该协议提供了一个全面的解剖和分析指南, 使用深眼地标, s-视蛋白免疫组化, Retistruct 和自定义代码, 以准确和可靠地定向孤立的小鼠视网膜在解剖空间。
准确、可靠地识别孤立的小鼠视网膜的空间方向对于许多视觉神经科学的研究都是很重要的, 包括视网膜细胞的密度和大小梯度的分析, 方向选择方向的调整。神经节细胞和一些视网膜疾病的地形退化模式的检查。然而, 文献中还有许多不同的眼部解剖方法, 用于鉴别和标记小鼠视网膜方向。虽然这种研究中使用的定位方法常常被忽视, 但如果不报告视网膜定向是如何确定的, 则在试图比较研究数据时, 可能会导致文学上的差异和混淆。表面的眼部地标, 如角膜烧伤, 通常使用, 但最近被证明是不可靠的比更深层次的标志, 如直肌, 脉络膜裂, 或 s 视蛋白梯度。在这里, 我们提供了一个全面的指导, 使用深眼地标, 以准确地解剖和记录的空间方向的孤立的小鼠视网膜。我们还比较了两种 s-视蛋白抗体的有效性, 并包括了视蛋白免疫组化的协议。因为视网膜的方向根据 s-视蛋白梯度要求视网膜重建与 Retistruct 软件和自转以自定义代码, 我们已经提出了使用这两个程序所需的重要步骤。总的来说, 本议定书的目标是提供一套可靠和可重复的方法, 用于精确的视网膜定向, 这是适应大多数实验性协议的。这项工作的一个首要目标是标准化视网膜定向方法, 以供将来研究之用。
视网膜神经科学的一个重要的, 有时被忽视的方面是正确的定位和分析孤立的全视网膜, 无论是视网膜的方向在电生理记录室或组织学幻灯片。这对于涉及老鼠视网膜的研究尤其重要, 这是目前最广泛使用的哺乳动物视觉系统调查模型。最近的发现表明, 小鼠视网膜不是空间上的均匀的, 而是有功能上不同的视网膜细胞类型的密度和大小梯度, 如黑视素神经节细胞, 瞬态的非α神经节细胞, 锥 opsins1,2 ,3,4,5。因此, 用于确定视网膜方向的方法可能会影响细胞类型或视蛋白分布2、3、6、方向选择性方向调谐的实验结果。神经节细胞7,8,9, 和地形模式视网膜变性10,11,12,13,14.事实上, 没有报告视网膜定向是如何报告的, 可能会导致文学的差异和混淆时, 试图比较数据之间的研究。因此, 研究人员要报告视网膜定位的方法是非常重要的, 这样可以准确地解释这些研究的结果。
视网膜定向通常是指在眼球摘除1、3、12、15、16、17 前, 在背、腹、鼻或颞部角膜上评分. ,18,19或通过切割或染色深解剖眼睛的地标, 如眼外肌6,7, 脉络膜裂20,21, 或s-视蛋白梯度2,3。直肌可用于鉴别背, 腹, 鼻和颞部视网膜通过做一个深的缓解切口, 平分的附件的上级直肌, 下直肌, 内侧直肌, 或侧直肌, 分别。然而, 对于大多数实验, 使用一个直肌是足够的定向视网膜22。脉络膜裂是眼睛发育的残余物, 可以被看作是眼睛背面的一条微弱的水平线。这条线的每个末端在鼻子或地球23的世俗极性终止。最后, 视蛋白表达不对称分布于小鼠腹侧视网膜, 视蛋白抗体可用于在免疫组化实验中揭示腹壁视网膜1。
最近的工作由 Stabio,等等。22表明, 浅表眼地标如角膜烧伤是一种较不可靠的方法定位视网膜在解剖空间, 很可能是由于人的错误和变异, 使角膜烧伤时, 使用的时间和内侧canthi 作为参考点。相反, 深的地标, 如直肌, 脉络裂, 和 s-视蛋白梯度, 已被证明是更可靠和准确的地标定向视网膜22。然而, 鉴定这些解剖地标需要独特的解剖步骤, 在文献中没有详细描述。因此, 本议定书的目的是提供一个全面的教程, 如何使用上直肌, 脉络膜裂, 和 s-视蛋白梯度, 以准确地识别的空间方向的小鼠视网膜。此外, 我们还包括了两种 s-视蛋白抗体的有效性的比较, 以及视蛋白免疫组化的协议。
依靠精确的视网膜方向进行研究的另一个挑战是在录音室、盘子或滑梯上压扁 wholemount 视网膜所需的大的减压切口。这可以为分析三维结构, 当它被成像为平面二维结构时, 引入挑战。一个名为 Retistruct24的程序可以用来返回一个平坦的 wholemount 视网膜到它的三维结构, 然后从它收集的数据进行分析。因此, 本协议的一节专门强调了使用 Retistruct 软件重建视蛋白 immunostained 小鼠视网膜所需的步骤。我们还包括了使用我们的自定义 MATLAB 脚本的一部分协议, 这是开发, 以准确地旋转和东方的老鼠视网膜染色的视蛋白。
目前还没有全面的标准化的协议来确定和标记孤立的小鼠视网膜在解剖空间的方向。这里详细的协议试图填补这个空白, 标准化和详细说明如何使用深解剖地标作为参考点, 以可靠地识别视网膜方向。结果表明, 本协议中的深部解剖标志提供了一种更准确、更可靠的方法来定位小鼠视网膜, 而不是像角膜烧伤22这样的表面标志物。因此, 依赖角膜烧伤视网膜定向的研究可能比依赖于诸如直肌和脉络膜裂隙等地标的研究有更大的方向性错误。这种差异突出了这一标准化议定书对解释结果的必要性和意义, 并对依赖准确的视网膜定向的研究进行比较。总体而言, 标准化的协议将为视觉研究人员提供一个共同的方法, 从而消除了在数据获取中存在混淆变量, 这种变化可能发生在使用非标准化方法来识别视网膜取向。
这里提出的方法很容易重复, 适用于许多类型的实验协议。事实上, 该协议的最大优点之一就是它的适应性。由于脉络膜裂、s-视蛋白表达、直肌等标志物均已被发现可靠地识别视网膜方位22最适合的标志性实验参数可选择优化数据采集 (表1). 此外, 可以结合解剖方法, 进一步阐明视网膜的方向。例如, 脉络膜裂隙切口可以与 s-视蛋白免疫组化相结合, 以适应视网膜的所有四个极: 鼻和颞半球可以通过脉络膜裂隙的切割来识别, 而 s-视蛋白免疫组织化学可以识别腹侧和背半球。然而, 该协议的适应性可能受到生理实验的时间敏感性的制约。由于确定一个地标的时间, 做一个角膜烧伤, 并执行减轻削减可能导致重大组织死亡的活体实验, 其中一些解剖方法可能是低于最佳。幸运的是, 一旦一个刀已经熟悉了脉络膜裂或上直肌解剖方法, 确定的深地标和使减轻削减迅速成为解剖例程的一部分, 并没有显著增加解剖长度。虽然我们承认, 这里详细的步骤可以增加时间对非常时间敏感的实验, 我们建议使用 s-视蛋白梯度的后视网膜定向后, 组织的生存能力不再是一个问题 (图3).视蛋白视网膜染色是一种有效的方法来定位视网膜, 因为它可以识别所有四个极点: s-视蛋白染色将视网膜分为背部和腹侧极, 并根据视网膜是否能识别鼻腔和颞极。是从右或左眼 (图 3)。因此, 我们认为该协议提供了可靠和可重复的一套方法, 以准确的视网膜方向, 可以满足任何实验参数。
与任何改良的视网膜解剖一样, 解剖方法的有效性受到刀的准确性和被隔离的组织质量的限制。如果在解剖过程中丢失了任何组织, 或者视网膜过于错位, 无法精确重建, Retistruct 和 MATLAB 程序将无法可靠地重建或定位视网膜。因此, 在使用该方法进行数据收集实验之前, 必须进行解剖法的实践。虽然这里解释的解剖类型并不困难, 但必须进行练习, 以确保识别视网膜方向的重复性与特定的地标。此外, 刀在开始收集数据之前, 必须在视觉上识别出解剖学地标, 以确定正确的地标正在使用。检查某一特定刀的准确性的一种方法是使脉络裂切口或优越的直肌切开, 然后将切口的位置与 s-视蛋白梯度进行比较, 因为它是一个固定的标记, 因此不依赖于 dissectio 的准确性。潜在的 dissectors 还可以将其重建的视网膜与重建后的视网膜的例子进行比较, 并进行精确的标志性切割, 如图 1 和图 2所示。本质上, 一个潜在的刀应该执行本协议中概述的特定解剖类型的步骤, 无论是直肌或脉络膜裂法, 并将结果与 s-视蛋白梯度进行比较, 以确定特别刀。因为如果刀不确定地标的位置, 它可能导致不准确的视网膜方向, 默认情况下, 会影响数据的收集和解释。
The authors have nothing to disclose.
我们要感谢布列塔尼天和杰西卡 Onyak 为他们的技术援助和刘医生好心让我们使用他的 epifluorescent 显微镜。支持的鸣谢: NIH R15EY026255-01 和卡尔 Kirchgessner 基金会。
0.1 M Phosphate Buffered Saline | Sigma-Aldrich | P5244 | |
Axioplan2 Epifluorescent Microscope | Zeiss | N/A | |
Clear Nailpolish | N/A | N/A | |
Corning LSE Low Speed Orbital Shaker | Sigma-Aldrich | CLS6780FP | |
Costar TC-Treated 24-well Plates | Sigma-Aldrich | CLS3524 | |
Dissection Microscope | Olympus | SZ51 | |
Donkey anti-Goat Alexa 594 | Life Technologies | A11058 | |
Donkey anti-Rabbit Alexa 594 | Life Technologies | A21207 | |
Donkey Normal Serum | Millipore | 566460 | Use at 5.2% (52 μL with 86 μL of 20% Triton X-100 and 863 μL of 0.1M PBS for 1 mL of blocking solution) |
Fisherbrand Superfrost Plus Microscope Slides | Fisher Scientific | 12-550-15 | |
Goat anti-s-opsin | Santa Cruz Biotechnologies | sc-14363 | Not commerically available as of 2017 |
Graefe Curved Forceps | Fine Science Tools | 11052-10 | |
ImageJ or FIJI | National Institute of Health | N/A | Freely available software |
Low Temperature Cautery Ophthalmic Fine Tip Cauterizer | Bovie Medical Corporation | AA00 | |
MATLAB | MathWorks | N/A | At least version 2007b or later |
Micro Cover Glasses | VWR International | 48393-241 | |
Micro Slide Trays | VWR International | 82020-913 | |
Moira Ultra Fine Forceps | Fine Science Tools | 11370-40 | |
Nitrocellulose membrane | Millipore | HAWP04700 | |
Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15714-S | Use at 4% (25 μL and 875 μL of 0.1 M PBS for 1 mL of fixative) |
PrecisionGlide Needle 20G (0.90mm x 25mm) | BD PrecisionGlide | 305175 | |
Pyrex Glass Petri Dish | Sigma-Aldrich | CLS3160152 | |
R | The R Project for Statistical Computing | N/A | Freely available software; version 3.4.3 or later |
Rabbit anti-s-opsin | Millipore | ABN1660 | |
Retiga R3 Microscope Camera | Qimaging | 01-RET-R3-R-CLR-14-C | |
Retistruct | N/A | N/A | Freely available software compatiable with Windows 7 or Windows 10 |
Shandon Aqua-Mount Slide Mounting Media | Fisher Scientific | 14-390-5 | |
Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | Use 1.7% (86 μL of 20% Triton-X with 52 μL of Donkey Normal Serum and 863 μL of 0.1 M PBS for 1 mL of blocking solution) |
Vannas Spring Dissection Scissors | Fine Science Tools | 15000-03 | |
5MP USB Microscope Digital Camera | AmScope | MU500 | To be used with the Olympus Dissection Microscope |