يوفر هذا البروتوكول دليل تشريح وتحليل شامل لاستخدام معالم العين العميقة، إيمونوهيستوتشيميستري s-أوبسين، ريتيستروكت، والتعليمات البرمجية المخصصة بدقة وموثوقية توجيه الشبكية الماوس معزولة في الفضاء التشريحية.
دقة وموثوقية تحديد التوجه المكاني الشبكية الماوس معزولة مهم للعديد من الدراسات في علم الأعصاب البصرية، بما في ذلك تحليل كثافة وحجم التدرجات من أنواع الخلايا الشبكية، ضبط الاتجاه للاتجاه الانتقائي خلايا العقدة، ودراسة أنماط طبوغرافية الانحطاط في بعض أمراض الشبكية. ومع ذلك، هناك العديد من الأساليب المختلفة من تشريح العين ذكرت في الأدبيات التي يتم استخدامها لتحديد وتسمية التوجه الشبكية في الشبكية الماوس. بينما يتم تجاهله غالباً أسلوب التوجيه المستخدمة في هذه الدراسات، يتحدد التوجه الشبكية كيفية تقديم التقارير لا يمكن أن يسبب اختلافات في الأدب والارتباك عند محاولة لمقارنة البيانات بين الدراسات. معالم العين سطحية مثل حروق القرنية شائعة الاستخدام ولكن ثبت مؤخرا أن تكون أقل موثوقية من معالم أعمق مثل العضلات المستقيمة أو شرخ choroid التدرج s-أوبسين. هنا، نحن نقدم دليل شامل لاستخدام معالم العين العميقة بدقة تشريح وتوثيق التوجه المكاني للشبكية الماوس معزولة. لدينا أيضا مقارنة فعالية الأجسام المضادة s-أوبسين اثنين وتشمل بروتوكول إيمونوهيستوتشيميستري s-أوبسين. لأنه يتطلب التوجه الشبكية وفقا للتدرج s-opsin التعمير الشبكية مع برامج ريتيستروكت والتناوب مع تعليمات برمجية مخصصة، وقد قدمنا الخطوات الهامة اللازمة لاستخدام كل من هذه البرامج. عموما، والهدف من هذا البروتوكول هو توفير مجموعة موثوقة وقابلة للتكرار لأساليب دقيقة التوجيه الشبكية التي قابلة للتكيف للبروتوكولات التجريبية الأكثر. هدف الأسمى من هذا العمل توحيد أساليب التوجيه الشبكية للدراسات المستقبلية.
أحد جوانب الهامة وفي بعض الأحيان يغفل علم الأعصاب الشبكية هو التوجه السليم والتحليل الشبكية الجامع-جبل معزولة، سواء كان ذلك التوجه للشبكية في دائرة تسجيل للكهربية أو على شريحة نسيجية. وهذا أهمية خاصة بالنسبة للدراسات التي تنطوي على الشبكية الماوس، الذي هو حاليا النموذج الأكثر استخداماً للتحقيقات المتعلقة بالنظام المرئي الثدييات. الاكتشافات الأخيرة تكشف عن أن الشبكية الماوس ليست موحدة مكانياً ولكن حجم وكثافة التدرجات من أنواع الخلايا الشبكية متميزة وظيفيا، مثل خلايا العقدة ميلانوبسين وخلايا العقدة OFF-ألفا عابرة ومخروط أوبسينس1،2 3، ،،من45. ونتيجة لذلك، الطريقة المستخدمة لتحديد اتجاه الشبكية قد يؤثر على النتائج التجريبية التي تنطوي على الخلية نوع أو opsin توزيعات2،،من36، ضبط الاتجاه للاتجاه الانتقائي العقدة الخلايا7،،من89، وأنماط طبوغرافية تنكس الشبكية10،11،،من1213،14 . في الواقع، يقال التوجه كيف شبكية العين الإبلاغ لا يمكن أن يسبب اختلافات في الأدب والارتباك عند محاولة لمقارنة البيانات بين الدراسات. ولذلك من المهم أن الباحثين تقرير طريقة لتحديد اتجاه الشبكية لكي يمكن تفسير نتائج هذه الدراسات بدقة.
عادة يتم تعريف التوجه الشبكية بالتهديف القرنية الظهرية والبطني والأنف أو الزمنية قبل انوكلييشن العين1،3،،من1215،16،17 ،،من1819 أو بقطع أو تلطيخ معالم العين تشريحية عميقة مثل6،extraocular العضلات7، الشق المشيمية21من20،، أو التدرج2،أوبسين s3. يمكن استخدام العضلات المستقيمة لتحديد الآنف الظهرية، البطني، والزمانية الشبكية بجعل قطع تخفيف العميقة التي تقسم المرفق أما المستقيمة متفوقة، أو المستقيمة أقل شأنا أو المستقيمة الآنسي، أو العضلات المستقيمة الجانبية، على التوالي. لمعظم التجارب، باستخدام العضلات المستقيمة واحدة غير كافية لتوجيه الشبكية22. يمكن اعتبار الشق شرويد، الذي من بقايا التنمية العين، خط أفقي باهتة في الجزء الخلفي العين. كل نهاية هذا السطر ينتهي الآنف أو القطب الزماني ل العالم23. وأخيراً، s-أوبسين التعبير دون تناسق توزع على الشبكية البطني في الفئران، و s-أوبسين الأجسام المضادة يمكن أن تكشف عن الشبكية البطني في تجارب المناعي1.
الأعمال الأخيرة التي Stabio, et al. 22 أظهرت أن معالم العين سطحية مثل حروق القرنية طريقة أقل موثوقية لتوجيه الشبكية في الفضاء التشريحية، الأكثر احتمالاً بسبب خطأ بشري وتقلبه في جعل حرق القرنية عند استخدام الزمانية والانسي كانثي كنقاط مرجعية. على النقيض من ذلك، أظهرت معالم العميق، مثل العضلات المستقيمة متفوقة، والشق شرويد، والتدرج s-أوبسين، لتكون معالم أكثر موثوقة ودقيقة لتوجيه الشبكية22. ومع ذلك، يتطلب تحديد هذه المعالم التشريحية خطوات تشريح فريدة غير الموضحة بالتفصيل في الأدب. وهكذا، والهدف من هذا البروتوكول توفير برنامج تعليمي شامل عن كيفية استخدام العضلات المستقيمة متفوقة والشق شرويد، والتدرج s opsin لتحديد دقة التوجه المكاني الشبكية الماوس. وباﻹضافة إلى ذلك، أدرجنا مقارنة فعالية اثنين s-أوبسين الأجسام المضادة، فضلا عن بروتوكول ل immunohistochemistry s-أوبسين.
واحد تحديا إضافيا للدراسات التي تعتمد على دقة التوجه الشبكية هو التخفيضات التصريف الكبيرة المطلوبة لشد شبكية العين ووليماونت في دائرة التسجيل، طبق، أو شريحة. وهذا يمكن أن يعرض التحديات لتحليل ما هو بطبيعة الحال هيكل ثلاثي الأبعاد عند فإنه يتم تصويرها كبنية مسطحة ثنائية الأبعاد. يمكن استخدام برنامج يسمى ريتيستروكت24 العودة شبكية ووليماونت مسطحة إلى هيكل ثلاثي الأبعاد قبل أن يتم تحليل البيانات التي جمعت من ذلك. وهكذا، قسم من هذا البروتوكول مكرس لتسليط الضوء على الخطوات اللازمة لاستخدام برنامج ريتيستروكت لإعادة إعمار أوبسين s إيمونوستاينيد الماوس شبكية العين. كما أدرجنا قسم من بروتوكول لاستخدام موقعنا MATLAB برنامج نصي مخصص، الذي تم تطويره لتدوير بدقة وتوجيه الماوس شبكية العين الملون مع s-أوبسين.
كان هناك لا بروتوكول شامل وموحد لتحديد وتصنيف اتجاه الشبكية الماوس معزولة في الفضاء التشريحية. البروتوكول بالتفصيل هنا محاولات لملء هذا الفراغ بتوحيد وتفاصيل عن كيفية استخدام المعالم التشريحية العميقة كمرجع يشير إلى موثوق بها تحديد اتجاه الشبكية. فقد ثبت أن معالم تشريحية عميقة في هذا البروتوكول يوفر طريقة أكثر دقة وموثوقية لتوجيه الشبكية الماوس من معالم سطحية مثل حروق القرنية22. وهكذا، الدراسات التي اعتمدت على حروق القرنية لاتجاه الشبكية قد يكون أخطاء أكبر في الاتجاه من الدراسات التي اعتمدت على معالم مثل العضلات المستقيمة والشق choroid. ويبرز هذا التناقض بضرورة وأهمية هذا البروتوكول الموحد فيما يتعلق بتفسير النتائج وإجراء المقارنات بين الدراسات التي تعتمد على دقة التوجه الشبكية. عموما، على بروتوكول موحد سوف توفر طريقة شائعة لرؤية الباحثين لمتابعة، وبالتالي القضاء على وجود متغير التباس في الحصول على البيانات التي قد تحدث مع استخدام أساليب غير موحدة لتحديد الشبكية التوجه.
الأساليب التي تعرض هنا بسهولة قابل للتكرار وتنطبق على العديد من أنواع البروتوكولات التجريبية. في الواقع، هو واحد من أعظم مزايا هذا البروتوكول القدرة على التكيف. نظراً لأن الشق شرويد والتعبير s-أوبسين، ومعالم العضلات المستقيمة وقد تم العثور على جميع موثوق بها تحديد اتجاه الشبكية22 يمكن أن يكون اختيار المعلم الذي يناسب المعلمات تجريبية لتحسين الحصول على البيانات (الجدول 1). بالإضافة إلى ذلك، يمكن الجمع بين أساليب التشريح بغية زيادة توضيح التوجه للشبكية. على سبيل المثال، تخفيضات الشق choroid يمكن دمجها مع s-opsin immunohistochemistry بغية توجيه جميع أقطاب أربعة الشبكية: يمكن تحديد الآنف والزمانية في نصفي الكرة الأرضية من خلال التخفيضات الشق choroid، ويمكن تحديد إيمونوهيستوتشيميستري s-أوبسين نصفي الكرة الأرضية البطني والظهري. حتى الآن، قد تكون مقيدة القدرة على التكيف لهذا البروتوكول بالطبيعة الحساسة للوقت من تجارب علم وظائف الأعضاء. لأن الوقت الذي يستغرقه لتحديد علامة بارزة وحرق القرنية وتنفيذ قطع تخفيف يمكن أن يسفر عن موت الأنسجة الهامة في تجارب السابقين فيفو ، قد تكون بعض هذه الأساليب تشريح أقل من المستوى الأمثل. لحسن الحظ، فور ديسيكتور أصبح معتاداً على الشق choroid أو أسلوب تشريح العضلات المستقيمة متفوقة، تحديد معالم العميق، وجعل تخفيف تخفيضات بسرعة يصبح جزءا من روتين تشريح ولا تقم بإضافة إلى حد كبير طول التشريح. على الرغم من أن نعترف بأن إضافة الخطوات بالتفصيل هنا في الوقت المناسب إلى تجارب حساسيتها البالغة من حيث الوقت، نقترح استخدام التدرج s-opsin للتوجه الشبكية وظيفة المخصصة عند صلاحية الأنسجة لم يعد قضية (رقم 3 ). تلطيخ الشبكية ل s opsin وسيلة فعالة لتوجيه شبكية العين، كما أنه يمكن تحديد جميع أقطاب أربعة: s-opsin تلطيخ يقسم الشبكية إلى أقطاب الظهرية والبطني ويسمح لتحديد الآنف والزمانية أعمدة تبعاً لما إذا كانت الشبكية هو من عين اليمنى أو اليسرى (الشكل 3). ولذلك، نعتقد أن هذا البروتوكول يوفر مجموعة موثوقة وقابلة للتكرار من أساليب دقيقة التوجيه الشبكية التي يمكن أن تفي بأي معلمات التجريبية.
كما مع أي تعديل تشريح الشبكية، محدودة صحة طريقة التشريح بالدقة في ديسيكتور ونوعية الأنسجة التي ظلت معزولة. إذا كان أي الأنسجة المفقودة أثناء تشريح أو شبكية هو المهترئ جداً لإعادة الإعمار دقيقة، ريتيستروكت والبرنامج MATLAB لن قادراً على إعادة بناء موثوق بها أو توجيه الشبكية. ولذلك من المهم أن ممارسة أسلوب التشريح قبل استخدامها لجمع البيانات والتجارب. في حين أوضح أنواع تشريح هنا ليست صعبة، يجب أن تمارس للتأكد من التكرار لتحديد اتجاه الشبكية مع معلما خاصا. وعلاوة على ذلك، فمن الضروري أن يتم استخدام هذه الممارسة dissector بصريا تحديد المعالم التشريحية قبل البدء في جمع البيانات للتأكد من أن التاريخي الصحيح. طريقة واحدة للتحقق من دقة ديسيكتور معين هو جعل أما الشق choroid تخفيضات أو العضلات المستقيمة متفوقة التخفيضات ومن ثم مقارنة موقع التخفيضات إلى التدرج s-أوبسين، أنه علامة ثابتة وهكذا لا تعتمد على دقة ديسيكتيو نون dissectors المحتملة أيضا مقارنة شبكية العين أعيد بناؤها إلى أمثلة عن شبكية العين أعيد بناؤها مع معلم دقيقة وترد التخفيضات في الشكل 1 و الشكل 2. أساسا، ديسيكتور محتملة يجب تنفيذ الخطوات المذكورة في هذا البروتوكول لنوع خاص تشريح، سواء أكان العضلات المستقيمة متفوقة أو المشيمية الشق الأسلوب، ومقارنة النتائج بالتدرج s opsin إثبات الصحة ديسيكتور خاصة. لأنه إذا كان ديسيكتور غير متأكد حول الموقع التاريخي، قد تترتب عليه توجه غير دقيقة للشبكية أن الإرادة، بشكل افتراضي، تؤثر على جمع البيانات وتفسيرها.
The authors have nothing to disclose.
نود أن نشكر اليوم بريتاني وجيسيكا أونياك لمساعدتها التقنية والدكتور ليو يرجى السماح لنا استخدام مجهر ابيفلوريسسينت له. شكر وتقدير للدعم: 01 R15EY026255 المعاهد الوطنية للصحة ومؤسسة كارل كيرتشجيسنير.
0.1 M Phosphate Buffered Saline | Sigma-Aldrich | P5244 | |
Axioplan2 Epifluorescent Microscope | Zeiss | N/A | |
Clear Nailpolish | N/A | N/A | |
Corning LSE Low Speed Orbital Shaker | Sigma-Aldrich | CLS6780FP | |
Costar TC-Treated 24-well Plates | Sigma-Aldrich | CLS3524 | |
Dissection Microscope | Olympus | SZ51 | |
Donkey anti-Goat Alexa 594 | Life Technologies | A11058 | |
Donkey anti-Rabbit Alexa 594 | Life Technologies | A21207 | |
Donkey Normal Serum | Millipore | 566460 | Use at 5.2% (52 μL with 86 μL of 20% Triton X-100 and 863 μL of 0.1M PBS for 1 mL of blocking solution) |
Fisherbrand Superfrost Plus Microscope Slides | Fisher Scientific | 12-550-15 | |
Goat anti-s-opsin | Santa Cruz Biotechnologies | sc-14363 | Not commerically available as of 2017 |
Graefe Curved Forceps | Fine Science Tools | 11052-10 | |
ImageJ or FIJI | National Institute of Health | N/A | Freely available software |
Low Temperature Cautery Ophthalmic Fine Tip Cauterizer | Bovie Medical Corporation | AA00 | |
MATLAB | MathWorks | N/A | At least version 2007b or later |
Micro Cover Glasses | VWR International | 48393-241 | |
Micro Slide Trays | VWR International | 82020-913 | |
Moira Ultra Fine Forceps | Fine Science Tools | 11370-40 | |
Nitrocellulose membrane | Millipore | HAWP04700 | |
Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15714-S | Use at 4% (25 μL and 875 μL of 0.1 M PBS for 1 mL of fixative) |
PrecisionGlide Needle 20G (0.90mm x 25mm) | BD PrecisionGlide | 305175 | |
Pyrex Glass Petri Dish | Sigma-Aldrich | CLS3160152 | |
R | The R Project for Statistical Computing | N/A | Freely available software; version 3.4.3 or later |
Rabbit anti-s-opsin | Millipore | ABN1660 | |
Retiga R3 Microscope Camera | Qimaging | 01-RET-R3-R-CLR-14-C | |
Retistruct | N/A | N/A | Freely available software compatiable with Windows 7 or Windows 10 |
Shandon Aqua-Mount Slide Mounting Media | Fisher Scientific | 14-390-5 | |
Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | Use 1.7% (86 μL of 20% Triton-X with 52 μL of Donkey Normal Serum and 863 μL of 0.1 M PBS for 1 mL of blocking solution) |
Vannas Spring Dissection Scissors | Fine Science Tools | 15000-03 | |
5MP USB Microscope Digital Camera | AmScope | MU500 | To be used with the Olympus Dissection Microscope |