए नए बीटा कोशिकाओं के एक स्रोत प्रकार में प्रदान कर सकते हैं 1 मधुमेह. इस अंत करने के लिए, यह बीटा सेल समारोह और आनुवंशिक मॉडल जीवों में परिपक्वता का अध्ययन करने के क्रम में एक डिश में कार्यात्मक बीटा कोशिकाओं बनाने के लिए आवश्यक ज्ञान हासिल करने के लिए महत्वपूर्ण है ।

बीटा सेल की कार्यक्षमता ग्लूकोज उत्तेजना के जवाब में स्रावित इंसुलिन की कुल मात्रा को बढ़ाता द्वारा पूरे-टाप स्तर पर नजर रखी जा सकती है । इस संचई दृष्टिकोण एक सेल के व्यक्तिगत गुणों में अंतर के बिना टाप कोशिकाओं के एक एकल समूह के रूप में अध्ययन । हालांकि, व्यक्तिगत बीटा कोशिकाओं के ग्लूकोज प्रतिक्रियाओं के विश्लेषण बीटा कोशिकाओं के कार्यात्मक गुणों में विविधता और3विविधता की उपस्थिति का पता चला. व्यक्तिगत बीटा-कोशिकाओं के समारोह का आकलन करने के लिए, यह intracellular परिवर्तन है कि इंसुलिन स्राव4के लिए नेतृत्व की निगरानी करने के लिए संभव है. इंसुलिन स्राव बीटा कोशिकाओं में ग्लूकोज की एक प्रविष्टि से पहले है. बीटा-कोशिकाओं में प्रवेश करने वाला ग्लूकोज एटीपी को तेजी से metabolized है । उच्च intracellular एटीपी सांद्रता बीटा सेल ध्रुवीकरण के लिए अग्रणी एटीपी-संवेदनशील पोटेशियम आयन चैनलों की खुली संभावना में कमी । ध्रुवीकरण वोल्टेज के प्रति संवेदनशील कैल्शियम आयन चैनलों को खोलता है और intracellular कैल्शियम बढ़ जाती है । बारी में, कैल्शियम इंसुलिन की exocytosis चलाता है, जो परिसंचरण में जारी किया गया है और ग्लूकोज का स्तर कम करती है-उपयोग5,6,7।

कई रणनीतियों बीटा कोशिकाओं के समारोह की जांच करने के लिए लागू किया गया है, झिल्ली संभावित8की निगरानी सहित, इंसुलिन के प्रत्यक्ष दृश्य-बुलबुले exocytosis9, और intracellular Ca के ठहराव2 + ग्लूकोज-जवाबदेही10के लिए एक प्रॉक्सी के रूप में आमद । उनमें से, intracellular Ca 2 के इमेजिंग+ का लाभ प्रदान करता है-एक ही टाप11,12के भीतर एकाधिक व्यक्तिगत कोशिकाओं को विश्लेषण स्केलिंग, के बीच ग्लूकोज की प्रतिक्रिया की सीधी तुलना के लिए अनुमति व्यक्तिगत बीटा-कोशिकाओं । Intracellular Ca2 + एकाग्रता कैल्शियम के प्रति संवेदनशील फ्लोरोसेंट रंजक13 या आनुवंशिक रूप से इनकोडिंग कैल्शियम संकेतक (GECIs)14का उपयोग कर निगरानी की जा सकती है । जबकि कैल्शियम-संकेतक रंजक कोशिका प्रकार विशिष्टता की कमी है, GECIs विशिष्ट प्रवर्तकों द्वारा एक विशिष्ट कोशिका प्रकार में व्यक्त किया जा सकता है । साथ ही, GECIs की नई जनरेशन, जैसे GCaMP6, तेज़ लौकिक dynamics15के साथ बेहतर सिग्नल-टू-शोर अनुपात प्रदान करता है । यहां हम GECIs की नई पीढ़ी की उपयोगिता का वर्णन, विशेष रूप से GCaMP6s में, एकल सेल संकल्प पर बीटा कोशिकाओं में कैल्शियम की कल्पना । हम अपनी पसंद के मॉडल के रूप में zebrafish प्राथमिक टाप करने के लिए इस विधि लागू होते हैं । भ्रूण के विकास के दौरान, प्राथमिक टाप में बीटा कोशिकाओं पृष्ठीय और ventral अग्नाशय कलियों16से शुरू । प्राथमिक टाप zebrafish अग्न्याशय के भीतर एक टकसाली संरचनात्मक स्थिति पर स्थित है, अपनी आसान पहचान और अलगाव को सक्षम करने से । प्राथमिक टाप में बीटा-कोशिकाएं ग्लूकोज-नियमन के लिए आवश्यक हैं, क्योंकि उनकी आनुवंशिक पृथक hyperglycemia17,18की ओर जाती है । इसके अलावा, इन बीटा कोशिकाओं जल्दी zebrafish विकास19के दौरान ग्लूकोज उत्तरदायी हो. इस प्रोटोकॉल भी माध्यमिक टाप, जो बाद भ्रूण चरणों के दौरान फार्म इमेजिंग करने के लिए लागू किया जा सकता है । प्रोटोकॉल छवि बीटा-कोशिकाओं के पूर्व vivo, विकास के बाद के चरणों में और परिभाषित ग्लूकोज सांद्रता के तहत अनुमति देता है ।

Protocol

पशु विषयों सहित सभी प्रक्रियाओं को पशु कल्याण अधिनियम और Landesdirektion Sachsen, जर्मनी (AZ 24 – 9168.11-1/2013-14, T12/2016) की अनुमति के साथ अनुमोदित कर दिया गया है ।

1. तैयारी

नोट: यह प्रोटोकॉल डबल ट्रांसजेनिक टीजी (ins: एनएलएस-Renilla-mKO2; cryaa:) से zebrafish प्राथमिक टाप के ex vivo इमेजिंग के लिए है; टीजी (ins: GCaMP6s; cryaa: mCherry) 19 zebrafish. इस ट्रांसजेनिक लाइन में, इंसुलिन प्रवर्तक (ins) दो transgenes की बीटा-कोशिका विशिष्ट अभिव्यक्ति को चलाता है: एनएलएस-Renilla-mKO2, जो monomeric Kusabira ऑरेंज 2 (mKO2) प्रतिदीप्ति के साथ बीटा-कोशिकाओं के नाभिक को चिह्नित करता है; और GCaMP6s15, जो intracellular कैल्शियम के स्तर में वृद्धि के जवाब में हरी प्रतिदीप्ति का उत्सर्जन करता है । बीटा-सेल-विशिष्ट अभिव्यक्ति GCaMP6s के आसपास के सेल प्रकार में कैल्शियम परिवर्तन से हस्तक्षेप के बिना बीटा कोशिकाओं की ग्लूकोज जवाबदेही का अध्ययन करने में सक्षम बनाता है ।

  1. तैयार ताजा फाइब्रिनोजेन स्टॉक (10 मिलीग्राम/एमएल) भंग 10 Ca के 1 मिलीलीटर में गोजातीय फाइब्रिनोजेन के2 +/Mg2 +-युक्त हैंक्स ' संतुलित नमक समाधान (HBSS) में एक १.५ मिलीलीटर केंद्रापसारक ट्यूब । भंवर सख्ती जब तक फाइब्रिनोजेन पाउडर पूरी तरह से घुल । अधिक से कम 15 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर समाधान रखें ।
    नोट: शेयर के लिए कमरे के तापमान पर रखा जा सकता है 2 – 3 h. यदि समाधान polymerize करने के लिए शुरू होता है और चिपचिपा हो जाता है शेयर त्यागें ।
  2. HBSS में फाइब्रिनोजेन स्टॉक तीन गुना कमजोर करके फाइब्रिनोजेन कार्य समाधान (३.३ मिलीग्राम/एमएल) तैयार करें । उदाहरण के लिए, HBSS के ६०० µ l में फाइब्रिनोजेन शेयर के ३०० µ l को मिलाकर µ कार्य समाधान के ९०० फाइब्रिनोजेन l को तैयार करना.
  3. thrombin की 10 इकाइयों को भंग करके thrombin सॉल्यूशन (10 U/ml) को HBSS या फास्फेट्ड खारा (पंजाब) के 1 मिलीलीटर में तैयार करें ।
    नोट: यह समाधान अग्रिम में तैयार किया जा सकता है, aliquoted में ५० µ l भागों, और पर जमे हुए-20 ° c.
  4. २०० mM d-ग्लूकोज सॉल्यूशन को भंग करके d-ग्लूकोज का ५० मिलीलीटर पानी में घोल तैयार करें । लंबी अवधि के भंडारण के लिए 4 डिग्री सेल्सियस में रखें ।
  5. पानी की ५० मिलीलीटर में KCl के १.१ ग्राम भंग करके ३०० mM KCl समाधान तैयार करें । लंबी अवधि के भंडारण के लिए 4 डिग्री सेल्सियस में रखें ।
  6. टाप बढ़ते के लिए ३५ mm व्यास ग्लास-नीचे व्यंजन की खरीद ।
  7. विच्छेदन और टाप के बढ़ते के लिए, एक स्टीरियो माइक्रोस्कोप प्रतिदीप्ति लैंप और लाल फिल्टर घन के साथ सुसज्जित का उपयोग करें (TRITC: उत्तेजना: 532 – 554 एनएम, उत्सर्जन: 570-613 एनएम; या टेक्सास-लाल: उत्तेजना: 540 – 580 एनएम, उत्सर्जन: 592-667 एनएम) ।
  8. इमेजिंग के लिए बीटा कोशिकाओं में कैल्शियम की आमद, 20X (०.८ NA) हवा उद्देश्य के साथ एक औंधा फोकल माइक्रोस्कोप (जीस LSM ७८० या इसी तरह) का उपयोग करें और ३५ mm व्यास ग्लास-नीचे व्यंजन के लिए एक प्लेट धारक के साथ सुसज्जित ।
  9. zebrafish euthanizing के लिए tricaine मीथेन sulfonate (MS222) का २०० मिलीग्राम/L समाधान तैयार करें ।
  10. zebrafish विच्छेदन के लिए ९० mm पेट्री व्यंजन की खरीद ।

2. Zebrafish प्राथमिक टाप विच्छेदन और बढ़ते

  1. Euthanize एक मछली MS222 में लंबे समय तक मशीन का उपयोग कर । इस के लिए, धीरे मछली एक मछली पकड़ने के जाल का उपयोग कर टैंक से मछली को हटाने और यह एक पेट्री MS222 समाधान युक्त पकवान में जब तक जानवर कोई opercular (गिल) आंदोलन से पता चलता है यह मशीन; आमतौर पर, यह 5 मिनट लेता है एक पेट्री HBSS समाधान से युक्त डिश के लिए मछली स्थानांतरण Ca2 +/Mg2 +।
  2. एक प्रतिदीप्ति लैंप और लाल फिल्टर घन के साथ सुसज्जित एक स्टीरियो माइक्रोस्कोप के तहत, अग्न्याशय को अलग करने के लिए पशु के पेट के दाईं ओर कवर त्वचा काटना ।
    1. इस के लिए, zebrafish के मुंह से गुदा पंख तेज संदंश का उपयोग कर की त्वचा में कटौती । काट त्वचा छील दूर पेट को बेनकाब करने के लिए; यह snipping आंतरिक अंगों को उजागर करता है । बीटा-कोशिकाओं में mKO2 अभिव्यक्ति के लाल प्रतिदीप्ति का उपयोग करके, माइक्रोस्कोप के तहत दृश्य परीक्षा द्वारा टाप के स्थान का पता लगाने. अगर जरूरत पड़े तो लिवर की पालियों को हटा दें, क्योंकि वे टाप को ढक सकते हैं, जिससे ढूंढना मुश्किल हो रहा है ।
      नोट: प्राथमिक टाप पेट के पूर्वकाल क्षेत्र के पास स्थित है, आमतौर पर दाईं ओर ।
  3. लीवर और adipocytes जैसे आसपास के ऊतकों को सावधानीपूर्वक निकालकर प्राथमिक टाप को साफ करें । इस टाप पर घायल या प्रहार न करने के लिए एहतियात बरतें; आसपास के ऊतकों के समाशोधन के बाद, टाप सतह पर व्यक्तिगत कोशिकाओं को समझदार बन जाते हैं ।
  4. एक गिलास नीचे पकवान के केंद्र पर HBSS के एक 30 µ एल ड्रॉप पिपेट । इस ड्राप को विच्छेदित टाप पर स्थानांतरित करें ।
  5. ध्यान से HBSS के साथ एक बार टाप धोने और फाइब्रिनोजेन काम समाधान (३.३ मिलीग्राम/एमएल) के 30 µ l के साथ एक बार । धोने के चरणों के दौरान टाप के सूखने से बचने के लिए सुनिश्चित करें क्योंकि कोशिका मृत्यु में ऐसा परिणाम करने में असफलता ।
  6. धीमे और धीरे thrombin समाधान के 10 µ एल जोड़ें (10 U/एमएल) । छोड़ दो और टाप पकवान 15-20 मिनट के लिए अछूता है कि फाइब्रिनोजेन-thrombin ड्रॉप चिपचिपा और थोड़ा अपारदर्शी हो जाएगा इस बिंदु पर ।

3. Ex Vivo Live-Zebrafish प्राइमरी टाप में GCaMP प्रतिदीप्ति तीव्रता की इमेजिंग

  1. मोल्ड के शीर्ष पर HBSS के २०० µ एल जोड़ें और डिश ध्यान से फोकल माइक्रोस्कोप की प्लेट धारक पर जगह है । फोकल इमेजिंग के लिए एक 20X, ०.८ एनए, एयर उद्देश्य का उपयोग करें । brightfield विकल्प का उपयोग कर टाप का पता लगाएँ ।
  2. बीटा-कोशिकाओं में न्यूक्लियर mKO2 प्रतिदीप्ति को देखने के लिए रेड प्रतिदीप्ति के लिए फिल्टर का इस्तेमाल कर टाप पर फोकस करें । व्यक्तिगत नाभिक स्पष्ट रूप से दिखाई जानी चाहिए ।
  3. अपने z-अक्ष के साथ टाप की मोटाई के माध्यम से स्थानांतरित करने के लिए इतनी के रूप में फोकल माइक्रोस्कोप के फोकल विमान को मैन्युअल रूप से बदलने के द्वारा एक स्पष्ट इमेजिंग विमान का पता लगाएँ । सुनिश्चित करें कि इमेजिंग विमान इमेजिंग के लिए बीटा कोशिकाओं की एक पर्याप्त संख्या (50 – 100) है, और परमाणु mKO2 प्रतिदीप्ति की चमक एक समान है, विशेष रूप से टाप के केंद्र में ।
  4. GCaMP6s और mKO2 प्रतिदीप्ति के लिए एक अनुक्रमिक अधिग्रहण "स्मार्ट सेटअप मेनू" में निंनलिखित सेटिंग्स का उपयोग कर सेट करें: GCaMP6s, उत्तेजना: ४८८ एनएम, उत्सर्जन: 500-555 एनएम, झूठी रंग: हरा ("GFP") का चयन करें; mKO2, उत्तेजना: ५६१ एनएम (mCherry), उत्सर्जन: 570-630 एनएम, झूठी रंग: लाल ("mCherry" का चयन करें) ।
    नोट: इस सेटिंग के साथ ही रेड चैनल बीटा-सेल नाभिक की पोजीशन रिकॉर्ड करेगा, जबकि ग्रीन चैनल GCaMP प्रतिदीप्ति की तीव्रता को रिकॉर्ड करेगा ।
  5. "अधिग्रहण मोड" में १,०२४ x १,०२४ पिक्सेल पर छवि संकल्प सेट, 10 में गति और 1 पर औसत । "समय-श्रृंखला" के लिए विकल्प का चयन करके एक निरंतर रिकॉर्डिंग आरंभ करें, और ५०० चक्र के लिए "अवधि" की स्थापना, लगभग 2 एस के साथ फ्रेम प्रति अधिग्रहण समय ।
    नोट: पहली बार के ५० फ्रेम-श्रृंखला 5 मिमी ग्लूकोज एकाग्रता पर बीटा कोशिकाओं की गतिविधि के अनुरूप. यह आधारभूत प्रतिक्रिया है । एक प्रतिक्रिया बीटा सेल एपिलेशन और समय के साथ हरी प्रतिदीप्ति तीव्रता में ढलते दिखाई देगा । हमने देखा है कि कुछ (1-5%) बीटा-कोशिकाओं में 5 मिमी ग्लूकोज दोलन ।
  6. इमेजिंग चक्र पर नजर रखें । पहले ५० फ्रेम के बाद, आसपास के समाधान के ग्लूकोज एकाग्रता में वृद्धि 10 मिमी रिकॉर्डिंग को रोकने के बिना.
    1. बिना perturbing छवि अधिग्रहण, धीरे पिपेट 5 µ एल के २०० mM D-ग्लूकोज पकड़ जेल के शीर्ष पर समाधान टाप । 10 मिमी ग्लूकोज में १५० फ्रेम का अधिग्रहण ।
      नोट: ग्लूकोज एकाग्रता में वृद्धि बीटा-ग्रीन चैनल में GCaMP फ्लोरोसेंट दोलनों के दौर से गुजर कोशिकाओं की संख्या में वृद्धि होगी ।
    2. सुनिश्चित करें कि प्रक्रिया के दौरान कोशिकाओं के नाभिक स्थिर रहते हैं । यदि टाप अधिग्रहण के दौरान बड़े पैमाने पर मिलाते है और नाभिक फोकल विमान से बाहर जा रहे हैं, नमूने को त्यागें (यदि आवश्यक हो) ।
    3. बहुलकीकरण फाइब्रिनोजेन-thrombin मोल्ड के क्रम में बाद के नमूनों की स्थिरता सुनिश्चित करने के लिए सक्षम करने के लिए समय की एक पर्याप्त अवधि रुको ।
  7. २०० फ्रेम में, आगे के समाधान की एकाग्रता में वृद्धि 20 मिमी द्वारा धीरे pipetting 10 µ एल के २०० mm D-ग्लूकोज समाधान । 20 मिमी एकाग्रता के लिए १५० फ्रेम का अधिग्रहण ।
  8. ३५० तख्तों के बाद ध्रुवीकरण कर टाप 30 एमएम KCl का उपयोग कर रहे हैं । इसके लिए, ३०० mM KCl शेयर सॉल्यूशन के 20 µ l को जोड़ें । इस स्तर पर, निरीक्षण कि GCaMP6s प्रतिदीप्ति दोलनों बंद हो जाएगा और एक उच्च तीव्रता पर तय; बीटा-कोशिकाओं है कि ग्लूकोज का जवाब नहीं था भी KCL अलावा पर हरी प्रतिदीप्ति तीव्रता में वृद्धि प्रदर्शित हो सकता है ।

4. व्यक्तिगत बीटा-कोशिकाओं के लिए GCaMP प्रतिदीप्ति स्ट्रेस का ठहराव

नोट: का पता लगाने और ग्लूकोज के स्तर में बदलती करने के लिए व्यक्तिगत बीटा कोशिकाओं की प्रतिक्रियाओं को बढ़ाता है, पूरे इमेजिंग अवधि के लिए GCaMP प्रतिदीप्ति तीव्रता को बढ़ाता है. ठहराव सेलुलर संकल्प पर किया जाता है । इसके लिए, फ़िजी का उपयोग20 छवियों से GCaMP प्रतिदीप्ति की तीव्रता मूल्यों को निकालने के लिए (कदम 4.1 – 4.6), और स्प्रेडशीट सॉफ्टवेयर या आर21 विश्लेषण करने के लिए (कदम 4.8 – 4.9).

  1. फिजी में छवि फ़ाइल खोलें "LSM Toolbox" का उपयोग कर । इस के लिए, चुनें "प्लगइन । LSM Toolbox । शो LSM toolbox ". "LSM Toolbox" में, "ओपन LSM" पर क्लिक करें और छवि फ़ाइल का चयन.
    नोट: "LSM उपकरण बॉक्स" द्वारा समर्थित नहीं स्वरूपों के लिए, उन्हें विश्लेषण के लिए tiff में पहले कनवर्ट करें ।
  2. फिजी में क्षेत्र-के-हित (ROI) टूल का उपयोग करके कक्षों की प्रतिक्रियाओं को निकालें. "विश्लेषण" मेनू "उपकरण" के अंतर्गत में "रॉय प्रबंधक" खोलें । टूलबार में स्थित "बहुभुज चयन टूल" का उपयोग करके ROI को मैंयुअली आरेखित करना ।
  3. रॉय को उस लाल चैनल में ड्रा करो जिसमें बीटा-सेल नाभिक दिखाई दे रहे हैं. रॉय का चयन करें जैसे कि यह किसी ऐसे क्षेत्र को शामिल करता है जो सेल के कोशिका द्रव्य के कुछ शामिल करने के लिए किसी कोशिका के नाभिक से बड़ा होता है । सुनिश्चित करें कि रॉय की स्थिति फ्रेम के बीच सुसंगत है और यदि आवश्यक हो तो स्थिति को समायोजित ।
  4. "add [t]" बटन पर क्लिक करके "ROI प्रबंधक" में चयनित ROIs जोड़ें. एकाधिक कक्षों पर डेटा प्राप्त करने के लिए ROI में एकाधिक ROIs का चयन करें और जोड़ें.
  5. अगला, "विश्लेषण" मेनू से, "सेट माप" का चयन करें. क्षेत्र के भीतर कुल प्रतिदीप्ति तीव्रता का निष्कर्षण निर्दिष्ट करने के लिए "एकीकृत घनत्व" का चयन करें ।
  6. GCaMP प्रतिदीप्ति युक्त ग्रीन चैनल में बदलाव और "रॉय प्रबंधक" में "मल्टी माप" का चयन करें.
    नोट: यह समय-श्रृंखला भर में कोशिकाओं के लिए तीव्रता माप प्रदान करेगा.
  7. मामले में रॉय की स्थिति को टाप के आंदोलन के कारण समायोजित करने की जरूरत है, मैंयुअल रूप से अलग फ्रेम में तीव्रता माप संकलन । किसी अलग स्प्रेडशीट में मानों की प्रतिलिपि बनाएं और चिपकाएं ।
  8. "LSM Toolbox" से छवि फ्रेम के टाइमस्टैंप प्राप्त करें । उपयोग "टिकटें लागू करें । टी टिकटें लागू करें । फ़ाइल नाम । textfile करने के लिए डंप "टाइमस्टैंप प्राप्त करने के लिए । "इस रूप में सहेजें" विकल्प का उपयोग करके टाइमस्टैंप सहेजें, या उंहें स्प्रेडशीट में प्रतिलिपि बनाएं ।
  9. सभी कक्षों के लिए तीव्रता मानों को संकलित करने पर, एक समय या स्वचालित रूप से विश्लेषण एक कक्ष (उदा., Excel सूत्रों या R का उपयोग करके) निष्पादित करें.
  10. दो चरणों में व्यक्तिगत कक्षों का विश्लेषण करें ।
    1. पहले चरण में, आधार रेखा के ऊपर प्रतिदीप्ति तीव्रता की गणना करें । इस अंत करने के लिए, आधारभूत फ्लोरोसेंट तीव्रता की गणना (एफ0) पहले ५० फ्रेम (5 मिमी ग्लूकोज) के लिए प्रतिदीप्ति तीव्रता के औसत के रूप में । फिर आधारभूत (f0) को पूरे समय-श्रृंखला (f – f0) से घटाना ।
      नोट: कुछ कोशिकाओं बेसल ग्लूकोज, जो आम तौर पर उच्च सांद्रता के साथ उत्तेजना के बाद जारी रखने के तहत स्पष्ट GCaMP दोलनों दिखा सकते हैं । ऐसी कोशिकाओं के लिए, यह केवल प्रारंभिक फ्रेम जिसमें कोशिकाओं प्रतिदीप्ति में एक बूंद दिखाया का मतलब तीव्रता लेने के द्वारा एफ0 अनुमान करने के लिए संभव है ।
    2. विश्लेषण के दूसरे चरण में, प्रतिदीप्ति तीव्रता को सामान्य करके अंतिम GCaMP प्रतिदीप्ति तीव्रता प्राप्त करें.
      नोट: यह विभिन्न जानवरों से टाप के बीच मतभेदों को दूर करने के लिए किया जाता है. व्यक्तिगत टाप ग्लूकोज उत्तेजना पर प्रतिदीप्ति उत्सर्जन के स्तर को अलग प्रदर्शन ।
    3. इसे उच्चतम तीव्रता मान के साथ विभाजित करके प्रतिदीप्ति तीव्रता को सामान्य करना. इस के लिए, पीक तीव्रता (एफमैक्स -एफ0) की गणना, और पीक तीव्रता से आधारभूत मूल्यों विभाजित करने के लिए अंतिम GCaMP प्रतिदीप्ति तीव्रता उपज (एफ – एफ0)/(एफअधिकतम -एफ0) ।
  11. उन कक्षों को छोड़ें जो KCl उत्तेजना के बाद तीव्रता में परिवर्तन प्रदर्शित नहीं करते हैं, क्योंकि वे अस्वस्थ या क्षतिग्रस्त हो सकते हैं ।
  12. विश्लेषण करने के लिए (चरण 4.9 – 4.10) r में, का उपयोग करें r स्क्रिप्ट (plotcelltrace । R) इस पांडुलिपि के साथ प्रदान की ।

Representative Results

प्रोटोकॉल का उपयोग ऊपर वर्णित है, एक ४५ दिनों के बाद निषेचन (dpf) zebrafish से एक टाप में बीटा कोशिकाओं के ग्लूकोज प्रतिक्रियाओं का विश्लेषण किया गया । इसके लिए प्राथमिक टाप को एक euthanized पशु से विच्छेदित किया गया और फाइब्रिनोजेन-thrombin मोल्ड में एक गिलास नीचे की डिश में रखा गया । टाप 5 एमएम ग्लूकोज युक्त HBSS में विसर्जित किया गया । ग्लूकोज एकाग्रता 10 मिमी और 20 मिमी करने के लिए एक कदम वार तरीके में वृद्धि हुई थी । बढ़ती ग्लूकोज सांद्रता के लिए बीटा कोशिकाओं की प्रतिक्रियाएं दर्ज की गई । अंत में, बीटा कोशिकाओं 30 mM KCl (चित्रा 1) का उपयोग कर ध्रुवीकरण किया गया । KCl का उपयोग कर ध्रुवीकरण स्वस्थ बीटा कोशिकाओं में कैल्शियम प्रवेश लाती है ।

फिजी और एक डेटा विश्लेषण सॉफ्टवेयर का उपयोग करना, व्यक्तिगत बीटा कोशिकाओं के GCaMP6s प्रतिदीप्ति तीव्रता निकाली और सामान्यीकृत है (चित्रा 2). के रूप में प्रतिदीप्ति तीव्रता का पता लगाने से देखा, व्यक्तिगत बीटा कोशिकाओं ग्लूकोज उत्तेजना, जो KCl उत्तेजना पर बंद हो जाता है पर GCaMP6s प्रतिदीप्ति में दोलनों प्रदर्शन । तकनीक बीटा कोशिका की ग्लूकोज-जवाबदेही और उनकी कार्यक्षमता में एक खिड़की के एक सेलुलर संकल्प प्रदान करता है ।

Figure 1
चित्रा 1: पूर्व vivo लाइव-zebrafish बीटा कोशिकाओं में GCaMP6s का उपयोग कर कैल्शियम की आमद की इमेजिंग । टीजी (ins: एनएलएस-Renilla-mKO2) से एक प्राथमिक टाप; टीजी (ins: GCaMP6s) zebrafish (४५ dpf) फाइब्रिनोजेन-thrombin मोल्ड में बढ़ गया था और 5 मिमी (बेसल) ग्लूकोज के साथ मशीन । बीटा-कोशिकाओं को एक लाल परमाणु मार्कर के साथ लेबल किया गया है, जबकि GCaMP6s प्रतिदीप्ति ग्रीन चैनल में मौजूद है । टाप एक ग्लूकोज-10 मिमी और 20 मिमी डी-ग्लूकोज के साथ अनुक्रमिक मशीन से मिलकर रैंप के साथ उत्तेजित हो गया था, और 30 mm KCl. ऐरोहेड निशान व्यक्तिगत बीटा-कोशिकाओं जिसका गतिविधि का विश्लेषण किया गया था के अलावा के माध्यम से विध्रुवीकरण । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 2
चित्रा 2: सामान्यीकृत GCaMP6s प्रतिदीप्ति तीव्रता-व्यक्तिगत बीटा कोशिकाओं के लिए ट्रेस. सामान्यीकृत GCaMP6s प्रतिदीप्ति तीव्रता-ट्रेस बीटा कोशिकाओं के लिए चित्र 1में ऐरोहेड के साथ चिह्नित । X-अक्ष सेकंड में समय का अर्थ है । शीर्ष पर, सलाखों HBSS माध्यम में ग्लूकोज और KCl की एकाग्रता को दर्शाती है । Y-अक्ष समय-श्रृंखला के दौरान सामान्यीकृत प्रतिदीप्ति तीव्रता का अर्थ होता है. इस के लिए, आधारभूत तीव्रता (एफ0) 5 मिमी ग्लूकोज में मशीनीकरण के दौरान मतलब तीव्रता के रूप में गणना की है. यह पूरे समय श्रृंखला डेटा (f-f0) से घटाया है । तीव्रता से अधिक बेसलाइन सेल (एफ-एफ0)/(एफमैक्स-एफ0) द्वारा प्रदर्शित अधिकतम तीव्रता से सामान्यीकृत है । सामान्यीकृत ट्रेस कोशिकाओं को 30 मिमी KCl के साथ अस्थिर कर रहे हैं, जो स्थिर ग्लूकोज, के लिए बीटा कोशिकाओं की एक थरथरानवाला प्रतिक्रिया से पता चलता है. इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें कृपया ।

Discussion

यहाँ हम एकल सेल संकल्प पर बीटा सेल ग्लूकोज जवाबदेही के ठहराव के लिए एक तकनीक का प्रदर्शन. इस intracellular कैल्शियम एकाग्रता का उपयोग कर एक आनुवंशिक रूप से इनकोडिंग कैल्शियम सूचक, GCaMP6s निगरानी द्वारा संभव बनाया है । बीटा सेल गतिविधि एक फाइब्रिनोजेन-thrombin मोल्ड में टाप बढ़ते द्वारा पूर्व वीवो कब्जा कर लिया है । प्रोटोकॉल का एक महत्वपूर्ण कदम मोल्ड की स्थिरता है । फाइब्रिनोजेन को HBSS समाधान में भंग करने के लिए पर्याप्त समय दिया जाना चाहिए । इसके बिना, मोल्ड इमेजिंग सत्र के दौरान स्थिरता प्रदान करने के लिए पर्याप्त रूप से polymerize नहीं करता है । एक फाइब्रिनोजेन में घुड़सवार टाप-thrombin मोल्ड और सेल संस्कृति मीडिया में डूबे के लिए व्यवहार्य रह सकते है कम से एक सप्ताह (नहीं दिखाया डेटा) । फाइब्रिनोजेन-thrombin मोल्ड के लिए विकल्प, कम पिघल agarose के रूप में, टाप22माउंट करने के लिए उपयोग किया जा सकता है । एक अंय महत्वपूर्ण पैरामीटर टाप का विच्छेदन है । इस चरण के दौरान, टाप के आसपास के ऊतकों को घायल या poking के बिना बाहर निकाल दिया जाना चाहिए । एक निपुण विच्छेदन अभ्यास के साथ आता है ।

इमेजिंग प्रोटोकॉल की एक सीमा टाप के एक फोकल विमान के लिए प्रतिबंध है । यह व्यक्तिगत बीटा कोशिकाओं के भीतर कैल्शियम आमद की गतिशीलता पर कब्जा करने के लिए किया जाता है । टाप की पूरी मोटाई के माध्यम से एक Z-स्टैक कम इमेजिंग गति और व्यक्तिगत कोशिकाओं से थरथरानवाला संकेत के नुकसान की ओर जाता है । इस सीमा जैसे कताई-डिस्क माइक्रोस्कोपी, 3-आयामों में कैल्शियम गतिशीलता पर कब्जा करने में सक्षम करने के लिए के रूप में फोकल इमेजिंग का तेजी से मतलब का उपयोग करके सुधार किया जा सकता है । एक अंय सीमांत vivo कैल्शियम इमेजिंग12 में होगा । zebrafish भ्रूण के पारदर्शी प्रकृति या वर्णक-zebrafish वयस्कों के कम उपभेदों के उपयोग के लिए भविष्य में vivo इमेजिंग में संभावना खोल सकता है ।

उच्च स्थानिक और लौकिक संकल्प पर बीटा सेल गतिविधि के इमेजिंग व्यक्तिगत बीटा कोशिकाओं के बीच कार्यात्मक विविधता की जांच करने के लिए सक्षम बनाता है । इस दृष्टिकोण में मदद कर सकते है बीटा सेल उप के अस्तित्व पर प्रकाश डाला आबादी । हाल ही में, कई अध्ययनों ने नाममात्र समरूप बीटा कोशिकाओं24,25,26में उप आबादी के अस्तित्व को दिखाया गया है । पूर्व vivo इमेजिंग आनुवंशिक पत्रकारों के साथ संयुक्त किया जा सकता है ग्लूकोज के लिए उप जनसंख्या प्रतिक्रिया की विशेषताएं । इसके अतिरिक्त, औषधीय उत्तेजना के साथ इमेजिंग सेटअप के संयोजन यौगिकों कि बीटा सेल कार्यक्षमता में सुधार कर सकता है की स्क्रीनिंग के लिए अनुमति दे सकते हैं ।

संक्षेप में, यहां प्रस्तुत तकनीक ठहराव और व्यक्तिगत बीटा कोशिकाओं के लिए ग्लूकोज जवाबदेही की तुलना की अनुमति देता है । यह बीटा-सेल कार्यक्षमता, मधुमेह के विकास में एक महत्वपूर्ण पैरामीटर में एक सीधी खिड़की प्रदान करता है ।

Disclosures

लेखक कोई प्रतिस्पर्धी वित्तीय हितों की घोषणा ।

Acknowledgments

हम पांडुलिपि पर टिप्पणी के लिए Ninov लैब के सदस्यों को धंयवाद, अपक्षयी उपचार ड्रेसडेन (CRTD) मछली और तकनीकी सहायता के लिए सूक्ष्म सुविधा के लिए केंद्र के सदस्यों । N.N. DFG-CRTD, टू में उत्कृष्टता के क्लस्टर-ड्रेसडेन, जर्मन रिसर्च फाउंडेशन (DFG) और जर्मन मधुमेह अनुसंधान के लिए केंद्र (DZD) से धन द्वारा समर्थित है ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Transgenic Zebrafish line: Tg(ins:nls-Renilla-mKO2; cryaa:CFP); Tg(ins:GCaMP6s; cryaa:mCherry) By request from authors
Stereo microscope ZEISS 495015-0001-000 SteREO Discovery.V8
Fluorescence lamp ZEISS 423013-9010-000 Illuminator HXP 120 V
Red Filter Cube ZEISS 000000-1114-462  Filter set 45 HQ TexasRed
Confocal Microscope ZEISS LSM 780
Bovine fibrinogen Sigma F8630
HBSS (Hanks' Balanced Salt solution) ThermoFisher 14025092
Thrombin Sigma T4648
D-Glucose Sigma G8270
KCl Sigma P9333
35 mm diameter glass-bottom dishes ThermoFisher 150680
tricaine methane sulfonate Sigma E10521 
Fine Forceps Fine Science Tools 11445-12
FIJI, using ImageJ Version: 2.0.0-rc-43/1.50e https://fiji.sc/
R, version 3.2.4 https://www.r-project.org/
RStudio https://www.rstudio.com/
plotcelltrace.R A custom script provided with the manuscript

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References

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जीव विज्ञान अंक १३७ बीटा-कोशिकाओं कैल्शियम GCaMP लाइव-इमेजिंग फंक्शन मधुमेह zebrafish
Zebrafish टाप में एकल-कक्ष रिज़ॉल्यूशन कैल्शियम इमेजिंग का उपयोग करके बीटा-कक्ष फ़ंक्शन का विश्लेषण
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Janjuha, S., Pal Singh, S., Ninov, N. Analysis of Beta-cell Function Using Single-cell Resolution Calcium Imaging in Zebrafish Islets. J. Vis. Exp. (137), e57851, doi:10.3791/57851 (2018).

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