Этот протокол обеспечивает полное руководство диссекции и анализа для использования глубоко глазной достопримечательности, s опсин иммуногистохимии, Retistruct и пользовательского кода сориентироваться точно и надежно изолированных мыши сетчатки в анатомические пространстве.
Точно и надежно определение пространственной ориентации сетчатки изолированных мышь имеет важное значение для многих исследований в визуального нейронауки, включая анализ плотности и размера градиенты типов клеток сетчатки, тюнинг направление направление-селективных клетки ганглии и изучение Топографическая дегенерации моделей в некоторых заболеваний сетчатки. Однако есть много различных глазных рассечение методов в литературе о, которые используются для идентификации и ярлык сетчатки ориентации в сетчатке мыши. В то время как метод ориентации, используемых в таких исследованиях часто упускается из виду, определяется не отчетности как сетчатки ориентации может вызвать расхождения в литературе и путаницу при попытке сравнения данных между исследованиями. Поверхностные глазной достопримечательности, такие как ожоги роговицы часто используются, но недавно было показано, быть менее надежными, чем глубже достопримечательности, такие как прямых мышц, сосудистое трещина или s опсин градиента. Здесь мы предоставляем полное руководство для использования глубоко глазной достопримечательности точно анализировать и документирования пространственной ориентации изолированных мыши сетчатки. Мы также сравнить эффективность двух s опсин антител и включен протокол для s опсин иммуногистохимия. Потому что ориентация сетчатки по s опсин градиент требует сетчатки реконструкции с Retistruct программного обеспечения и вращение с пользовательским кодом, мы представили важные шаги, необходимые для использования обоих этих программ. В целом цель настоящего Протокола заключается в поставлять надежные и повторяемые набор методов для точной сетчатки ориентации, которая адаптируется к наиболее экспериментальных протоколов. Главной целью этой работы заключается в стандартизации методов сетчатки ориентации для будущих исследований.
Важную и иногда забывают аспект сетчатки нейронауки является правильной ориентации и анализ изолированных целом гора сетчатки, будь то ориентации сетчатки в камере электрофизиологии запись или на слайде гистологические. Это особенно важно для исследований с участием мыши сетчатки, который в настоящее время наиболее широко используется модель для исследования млекопитающих зрительной системы. Недавние открытия показывают, что мыши сетчатки пространственно неоднородно, но имеет плотность и размер градиенты сетчатки клетки функционально различных типов, например который клетки ганглии, переходных клеток ганглия OFF-альфа и конус опсины1,2 ,3,4,5. Следовательно, метод, используемый для определения ориентации сетчатки может повлиять на результаты экспериментов с участием ячейки типа или опсин дистрибутивов2,3,6, направление тюнинг направление селективный ганглии клетки7,8,9и топографические схемы дегенерации сетчатки10,11,12,13,14 . В самом деле сообщается не отчетности как сетчатки ориентации может вызвать расхождения в литературе и путаницы, при попытке сравнения данных между исследованиями. Поэтому важно, что исследователи сообщают метод для определения ориентации сетчатки, таким образом, чтобы результаты таких исследований может быть точно истолковано.
Сетчатки ориентации обычно идентифицируется скоринга спинной, брюшины, носа или височной роговицы до глазной Энуклеация1,3,12,,1516,17 ,18,19 или путем разрезания или окрашивание глубокие анатомические глаз достопримечательности, такие как экстраокулярные мышцы6,7, сосудистое расселина2120,, или s опсин градиента2,3. Мышцы влагалища прямой мышцы живота может использоваться для идентификации грудной, брюшной, носа и височной сетчатки, сделав глубокий снятия вырезать, что bisects вложение или Улучшенный прямая, Нижняя прямая, медиальная прямая или боковые прямая мышца, соответственно. Однако для большинства экспериментов, используя один прямая мышца является достаточным для ориентации сетчатки22. Сосудистое трещина, которая является пережитком глаз развития, можно рассматривать как слабое горизонтальной линии на задней части глаза. Каждый конец этой строки завершается на носовой или временной полюс мира23. Наконец s опсин выражение асимметрично распределены вентральной сетчатки в мышей, и s опсин антител может использоваться раскрыть вентральной сетчатки в иммуногистохимической экспериментов1.
Последние работы Stabio, и др. 22 показал, что поверхностные глазной достопримечательности, такие как ожоги роговицы менее надежный метод для ориентации сетчатки в анатомические пространства, скорее всего, из-за человеческой ошибки и изменчивости в принятии ожогом роговицы при использовании временной и медиальной canthi качестве точки отсчета. Напротив глубокая достопримечательности, такие как Улучшенный прямая мышца, сосудистое трещина и s опсин градиент, было показано, быть более надежные и точные ориентиры для ориентации сетчатки22. Однако выявление этих анатомические ориентиры требует уникальный рассечение шаги, которые не описаны подробно описаны в литературе. Таким образом цель настоящего Протокола заключается в том, предоставить всеобъемлющий учебник о том, как использовать Улучшенный прямая мышца, сосудистое трещина и s опсин градиент для точной идентификации пространственной ориентации мыши сетчатки. Кроме того мы включили сравнения эффективности двух s опсин антител, а также протокол для s опсин иммуногистохимия.
Один дополнительный вызов исследования, опираясь на точные сетчатки ориентации является большой снятия сокращений, необходимых для укладки wholemount сетчатки на запись камеры, блюдо или слайд. Это может создать проблемы для анализа что такое естественно трехмерную структуру, когда его образ в виде плоской двумерной структуры. Программа под названием Retistruct24 может использоваться вернуться его трехмерную структуру плоский wholemount сетчатки, прежде чем проанализированы данные, собранные из него. Таким образом раздел настоящего протокола посвящена отметив шаги, которые необходимы для использования программного обеспечения Retistruct для реконструкции s опсин immunostained мыши сетчатки. Мы также включили раздел протокола для использования наших сценариев MATLAB, который был разработан, чтобы точно поворот и Восточный мыши сетчатки, окрашенных с s опсин.
Там был не всеобъемлющий, стандартизированный протокол для определения и маркировки ориентации изолированных мыши сетчатки в анатомические пространстве. Протокол подробно здесь попытки заполнить этот пробел путем стандартизации и детализируя как использовать глубокие анатомические ориентиры как ориентир для надежно идентифицировать сетчатки ориентации. Было показано, что глубокие анатомические ориентиры в этом протоколе обеспечить более точный и надежный метод для ориентации мыши сетчатки чем поверхностные достопримечательности, такие как ожоги роговицы22. Таким образом исследования, которые полагались на роговицы ожогов сетчатки ориентации может имели больше ошибок в ориентации чем исследования, которые опирались на такие достопримечательности, как мышцы влагалища прямой мышцы живота и сосудистое трещина. Это несоответствие подчеркивает необходимость и значимость этого стандартизованного протокола в отношении интерпретации результатов и сравнений между исследованиями, которые зависят от точной ориентации сетчатки. В целом стандартизированный протокол будет обеспечивать общий метод для исследователей видение, чтобы следовать, таким образом устраняя наличие смешанных переменной в сбор данных, которые могут возникнуть с использованием нестандартизированного методов для выявления сетчатки ориентация.
Представленные здесь методы легко воспроизводимой и для многих видов экспериментальных протоколов. В самом деле один из величайших преимуществ этот протокол основывается на ее адаптивности. Потому что сосудистое трещина, s опсин выражение и прямая мышца достопримечательности все были найдены надежно определить сетчатки ориентации22 ориентир, который лучше всего подходит экспериментальные параметры могут быть выбраны для оптимизации сбора данных (таблицы 1). Кроме того, методы вскрытия могут быть объединены с целью дальнейшего уточнения ориентации сетчатки. Например, сосудистое трещина сокращений могут быть объединены с s опсин иммуногистохимия для того, чтобы ориентировать все четыре электрода сетчатки: носовой и временных полушарий могут быть идентифицированы по отрубы сосудистое трещина, и s опсин иммуногистохимия можно определить брюшной и спинной полушарий. Тем не менее адаптируемость настоящего Протокола может быть ограничен срочным характером физиологии экспериментов. Потому что время, необходимое для выявления ориентир, сделать ожог роговицы и выполнения снятия кроя может привести к значительным ткани смерти в ex vivo экспериментов, некоторые из этих методов диссекции может быть меньше оптимальной. К счастью после диссектор стал знаком с сосудистое трещина или Улучшенный прямая мышца рассечение метод, выявления глубокую достопримечательности и делая снятия отрубы быстро стать частью процедура диссекции и не добавлять значительно к длине рассечение. Хотя мы признаем, что шаги, описанные здесь можно добавить на время экспериментов крайне критичный по времени, мы предлагаем использовать s опсин градиента для пост Специального сетчатки ориентации, когда жизнеспособность тканей больше не является проблемой (рис. 3 ). Окрашивание сетчатки для s опсин является эффективным способом для ориентации сетчатки, как оно может идентифицировать все четыре электрода: s опсин пятнать делит сетчатки на дорсальной и вентральной поляков и позволяет для идентификации носовой и височной поляков в зависимости от сетчатки — из правого или левого глаза (рис. 3). Поэтому мы считаем, что этот протокол обеспечивает надежные и повторяемые набор методов для точной сетчатки ориентации, который может выполнить любой экспериментальной параметров.
Как с любой изменение сетчатки рассечение, действительность этого способа диссекции ограничен точности диссектор и качество ткани, был выделен. Если любой ткани теряется во время вскрытия или сетчатки слишком искажается для точной реконструкции, Retistruct и в программе MATLAB не будет возможность надежно восстановить или Ориент сетчатки. Поэтому важно практиковать метод вскрытия, прежде чем использовать его для сбора данных экспериментов. В то время как типы Анатомирование объяснил здесь не сложны, они должны быть осуществлены для обеспечения повторяемости идентификации сетчатки ориентации с определенной вехой. Кроме того важно, что используется практика диссектор, визуально определить анатомические ориентиры до начала сбора данных, чтобы убедиться, что правильный ориентир. Один из способов проверить точность конкретного диссектор это сделать либо сосудистое трещины, порезы или Улучшенный прямая мышечных сокращений и затем сравнить расположение сокращений s опсин градиент, поскольку она является фиксированной маркером и таким образом не зависит от точности dissectio n. потенциальных Диссекторы можно также сравнить их реконструированный сетчатки примеры реконструированный сетчатки с точной ориентир, порезы показано на рисунке 1 и Рисунок 2. По существу, потенциальные диссектор должен выполнить шаги, описанные в этом протоколе для конкретного рассечение типа, будь то Улучшенный прямая мышца или сосудистое расселина метод и сравнить полученные результаты для s опсин градиента установить действительность особое диссектор. Потому что если диссектор уверены о местонахождении ориентир, это может привести к неточной ориентации сетчатки что будет, по умолчанию, влияет на сбор данных и толкование.
The authors have nothing to disclose.
Мы хотели бы поблагодарить Brittany день и Джессика Onyak для их технической помощи и д-р Лю за любезно позволить нам использовать его epifluorescent Микроскоп. Подтверждений поддержки: низ R15EY026255-01 и Фондом Карла Кирчгесснер.
0.1 M Phosphate Buffered Saline | Sigma-Aldrich | P5244 | |
Axioplan2 Epifluorescent Microscope | Zeiss | N/A | |
Clear Nailpolish | N/A | N/A | |
Corning LSE Low Speed Orbital Shaker | Sigma-Aldrich | CLS6780FP | |
Costar TC-Treated 24-well Plates | Sigma-Aldrich | CLS3524 | |
Dissection Microscope | Olympus | SZ51 | |
Donkey anti-Goat Alexa 594 | Life Technologies | A11058 | |
Donkey anti-Rabbit Alexa 594 | Life Technologies | A21207 | |
Donkey Normal Serum | Millipore | 566460 | Use at 5.2% (52 μL with 86 μL of 20% Triton X-100 and 863 μL of 0.1M PBS for 1 mL of blocking solution) |
Fisherbrand Superfrost Plus Microscope Slides | Fisher Scientific | 12-550-15 | |
Goat anti-s-opsin | Santa Cruz Biotechnologies | sc-14363 | Not commerically available as of 2017 |
Graefe Curved Forceps | Fine Science Tools | 11052-10 | |
ImageJ or FIJI | National Institute of Health | N/A | Freely available software |
Low Temperature Cautery Ophthalmic Fine Tip Cauterizer | Bovie Medical Corporation | AA00 | |
MATLAB | MathWorks | N/A | At least version 2007b or later |
Micro Cover Glasses | VWR International | 48393-241 | |
Micro Slide Trays | VWR International | 82020-913 | |
Moira Ultra Fine Forceps | Fine Science Tools | 11370-40 | |
Nitrocellulose membrane | Millipore | HAWP04700 | |
Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15714-S | Use at 4% (25 μL and 875 μL of 0.1 M PBS for 1 mL of fixative) |
PrecisionGlide Needle 20G (0.90mm x 25mm) | BD PrecisionGlide | 305175 | |
Pyrex Glass Petri Dish | Sigma-Aldrich | CLS3160152 | |
R | The R Project for Statistical Computing | N/A | Freely available software; version 3.4.3 or later |
Rabbit anti-s-opsin | Millipore | ABN1660 | |
Retiga R3 Microscope Camera | Qimaging | 01-RET-R3-R-CLR-14-C | |
Retistruct | N/A | N/A | Freely available software compatiable with Windows 7 or Windows 10 |
Shandon Aqua-Mount Slide Mounting Media | Fisher Scientific | 14-390-5 | |
Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | Use 1.7% (86 μL of 20% Triton-X with 52 μL of Donkey Normal Serum and 863 μL of 0.1 M PBS for 1 mL of blocking solution) |
Vannas Spring Dissection Scissors | Fine Science Tools | 15000-03 | |
5MP USB Microscope Digital Camera | AmScope | MU500 | To be used with the Olympus Dissection Microscope |