Este protocolo proporciona a una guía completa de disección y análisis para la utilización de hitos profundos oculares s-opsina immunohistochemistry, Retistruct y código personalizado a exactamente y confiablemente Oriente la retina de ratón aislados en el espacio anatómico.
Precisa y segura identificación de orientación espacial de la retina de ratón aislados es importante para muchos estudios en Neurociencia visual, incluyendo el análisis de densidad y gradientes de tamaño de tipos de células retinianas, el ajuste de dirección de dirección selectiva las células del ganglio y el examen de los patrones topográficos degeneración en algunas enfermedades de la retina. Sin embargo, hay muchos métodos diferentes de disección ocular divulgados en la literatura que se utilizan para identificar y etiquetar orientación retiniana en la retina de ratón. Mientras que el método de orientación utilizado en este tipo de estudios es a menudo pasado por alto, no informa cómo retiniana orientación está determinada puede provocar discrepancias en la literatura y la confusión cuando se intenta comparar los datos entre los estudios. Hitos oculares superficiales tales como quemaduras corneales son de uso general pero se han demostrado recientemente para ser menos confiables que más lugares de interés como los músculos rectos, la fisura de la coroide o el gradiente s-opsina. Aquí, ofrecemos a una guía completa para el uso de hitos profundos oculares para diseccionar con precisión y documentar la orientación espacial de una retina de ratón aislados. Hemos también comparó la efectividad de dos anticuerpos s-opsina e incluye un protocolo de inmunohistoquímica s-opsina. Porque la orientación de la retina según el gradiente s-opsina requiere reconstrucción retiniana con software Retistruct y rotación con código personalizado, hemos presentado los pasos importantes para usar tanto de estos programas. En general, el objetivo de este protocolo es proporcionar un conjunto de métodos para la orientación exacta de retina que es adaptable a protocolos experimentales más confiable y repetible. Un objetivo primordial de este trabajo es estandarizar métodos de retina orientación para futuros estudios.
Un aspecto importante y a veces pasado por alto de Neurociencia retiniana es la orientación adecuada y el análisis de la retina de todo Monte aislada, ya sea la orientación de una retina en una cámara de grabación de electrofisiología o en una diapositiva histológica. Esto es particularmente importante para los estudios que implican la retina de ratón, que es actualmente el modelo más ampliamente utilizado para las investigaciones del sistema visual mamífero. Descubrimientos recientes revelan que la retina de ratón no es espacial uniforme pero tiene gradientes de densidad y tamaño de tipos de células retinianas funcionalmente distintas, como las células del ganglio de melanopsina, las de células ganglionares OFF-alfa de transitorias y opsins cono1,2 ,3,4,5. En consecuencia, el método utilizado para determinar la orientación de la retina puede afectar los resultados experimentales con células tipo o opsin distribuciones2,3,6, ajuste de dirección de dirección selectiva del ganglio las células7,8,9y los patrones topográficos de degeneración retiniana10,11,12,13,14 . De hecho, no informa cómo retiniana orientación se divulga puede provocar discrepancias en la literatura y la confusión cuando se intenta comparar los datos entre los estudios. Por lo tanto es vital que los investigadores informan el método para identificar la orientación de la retina por lo que pueden interpretarse exactamente los resultados de dichos estudios.
Orientación retiniana es identificado comúnmente por anotando la córnea dorsal, ventral, nasal o temporal antes de la enucleación ocular1,3,12,15,16,17 ,18,19 o por corte o monumentos, ojos profundos anatómicos como los músculos extraoculares6,7la coloración, el coroides fisuras20,21, o s-opsina gradiente2,3. Los músculos rectos se pueden utilizar para identificar la nasal dorsal, ventral y la retina temporal haciendo un corte profundo alivio que biseca el accesorio de el el recto superior, recto inferior, recto medial o músculo recto lateral, respectivamente. Sin embargo, para la mayoría de los experimentos, usando un músculo es suficiente para orientar la retina22. La fisura coroide, que es un remanente del desarrollo del ojo, puede verse como una línea horizontal tenue en la parte posterior del ojo. Cada extremo de esta línea termina en el polo temporal del mundo23o la nasal. Por último, expresión de s-opsina se distribuye asimétricamente a la retina ventral en ratones y anticuerpos s-opsina se pueden utilizar para revelar la retina ventral en immunohistochemical experimentos1.
Trabajo reciente de Stabio, et al. 22 demostró que superficial ocular tales como quemaduras corneales son un método menos confiable para orientar la retina en el espacio anatómico, muy probablemente debido a error humano y la variabilidad en la fabricación de la quemadura corneal cuando se utilizan temporal y medial ángulos palpebrales como puntos de referencia. En cambio, puntos de interés profundos, como el músculo recto superior, fisura coroide y el gradiente s-opsina, han demostrado ser más fiables y precisos puntos de referencia para orientar la retina22. Sin embargo, la identificación de estos puntos anatómicos requiere disección únicos pasos que se describen en detalle en la literatura. Así, el objetivo de este protocolo es proporcionar un tutorial completo sobre cómo usar el músculo recto superior, fisura coroide y gradiente s-opsina para identificar con precisión la orientación espacial de la retina de ratón. Además, hemos incluido una comparación de la efectividad de dos anticuerpos s-opsina, así como un protocolo de inmunohistoquímica s-opsina.
Un desafío adicional a los estudios de depender de la orientación exacta de retina es los grandes cortes alivio necesarios para aplanar la retina wholemount en una cámara de grabación, plato o diapositiva. Esto puede presentar desafíos para el análisis de lo que naturalmente es una estructura tridimensional cuando es reflejada como una estructura plana de dos dimensiones. Un programa llamado Retistruct24 puede utilizarse para devolver una retina plana wholemount a su estructura tridimensional antes de que los datos recogidos desde se analizaron. Así, una sección de este protocolo se dedica a destacar los pasos que son necesarios para utilizar el software de Retistruct para reconstruir la retina de ratón immunostained s-opsina. También hemos incluido una sección de protocolo para usar nuestro script personalizado de MATLAB, que fue desarrollado para rotar y orientar con precisión del ratón retinas con s-opsina.
No ha habido ningún protocolo completa, estandarizada para la determinación y la orientación de la retina de ratón aislados en el espacio anatómico de etiquetado. El protocolo detallado aquí intenta llenar este vacío por estandarizar y detallando cómo utilizar puntos profundos anatómicos como referencia puntos a confiablemente identificar orientación retiniana. Se ha demostrado que los puntos anatómicos profundos en este protocolo proporcionan un método más preciso y confiable para orientar la retina de ratón que hitos superficiales tales como quemaduras corneales22. Así, estudios que han confiado en quemaduras corneales para orientación retiniana pueden haber tenido mayor errores en orientación de estudios que se han basado en puntos de referencia como los músculos del músculo recto y fisura coroide. Esta discrepancia pone de relieve la necesidad y la importancia de este protocolo estandarizado con respecto a la interpretación de los resultados y realizar comparaciones entre los estudios que dependen de la orientación exacta de retina. En general, un protocolo estandarizado proporcionará un método común para los investigadores de la visión a seguir, eliminando así la presencia de una variable de confusión en la adquisición de datos que puede ocurrir con el uso de métodos no estandarizados para la identificación de retina orientación.
Los métodos presentados aquí son fácilmente repetible y aplicable a muchos tipos de protocolos experimentales. De hecho, una de las mayores ventajas de este protocolo es su adaptabilidad. Debido a la fisura coroide, expresión de s-opsina y monumentos de músculo de músculo recto se todos han encontrado confiablemente identificar orientación retiniana22 la señal que mejor se adapte a los parámetros experimentales se puede elegir para optimizar la adquisición de datos (tabla 1). Además, se pueden combinar métodos de disección con el fin de aclarar aún más la orientación de la retina. Por ejemplo, cortes de fisura coroide pueden combinarse con inmunohistoquímica s-opsina para orientar todos los cuatro polos de la retina: hemisferios nasal y temporales pueden ser identificados por los cortes de fisura coroide y s-opsina inmunohistoquímica se puede identificar hemisferios ventrales y dorsales. Sin embargo, la adaptabilidad de este protocolo puede estar limitada por la naturaleza sensible al tiempo de los experimentos de Fisiología. Porque el tiempo que toma para identificar un punto de referencia, hacer una quemadura corneal y ejecutar un corte alivio podría resultar en la muerte de tejido importante en experimentos ex vivo , algunos de estos métodos de disección pueden ser inferior al óptimos. Afortunadamente, una vez que un disector se ha convertido en familiar con la fisura coroide o el método de disección de músculo recto superior, identificar los hitos profunda y el alivio de cortes rápidamente a formar parte de la rutina de disección y no añadir significativamente a la longitud de la disección. Aunque reconocemos que los pasos detallados aquí pueden añadir el tiempo a experimentos extremadamente sensibles al tiempo, le sugerimos utilizar el gradiente s-opsina para post hoc retiniana orientación cuando la viabilidad de los tejidos ya no es un problema (figura 3 ). Coloración de la retina para s-opsina es una forma efectiva para orientar a la retina, como pueden identificar todos los cuatro polos: s-opsina coloración divide la retina en polos dorsales y ventrales y permite la identificación de la nasal y temporal postes dependiendo de si la retina es de un ojo derecho o izquierdo (figura 3). Por lo tanto, creemos que este protocolo ofrece un conjunto de métodos para la orientación exacta de retina que puede cumplir con los parámetros experimentales confiable y repetible.
Como con cualquier disección modificada retiniana, la validez del método de disección está limitada por la exactitud del disector y la calidad del tejido que ha sido aislado. Si los tejidos se pierde durante la disección o una retina es demasiado destrozada para la reconstrucción precisa, Retistruct y el programa MATLAB no serán capaces de reconstruir confiablemente u orientar la retina. Por lo tanto, es importante practicar el método de disección antes de experimentos utilizando para la recolección de datos. Mientras que los tipos de disecciones explicaron aquí no es difícil, debe ser practicadas para asegurar la repetibilidad de identificar orientación retiniana con una señal particular. Además, es esencial que se utiliza la práctica de disector visualmente identificar los puntos anatómicos antes de comenzar la recolección de datos para asegurarse de que la señal correcta. Una forma de comprobar la precisión de un disector especial es hacer cualquier fisura coroide cortes o músculo recto superior corta y luego comparar la ubicación de los cortes para el gradiente s-opsina, puesto que es un marcador fijo y así no es dependiente de la precisión de dissectio n. disectores potenciales también pueden comparar sus retinas reconstruidos a los ejemplos de retinas reconstruidos con señal precisa cortes se muestran en la figura 1 y la figura 2. Esencialmente, un disector potencial debe realizar los pasos descritos en este protocolo para un tipo particular de la disección, ya sea el músculo recto superior o coroides fisuras método y comparar los resultados con el gradiente s-opsina para establecer la validez de una disector de particular. Porque si no está seguro acerca de la ubicación de la señal del disector, puede resultar en una orientación incorrecta de la retina que va por defecto, afectan interpretación y recopilación de datos.
The authors have nothing to disclose.
Nos gustaría agradecer a Bretaña día y Jessica Onyak su asistencia técnica y el Dr. Liu por favor dejarnos utilizar su microscopio epifluorescente. Agradecimientos de apoyo: NIH R15EY026255-01 y la Fundación de Kirchgessner Karl.
0.1 M Phosphate Buffered Saline | Sigma-Aldrich | P5244 | |
Axioplan2 Epifluorescent Microscope | Zeiss | N/A | |
Clear Nailpolish | N/A | N/A | |
Corning LSE Low Speed Orbital Shaker | Sigma-Aldrich | CLS6780FP | |
Costar TC-Treated 24-well Plates | Sigma-Aldrich | CLS3524 | |
Dissection Microscope | Olympus | SZ51 | |
Donkey anti-Goat Alexa 594 | Life Technologies | A11058 | |
Donkey anti-Rabbit Alexa 594 | Life Technologies | A21207 | |
Donkey Normal Serum | Millipore | 566460 | Use at 5.2% (52 μL with 86 μL of 20% Triton X-100 and 863 μL of 0.1M PBS for 1 mL of blocking solution) |
Fisherbrand Superfrost Plus Microscope Slides | Fisher Scientific | 12-550-15 | |
Goat anti-s-opsin | Santa Cruz Biotechnologies | sc-14363 | Not commerically available as of 2017 |
Graefe Curved Forceps | Fine Science Tools | 11052-10 | |
ImageJ or FIJI | National Institute of Health | N/A | Freely available software |
Low Temperature Cautery Ophthalmic Fine Tip Cauterizer | Bovie Medical Corporation | AA00 | |
MATLAB | MathWorks | N/A | At least version 2007b or later |
Micro Cover Glasses | VWR International | 48393-241 | |
Micro Slide Trays | VWR International | 82020-913 | |
Moira Ultra Fine Forceps | Fine Science Tools | 11370-40 | |
Nitrocellulose membrane | Millipore | HAWP04700 | |
Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15714-S | Use at 4% (25 μL and 875 μL of 0.1 M PBS for 1 mL of fixative) |
PrecisionGlide Needle 20G (0.90mm x 25mm) | BD PrecisionGlide | 305175 | |
Pyrex Glass Petri Dish | Sigma-Aldrich | CLS3160152 | |
R | The R Project for Statistical Computing | N/A | Freely available software; version 3.4.3 or later |
Rabbit anti-s-opsin | Millipore | ABN1660 | |
Retiga R3 Microscope Camera | Qimaging | 01-RET-R3-R-CLR-14-C | |
Retistruct | N/A | N/A | Freely available software compatiable with Windows 7 or Windows 10 |
Shandon Aqua-Mount Slide Mounting Media | Fisher Scientific | 14-390-5 | |
Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | Use 1.7% (86 μL of 20% Triton-X with 52 μL of Donkey Normal Serum and 863 μL of 0.1 M PBS for 1 mL of blocking solution) |
Vannas Spring Dissection Scissors | Fine Science Tools | 15000-03 | |
5MP USB Microscope Digital Camera | AmScope | MU500 | To be used with the Olympus Dissection Microscope |