Summary
Este protocolo proporciona a una guía completa de disección y análisis para la utilización de hitos profundos oculares s-opsina immunohistochemistry, Retistruct y código personalizado a exactamente y confiablemente Oriente la retina de ratón aislados en el espacio anatómico.
Abstract
Precisa y segura identificación de orientación espacial de la retina de ratón aislados es importante para muchos estudios en Neurociencia visual, incluyendo el análisis de densidad y gradientes de tamaño de tipos de células retinianas, el ajuste de dirección de dirección selectiva las células del ganglio y el examen de los patrones topográficos degeneración en algunas enfermedades de la retina. Sin embargo, hay muchos métodos diferentes de disección ocular divulgados en la literatura que se utilizan para identificar y etiquetar orientación retiniana en la retina de ratón. Mientras que el método de orientación utilizado en este tipo de estudios es a menudo pasado por alto, no informa cómo retiniana orientación está determinada puede provocar discrepancias en la literatura y la confusión cuando se intenta comparar los datos entre los estudios. Hitos oculares superficiales tales como quemaduras corneales son de uso general pero se han demostrado recientemente para ser menos confiables que más lugares de interés como los músculos rectos, la fisura de la coroide o el gradiente s-opsina. Aquí, ofrecemos a una guía completa para el uso de hitos profundos oculares para diseccionar con precisión y documentar la orientación espacial de una retina de ratón aislados. Hemos también comparó la efectividad de dos anticuerpos s-opsina e incluye un protocolo de inmunohistoquímica s-opsina. Porque la orientación de la retina según el gradiente s-opsina requiere reconstrucción retiniana con software Retistruct y rotación con código personalizado, hemos presentado los pasos importantes para usar tanto de estos programas. En general, el objetivo de este protocolo es proporcionar un conjunto de métodos para la orientación exacta de retina que es adaptable a protocolos experimentales más confiable y repetible. Un objetivo primordial de este trabajo es estandarizar métodos de retina orientación para futuros estudios.
Introduction
Un aspecto importante y a veces pasado por alto de Neurociencia retiniana es la orientación adecuada y el análisis de la retina de todo Monte aislada, ya sea la orientación de una retina en una cámara de grabación de electrofisiología o en una diapositiva histológica. Esto es particularmente importante para los estudios que implican la retina de ratón, que es actualmente el modelo más ampliamente utilizado para las investigaciones del sistema visual mamífero. Descubrimientos recientes revelan que la retina de ratón no es espacial uniforme pero tiene gradientes de densidad y tamaño de tipos de células retinianas funcionalmente distintas, como las células del ganglio de melanopsina, las de células ganglionares OFF-alfa de transitorias y opsins cono1,2 ,3,4,5. En consecuencia, el método utilizado para determinar la orientación de la retina puede afectar los resultados experimentales con células tipo o opsin distribuciones2,3,6, ajuste de dirección de dirección selectiva del ganglio las células7,8,9y los patrones topográficos de degeneración retiniana10,11,12,13,14 . De hecho, no informa cómo retiniana orientación se divulga puede provocar discrepancias en la literatura y la confusión cuando se intenta comparar los datos entre los estudios. Por lo tanto es vital que los investigadores informan el método para identificar la orientación de la retina por lo que pueden interpretarse exactamente los resultados de dichos estudios.
Orientación retiniana es identificado comúnmente por anotando la córnea dorsal, ventral, nasal o temporal antes de la enucleación ocular1,3,12,15,16,17 ,18,19 o por corte o monumentos, ojos profundos anatómicos como los músculos extraoculares6,7la coloración, el coroides fisuras20,21, o s-opsina gradiente2,3. Los músculos rectos se pueden utilizar para identificar la nasal dorsal, ventral y la retina temporal haciendo un corte profundo alivio que biseca el accesorio de el el recto superior, recto inferior, recto medial o músculo recto lateral, respectivamente. Sin embargo, para la mayoría de los experimentos, usando un músculo es suficiente para orientar la retina22. La fisura coroide, que es un remanente del desarrollo del ojo, puede verse como una línea horizontal tenue en la parte posterior del ojo. Cada extremo de esta línea termina en el polo temporal del mundo23o la nasal. Por último, expresión de s-opsina se distribuye asimétricamente a la retina ventral en ratones y anticuerpos s-opsina se pueden utilizar para revelar la retina ventral en immunohistochemical experimentos1.
Trabajo reciente de Stabio, et al. 22 demostró que superficial ocular tales como quemaduras corneales son un método menos confiable para orientar la retina en el espacio anatómico, muy probablemente debido a error humano y la variabilidad en la fabricación de la quemadura corneal cuando se utilizan temporal y medial ángulos palpebrales como puntos de referencia. En cambio, puntos de interés profundos, como el músculo recto superior, fisura coroide y el gradiente s-opsina, han demostrado ser más fiables y precisos puntos de referencia para orientar la retina22. Sin embargo, la identificación de estos puntos anatómicos requiere disección únicos pasos que se describen en detalle en la literatura. Así, el objetivo de este protocolo es proporcionar un tutorial completo sobre cómo usar el músculo recto superior, fisura coroide y gradiente s-opsina para identificar con precisión la orientación espacial de la retina de ratón. Además, hemos incluido una comparación de la efectividad de dos anticuerpos s-opsina, así como un protocolo de inmunohistoquímica s-opsina.
Un desafío adicional a los estudios de depender de la orientación exacta de retina es los grandes cortes alivio necesarios para aplanar la retina wholemount en una cámara de grabación, plato o diapositiva. Esto puede presentar desafíos para el análisis de lo que naturalmente es una estructura tridimensional cuando es reflejada como una estructura plana de dos dimensiones. Un programa llamado Retistruct24 puede utilizarse para devolver una retina plana wholemount a su estructura tridimensional antes de que los datos recogidos desde se analizaron. Así, una sección de este protocolo se dedica a destacar los pasos que son necesarios para utilizar el software de Retistruct para reconstruir la retina de ratón immunostained s-opsina. También hemos incluido una sección de protocolo para usar nuestro script personalizado de MATLAB, que fue desarrollado para rotar y orientar con precisión del ratón retinas con s-opsina.
Protocol
Todos los métodos aquí descritos han sido aprobados por el cuidado institucional del Animal y el Comité uso (IACUC) de la Universidad de Akron.
1. utilizando la señal del músculo recto Superior para identificar la orientación retiniana
Nota: El músculo recto superior es un hito para la retina dorsal (tabla 1). Si el experimento requiere el marcado de la retina dorsal, omita el paso 1 y continuar al paso 2.
- Siga su protocolo institucional cuidado Animal y el Comité de uso aprobado para el euthanasia de ratón.
- Para identificar la orientación general del mundo, marque con una quemadura en la córnea dorsal directamente entre los ángulos palpebrales nasal y temporales cerca de la frontera de la córnea-esclera inmediatamente después de la eutanasia (figura 1A). Marque la quemadura por calentar un lápiz cauterio durante diez segundos y luego tocarse la punta de la pluma a la córnea dorsal durante menos de un segundo.
Nota: Sostener que el lápiz cauterio a la córnea para demasiado largo hará que el globo a la puntura.
Nota: Mientras algunos lápices de cauterización emiten luz, la pluma de cauterio enumerada en la Tabla de materiales no emite ninguna luz cuando se calienta, lo que es una opción segura para experimentos oscuro-adaptado. - Para enucleación, utilizar fórceps curvado suavemente presione el ojo fuera de su zócalo y el mundo de debajo del apretón. No cortar el nervio óptico para eliminar del mundo; en su lugar, levante lentamente el globo de su zócalo mientras simultáneamente moviendolo suavemente de izquierda a derecha hasta que el mundo se libera de la toma.
Nota: Esta propuesta permitirá que los músculos rectos a permanecer unido al mundo cuando el mundo finalmente se retira totalmente de la toma. El nervio óptico también permanecerá unido al mundo. - Transferencia del globo con los músculos rectos conectados en una placa Petri conteniendo medio de disección. Asegúrese de hacer un seguimiento de qué ojo es el ojo izquierdo y que es el ojo derecho.
Nota: El disector debe utilizar un medio apropiado de disección que se alinea con su protocolo experimental. - En el ámbito de la disección, localizar visualmente la quemadura corneal dorsal e identificar el músculo recto superior con que está asociado (figura 1A).
- Con tijeras de disección o un 20 G (0,9 x 25 mm) de la aguja punción (véase Tabla de materiales), la córnea en la marca de la quemadura. Hacer un profundo alivio en el globo hacia el nervio óptico que atraviesan el músculo superior de corte. Una retina aislada y reconstruido con este corte se muestra en las figuras 1B y 1C.
- Se comienza a aislar la retina mediante el uso de dos juegos de pinzas (véase Tabla de materiales) para rasgar suavemente el orificio hecho con la puntura en el paso 1.6 hasta que se expone parte de la retina.
Nota: Es importante que esto se haga suavemente, como rasgado con demasiada fuerza puede causar el corte para aliviar a otros. - Utilice pinzas para embromar aparte la retina de la esclera hasta la esclerótica ha sido completamente eliminada. Retire el diafragma, lente, vítreo y las estructuras restantes con pinzas hasta que la retina está completamente aislada.
Nota: El protocolo se puede detener aquí. Si el tejido se va a fijar para s-opsina immunohistochemistry, continúe con el paso 3.5.
2. utilizando la señal de fisura coroide para identificar orientación retiniana
Nota: La fisura coroide está presente en la esclera en la parte posterior del ojo y va desde el polo temporal al polo nasal (figuras 2B y 2C; Tabla 1).
- Siga el protocolo institucional cuidado Animal y el Comité de uso aprobado para el euthanasia de ratón.
- Para identificar la orientación general del mundo, marque con una quemadura en la córnea dorsal directamente entre los ángulos palpebrales nasal y temporales cerca de la frontera de la córnea-esclera inmediatamente después de la eutanasia (figura 2A). Marque la quemadura por calentar un lápiz cauterio durante diez segundos y luego tocarse la punta de la pluma a la córnea dorsal durante menos de un segundo.
Nota: Sostener que el lápiz cauterio a la córnea para demasiado largo hará que el globo a la puntura. - Enuclear el ojo y el mundo en una placa Petri conteniendo medio de disección la transferencia. Asegúrese de hacer un seguimiento de qué ojo es el ojo izquierdo y que es el ojo derecho.
Nota: El disector debe utilizar un medio apropiado de disección que se alinea con su protocolo experimental. - Visualmente, localizar e identificar la fisura coroide en la parte posterior del ojo (figura 2B, 2 C).
Nota: La fisura coroidea también es visible dentro de la ojera bajo luz infrarroja20. - Oriente del globo en la caja Petri para que la quemadura dorsal se encuentra en el polo superior, como sería si el ojo todavía estaba en el ratón.
Nota: La presencia de la dorsal burn permite la identificación del lado nasal y temporal del mundo, como si se trata de un ojo derecho o izquierdo se ha documentado: si se trata de un ojo derecho, la fisura coroide nasal será a la derecha de la quemadura y la tempora fisura coroide l será a la izquierda de la quemadura. Si es un ojo izquierdo, la fisura coroide temporal será a la derecha de la quemadura y la fisura coroide nasal será a la izquierda de la quemadura.
Con tijeras de disección o una 20 G (0,9 x 25 mm) agujas (véase Tabla de materiales), hacer una punción en el mundo donde se encuentra la quemadura dorsal. - Hacer un alivio superficial corte hacia el nervio óptico donde se encuentra la dorsal quemadura corneal. Este corte será perpendicular a la fisura coroide, para identificación de la retina dorsal después de aislamiento (figura 2D).
- Hacer los dos siguientes cortes alivio profundo hacia el nervio óptico: uno por las hojas de la disección de la guarnición tijeras para arriba con la línea temporal fisura coroides en la parte posterior del ojo, y uno por las hojas de la disección de la guarnición de las tijeras hasta con la coroides nasal línea de fisura en la parte posterior del ojo. Estos cortes se muestran en una retina aislada y reconstruido en figura 2D y 2E.
Nota: Como alternativa, puede hacer un corte profundo en la fisura temporal de la coroide y puede hacer un corte poco profundo en la fisura coroide nasal, haciendo la quemadura corneal dorsal corte innecesario. Esto permite la orientación exacta de la retina con menos cortes alivio. - Se comienza a aislar la retina mediante el uso de dos juegos de pinzas (véase Tabla de materiales) para rasgar suavemente el orificio hecho con la punción en pasos 2.7 y 2.8 hasta que se expone parte de la retina.
Nota: Es importante que esto se haga suavemente, como rasgado con demasiada fuerza puede causar la cut(s) alivio a otra. - Utilice pinzas para embromar aparte la retina de la esclera hasta la esclerótica ha sido completamente eliminada. Retire el diafragma, lente, vítreo y las estructuras restantes con pinzas hasta que la retina está completamente aislada.
Nota: El protocolo se puede detener aquí. Si el tejido se va a fijar para s-opsina immunohistochemistry, continúe con el paso 3.5.
3. etiquetado el gradiente S-opsina en la Retina de ratón
Nota: La expresión de fotopigmento s-opsina se distribuye asimétricamente a la retina ventral1, convirtiéndolo en un excelente marcador para la mitad ventral de la retina. Este método sólo es útil para fijo y immunostained tejido (tabla 1). Los siguientes pasos pueden aplicarse a retinas que han sido disecadas usando cualquiera de los métodos antes mencionados.
- Siga el protocolo institucional cuidado Animal y el Comité de uso aprobado para el euthanasia de ratón.
- Inmediatamente después de la eutanasia, enuclear el ojo y el mundo en una placa Petri con medio de disección. Asegúrese de hacer un seguimiento de qué ojo es el ojo izquierdo y que es el ojo derecho con el fin de identificar orientación retiniana después de la retina se diseca.
Nota: El disector debe utilizar un medio apropiado de disección que se alinea con su protocolo experimental. -
Se comienza a aislar la retina mediante el uso de dos juegos de pinzas (tabla de materiales) para rasgar suavemente un orificio en la córnea hasta que se expone parte de la retina.
Nota: Es importante que esto se haga suavemente, como rasgado con demasiada fuerza puede causar la retina rasgar. - Utilice pinzas para embromar aparte la retina de la esclera hasta la esclerótica ha sido completamente eliminada. Retire el diafragma, lente, vítreo y las estructuras restantes con pinzas hasta que la retina está completamente aislada.
Nota: El protocolo se puede detener aquí. Si usando la retina para una ex vivo experimenta, realizar el experimento antes de realizar los siguientes pasos. - Usando las tijeras de disección, haga cuatro cortes alivio en la retina para que se acuesta plana. Montar el retina ganglio del otro celular hasta en membrana de nitrocelulosa (Tabla de materiales) presionando suavemente cada rincón de la retina sobre la membrana con pinzas.
Nota: La ubicación de los cortes de alivio puede ser arbitraria cuando se utiliza el gradiente s-opsina para orientación retiniana. - Con unas pinzas, lleno de transferencia la retina montada para el primer pozo en una placa de 24 pozos (Tabla de materiales) con 1 mL de paraformaldehído al 4% (Tabla de materiales) para la fijación. Coloque la placa de 24 pocillos en un agitador orbital a temperatura ambiente (Tabla de materiales) y fijar la retina durante exactamente 40 minutos.
Nota: Todos los siguientes pasos de lavado e incubación deben completarse con la placa de 24 pocillos en un agitador orbital. - Lave la retina durante 15 min a temperatura ambiente mediante la transferencia a la segunda bien llenada con 1 mL de PBS de 0,1 M. Repita este paso dos veces transfiriendo secuencialmente la retina a los 0,1 M PBS llena terceros y cuarto pozos.
- Transferir la retina montada a la quinta bien que contiene 1 mL de solución (1.7% Tritón X-100 y 5,2% burro de suero normal en PBS de 0,1 M; véase Tabla de materiales) de bloqueo e incubar durante una noche a 4 ° C.
- Añadir el anticuerpo primario de conejo anti-s-opsina (véase Tabla de materiales) a la solución de bloqueo a una concentración de 1: 500 y se incuba por tres días a 4 ° C.
- Lave el exceso de anticuerpo primario de la retina seis veces colocando secuencialmente en seis pozos llenados con 1 mL de PBS de 0,1 M durante 10 minutos a temperatura ambiente.
- Colocar la retina en un pozo con solución fresca de bloqueo (1.7% Tritón X-100 y 5,2% burro de suero normal en PBS de 0,1 M) y añadir burro anti-conejo Alexa-594 de anticuerpo secundario (véase Tabla de materiales). Incubar la retina con el anticuerpo secundario durante la noche a 4 ° C.
- Lave el exceso de anticuerpo secundario de la retina seis veces colocando secuencialmente en los seis pozos con 1 mL de PBS fresco de 0,1 M durante 10 min a temperatura ambiente.
- Con unas pinzas, traslado la retina montada a una caja de Petri que contiene PBS de 0,1 M. Liberar la retina de la membrana de nitrocelulosa insertando suavemente las puntas de la pinza entre la retina y la membrana hasta que la retina no está conectada.
- Monte la retina en un portaobjetos de vidrio por insistencia suavemente con unas pinzas hasta que la retina se pega al cristal y quitar la corredera de la caja Petri.
- Cubrir la retina en la diapositiva con Aquamount y cubrirla con un cubreobjetos 1.5 #. Coloque el portaobjetos en una bandeja de diapositivas (véase Tabla de materiales) y déjelo reposar a temperatura ambiente una hora.
- Volver la diapositiva al frigorífico y almacén en una bandeja de diapositivas (véase Tabla de materiales) a 4 ° C cuando no esté en uso. Después de la diapositiva coverslipped durante 24 horas, use esmalte de uñas para sellar los lados de la corredera para evitar la desecación.
Nota: El protocolo se puede detener aquí.
4. usando reconstruido Retinas Immunostained con S-opsina para identificar orientación retiniana
- Visualizar el gradiente s-opsina con un microscopio confocal o un microscopio epifluorescente con un accesorio de cámara (véase Tabla de materiales) y la retina la imagen que la retina entera es visible en una imagen (figuras 1B, 2D, 3A y 3D). esto puede hacerse por la retina en las secciones de baja magnificación de la imagen y luego cose las imágenes juntos.
- Nombre de la retina por lo que son identificables. Por ejemplo, el nombre la primera retina ser reconstruido "Retina1".
- Descargar e instalar ImageJ en https://imagej.nih.gov/ij/download.html.
- Cree una carpeta individual de cada retina que necesita ser reconstruido, pero deja las carpetas vacías. Por ejemplo, crear una carpeta titulada "Retina1". Todos los archivos necesarios para reconstruir esta retina se colocarán en esta carpeta en los pasos posteriores.
Nota: Los únicos archivos de que estas carpetas deben contener son los archivos que deben ser analizadas por Retistruct. Los archivos que no sean los detallados a continuación harán que la retina no puede ser abierto por el software de Retistruct. - Abra la imagen de la retina en ImageJ seleccionando File → Open y luego elegir "Retina1".
- Sin realizar ningún cambio en la imagen, guardarla como "image.png" a la carpeta titulada "Retina 1" seleccionar archivo → guardar como → PNG.
Nota: El archivo debe llamarse "image.png" en orden para el software de Retistruct reconocer el archivo como una retina para la reconstrucción. - Utilice la herramienta de línea segmentada para delinear los bordes de la retina. Haciendo clic en dos puntos adyacentes en la frontera de la retina, la herramienta de línea segmentada será esencialmente "conectar los puntos" entre los dos puntos adyacentes, creando un contorno. Repita hasta que la retina entera ha sido expuesta. Guardar el esquema de la retina como "outline.roi" a la carpeta titulada "Retina1" seleccionando analizar → herramientas → ROI manager → añadir [t] → más → guardar.
Nota: El borde de la retina se puede identificar donde la tinción de s-opsina transiciones a un segundo plano. - Utilice la herramienta de línea segmentada como se indica en el paso 4.7 para delinear la frontera del disco óptico. Guardar el esquema de disco óptico como "od.roi" a la carpeta titulada "Retina1" seleccionando analizar → herramientas → ROI manager → añadir [t] → más → guardar.
Nota: El disco óptico se identifica como el pequeño agujero en el centro de la retina y variará según la calidad de la disección.
Nota: Todos los archivos necesarios para la reconstrucción de Retistruct ("image.png", "outline.roi" y "od.roi") ahora se salvaría la carpeta "Retina1". - Para descargar, instalar y abrir el programa Retistruct, siga las instrucciones descritas en la guía del usuario Retistruct en la sección de materiales suplementarios de Sterratt, et al. 24
- Una vez que el Retistruct ha aparecido la ventana, haga clic en el icono "Abrir" en la parte superior izquierda de la ventana y seleccione la carpeta del directorio "Retina1".
- Aparecerá una ventana de la imagen que indica que no existe ninguna barra de escala. Haga clic en "Close" y aparecerá en el cuadro de una imagen de la retina. Visualizar el contorno de la retina haciendo clic en el botón "Propiedades" en la parte superior derecha de la ventana y cambio de color del contorno en un color visible (figura 5A).
- IMPORTANTE: Especificar si la retina de un ojo derecho o el ojo izquierdo en el panel de la izquierda (figura 5A).
- Haga clic en el botón "Añadir desgarro" de la izquierda y especifique donde es un desgarro o un corte en la retina haciendo clic en los tres vértices de la lágrima (figura 5A). Esto creará líneas que conectan los tres vértices de corte. Repita para todos los cortes en la retina.
- Especificar la retina dorsal haciendo clic en un punto arbitrario del contorno retinal. Una letra mayúscula "D" aparece en ese momento en el contorno (figura 5B).
Nota: La retina dorsal será la mitad más oscuro de la retina, enfrente el gradiente s-opsina. Sin embargo, la retina dorsal en Retistruct de la marca no es un método fiable para identificar la mitad dorsal de la retina, por lo que la marca de "dorsal" puede ser arbitraria en este paso. - Reconstruir la retina haciendo clic en el botón de "Reconstruir la Retina" en la parte superior izquierda de la pantalla (figura 5B). Un diagrama polar de la retina reconstruido aparecerá con los cortes en el mismo color que el contorno (figura 5C).
- Haga clic en el botón "Guardar" a la derecha de la pantalla para que la retina reconstruida y todos los datos asociados con él se guarda en el directorio de la carpeta "Retina1"(figura 5).
- Salvar la retina reconstruida haciendo clic en el botón "PDF" en el panel derecho(figura 5). Aparecerá un cuadro pidiendo especificaciones de tamaño. El tamaño predeterminado es aceptable para los siguientes pasos. Esta acción guardará la retina reconstruida como "image.polar.pdf" en el directorio de la carpeta de "Retina1".
- Abrir "image.polar.pdf" en un programa (u otro programa de manipulación de imagen) y utilizar la herramienta "Paint Bucket" (o similar) para cambiar el fondo de la retina reconstruido a negro. Guarde la retina reconstruida como un archivo .tif, como "Retina1_reconstructed.tif" en el directorio de la carpeta de "Retina1".
Nota: El protocolo se puede detener aquí. - Descargar el código MATLAB para girar la retina llamada "Retina_Rotator.m" (ver materiales suplementarios). Coloque el archivo de código en su propia carpeta con no otros archivos en la carpeta.
- Abrir MATLAB, versión 2007b o posterior. Haga doble clic en el archivo de código para abrirlo en MATLAB. En la ventana comando, escriba "Retina_Rotator" y presione la tecla enter. Aparecerá una ventana de búsqueda.
Nota: El código es específico para los archivos .tif. Si el archivo a ser girado no está en el formato correcto, el código no gire correctamente la retina. Vea los pasos 4.17 y 4.18. para guardar la retina reconstruida en el formato adecuado. - Abra el archivo para girarse. Por ejemplo, elegir "Retina1_reconstructed.tif". El código entonces analizar la retina reconstruida y automáticamente guardará la retina girada como "Retina1_reconstructed_rotated.tif" en la carpeta donde se encuentra el archivo original.
- Después de que el código ha terminado de analizar la retina, una ventana también aparecerá mostrando las imágenes de la retina antes y después de la rotación (figuras 3B y 3 C; Figuras 3E y 3F).
Nota: Este código rota la retina reconstruida para que la mitad ventral (más brillante) es en la parte inferior y la mitad (tenue) dorsal es en la parte superior, así, orientar con precisión la retina según el gradiente s-opsina1. Si o es la retina de un ojo derecho ojo izquierdo se ha documentado, la ubicación de los polos temporales y nasal también puede ser extrapolada de este método de orientación (figura 3).
Representative Results
Un solo corte alivio que biseca el músculo recto superior con precisión y fiabilidad identifica la retina dorsal (figura 1). La fisura coroide precisa y segura la retina nasal y temporal identifica con profundos alivio cortes a lo largo de la fisura coroide temporal y nasal (figura 2). En este ejemplo, un corte alivio también se ha en la retina dorsal con el fin de identificar el eje de la dorsal/ventral de la retina (figura 2D, flecha vertical). Los pasos de estos procesos aparecen con propósito de replicación por futuro disectores. Una combinación de la s-opsina inmunohistoquímica (Figura 3A y 3D), reconstrucción con software Retistruct (3B, 3E) y rotación exacta con un código personalizado de MATLAB (3C, 3F) permite la identificación de las mitades ventrales y dorsales de la retina, así como los polos nasal y temporales si se conoce si la retina de un ojo derecho o izquierdo (figura 3). También comparamos dos anticuerpos primarios utilizados s-opsina para efectividad en etiquetado conos s-opsina (figura 4A, D): tanto la cabra anticuerpo primario anti-s-opsina y los anticuerpos primarios anti-s-opsina efectivamente etiqueta conos de s-opsina (figura 4E) en el mismo ratón.
Cortes de alivio se identificaron en retinas de s-opsina immunostained reconstruido y sus ubicaciones se compararon con la orientación determinada por el gradiente s-opsina. Usando nuestro encargo MATLAB código retinas (ver Materiales suplementarios), precisa se gira para que la mayor concentración de s-opsina tinción está situada ventralmente, lo que coloca verdadero dorsal en 90 ° (para el recto superior), verdadero nasal en 0 ° (para nasal fisura coroide) y temporal a 180 ° (para la temporal fisura coroide). El valor de alivio cada ángulo de corte se determinó con la herramienta ángulo de ImageJ después retinas se gira según el gradiente s-opsina. Un ángulo promedio se calculó para cada alivio corte tipo y el valor promedio de cada tipo de corte para aliviar entonces se traza en un diagrama polar (figura 6). En promedio, los cortes de músculo de músculo recto superior identificaron el polo dorsal a 96,3 ± 4,3 ° (n = 11) (figura 6). La fisura coroide nasal identificado el polo nasal a 6,7 ± 5,8 ° y la temporal fisura coroide identificado el polo temporal a 172.0 ± 4,4 ° (n = 9; Figura 6).
Figura 1: utilizando el músculo recto superior para identificar con precisión la retina dorsal de un ojo derecho. (A) un ejemplo de una quemadura córnea dorsal cerca de la frontera córneo-escleral con un rotulador de punta de cauterio (flecha blanca). Músculo recto superior también es visible en esta vista (flecha blanca). (B) un ejemplo de un conjunto de retina montado con un alivio de corte en la retina dorsal por bisecan el músculo recto superior. Flecha muestra el profundo alivio de corte hecho en la retina dorsal por bisecan el músculo recto superior. La retina se tiñe con anticuerpo primario cabra anti-s-opsina (véase Tabla de materiales) y anticuerpo secundario burro anti-cabra Alexa 594 (véase Tabla de materiales; excitación: 590 nm, emisión: 620 nm) (cyan). Retina fue fotografiada con un microscopio epifluorescente con un filtro rojo de Texas (595 nm). (C) A retina reconstruido en Retistruct y rota con un código personalizado de MATLAB (ver Materiales complementarios) con el recto superior músculo para aliviar el corte visible (flecha blanca). D: dorsal, V: ventral, T: temporal, N: nasal. Barras de escala = 1 mm. haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: usando la fisura coroide para identificar con precisión los polos temporales y nasal de la retina de un ojo derecho. (A) un ejemplo de una quemadura córnea dorsal cerca de la frontera córneo-escleral con un rotulador de punta de cauterización. (B) la coroides fisura visible en la parte posterior del ojo en la esclera (flecha blanca). La quemadura córnea dorsal también es visible en esta vista, ubicado a unos 90° de la temporal fisura coroide. (C) la coroides fisura visible en la parte posterior del ojo en la esclerótica, viajando desde el nervio óptico hasta la frontera córneo-escleral. (D) una retina teñidas con cabra anti-s-opsina (véase Tabla de materiales) y anticuerpo secundario burro anti-cabra Alexa 594 (véase Tabla de materiales; excitación: 590 nm, emisión: 620 nm) (cyan) con cortes de fisura coroide (horizontal las flechas) y el alivio de la dorsal (flecha vertical). Retina fue fotografiada con un microscopio epifluorescente con un filtro rojo de Texas (595 nm). (E) una retina reconstruido en Retistruct y rota con un código personalizado de MATLAB (ver materiales complementarios) con el corte alivio dorsal y los fisura coroide nasal y temporal cortes visibles (flechas blancas). D: dorsal, V: ventral, T: temporal, N: nasal. Barras de escala = 1 mm. haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: utilizando el gradiente s-opsina para identificar todos los cuatro polos de la retina. (A) un ejemplo de una retina disección de un ojo derecho immunostained para etiquetar s-opsina y fotografiada con un microscopio epifluorescente con un filtro rojo de Texas (595 nm). Los cortes en esta retina son arbitrarios, puesto que la orientación topográfica es determinada por el gradiente s-opsina. (B) los resultados de la reconstrucción de la retina en el A con Retistruct. Observe que el gradiente s-opsina no está alineado correctamente, porque la retina no se ha ejecutado mediante el código MATLAB (ver Materiales complementarios). (C) los resultados de la retina en el A con el código personalizado de rotación. La retina ha sido girada para que la mayor concentración de s-opsina coloración se encuentra en la parte inferior e identificado como la retina ventral. Porque la retina es de un ojo derecho, el polo temporal está situado 90° en sentido antihorario desde el polo dorsal y el polo nasal está situado 90° en sentido horario desde el polo dorsal. Disecado (D) un ejemplo de una retina de un ojo izquierdo immunostained para etiquetar s-opsina y fotografiada con un filtro rojo de Texas (595 nm). Los cortes en esta retina son arbitrarios, puesto que la orientación topográfica es determinada por el gradiente s-opsina. (E) los resultados de la reconstrucción digital de la retina en D con Retistruct. Observe que el gradiente s-opsina no está alineado correctamente, porque la retina no ha sido girada por el código personalizado. (F) los resultados de la retina en D con el código personalizado de rotación. La retina ha sido girada para que la mayor concentración de s-opsina coloración se encuentra en la parte inferior e identificado como la retina ventral. Porque la retina es de un ojo izquierdo, el polo nasal está situado 90° en sentido antihorario desde el polo dorsal y el polo temporal está situado 90° en sentido horario desde el polo dorsal. D: dorsal, V: ventral, T: temporal, N: nasal. Barras de escala = 1 mm. haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: comparación de dos anticuerpos primarios s-opsina en etiquetado conos s-opsina. (A) A retina teñidas con el anticuerpo primario de cabra anti-s-opsina (véase Tabla de materiales). (B) la otra retina del ratón mismo teñidos con anticuerpos primarios anti-s-opsina (véase Tabla de materiales). (C) A representante de la región (0.1 x 0.1 mm2) de una retina teñida con el anticuerpo primario de cabra anti-s-opsina. Imagen tomada en un microscopio epifluorescente con 40 aumentos. (D) una región representativa (0.1 x 0.1 mm2) de una retina teñidas con conejo anti-s-opsina (véase Tabla de materiales), una alternativa de anticuerpo primario. Imagen fue tomada en un microscopio epifluorescente con 40 aumentos. (E) ambos anticuerpos etiqueta el mismo número de segmentos exteriores cono s porque no hay ninguna diferencia significativa en el número de conos s immunopositive que están manchados por cabra anti-s-opsina y conejo anti-s-opsina en cualquiera de la retina probado excentricidades (n = 2; ANOVA con post hoc de Bonferroni prueba; p > 0.05). Barras de escala = 1 mm (A-B); 25 μm (C-D). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 5: una guía visual para utilizar el software de Retistruct para reconstruir retinas immunostained con s-opsina. (A) A retina abrió en Retistruct con el contorno visible y un "desgarro" agregó. Puntos de la "lágrima" se indican con flechas blancas superpuestas. Todos los cortes en esta retina son arbitrarios, como ninguna señal particular fue utilizado para marcar la orientación de retina durante la disección. Botones importantes están señaladas en rojo. (B) una retina con todos «lágrimas» añadido y la retina dorsal identificado con "D" en el borde de la retina. Observe que el botón de "Reconstruir la Retina" ahora es visible. Botones importantes están señaladas en rojo. (C) el proceso de reconstrucción de una retina. La trama de la polar de la retina reconstruida aparecerá a la derecha, mostrando que el alivio cortes en cian (flechas azules superpuestas para aclarar puntos de corte). (D) el resultado de ejecutar una retina a través de Retistruct. La retina wholemount original sigue siendo el de la izquierda y la retina reconstruida aparece a la derecha. Los cortes de alivio son visibles en cian (flechas blancas superpuestas para aclarar puntos de corte). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 6: la fisura superior del músculo recto músculo y coroides puede utilizarse para orientar con precisión la retina de ratón. Un diagrama polar de los ángulos obtenidos de cualquier músculo recto superior para aliviar los cortes o cortes de fisura coroide en retinas que han sido reconstruidas con Retistruct. Cortes de alivio se identificaron en retinas de s-opsina immunostained reconstruido y sus ubicaciones se compararon con la ubicación del gradiente s-opsina. Usando el código MATLAB para girar con precisión las retinas para que la mayor concentración de s-opsina tinción está situado ventralmente, verdadero dorsal (90° para el recto superior), verdadero nasal (a 0° para la fisura coroide nasal) y cierto temporal (180° de coroides temporal fisura) se determinaron para cada retina. Se calculó el valor de cada ángulo de corte se determinó en ImageJ y un ángulo medio de relevar individuales para cada alivio corte tipo. Cortes de músculo de músculo recto superior identificaron el polo dorsal a 96,3 ± 4,3 ° (n = 11). La fisura coroide nasal identificado el polo nasal a 6,7 ± 5,8 ° y la temporal fisura coroide identificado el polo temporal a 172.0 ± 4,5 ° (n = 9). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
| Histórica profunda | Localización de la quemadura corneal | Poste de Retina identificado | Aplicación experimental |
| Recto superior | Dorsal | Dorsal | Vivo o fijo |
| Fisura coroide nasal | Dorsal | Nasal | Vivo o fijo |
| Temporal fisura coroide | Dorsal | Temporal | Vivo o fijo |
| S-opsina gradiente | Ninguno | Dorsal, Ventral, Nasal, Temporal | Fijo |
Tabla 1: Hitos profundos, el polo de la retina se identifican, y si pueden ser utilizados para la aplicación de tejido vivo o fijo.
Discussion
No ha habido ningún protocolo completa, estandarizada para la determinación y la orientación de la retina de ratón aislados en el espacio anatómico de etiquetado. El protocolo detallado aquí intenta llenar este vacío por estandarizar y detallando cómo utilizar puntos profundos anatómicos como referencia puntos a confiablemente identificar orientación retiniana. Se ha demostrado que los puntos anatómicos profundos en este protocolo proporcionan un método más preciso y confiable para orientar la retina de ratón que hitos superficiales tales como quemaduras corneales22. Así, estudios que han confiado en quemaduras corneales para orientación retiniana pueden haber tenido mayor errores en orientación de estudios que se han basado en puntos de referencia como los músculos del músculo recto y fisura coroide. Esta discrepancia pone de relieve la necesidad y la importancia de este protocolo estandarizado con respecto a la interpretación de los resultados y realizar comparaciones entre los estudios que dependen de la orientación exacta de retina. En general, un protocolo estandarizado proporcionará un método común para los investigadores de la visión a seguir, eliminando así la presencia de una variable de confusión en la adquisición de datos que puede ocurrir con el uso de métodos no estandarizados para la identificación de retina orientación.
Los métodos presentados aquí son fácilmente repetible y aplicable a muchos tipos de protocolos experimentales. De hecho, una de las mayores ventajas de este protocolo es su adaptabilidad. Debido a la fisura coroide, expresión de s-opsina y monumentos de músculo de músculo recto se todos han encontrado confiablemente identificar orientación retiniana22 la señal que mejor se adapte a los parámetros experimentales se puede elegir para optimizar la adquisición de datos (tabla 1). Además, se pueden combinar métodos de disección con el fin de aclarar aún más la orientación de la retina. Por ejemplo, cortes de fisura coroide pueden combinarse con inmunohistoquímica s-opsina para orientar todos los cuatro polos de la retina: hemisferios nasal y temporales pueden ser identificados por los cortes de fisura coroide y s-opsina inmunohistoquímica se puede identificar hemisferios ventrales y dorsales. Sin embargo, la adaptabilidad de este protocolo puede estar limitada por la naturaleza sensible al tiempo de los experimentos de Fisiología. Porque el tiempo que toma para identificar un punto de referencia, hacer una quemadura corneal y ejecutar un corte alivio podría resultar en la muerte de tejido importante en experimentos ex vivo , algunos de estos métodos de disección pueden ser inferior al óptimos. Afortunadamente, una vez que un disector se ha convertido en familiar con la fisura coroide o el método de disección de músculo recto superior, identificar los hitos profunda y el alivio de cortes rápidamente a formar parte de la rutina de disección y no añadir significativamente a la longitud de la disección. Aunque reconocemos que los pasos detallados aquí pueden añadir el tiempo a experimentos extremadamente sensibles al tiempo, le sugerimos utilizar el gradiente s-opsina para post hoc retiniana orientación cuando la viabilidad de los tejidos ya no es un problema (figura 3 ). Coloración de la retina para s-opsina es una forma efectiva para orientar a la retina, como pueden identificar todos los cuatro polos: s-opsina coloración divide la retina en polos dorsales y ventrales y permite la identificación de la nasal y temporal postes dependiendo de si la retina es de un ojo derecho o izquierdo (figura 3). Por lo tanto, creemos que este protocolo ofrece un conjunto de métodos para la orientación exacta de retina que puede cumplir con los parámetros experimentales confiable y repetible.
Como con cualquier disección modificada retiniana, la validez del método de disección está limitada por la exactitud del disector y la calidad del tejido que ha sido aislado. Si los tejidos se pierde durante la disección o una retina es demasiado destrozada para la reconstrucción precisa, Retistruct y el programa MATLAB no serán capaces de reconstruir confiablemente u orientar la retina. Por lo tanto, es importante practicar el método de disección antes de experimentos utilizando para la recolección de datos. Mientras que los tipos de disecciones explicaron aquí no es difícil, debe ser practicadas para asegurar la repetibilidad de identificar orientación retiniana con una señal particular. Además, es esencial que se utiliza la práctica de disector visualmente identificar los puntos anatómicos antes de comenzar la recolección de datos para asegurarse de que la señal correcta. Una forma de comprobar la precisión de un disector especial es hacer cualquier fisura coroide cortes o músculo recto superior corta y luego comparar la ubicación de los cortes para el gradiente s-opsina, puesto que es un marcador fijo y así no es dependiente de la precisión de dissectio n. disectores potenciales también pueden comparar sus retinas reconstruidos a los ejemplos de retinas reconstruidos con señal precisa cortes se muestran en la figura 1 y la figura 2. Esencialmente, un disector potencial debe realizar los pasos descritos en este protocolo para un tipo particular de la disección, ya sea el músculo recto superior o coroides fisuras método y comparar los resultados con el gradiente s-opsina para establecer la validez de una disector de particular. Porque si no está seguro acerca de la ubicación de la señal del disector, puede resultar en una orientación incorrecta de la retina que va por defecto, afectan interpretación y recopilación de datos.
Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Nos gustaría agradecer a Bretaña día y Jessica Onyak su asistencia técnica y el Dr. Liu por favor dejarnos utilizar su microscopio epifluorescente. Agradecimientos de apoyo: NIH R15EY026255-01 y la Fundación de Kirchgessner Karl.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.1 M Phosphate Buffered Saline | Sigma-Aldrich | P5244 | |
| Axioplan2 Epifluorescent Microscope | Zeiss | N/A | |
| Clear Nailpolish | N/A | N/A | |
| Corning LSE Low Speed Orbital Shaker | Sigma-Aldrich | CLS6780FP | |
| Costar TC-Treated 24-well Plates | Sigma-Aldrich | CLS3524 | |
| Dissection Microscope | Olympus | SZ51 | |
| Donkey anti-Goat Alexa 594 | Life Technologies | A11058 | |
| Donkey anti-Rabbit Alexa 594 | Life Technologies | A21207 | |
| Donkey Normal Serum | Millipore | 566460 | Use at 5.2% (52 μL with 86 μL of 20% Triton X-100 and 863 μL of 0.1M PBS for 1 mL of blocking solution) |
| Fisherbrand Superfrost Plus Microscope Slides | Fisher Scientific | 12-550-15 | |
| Goat anti-s-opsin | Santa Cruz Biotechnologies | sc-14363 | Not commerically available as of 2017 |
| Graefe Curved Forceps | Fine Science Tools | 11052-10 | |
| ImageJ or FIJI | National Institute of Health | N/A | Freely available software |
| Low Temperature Cautery Ophthalmic Fine Tip Cauterizer | Bovie Medical Corporation | AA00 | |
| MATLAB | MathWorks | N/A | At least version 2007b or later |
| Micro Cover Glasses | VWR International | 48393-241 | |
| Micro Slide Trays | VWR International | 82020-913 | |
| Moira Ultra Fine Forceps | Fine Science Tools | 11370-40 | |
| Nitrocellulose membrane | Millipore | HAWP04700 | |
| Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15714-S | Use at 4% (25 μL and 875 μL of 0.1 M PBS for 1 mL of fixative) |
| PrecisionGlide Needle 20G (0.90 mm x 25 mm) | BD PrecisionGlide | 305175 | |
| Pyrex Glass Petri Dish | Sigma-Aldrich | CLS3160152 | |
| R | The R Project for Statistical Computing | N/A | Freely available software; version 3.4.3 or later |
| Rabbit anti-s-opsin | Millipore | ABN1660 | |
| Retiga R3 Microscope Camera | Qimaging | 01-RET-R3-R-CLR-14-C | |
| Retistruct | N/A | N/A | Freely available software compatiable with Windows 7 or Windows 10 |
| Shandon Aqua-Mount Slide Mounting Media | Fisher Scientific | 14-390-5 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | Use 1.7% (86 μL of 20% Triton-X with 52 μL of Donkey Normal Serum and 863 μL of 0.1 M PBS for 1 mL of blocking solution) |
| Vannas Spring Dissection Scissors | Fine Science Tools | 15000-03 | |
| 5MP USB Microscope Digital Camera | AmScope | MU500 | To be used with the Olympus Dissection Microscope |
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